专利名称：：通过发酵组成性过产类胡萝卜素的选定菌株或突变体生产高纯度类胡萝卜素的方法
技术领域：
：本发明描述了(i)选自自然分离的组成性过产类胡萝卜素，优选(3-胡萝卜素的菌抹或其突变体；以及(ii)高纯度类胡萝卜素、优选(3-胡萝卜素的生产方法，其通过对发酵、纯化及分离条件的改进，产出具有结晶特性的高纯度类胡萝卜素，可用于饲料、食品、化妆品和制药领域。
背景技术：
：类胡萝卜素是天然的脂溶性色素，植物、藻类、真菌和细菌通过生物合成取得，但动物不是，动物从其饮食中取得。当其大量存在时，其赋予植物和微生物以及动物器官(如鲑鱼)明亮的色彩(黄色，橙色，红色或紫色)，易于辨认。它们在微生物和植物的光合膜中有许多不同的功能，如种特异性染色，光保护和捕光。所有的类胡萝卜素都是包含长的共轭多烯链的疏水性分子，该链不仅决定了类胡萝卜素的吸光性和其颜色，而且也决定了他们的光化学性质和由此而得的捕光及光保护功能的。特别是光保护功能取决于类胡萝卜素淬火单线态氧和激活在光合作用过程中产生感光色素的能力，从而防止有害氧的积累。此外，类胡萝卜素除了光合作用外还具有抗氧化性能，如与自由基相互作用，抑制脂质过氧化。一些类胡萝卜素中的维生素原A活性一直是营养学家关注的焦点。例如，在哺乳动物体内可将P-胡萝卜素和50多种其他类胡萝卜素转换7一种形式。视黄輕在细胞中进一步氧化成维曱酸，即维生素A的活性细胞形式。因为维生素A不能在植物或动物体中再造合成，所以类胡萝卜素为整个动物王界提供维生素A的唯一来源。除其在人类营养方面具有重要意义以外，近20年的研究资料表明类胡萝卜素对心血管疾病和各种癌症的预防也具有重要作用。人们认为这种保护作用与作为抗氧化剂的类胡萝卜素的活性有关。因此，类胡萝卜素引起了伺料、食品、化妆品和医药行业的极大兴趣，因为它们不仅可以用来做天然色素，而且还可以用来做高价值的膳食补充剂和用于化疗保护配方中。在饲料、食品、化妆品和医药市场以及它们的交叉领域如保健品和药用化妆品领域中，随着类胡萝卜素越来越重要，人们不断改进努力生产出大量有效的类胡萝卜素。类胡萝卜素产自高等植物，藻类，真菌和细菌，以及像鸟类和曱壳类的动物。类胡萝卜素主要源于其全反式结构，是一种热力更稳定的异构体。顺式的异构体也会自然发生，或作为食品加工如加热的结果而形成。例如，存在p-胡萝卜素的几种不同的几何异构体(全反式，9-顺，13-顺，和15-顺的异构体形式)。已知，与13-顺(53%活性)和9-顺-卩-胡萝卜素(38%活性)异构体相比，全反式(3-胡萝卜素维生素A原的含量最高(A.SchieberandR.Carle,2005)。顺反式异构化的作用也影响着类胡萝卜素的抗氧化能力和生物药效(生物利用度)。在人体的循环中主要卩-胡萝卜素异构体是带有少量13-顺和9-顺p-胡萝卜素的全反式(3-胡萝卜素。(3-胡萝卜素顺式异构体的循环水平对其异构体消耗的增加不敏感，有证据表明肠子有选择性地吸收全反式结构!3-胡萝卜素或9-顺(3-胡萝卜素在血浆中在摄取和表现之间被异构化成全反式(3-胡萝卜素(K.-J.Yeum8andR.M.Russell,2002)。最近关于胡萝卜素立体异构体抗氧化能力的测试研究已经完成，在全反式P-胡萝卜素，9顺-(3-胡萝卜素，13顺-(3-胡萝卜素，15-顺-(3-胡萝卜素之间并没有显著差异(V.B6hmeta1.,2002)。一个最近的体内研究表明全反式)3-胡萝卜素恢复了肝酶，如过氧化氪酶，过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，可以保护重要器官抵抗例如老鼠以四氯化碳为食时，异源物质导致的氧化压力。异源物质存在时，脂质过氧化物酶的活性增加，老鼠以四氯化碳为食、全反式(3-胡萝卜素含于膳食补充剂时，脂质过氧化物酶的活性也保持在正常的生理水平。(K.N.C.Murthyetal"2005)现有的类胡萝卜素的生产方法在许多源于动植物的人类食品中都含有类胡萝卜素，但主要存在于水果和蔬菜中。例如，胡萝卜中含有高浓度的p-胡萝卜素(新鲜产品中的含量为0.11毫克/克)。然而，植物来源的类胡萝卜素含量和组成的季节性变化是会损失的。更因经济、环境和逻辑上的限制，从蔬菜类中直接大规模的提取类胡萝卜素是不可行的。类胡萝卜素，如P-胡萝卜素和番茄红素，可以通过重复性的和可扩展的过程，化学合成。事实上市面上的P-胡萝卜素85%以上都是由化学合成得到的。然而常规的化学合成过程中，原材料源于化石燃料，通过使用化工催化剂和试剂，由高温、能源密集型操作单位处理化石燃料。在化工业，人们越来越意识到要想提高企业的竟争力和增强公众的信心，当务之急是减少对基于石油的原材料和燃料的依赖性，使环境影响最小化。生物技术的应用取代现有工艺可使许多产业提高效率、优化环境和有助于工业的可持续发展。这将减少废物，降低能源消耗，减少温室效应的气体排;故，并且广泛应用可再生原材料。具有代表性的农业材料经过生物工艺首先转换成单糖然后转换成范围广泛的最后产品。用于工业的生物工艺具有变革当前基于化学工艺的生产基础的潜力。替换的，微藻类是类胡萝卜素的天然来源。例如，在一定条件下，杜氏藻类能蓄积多达干重的14%的(3-胡萝卜素(140毫克Z克)。微藻要在大型的室外池塘中培养，因生产高水平的p-胡萝卜素积聚物要求高盐度，高温和高光强，而会受到环境影响，如降雨，阳光和盐水的可用性。对营养的限制，尤其是氮的限制，也增加了类胡萝卜素的形成。一般来说，当特定生长速率低时，在最佳条件下胡萝卜素形成作用是最理想的。微藻类呈现低特定生长速率和工艺条件允许的最高生物量生产率是不利于p-胡萝卜素的累积的，通常需要高盐浓度和增加在阳光下的暴露，如使用5-IO厘米深的浅的池塘。[US4，199，895]。用于生产微藻的设施必须设在有足够的平坦陆地之地，要有廉价的高盐度盐水源，也要有较低含盐量的水源来控制盐度和弥补蒸发损失(约总容量Z日的5%);该地区一年中要很少阴天，一年内大部分时间的平均日气温高于30。C,降雨量要越少越好，且要未受任何污染。换句话说，工厂既不能设在使用杀虫剂或除草剂的农业活动区域，也不能设在有可能发生重金属污染的工业活动区(M.A.Borowitzka,1990)。由于这些特异性，世界上很少有地方可广泛长期应用微藻类生产卩-胡萝卜素。藻类细胞密度低，尺寸小，难于收割，成本高。事实上，杜氏藻是在高比重、高黏性盐水中是中立悬浮的无防护细胞壁的小单细胞。由于在大量培养基中只能得到的相当低细胞密度'常常采用极大容量方式处理，比较典型地是不超出1g/L(M.A。borowitzka,1990),常有的报道是密度低至0.25g/L—0.50g/L。常规固液分离操作如过滤和离心过滤通常会剪伤这些细胞，从而导致(3-胡萝卜素氧化损失。此外，高盐浓度的盐水腐蚀金属设备是个重大难题。生产的卩-胡萝卜素成为食品的一部分前必须符合严格的要求。例如，欧洲规定只允许从位于南澳洲的怀阿拉的大盐湖中产出的杜氏海藻中获取的微藻生卩-胡萝卜素才能做食品用途。即使在执行精细的下游纯化(微藻部分仍处于最后制备阶段)时，在放入P-胡萝卜素的食物中往往也有令人不愉快的鱼腥味。上述原因有助于解释为什么微藻类生产卩-胡萝卜素不能代替目前实现占全球P-胡萝卜素市场份额的超过85%的大规模的化学合成过程的原因。由真菌进行类胡萝卜素工业生产的基础技术已经设定，尽管只有真菌(3-胡萝卜素和番茄红素工业生产的极少案例。原始的(3-胡萝卜素生产工艺经不断改进(A.Ciegler,1965)，目前已公开的P-胡萝卜素的浓度已高达9克/升(EP1367131Al)。发酵过程釆用曝气和搅拌深层培养乙三孢。在发酵过程中，由乙三孢生产类胡萝卜素取决于两种兼容菌株,其在交配前必先在两个平行的发酵桶中独立发酵约48小时。类胡萝卜素生物合成的诱导依据有交配类型特异性的费洛蒙，即卩-胡萝卜素的降解产物的扩散而来。三孢子酸便是产物之一，作为触发接合孢子发展的主要费洛蒙(A.D.Schmidtetal.,2005)。这给合成过程增加了困难，每个交配型之间的比例必须进行优化，以获得期望的(3-胡萝卜素累积，和/或f3-胡萝卜素的降解产物必须添加到培养基中，以触发卩-胡萝卜素累积。另一个困难是，要使乙三孢培养液变得粘稠，就需要投入相当大的能量来保持良好的混合和所需的维持溶解氧水平。此外，由于复杂的菌丝形态，产量高的P-胡萝卜素的提取只能在菌丝体分裂后获取，以增加菌丝体和萃取溶剂之间接触的表面积。菌丝体的分裂通过烘千和粉碎、干燥和解体，或仅仅是生物量解体(EP1306444)获得。鉴于这一过程的复杂性，只有当类胡萝卜素的生产过程是通过常规的大规模生产菌抹的设施(如抗生素生产设施)而实现时，才能说具有经济可行性。应用其他真菌进行|3-胡萝卜素工业生产的可能还只是在实验室开展，因为类胡萝卜素累积通常利润太低(E.A.Iturriaga，etal.,2005)。