专利名称：橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素的提取方法，特别是一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法。
背景技术：
大白菜[Brassicacampestris ssp.pekinensis (Lour.)01sson]是中国最主要的蔬菜，产量和面积均居各类蔬菜之首，普通大白菜富含Vc、矿质元素钾、钙、镁、锌等。橙色大白菜中除了具有普通大白菜的营养成分外，还含有多酚、类胡萝卜素等抗氧化物质[1]。类胡萝卜素是构成植物叶、花和果实颜色的重要成分之一 [2]，只能由植物或微生物合成，是人体必需的营养成分。在植物中，类胡萝卜素可以协助吸收光能，防止光氧化产生的破坏作用；在动物体内，类胡萝卜素具有清除自由基、延缓衰老、保护眼睛、预防肿瘤、血栓等功能[3_6]。因此，类胡萝卜素的种类和含量是评估水果和蔬菜品质的重要参数。研究类胡萝卜素种类与含量，对了解大白菜种质资源保健价值、改善营养品质，保障人民健康具有重要意义。类胡萝卜素的提取方法主要有超临界CO2萃取方法[7]、超声波法[8]、酶法[9]、微波法[1°_11]和有机溶剂提取方法，但没有任何一种方法是适合所有材料的。根据申请人所作的资料检索，尚未见有关大白菜中类胡萝卜素的最佳提取工艺报道[12]。以下是申请人检索的相关参考文献:[l]Mitsuru ff,Keiichi M,Jun A.Carotenoid pigment composition,polyphenolcontent， and antioxidant activities of extracts from orange-colored Chinesecabbage[J].LWT-Food Science and Technology，2011，44 (5):1971_19750[2]陈鹏飞，刘栓桃，张志刚等，大白菜的类胡萝卜素种类鉴定[J].中国农学通报，2011,27(19):137-143。[3]李娟，橙色大白菜类胡萝卜素和黄酮提取测定方法及其积累规律的研究[D].陕西.杨凌:西北农林科技大学，2007。[4]尹晴红，谢一芝，陈明等，银杏废叶中类胡萝卜素的提取[J].金陵科技学院学报，2005，21 (3):69-72。[5]刘云，王保健，林亲雄等，油菜籽中天然类胡萝卜素的提取工艺研究[J].食品工业科技，2009，30 (2):234-236。[6]张金云，武红霞，邢姗姗等，杧果类胡萝卜素提取条件研究[J].中国南方果树，2010，39 (4):14-19。[7]郝磊，张坤生，超临界CO2萃取玉米蛋白粉中类胡萝卜素的研究[J].食品研究与开发，2007，28 (2):57-60。[8]熊犍，冯凌凌，叶君，超声辐射对玉米类胡萝卜素提取的影响[J].华南理工大学学报:自然科学版，2006，34(3):82-85。[9]Kanokphorn S,Piyaporn P,Nisa P,et al.Application of lipase treatmenton carotenoids extraction from Chili (Capsicum annuum L.)[J].African Journal ofMicrobiology Research,2011,5 (28):5057_5061。[10]陶能国，张继红，张妙玲等，微波法提取枸杞中类胡萝卜素的工艺研究