此外，一些菌类在液体或固体介质表面优先产出胡萝卜素，因此很难进行工业规才莫生产。已知有些酵母菌株积累P-胡萝卜素而的，如粘红酵母(1.1毫克/升)(P.Buzzini，2004);红发夫酵母(10毫克/升)[EP0608172]，但还没有在经济上可行的生产过程。另一个接近过产类胡萝卜素的方法，是通过基因工程微生物菌株。迄今作出的努力并未达到期望的结果。例如，有代表性的报导说通过转化大肠杆菌累积|3-胡萝卜素已高达1毫克/克干重[US5656472]。最近，据报道代谢工程生产的大肠杆菌菌株累积(3-胡萝卜素已高达30毫克/克干重(S.-W.，Kim,etal.,2006),但相对于总的类胡萝卜素来说这样生产的卩-胡萝卜素的纯度仅为80%左右。其他一些报告说，不但在菌抹(除大肠杆菌，最近也在i更计曱基单孢菌4朱，如US6929928冲艮道)，而且在真菌(拟枝孢镰刀菌，US6372479;布拉克须霉，EP0587872;构巢曲霉，US5656472)和酵母菌(酿酒酵母，US5656472;毕赤酵母，US5656472)中都已开展胡萝卜素基因工程。一般，达到生产效价是非常低的。此外，要在重组无性菌林条件下生产类胡萝卜素必须克隆一些基因，而这些重组菌4朱往往是不稳、定的。用基因重组微生物菌抹生产的类胡萝卜素很难上市，因为大多数类胡萝卜素都用于人和动物营养。而法律法规严控将转基因的原料或添加剂加入到用于人和动物营养的产品中。即使这些转基因的原料或添加剂经过相当漫长和昂贵的程序得到安全许可，也必须标明是源于转基因的，并且在添加有这些转基因的原料或添加剂的也要标明包含转基因成分。由于消费者反对转基因食品，在食品和饲料市场中利用基因重组技术生产是个关键的弊端(如类胡萝卜素的生产)。生产类胡萝卜素的天然菌抹一些胡萝卜素生成菌林已公开，包括蓝藻(Cyanobacteria),噬夏孢欧文氏菌(泛菌(Pantoeaananatis)),草生欧文氏菌(成团泛菌(Pantoeaagglomerans))，黄軒菌(Flavobacterium),万尼氏红微菌(Rhodomicrobiumvannielii)，固定4匕红色精朊杆菌(Protaminobacterruber)，嗜盐细菌(halophilicbacteria)和分枝杆菌(Mycobacterial但通常这些生物产出的类胡萝卜素混合物浓度非常低，在1毫克/克干重以下。此外，通常表现为比生长速率低、类胡萝卜素的生产率低和加工过程效率低，因而不能用于经济上可行的工业化生产。事实上，迄今已报告的自然产生(3-胡萝卜素的菌林显示细胞内浓度极低，极难形成P-胡萝卜素的特性。自19世纪末开始用一些菌抹生产类胡萝卜素(M.A.IngrahamandC.A.Baumann,1933),尽管只有在近期才发展一些分析技术，允许天然对色素进行更精密的定性和定量分析。已报道的堪萨斯分枝杆菌能够积累达到类胡萝卜素总量的75%的卩-胡萝卜素，但(3-胡萝卜素的细胞内浓度不超过0.80毫克/克干重(H丄.David，1974a;H丄.David,1974b)。而且分枝杆菌的增长率通常较低，这些菌林往往依附于表面，甚至是不锈钢表面，这使它们在生物反应器中生长和进一步的处理很难。此外，有证据表明，用分枝杆菌和其他的菌林的胡萝卜素形成作用是一个光感过程，更加限制了在生物反应器中进行大规模处理。最近有关于多食黄杆菌(Flavobacteriummultivorum)ATCC55238的报道[US20050214898A1],其中|3-胡萝卜素的浓度达到2.4毫克/克干重，最高P-胡萝卜素纯度占总类胡萝卜素的80。/。。但是，以此生长过程中，在特定点加入盐或三羧酸循环化合物，以触发类胡萝卜素积累。此外，这种菌抹属于德国微生物保藏和细胞培养中心和美国典型微生物菌种保藏中心的生物安全为2级的微生物，这意味着它是与人类疾病有关。成团泛菌(Pantoeaagglomerans)，堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)的情况同上。有关于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌株的隔离报道称，卩-胡萝卜素的浓度为16毫克/升，纯度为总类胡萝卜素的71%(Silvaetal.，2004)。再添加另外的的营养液在摇瓶内进一步处理，经7天的培养，可产出45毫克/升、纯度为89%的(3-胡萝卜素。最近，一个使用副球菌(Paracoccus)菌株的方法声称生产p-胡萝卜素的纯度为100%，然而培养液的浓度仅为16mg/L(EP1676925)。这样的生产和生产力水平仍然不足，实行起来仍然不经济。因此，对于一些研究人员和公司来说，尽管他们尽其所能，不辞辛苦，但却仍没有推出具有高生产率的、简易的、可再生的、稳定的和便于规模和纯化的、使用从农产品或废物获得的可再生的和廉价的原料的特点的(3-胡萝卜素生产方法
发明内容本发明描述了一种新的生产方法，其使用从自然界隔离的新的天然菌林实现组成性过产卩-胡萝卜素，其中有可控和可扩展的一步发酵，并使用廉价和可再生的原材料，能够产出高纯度(3-胡萝卜素，可广泛应用于例如但不限于飼料、食物、化妆品和药品领域。制备组成性过产类胡萝卜素的突变体菌林的方法
技术领域：
：本发明中，经鉴定为属鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属的组成性生产(3-胡萝卜素的天然菌抹是从土壤中隔离得到。通常对于所有胡萝卜素合成生物体来说，隔离的菌株通过胡萝卜素合成途径会产出混合的类胡萝卜素。本发明中，分离菌株的改进方法已经得到开发，使类胡萝卜素细胞内浓度最高，使和其他类胡萝卜素相比(3-胡萝卜素的纯度最大，且不需要化学或物理诱导或在三羧酸循环或胡萝卜素生物合成途径中额外设置构件。本发明的诱变方法是以这样的方式调整典型的诱变技术将其中诱变条件设置为获得低于10%的存活率的试验与设计为改进菌抹的自发突变的试验相结合。。本发明的诱变方法使用一系列的检测方法，基于在突变体形成菌群的视觉色彩观察和对突变体色素的组成的光度色谱分析，尤其是对上述方法展示了与其亲株有可检测的色差的突变体进行检测分析。本发明从而提供了一种快捷的，易于实施的方法，来产出改进的过产类胡萝卜素菌抹，优于自然隔离。本发明的方法可以获取突变抹，其能够积累比原始隔离抹更高的积累量的(3-胡萝卜素，且纯度更高都高出很多的，如示例1和2所示。排列隔离抹与所获得的突变体的16SrRNA基因序列，发现有98%的相似度。15种系发育分析表明，通过本发明获得的突变抹，下文中进一步描述,为一种新型的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌抹。本发明中获得的鞘氨醇单胞菌属突变株相对于其他胡萝卜素生物合成微生物具有更高的增长率(高达0.20h—、在不到48小时内允许达到100光密度单位)，卩-胡萝卜素累积水平超过10毫克/克干重，自然积累(3-胡萝卜素超过其他类胡萝卜素，相对总类胡萝卜素而言(3-胡萝卜素的纯度高于90%。根据本发明的生产(3-胡萝卜素的方法，所有参量都得到了重大改进，使用天然菌株，首次提出一种可吸引大规模的商业生产天然(3-胡萝卜素的菌株。另外，选定的菌抹是安全的，适合大规模生产，与用鞘氨醇单胞菌属菌抹生产食品添加剂的其他生产工艺类似，例如生物素[EP0589285]和结冷胶(Kangetal.，1982)在目前科技水平下，使用自然发生的菌株生产p-胡萝卜素的方法的所有参量都得到了重大改进，并且首次4是出菌4朱生产，对自然(3-胡萝卜素的大规模的商业生产具有吸引力。另外，选定的菌株是安全的，适合大规模生产，与使用鞘氨醇单胞菌属菌抹生产食品添加剂的其他生产工艺类似，例如生物素[EP0589285]和结冷胶(Kangeta1.,1982)大规模生产类胡萝卜素的方法
技术领域：
：本发明还首次提供了大规模培养运用本发明的选定和诱变的方法获得的菌抹的方法，使每单位生物质的产量、类胡萝卜素尤其是[3-胡萝卜素的产量以及相对总类胡萝卜素的结晶类胡萝卜素尤其是(3-胡萝卜素的特异性达到最佳。本发明的生产流程使用源于农产品和废物的可再生原料，并在整个培养中，以此喂食在密闭可控的生物反应器中生长的菌株，就这样实现最大限度地增长，促进特定类胡萝卜素尤其是P-胡萝卜素的累积，不需要进行化学或物理诱导或在三羧酸循环或在胡萝卜素生合成途径中增加构件。本发明提供了培养参数的最佳范围，如温度，pH值，溶解氧浓度，营养物浓度，其能够最大限度增加生物量和类胡萝卜素积累及其他们各自的生产率。据我们所知，本发明是迄今为止首次公开表述使用天然菌抹或其突变体，在可控生物反应器中，模仿工业化规模，生产(3-胡萝卜素，并因此确定该条件可用于生产工厂。所有用于生产类胡萝卜素的生物学方法都涉及细胞破裂而致类胡萝卜素累积，因此，类胡萝卜素混在包含由细胞碎片组成的复杂的混合物的碎片之中，使获得所需纯度的类胡萝卜素的纯化步骤变得复杂和昂贵。本发明生产流程的纯化步骤的重要优势在于无需事先细胞破碎步骤，直接从生物质中提取高纯类胡萝卜素。通过这种方式，当细胞断裂时并不需要将类胡萝卜素从释放的大量细胞碎片中分离。这不但减少了下游进程所需的步骤，而且还利用简单和具有成本效益的提取步骤提供一种非常干净的类胡萝卜素提取物。本发明描述了构成过产类胡萝卜素尤其是(3-胡萝卜素的的天然菌抹，或其突变体，尤其是过产j3-胡萝卜素的属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的新菌抹，和其突变体，以及一种使用所述天然菌抹及其突变体的生产方法，其包括一可再生、稳定的、容易控制和扩展的发酵步骤，利用源于农产品或废物的廉价而又可再生的原料，经简单的净化后可获取高产量的类胡萝卜素，特别是高纯的类胡萝卜素，最适宜的是高纯的P-胡萝卜素，可广泛应用于但不限于饲料、食物、化妆品和药品领域。本发明包括以下方面(i)从自然分离的菌抹或其突变体中选定组成性过产类胡萝卜素尤其是(3-胡萝卜素的菌林;及(ii)生产工艺，包括改良和控制使用天然菌株或其突变体的发酵的生产工艺，旨在最大限度地提高单位体积和时间内的生物质的产量，和最大限度地提高单位体积和时间内的的类胡萝卜素的产量，尤其是高纯的类胡萝卜素，最优的是高纯的j3-胡萝卜素的产量，以及使用天然溶剂对所述类胡萝卜，尤其是高纯的类胡萝卜素，最优的是高纯的P-胡萝卜素的纯化。本发明的方法的特征，与目前工业上使用的化学合成方法相比，更有竟争力，并可替代现在的生物法生产(3-胡萝卜素的方法。本发明所述的"天然菌抹，，可定义为可以从自然界任一来源尤其是从土壤中隔离的菌抹，可自然地并组成性生产类胡萝卜素。本发明所述的"高纯的类胡萝卜素，，是指从天然菌抹生产的具体的类胡萝卜素的产量占由所述菌抹生产的总类胡萝卜素产量的50%以上，优选的是超过由所述菌株生产的总类胡萝卜素产量的80%,最好的是超过由所述菌抹生产的总类胡萝卜素产量的90%。本发明所述的"高纯的P-胡萝卜素"是指从天然菌抹生产的P-胡萝卜素的产量占由所述菌林生产的总类胡萝卜素产量的50%以上，优选的是超过由所述菌抹生产的总类胡萝卜素产量的80%,最好的是超过由所述菌林生产的总类胡萝卜素产量的90%。本发明所述的"最大生物量"是指在600nm的条件下测定生物量至少是20光密度单位，优选的是在600nm的条件下测定生物量至少是50光密度单位，最好的是在600nm的条件下测定生物量至少是100。本发明所述的"高纯的类胡萝卜素的最大浓度"是指高纯的类胡萝卜素的浓度在细胞干重基础上达到至少1毫克/克，较好的是达到至少3毫克/克细胞干重，更好的是达到至少5毫克/克细胞干重，最好的是达到至少10毫克/克细胞干重。本发明所述的"天然溶剂，，是指任何无毒的溶剂和/或国际协调会议(ICH)指南中规定的第三类溶剂。(i)从自然菌株选择和生产组成性过产类胡萝卜素的突变菌林本发明提供了一种改良自然菌抹的方法，即基于利用传统诱变技术或自发突变产生突变体，结合一系列表型检测，旨在鉴定过产类胡萝卜素，较好的是过产高纯的类胡萝卜素，最好的是过产高纯的p-胡萝卜素的菌抹。本发明中，开发了改进隔离菌抹的方法，以便最大程度地提高细胞内类胡萝卜素的浓度，和相对于其它类胡萝卜素来说，实现P-胡萝卜素的纯度最大。本发明的诱变方法是把诱变条件设置为获得低于10%的存活率的试验与促进菌抹的自发突变的试验相结合，以此方式获得经历检测后还存活的隔离的易于分别取出的菌落。本发明的诱变方法使用一系列的检测方法，基于在突变体形成菌群的视觉色彩观察和对突变体色素的组成的光度色语分析，尤其是对展示了与其亲抹有可检测的色差的突变体进行检测分析。本发明的方法中选择相对于其亲系林有改良特性的突变抹的标准是，每单位生物量或每单位液体培养基中，类胡萝卜素总量或单一类胡萝卜素尤其是P-胡萝卜素的积累量至少能增加5%,或者单一类胡萝卜素尤其是P-胡萝卜素在总类胡萝卜素中的积累比例至少能增加5%，尤其是|3-胡萝卜素在总类胡萝卜素中的比例至少能增加5%。这里描述了获得具有改进的单一类胡萝卜素尤其是P-胡萝卜素的突变体的方法，也可以将该方法用于已获得的突变体，以更进一步提高菌林的性能。本发明的诱变方法适合于改良从土壤中分离的鞘氨醇单胞菌属(SEQID:1),能自然积累类胡萝卜素。该隔离株的比生长速率为0.18^,组成性积累的类胡萝卜素浓度为1.7毫克/克细胞干重，其中f3-胡萝卜素含量为29%。19利用本发明的方法对选定的后代经过三次诱变和选择后，可获得新的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌株M63Y(SEQID:2)。将其在摇瓶培养，呈现出较高的增长率(0.20h"),并有助于特异性积累含P-胡萝卜素的较高的类胡萝卜素，其浓度为4.8毫克/克细胞干重，相对总类胡萝卜素的纯度为78%。(ii)利用选定过产菌抹、改进并控制发酵条件获取高纯类胡萝卜素的制备过程使用过产类胡萝卜素，尤其是p-胡萝卜素的天然菌株或其突变体的本发明的新方法的发酵步骤，可采用任何传统的方法，如分批发酵，流加发酵，连续发酵，有或没有细胞回收，也可以是其他任何组合或变化的方式。由于以生物量产物的形式得到最高的产率和产量的发酵条件是不同于以高纯的类胡萝卜素的形式得到最高的产率和产量的发酵条件的，因此发酵可以因目的不同而包括不同的阶段。例如，有的阶段可能以生物量浓度最大化为目标，而其他的阶段可能以高纯的类胡萝卜素的浓度最大化为目标。这些阶段可以结合成任何适当的顺序，尽管第一阶段的发酵条件以生物量浓度最大化为首选。发酵条件为使生物量浓度最大化的阶段后可以紧随发酵条件为使高纯的类胡萝卜素浓度最大化的阶段或其发酵条件与前述阶段都不同的发酵条件、但也以生物量浓度最大化为目标的阶段。发酵条件为4吏高纯的类胡萝卜素浓度最大化的阶段后可以紧随发酵条件为使生物量浓度最大化的阶段或其发酵条件与前述阶段都不同的发酵条件、但也以高纯的类胡萝卜素浓度最大化为目标的阶段。此外，在整个发酵过程中可以包括其发酵条件为在生物量和类胡萝卜素产量之间进行折中的阶段。在每个阶段^吏用的发酵模式可单独选择上述发酵方式，如分批发酵，流加发酵，连续发酵，有或没有细胞回收，也可以是其他任何组合或变化的方式。在每个所述阶段，生物反应器内的条件都可以以温度时间曲线、pH值时间曲线、溶解氧浓度时间曲线、进食率(feedingrate)、或其他任何影响培养基性能的参数的形式单独设置。当在任何阶段，发酵模式涉及营养喂养，可预先设定进食率，例如，采用恒定进给速度，或采用通过关于限定营养素需要量、以达到预期的增长率和预期的生物量/营养产量的数学公式计算得出的进给速度，或由任何精通该技术的人容易确定的任何其他预设的合适的进料速度。营养液的进食率可通过任何形式的基于控制例如但不限于pH值，溶解氧，发酵废气中的氧气和/或二氧化碳的浓度，呼吸商(respiratoryquotient),葡萄糖浓度或其他任何碳源浓度，或其任何的组合的控制回路得到触发。在任何阶段，发酵中的其他添加包括精通该技术的人公知的适当的防沫剂。在细菌细胞中高纯的类胡萝卜素的积累受以下因素影响包括但不限于，应激因子如增加一种緩慢可代谢碳源的，增加类胡萝卜素生物合成路径的前体，添加生长抑制化合物，培养液pH值的变化，温度的变化，盐度的变化，碳源浓度的变化，氮源浓度的变化，碳/氮比的变化以及溶解氧浓度的变化。上述应激因子可以单独或以任何组合形式使用。上述应激因子在发酵时间过程中可单次使用或重复使用。养分的比例能够被确定为也随微生物的生产需求和生产水平的函数。中间成分的添加应控制在适当的范围内即最小和最大浓度水平之间。21例如，葡萄糖浓度过高导致生长的抑制作用，而葡萄糖浓度过低也会导致产率下降。同理，盐浓度过高可能会导致中间物的离子强度增加，不利于培养液，而过低的盐浓度可能会必须因素的丧失培养液。此外，溶解氧浓度可能会影响羟基和非羟基类胡萝卜素之间的平衡，进而会影响生产的类胡萝卜素的纯度。本发明利用任何天然菌抹生产类胡萝卜素，尤其是高纯的类胡萝卜素，最好是高纯的P-胡萝卜素，进而包括适当的纯化步骤，用来分离生物质和后续的提^f又物以及从在发酵阶段产生的生物质中净化类胡萝卜素，尤其是高纯的类胡萝卜素，最好是高纯的(3-胡萝卜素。本发明的纯化步骤优点在于不涉及细胞分裂，而是从生物质中直接提取类胡萝卜素，尤其是高纯的类胡萝卜素，最好是高纯的P-胡萝卜素，该生物质是在利用合适的天然溶剂或合适的天然溶剂混合物的发酵步骤得到的，，再进行洗涤，然后被萃取到另一种天然溶剂或天然溶剂的混合物中，最后利用抛光步骤处理获得的提取物。/人发酵液中分离生物质可用确定的过滤操作，即可使用当前的过滤技术，或者是滤带的、旋转的、压力的、有机及无机膜过滤技术，其原或者是离心过滤技术，其原理是利用装置如离心机中生物质和液体的密度不同；或使用滗析器或类似机器，其原理是带有可能的最少量的生物质的较重的相被集中并被从液相中分离；这样使得生物质的损失降到最低。另外，这些步骤还可以与清洗步骤相配合，该清洗步骤是加入适当的洗液，例如但不限于水，盐水，或天然有机〉容剂，然后被从生物质中分离出来。虽然高纯的类胡萝卜素是在细胞内，本发明的重要的进步在于在使用微生物生产类胡萝卜素的过程中直接从生物质中提取高纯的类胡萝卜素，无需细胞分裂步骤。这样，本发明的方法，不需要从当细胞断裂释放有用的细胞碎片时产生的大块细胞成分中分离类胡萝卜素。素。本发明涉及的天然或混合的溶剂为食品级溶剂，对类胡萝卜素有较高的溶解度，允许用于医药和食品领域。所以这些溶剂能够回收和再利用。在该提取步骤后，再从提取物中分离生物质，以便从提取物中除去无效生物质和生物质残片。如前述，该步骤能在任何液/固分离操作中使用，如过滤或离心过滤或滗析。再用液液萃取进一步处理澄清的提取物，其中，疏水溶剂或疏水溶剂的混合物常用于从任何膜脂中分离高纯的类胡萝卜素，这可能是从生物质中共同萃取。因为膜脂是双极性的，而高纯的类胡萝卜素，尤其是高纯的非羟基类胡萝卜素是无极性的，前者优选分成酮/醇相，而后者优选分为疏水相中。向混合物中加入水，进一步改善不必要的化合物在混合中的分割。然后使用本领域公知技术对纯化后的高纯的类胡萝卜素进行结晶，如添加化合物到提取物中，但类胡萝卜素基本不溶解，逐渐形成晶体，随后用过滤或离心的方法获得晶体，并最后对晶体在真空下进行烘干，除去残留的溶剂。具体实施例方式本发明描述了组成性过产类胡萝卜素尤其是(3-胡萝卜素的的天然菌抹，或其突变体，以及利用廉价而又可再生的原料、改良发酵条件生产类胡萝卜素、特别是(3-胡萝卜素的方法，并从所得发酵液中纯化和隔离获得高纯度的特殊晶形的类胡萝卜素，应用于饲料、食品、化妆品和药品领域中。1.菌抹(Bacterialstrains)本发明优选使用以下属的分离菌抹分冲支牙干菌属(Mycobacterium),々I单月包菌属(Pseudomonas)，迪茨氏菌属(Dietzia),黄质菌属(Flavobacterium)，副球菌属(Paracoccus),红球菌属(Rhodococnas),芽生菌(Blastomonas),鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),短杆菌属(Brevibacterium),欧文菌属(Envinia),泛菌(Pantoea),土土裏軒菌属(Agrobacterium),副球菌属(Paracoccus),纟工色#干菌属(Erythrobacter)，黄色4干菌属(Xanthobacter),鞘脂杆菌门(Sphingobacteria),红杆菌属(Rhodobacter)，大头茶属(Gordonia),红色杆菌属(Rubrobacter),节杆菌(Arthrobacter),新鞘月旨菌属(Novosphingobium),诺卡氏菌属(Nocardia),棒状杆菌(Corynebacterium),链霉菌属(Streptomyces),月易4干菌-牛(Enterobacteriaceae),Thermobifida,肠牙干菌属(Enterobacter),4豆波单胞菌属(Brevundimonas),5文瑰弯菌属(Roseiflexus),Sphingopyxis，橙单』包菌属(Aurantimonas)，发光菌属(Photobacterium),Robiginitalea,才及i也^f干菌属(Polaribacter),Tenacibaculum,4豆小盒菌属(Parvularcula),异常球菌属(Deinococcus),绿曲挠丝状菌属(CWoroflexusgenera);尤其是属于以下属分枝杆菌属(Mycobacterium),4艮单胞菌属(Pseudomonas),迪茨氏菌属(Dietzia),黄质菌属(Flavobacterium),副3求菌属(Paracoccus),纟工J求菌属(Rhodococcus),芽生菌(Blastomonas),鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),短杆菌属(Brevibacterium),欧文菌属(Erwinia),;乏菌(Pantoea),土士裏杆菌属(Agrobacterium),副；求菌属(Paracoccus),纟工色才干菌属(Erythrobacter),黄色4亍菌属(Xanthobacter),鞘脂杆菌门(Sphingobacteria)，红杆菌属(Rhodobacter),大头茶属(Gordonia),红色杆菌属(Rubrobacter),节杆菌(Arthrobacter),新鞘月旨菌属(Novosphingobium)，诺卡氏菌属(Nocardia),棒状杆菌(Corynebacterium),链霉菌属(Streptomyces);更好的是属于以下属分枝杆菌属(Mycobacterium),假单胞菌属(Pseudomonas),迪茨氏菌属(Dietzia),黄质菌属(Flavobacterium),副球菌属(Paracoccus),红球菌属(Rhodococcus),芽生菌(Blastomonas)，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),短4干菌属(Brevibacterium)，欧文菌属(Erwinia),泛菌(Pantoea),畜'J玉求菌属(Paracoccus),红色神干菌属(Erythrobacter),黄色4干菌属(Xanthobacter),红杆菌属(Rhodobacter),大头茶属(Gordonia),新鞘月旨菌属(Novosphingobium),诺卡氏菌属(Nocardia),氺奉^1犬牙干菌(Corynebacterium);最好是属于以下属分枝杆菌属(Mycobacterium),假单胞菌属(Pseudomonas),迪茨氏菌属(Dietzia),黄质菌属(Flavobacterium),副球菌属(Paracoccus),红球菌属(RJiodococcus),芽生菌(Blastomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)尤其最优选的是属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas);在这些菌林中，从土壤中分离出来的一种具体的鞘氨醇单胞菌属的具有16sRNA基因序列SEQID1的菌株是首选的。使用本发明的诱变和选种的方法自然分离得到的菌抹也是优选的。特别是使用本发明的过产具有高特异性的P-胡萝卜素的方法的诱变和选种的方法获得的鞘氨醇单胞菌属菌株M63Y更加优选。通过本发明的诱变和选种的方法获得的改良菌株具有以下特征形态特征鞘氨醇单胞菌属菌林M63Y是革兰氏阴性，杆形，非孢子形成。生理学特征在琼脂培养基上，菌林为圓形、光滑和橘黄色菌落，菌抹M63Y能在20-30。C的温度范围下生长，最适合的生长温度为27°C,采用API20NEkit鉴定菌^^朱的其他生理特性(Biom6rieux,法国)表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>同化作用表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>化学分类特征M63Y菌林包含二氨基庚二酸(meso-Dpm)、典型的Aly型肽聚糖，主要的类异戊二烯醌类成分是辅酶QIO,占醌类的80%。表3细胞中脂肪酸的组成:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>该菌林能合成极性脂质，包括神经鞘糖脂类。类胡萝卜素中以p-胡萝卜素为主，也能检测到其他种类的类胡萝卜素，菌抹M63Y的DNA中鸟票呤+胞嘧咬含量达66.6mol%.系统进化分析法采用PCR扩增16srRNA脱氧核糖核酸重组体(SEQID:2)后直^t妄测序，能测定M63Y的大约95%的16srRNA基因序列。抽提基因组DNA，PCR介导16s脱氧核一唐核酸重组体和纯化PCR产物，对纯化的PCR产物进行测序，序列反应物加到电泳中，排列由此产生的序列数据，并与属于变形菌纲(Alphaproteobacteria)的有机体的典型的16SRNA序列相比较。将序列排成直线成对比较，计算16SrRNA基因相似值。菌抹M63YSphingomonas与鞘氨醇单胞菌属密切相关，并与这些菌种形成一个菌落。菌抹M63Y的基因序列表明与鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)oligophenolica的相似度才及高(98.5%)，产生与Sphingomonasechinoides—样的菌落(相似度为97.9°/。)。结果表明与原代的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)有98%的相似度。菌抹M63Y分别与Sphingomonasoligophenolica和Sphingomonasechinoides进行DNA-DNA杂交,DNA-DNA相似百分率分别为16°/。和3%.这些结果表明，使用本发明所述的方法获得的改良菌抹为一鞘氨醇单胞菌属的新菌株。2.生成和筛选天然菌林突变体的方法
技术领域：
：本发明提供一个天然菌林的改良方法，采用传统的诱变技术或自发突变技术，并用一系列的表型测试，鉴定过产类胡萝卜素，特别是过产高纯的类胡萝卜素，最好是过产高纯的P-胡萝卜素的菌林。2.1.菌林改良可从自然界任何地方例如但不限于土壤分离能累积类胡萝卜素的菌抹或其突变体，这些菌林可以他处(Silvaetal.,2004)所述的方式培养。采用离心过滤的方式/人选定菌抹的生长活跃的培养液中收集细胞(15000g，30s),用15mM、pH为6.5的磷酸盐緩冲液处理，緩冲液中含甲》黄酸QEMS)或亚硝基胍(NTG)，浓度在0至40吗/mL、较好的在0至20吗/mL、最好的在0至15叱/mL的范围内，，，时间小于或等于2小时，较好的是小于或等于1小时，最好的是小于或等于30分钟，在适合菌株生长的温度条件下，达到卯％以上的死亡率，最好接近990/。。经此处理的细月包用盐水洗两次，并让细胞在任一液体培养基中至少恢复3小时，尤其是最好能过夜。在适合菌抹生长的温度下和足够菌落形成的时间内，稀释上述获得的培养基，在标准的固体培养基和平板培养基上培养。未处理过的细胞样本也被展开作为参照。稀释处理后，每个平板获得少于250个菌落，优选的是每个平板少于IOO个菌落，最好是每个平板接近50个菌落。2.2.改良菌林的选择根据菌落的颜色和形状，用可见的表性分析进行第一步选择。不选与亲抹相对照的没有颜色变化的、或粘液状的菌落。颜色变化的菌落在液态培养基中成长直至发酵结束(大约72小时)，分析生物量、总的类胡萝卜素产量和e胡萝卜素产量，在600nm下测得液体培养基的混浊度和生物量浓度。离心过滤(15000g，30s)收集细胞，分析类胡萝卜素，离心沉淀物在盐水中再悬浮，然后再离心(15000g,30s)，在室温下用溶剂或溶剂混合物，提取清洗过的细胞沉淀物，可用的溶剂包括但不限于甲醇，丙酮，二氯曱烷或其组合物。离心(15000g,30s)萃取物后，用他处(Silvaetal.，2004)所述的薄层色谱法和高效液相色i普法分析类胡萝卜素含量。评价选择有改良特性的突变林的标准是每单位生物量或每单位液体培养基中，类胡萝卜素总量或单一一种类胡萝卜素的积累量至少能增加5%，尤其是P-胡萝卜素的积累量至少能增加5%,或者单一一种类胡萝卜素在总类胡萝卜素中的比例至少能增加5%,尤其是P-胡萝卜素在总类30胡萝卜素中的比例至少能增加5%。这里描述了获得具有改进的单一类胡萝卜素尤其是P-胡萝卜素的突变体的工艺，也可以将该工艺用于已获得的突变体，以更进一步提高菌抹的性能。3.使用天然菌林及其突变体、通过改良发酵的改进和控制条件及改进纯化，生产类胡萝卜素的方法
技术领域：
：本发明的另一个目的是提供使用上文中描述天然菌抹或者其变体，生产胡萝卜素，特别是充分纯的类胡萝卜素，最好是充分纯的胡萝卜素的方法。该方法包括在液体发酵培养基中培养所述菌抹中，在发酵过程中采用确定的手段，控制PH、氧溶解量以及碳源浓度；培养后进行生物质的分离；分离之后从发酵产生的生物质中提取及纯化类胡萝卜素，尤其是高纯的类胡萝卜素，最好是高纯的P-胡萝卜素。发酵可以在任何的培养基中进行，该培养基包含碳源、氮源及无机盐，碳源可以是一种或者多种，氮源也可以是一种或多种。碳源可以是单一的营养成分也可以是复合营养成分，主要包括'.l)糖类，例如但是不局限于葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖及淀粉，既可以是纯化的也可以是包含所述糖类的多种的混合物，例如但不局限于玉米浆及干酪乳清)；2)食用油，其中植物油较好，例如但是不局限于以下植物油橄榄油、大豆油、油菜籽油、棕榈油、花生油、芥花籽油；3)其他可同化碳或者能源，例如但是不局限于甘油和类脂。优选使用葡萄糖作为主要碳源，其浓度以40g/L~0g/L为宜，更适宜的浓度是20g/L0g/L,最好的浓度是10g/L0g/L。发酵步骤中使用的氮源包括有机氮源和无机氮源，例如但是不局限于大豆豆皮、大豆粉、玉米粉、酵母提取物、棉花粉、蛋白胨、酪蛋白、氨基酸、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和氢氧化铵。整个发酵过程中应该控制碳氮比，并且每个发酵阶段都有合适的碳氮比。碳氮当量比值范围优选10-20,最好的比值范围在12-15。发酵步骤中使用的无机盐包括但是不局限于磷酸盐、硫酸盐、氯化物或钼酸盐，此。其中阳离子包括但不局限于钠离子、钾离子、铵离子、4丐离子、铜离子、铁离子、锰离子、镁离子或锌离子。磷酸盐的浓度优选lg/L~10g/L，最好是2g/L4g/L;镁离子浓度可以是0.01g/L0.2g/L,但最好是0.05g/L~0.15g/L。发酵步骤应该在好气条件下进行浸没培养。温度为20。C37。C,较好温度为22°C~31°C,最好温度为24°C~28°C发酵步骤中培养基中的溶解氧应该控制在空气饱和的100%0%,优选是空气饱和的50%~0.5%,最好为空气饱和氧的30%1%。通过控制液体培养基的空气流量以及使用的涡轮机或叶轮的搅拌速度共同调节氧气溶解量。可选择的，采用氧来强化空气流量。流速控制点可以是一个恒值也可是一个随着时间变化的值。当获得期望的P-胡萝卜素积累时，氧气的浓度应该控制在空气饱和值的50%以下，优选30%以下，更好10%以下，最好在5%以下。发酵步骤中，通过添加酸和/或碱和/或碳源，将PH控制在6.0-8.0,较好是6.4-7.6较好。PH控制起点取决于培养的增长模式，但是总的来说应该在发酵1~48小时之后进4亍控制，也可在10~28小时后进行控制，或当首次发生由于培养基中碳源的吸收及消耗而引起的培养液的PH升高或者降低时进行控制。控制设定点可以是恒值或随着时间改变的值。本发明的利用天然菌抹生产类胡萝卜素，特别是充分纯的类胡萝卜素，最好是高纯的P-胡萝卜素的方法进一步包括纯化步骤，以分离生物质并随后对类胡萝卜素，尤其是高纯的类胡萝卜素，最好是高纯的P-胡萝卜素进行提取和纯化。纯化单元操作和它们的顺序可以由精通本领域的人员容易地选择。优选的，本发明的纯化步骤包括使用合适的天然溶剂或者是合适的天然溶剂的混合物，直接从发酵步骤中生成的生物质中提取类胡萝卜素，特别是高纯的类胡萝卜素，最好是充分纯的P-胡萝卜素，再进行清洗，再用另外的有机溶剂或者有机溶剂混合物进行提取，最后利用抛光步骤处理所获得的提取物从发酵液中分离生物质可用确定的过滤操作，即可使用当前的过滤技术，或者是滤带的、旋转的、压力的、有机及无机膜过滤技术，其原理是有过滤材料制成的栏止住生物质而允许不带生物质的液体通过；或者是离心过滤技术，其原理是利用在装置如离心机，滗析器或类似机器中的发酵液和生物质的密度的不同，其中，带有可能的最少量的生物质的较重的相被集中并被从液相中分离；这样使得生物质的损失降到最低。另外，这些步骤还可以与清洗步骤相配合，该清洗步骤是加入适当的洗液，例如但不限于水，盐水，或天然有机溶剂，然后被从生物质中分离出来。这种方法获得生物菌体中含有的胡萝卜素可达发酵生成类胡萝卜素的80%以上，优选超过95%，最好的可以超过99%。虽然高纯的类胡萝卜素是在细胞内，本发明的纯化步骤包括直接从根据本发明的方法选定的菌株的生物质中提取高纯的类胡萝卜素，无需事先的细胞分裂步骤。不同的有机溶剂可用于从生物质中直接提取高纯的类胡萝卜素。本发明涉及的天然或混合的溶剂为食品级溶剂，对类胡萝卜素有较高的溶解度，允许用于医药和食品领域。优选地使用酮与醇的混合物，更优选地使用丙酮和乙醇的混合物，最优选地使用丙酮和曱醇的混合物，酮醇比的范围为0/1~1/0,优选1/99/1，最好是2/77/2。提取温度一般在室温到所用溶剂的沸点之间变化。优选的提取温度为室温80。C,但是室温最好。提取时间可以是实现高纯的类胡萝卜素的溶解所需要的最短时间，一般为lslh，lmin15min较好。所用的有机溶剂或有机溶剂混合物的用量主要由以下因素决定提取温度和高纯的类胡萝卜素量与生物质的量的比值，在5ral/g~100ml/g之间。提取次数为1~3次，最好少于3次。进行下次提取时要与上次提取完毕时有一定的时间间隔。高纯的类胡萝卜素的提取率一般大于85%,较好的可以超过90%,甚至超过95%。提取完毕后，要从提取物种分离生物质，目的在于从提取物中去除无效生物质和生物质残骸。。就像先前描述的一样，这个步骤主要采用固液分离技术如过滤、离心或倾析。通过液液提取单元操作进一步处理所得到的澄清提取液，用单一疏水性剂或者疏水性溶剂的混合物将高纯的类胡萝卜素从任何膜脂中分离出来，膜脂从生物质中共同萃取得到因为膜脂类是双极性的，而高纯的类胡萝卜素，尤其高纯的非羟基类胡萝卜素是无极性的。因此前者优选分成酮/醇相，而后者优选分为疏水相中。向混合物中加入水，进一步改善不必要的化合物在混合中的分割。优选地，溶剂为但不局限于正己烷及叔丁基甲醚。用本领域技术人员公知的方法对已纯化的高纯的类胡萝卜素进行结晶处理，例如，如添加化合物到提取物中，但类胡萝卜素基本不溶解，逐渐形成晶体，随后用过滤或离心的方法获得晶体，并最后对晶体在真空下进行烘干，除去残留的溶剂。制本发明的保护范围。实施例1一种从土壤中分离的天然鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)菌林的化学诱变衍生的过产P-胡萝卜素的突变体34土壤样品采自在葡萄牙大里斯本地区(Portugal,theGreaterLisbonarea)的不同地点。将样品悬浮于水中，连续稀释后，涂在琼脂平板上，分离黄色或橘黄色菌落，连续培养4次，表型证实稳定，并且没有杂菌存在。在暗处培养一段时间，用来确认菌落产生的颜色是构成，是非光诱导的。使用API20NE试剂盒(革兰氏阴性菌非肠杆菌科试剂盒，鉴定时间24-48小时，来自Biom6rieux，法国)和16Sr認A基因序列(SEQID:l)分析法鉴定菌抹为鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。该分离株的比生长速率为0.18h",组成性积累的类胡萝卜素的浓度为1.7mg/g细胞干重，其中29%为(3-胡萝卜素。菌林的生长培养基参见Silvaetal(2004)。在指数生长期用离心法(15000g,30s)收集培养基中的细胞，，在室温下，用pH为6.5，浓度为15mM的磷酸緩冲溶液处理，磷酸緩冲溶液中包含浓度为40^LZmL的EMS,持续30分钟，处理上述的细胞，用盐水清洗两次，并且在任一标准的液态培养基中恢复培养3小时。培养液以1:107-1:108.比例稀释后，涂在50个含有固体培养基的平板上，在28。C下，培养3天。分析在色度上有视觉上可见变化的细胞，以分析总类胡萝卜素的含量和P-胡萝卜素的纯度，获得一个菌抹，被称为菌林EMSl,类胡萝卜素的积累量可达3.8mg/g细胞干重，其中24%是(3-胡萝卜素。以EMS为诱变剂，该抹可用于另一诱变周期，如上面所述。分析在色度上有视觉上可见变化的细胞，以分析总类胡萝卜素的含量和(3-胡萝卜素的纯度，获得一个菌抹，被称为菌林EMS2，类胡萝卜素的积累量可达3.3mg/g细胞干重，其中71%是(3-胡萝卜素。因此，尽管每生物单位生成的类胡萝卜素总量有微小的不同，但是突变体累积P-胡萝卜素明显较多，在与上述相同的条件下，该突变体被选定用于更进一步的诱变周期。与亲株相比，颜色改变的表型菌落共有69个。将上述每一个菌落的细胞，在与上述培养条件相同的液体培养基中培养。3天后，测定各培养物的光密度、总类胡萝卜素浓度和p-胡萝卜素浓度。通过上述测定，p-胡萝卜素的纯度是用P-胡萝卜素浓度除以总类胡萝卜素浓度得到，并且，|3-胡萝卜素的细胞含量用(3-胡萝卜素浓度除以生物量浓度得到。根据生物量浓度、(3-胡萝卜素的浓度，(3-胡萝卜素的纯度和P-胡萝卜素的细胞含量，对所有培养物进行评分(表1)，69分是每个参数中表现最好的菌株的得分，68分是每个参数中表现第二好的菌抹，等等，所有参数中表现最差的菌抹给O分，表2中给出每个突变体的分数，该分数是该突变体所有参数得分的总和。表1.用上述的诱变方法，将组成性生产类胡萝卜素的鞘脂单胞菌属菌抹在摇瓶中培养3天后，经过三次诱变周期的突变抹的表现。各参数表现最出色的突变体加下划线(OD600nm:在600nm下测定的，以光密度单位表示的生物质浓度；％B:相对于总类胡萝卜素的(3-胡萝卜素的纯度；B(mg/L):|3-胡萝卜素的浓度；B(mg/g):p-胡萝卜素的细胞含量)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>M3310.962.18.92.7124M3412.062.59.92.8161M3511.160.57.92.469M3614.059.99.92.4119M3712.859.110.32.7126M3811.858.59.42.694M3915.061.511.22.5199M4011.959.59.22.692M4114.060.09.52.2100M4214.162.111.22.6199M4314.159.99.72.3117M4414.161.610.22.4151M4514.962.010.52.4186M4614.162.37.41.891M4713.961.29.62.3120M4812.361.78.32.278M4913.561.19.02.283M5013.862.69.62,3137M5114.363.110.72.5202M5214.659.712.32.8199M5314.361.811.02.6192M5414.163.711.72.8221M5514.164.811.82.8228M5614.863.011.52.6222M5714.561.512.02.7209M5815.061.712.02.7221M5913.863.811.82.8218M6014.160.410.52.515038<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>EMS2菌抹相关的数据与以上这些报告的不同，仅因为上述菌株是从在液体培养基中培养3天，而不是从平板上取的菌落。M63菌抹的产量总体结果最好，并且，培养3天后的生物量浓度和卩-胡萝卜素浓度分数也最高，它产生的主要改进优于分离菌，例如，生物量增加23%,总类胡萝卜素产量增加37%,(3-胡萝卜素的细胞含量增加12.5%，并且(3-胡萝卜素的纯度略有升高。实施例2-筛选自发过产p-胡萝卜素的突变体不断地重复平板培养M63细胞(实施例1中所得)，直到能看到明显的表型变化，例如，形成的菌落的颜色。原始的菌落为黄色，经不断的平板再培养后，菌落为深橙橘色，即可判断是M63Y。在与上述相同的条件下，M63和M63Y细胞在与实施例1相同的液体培养基中培养5天，定期取样，并分析光密度、总类胡萝卜素和(3-胡萝卜素浓度。通过上述测定，p-胡萝卜素的纯度是用P-胡萝卜素浓度除以总类胡萝卜素浓度得到，并且，卩-胡萝卜素的细胞含量用(3-胡萝卜素浓度除以生物量浓度得到。在培养过程中每一个时间点的这些参数的最大值都记载在表3中。表3.通过表型筛选将菌抹M63经连续再培养，获得的M63Y表现。(OD600nm:在600nm下测定的，以光密度单位表示的生物质浓度；％B相对于总类胡萝卜素的p-胡萝卜素的纯度；B(mg/L):p-胡萝卜素的浓度；B(mg/g):p-胡萝卜素的细胞含量)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>釆用如上文所描述的本发明突变和筛选的方法，从菌林M63获得的突变抹M63Y，与其亲系4朱M63相比，能增强P-胡萝卜素的纯度(相当于类胡萝卜素的78。/。)，能提高细胞内p-胡萝卜素的产量。细胞的颜色从橙色到黄色，能说明细胞中P-胡萝卜素相对于红色的类胡萝卜素如番茄红素的量在增加。进行菌林M63Y的16SrRNA基因序列分析(序列ID:2)，与欧洲分子生物学实验室数据库(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)或核糖体凄t据库计划(RibosomalDatabaseProject)的数据对比，得到的结果是M63Y菌林是鞘脂单胞菌属的一个新种。实施例3-溶解氧对p-胡萝卜素产量的影响在摇瓶中过夜培养M63Y细胞(来自实施例2)，摇瓶内包含75ml实施例1所述的液态培养基，使用定轨振荡器(200rpm,27。C)。将这些培养物接种到包含2L培养基(葡萄糖，10g/L;酵母提取物10g/L;10g/L甘油)的生物反应器。所有的培养基在恒定pH(6.75)下，并在不同的定数溶氧浓度下(氧饱和度与大气中的空气浓度平衡，分別为。/。DO:20。/。，10%，5%and2%)。表4不同溶氧浓度下培养M63Y得到的生物反应器中(3-胡萝卜素产量(OD600nm:在600nm下测定的，以光密度单位表示的生物质浓度；%B:相对于总类胡萝卜素的(3-胡萝卜素的纯度；B(mg/L):(3-胡萝卜素的浓度；B(mg/g):(3-胡萝卜素的细胞含量；TC(mg/L):总的类胡萝卜素浓度；。/。DO,溶氧浓度占氧饱和的百分比)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表4表明在低的溶氧浓度下易于积累(3-胡萝卜素。这可以用(3-胡萝卜素是非羟基类胡萝卜素的事实来说明。在有氧的条件时，在胡萝卜素生成路径的下游，p-胡萝卜素能够被鞋化酶的活性转换为羟基化合物。实施例4-应力诱发下(3-胡萝卜素的生产实施例4a-分批培养在摇瓶中过夜培养M63Y细胞(来自实施例2)，摇瓶内包含乃ml实施例1所述的液态培养基，使用定轨振荡器(200rpm,27。C)。将这些培养物接种到包含2L培养基(葡萄糖，10g/L;酵母提取物10g/L;10gZL甘油)的生物反应器。所有的培养物在2%的溶氧浓度下培养。在培养过程中，3个发酵液中的2个，在不同时间点pH增加到7.40。表5在菌抹M63Y的发酵过程中pH值提高对生物反应器中(3-胡萝卜素产量的影响。(OD600nm:在600nm下测定的，以光密度单位表示的生物质浓度；％B:相对于总类胡萝卜素的卩-胡萝卜素的纟屯度；B(mg/L):(3-胡萝卜素的浓度；B(mg/g):(3-胡萝卜素的细胞含量；TC(mg/L):总的类胡萝卜素浓度)表7<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表5说明在发酵过程中提高pH有利于p-胡萝卜素的细胞浓度的增加。在两个有pH提高的发酵液中得到的最终光密度低于没有提高pH值的发酵液中得到的最终光密度。pH增加越快的，其得到的光密度值最低，表明增加pH给细胞强加个应激。一般认为(3-胡萝卜素和类胡萝卜素在细胞中是应激反应机制，乂人而一皮识别。表5说明(3-胡萝卜素的细胞浓度能在pH降低的胁迫的条件下提高。实施例4b-加料分批培养发酵分为三阶段第一阶段，在pH6.50下，在2L的菌种生长培养基中分批发酵，14.5小时，其后，pH提高至7.30;发酵27个小时后，在恒定的加液速率下，在培养物中加入200ml含40g/L葡萄糖的生长培养基，维持葡萄糖在限制浓度。导致的结果是生物量的光密度为15么总的类胡萝卜素为47.7mg/L，相对总的类胡萝卜素的P-胡萝卜素的纯度为91.6%,并且，(3-胡萝卜素的细胞浓度为11.4mg/g。参考文献V.B6hm,N丄.Puspitasari-Nienaber,M,G.Ferruzzi,S.J.Schwartz(2002)Troloxequivalentantioxidantcapacityofdifferentgeometricalisomersofa-carotene,b-carotene,lycopene，andzeaxanthin.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,50:221—226.M.A.Borowitzka(1990)ThemasscultureofDunaliellasalina.In:Technicalresourcepapers-Regionalworkshoponthecultureandutilizationofseaweeds-volumeII,FoodandAgricultureOrganization.P.Buzzini(2004)AnoptimizationstudyofcarotenoidproductionbyRhodotorulaglutinisDBVPG3853fromsubstratescontainingconcentratedrectifiedgrapemustasthesolecarbohydratesource.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,24:41-45.A.Ciegler(1965)Microbialcarotenogenesis.Adv.Appl.Microbiol.7:1-34.H丄.David(1974a)Biogenesisofbeta-caroteneinMycobacteriumkansasii,JournalofBacteriology,119:527-533.ELL.David(1974b)CarotenoidpigmentsofMycobacteriumkansasii.ApplMicrobiol,28:696-699.M.A.Ingmham,C.A.Baumann(1933)TherelationofmicroorganismstocarotenoidsandvitaminA-I.Theoccurrenceofcaroteneinbacteria,JournalofBacteriology,28:31-40.E.A.Iturriaga,T.Papp,J.,Breum，J.,Amau,A.R,Eslava(2005)StrainandCultureConditionsImprovementfor(3-CaroteneProductionwithMucor.MethodsinBiotechnology,Vol.18:MicrobialProcessesandProducts,pp.199-216.Ed.J.L.Barredo，HumanaPressInc.,Totowa,N丄K.S.Kang,G.T.Veeder,RJ.Mirrasoul,T.Kaneko,I.W.Cottrell(1982)Agar-likepolysaccharideproducedbyapseudomonasspecies:productionandbasicproperties.Appl.Environ.Microbiol"43:1086-1091.S,-W.Kim，J,B.Kim,W.-H.Jung,J,H.Kim,J,K.Jung(2006)Over-productionofbeta-carotene'frommetabolicallyengineeredEscherichiacoli，BiotechnologyLetters,28:897—904.K.N.C.Murthy，A.Vanitha，丄Rajesha，M.M.Swamy,RR.Sowmya，G.A.Ravishankar(2005)InvivoantioxidantactivityofcarotenoidsfromDimaliellasalina—agreenmicroalga.LifeSciences,76:1381-1390.A.D.Schmidt,T.Heinekamp,M.Matuschek,B.Liebmann，C.Bollschweiler,A.A.Brakhage(2005)Analysisofmating-dependenttranscriptionofBlakesleatrisporacarotenoidbiosynthesisgenescarBandcarRAbyquantitativereal-timePCR.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,67:549-555.A.Schieber，R.Carle(2005)Occurrenceofcarotenoidcis-isomersinfood-Technological,analytical,andnutritionalimplications.TrendsinFoodScience&Technology,16:416-422.C.Silva,J.M.S.Cabral,F.vanKeulen(2004)Isolationofa(3-caroteneover-producingsolibacterium,Sphingomonassp"BiotechnologyLetters,26:257-262.K.-J.Yeum,R.M.Russell(2002)Carotenoidbioavailabilityandbioconversion.AnnualReviewofNutrition,22:483-504.权利要求1.一种使用过产类胡萝卜素的天然菌株或其突变体制备高纯度类胡萝卜素的方法，其特征在于，包括a)包括诱导选定的过产类胡萝卜素的天然菌株或其变变体以及筛选能提高总类胡萝卜素积累量或单一类胡萝卜素相对总类胡萝卜素的积累比例的突变株；b)培养所述菌株，发酵过程中不需要进行任何物理或化学的产生胡萝卜素的诱导，菌株在可控的生物反应器中采用液体培养，pH控制在6.0-8.0的范围内，温度在22℃-29℃的范围内，溶氧范围在50％-1％饱和度范围内，在培养基中添加其浓度操持低于40g/L的可再生碳源，在培养基中，相应数量的氮源以及镁和磷源，在不破坏细胞的情况下，提取和纯化生物质内积累的类胡萝卜素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能组成性生产类胡萝卜素的天然菌抹或其突变体是由自然界中任何来源优选土壤中分离得到的，优选属于以下菌属分枝杆菌,假单胞菌属,迪茨氏菌属,黄质菌属,副球菌属，红球菌属,芽生菌,鞘氨醇单胞菌属,短杆菌属,欧文菌属,泛菌，土壤杆菌属,副球菌属,红色杆菌属，黄色杆菌属,鞘脂杆菌门，红杆菌属，大头茶属，红色杆菌属,节杆菌属，新鞘脂菌属，诺卡氏菌属,棒状杆菌,链霉菌属,肠杆菌科，Thermobifida,肠杆菌属，短波单胞菌属，玫瑰弯菌属，Sphingopyxis,橙单胞菌属，发光菌属，Robiginitalea,极地杆菌属，Tenacibaculum,短小盒菌属,异常球菌属,绿曲挠丝状菌属；优选属于以下属分枝杆菌，假单胞菌属,迪茨氏菌属,黄质菌属,副球菌属，红球菌属,芽生菌,鞘氨醇单胞菌属，短杆菌属,欧文菌属,泛菌,土壤杆菌属，副球菌属，红色杆菌属,黄色杆菌属,鞘脂杆菌门,红杆菌属，大头茶属,红色杆菌属，节杆菌,新鞘脂菌属,诺卡氏菌属,棒状杆菌,链霉菌属；更好是属于以下属分枝杆菌属，假单胞菌属，迪茨氏菌属，黄质菌属,副球菌属，红球菌属,芽生菌，鞘氨醇单胞菌属，短杆菌属，欧文菌属，泛菌，副球菌属，红色杆菌属，黄色杆菌属，红杆菌属,大头茶属，新鞘脂菌属，诺卡氏菌属,棒状杆菌；最好是属于以下属分枝杆菌属，假单胞菌属，迪茨氏菌属，黄质菌属，副球菌属，红球菌属,芽生菌和鞘氨醇单胞菌属；尤其最优选的是属于鞘氨醇单胞菌属的菌株；特别是一种属于鞘氨醇单胞菌属的，其DNA碱基序列的16sribossomal核糖核酸位上大部分染色体的碱基序列与SEQIDN°l碱基序列充分一致的菌抹。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由自然界中任何来源优选土壤中分离得到的能组成性生产类胡萝卜素的天然菌株的或其突变体的突变体的筛选，以提高总类胡萝卜素积累或单一类胡萝卜素相对总类胡萝卜素的积累比例，包括包括选择突变林，其是在至少一种诱变剂的作用下生成的，所述诱变剂优选紫外线辐射、甲磺酸盐或亚硝基胍，最好是曱磺酸盐或亚硝基胍，与亲林相比每单位生物量或每单位培养液中总的类胡萝卜素或单一一类种胡萝卜素，尤其是卜胡萝卜素的积累量能多5%，或与亲系抹相比，相对于总类胡萝卜素来说单一一种类胡萝卜素，尤其是P-胡萝卜素的积累比例至少增加5%。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，用权利要求3所述的突变体的筛选方法获得的鞘氨醇单胞菌属菌抹为M63Y，其序列为SEQIDN02。5.根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于，所选择菌抹在液体培养基中发酵，发酵温度在24。C-28。C范围内，最好在24。C-28。C范围内。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中培养基中葡萄糖的浓度保持在40g/L~0g/L之间,优选其浓度保持在20g/L0g/L之间,最好是浓度保持在10g/L0g/L。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在培养基中碳氮比最好在12-15当量。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在培养基中磷酸盐浓度保持在lg/L10g/L范围内，最好是在2g/L4g/L范围内。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中，在培养基中4美的浓度保持在0.01g/L0.15g/L范围内，最好在0.05g/L~0.15g/L范围内。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中，培养基中溶解氧控制在50%-1%空气饱和度范围内。11.根据权利要求IO所述的方法，其特征在于，包括这些阶段其中溶氧浓度控制在低于10。/。空气饱和度范围，尤其是低于5。/。空气饱和度范围，最好是低于2%空气饱和度范围。12.才艮据4又利要求5所述的方法，其特征在于，通过添加酸和或石威和或碳源控制培养基的pH值，尤其是控制pH值在6.0-8.0范围内，最好是控制pH值在6.4-7.6范围内。13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当在600nm下，检测生物质的光密度不低于20,优选不低于50，最好是不低于100时，或者当高纯的类胡萝卜素的浓度达到3mg/g细胞干重，优选达到5mg/g细胞干重，最好达到10mg/g细胞干重时，或者当天然菌抹生产的高纯的类胡萝卜素相对于该菌林生产的总类胡萝卜素的比例高于50%,优选是高于80%,最好是高于90%时，通过使用如过滤、离心或倾析处理从发酵步骤回收生物质。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，从发酵过程中回收生物质与用适当的溶剂，例如但不限于水、盐水，或天然有机溶剂的清洗步骤相配合。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，直接从生物质中提取高纯的类胡萝卜素，而没有任何事先的破坏细胞的步骤。16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，釆用酮醇混合物从生物质中直接-提取高纯的类胡萝卜素，酮醇混合物优选丙酮和乙醇的混合物，酮醇比的范围为0/11/0,优选1/9~9/1,最好为2/77Z2。17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从废生物质中分离的富含类胡萝卜素的提取物，和采用液-液萃取的方法对其进一步处理，其中使用一种疏水溶剂或疏水溶剂的混合物，例如但不限于己烷与叔丁基曱醚作为萃取剂。18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使纯化后的高纯的类胡萝卜素结晶。19.根据权利要求1-18所述的生产高纯度类胡萝卜素的方法的用途，其特征在于，用于生产充分纯的类胡萝卜素，优选高纯的P-胡萝卜素，纯度为96%-98%。20.根据权利要求1-3所述的生产高纯度类胡萝卜素的方法的用途，其特征在于，生产过产类胡萝卜素尤其是过产P-胡萝卜素的突变菌抹，，包括但不限于鞘氨醇单胞菌属的M63Y、基因序列为SEQ.IDn。2的菌抹。21.根据权利要求3所述方法篩选突变林而得到的鞘氨醇单胞菌属菌抹M63Y,其特征在于，其基因序列为SEQIDN。2,为革兰氏阴性菌，杆形，非孢子形成，在琼脂培养基上为圆形，光滑、橙色菌落，可在20。C30。C温度范围内生长，最适生长温度为27。C，含有二胺基庚二酸(meso-Dpm)、典型的A1y型肽聚糖、含有为主要的类异戊二烯醌类成分的辅酶Q10和主要脂肪酸18:1w7c,能产生极性脂质，包括神经鞘氨糖脂，和胡萝卜素类，主要是(3-胡萝卜素，菌林M63Y的DNA中鸟嘌呤+胞嘧啶含量为66.6mol%,是鞘氨醇单胞菌属的一种新菌林。22.根据上述权利要求所述的鞘氨醇单胞菌属菌抹M63Y的用途，其特征在于，用在生产类胡萝卜素，尤其是P-胡萝卜素。全文摘要本发明描述了一种类胡萝卜素的生产方法，其通过改进组成性过产类胡萝卜素的选定菌株或其突变体的发酵条件，净化和分离出一种具体的结晶类胡萝卜素，优选β-胡萝卜素，用于饲料、食品、化妆品和药品领域。本发明还描述了一种从天然菌株获取、组成性过产类胡萝卜素的突变株的方法，允许选用类胡萝卜素含量高的和实现具体的类胡萝卜素的突变株。此外本发明还描述了获取突变株的方法用于所获得的突变体进行进一步的改进的用途。本发明还描述了上述菌株及其改进的发酵条件，来获取高浓度的类胡萝卜素和具有特异性的类胡萝卜素，并进一步披露无细胞破碎的纯化步骤，从生物质中提取类胡萝卜素。文档编号C12P23/00GK101680015SQ200780052896公开日2010年3月24日申请日期2007年3月8日优先权日2007年3月8日发明者卡罗拉斯·安娜·露西娅,文·科伊伦·费雷德里克,洛佩斯·布里托·马法尔达,萨默·费雷拉·布鲁诺申请人:比奥特伦德生物技术创新工程股份公司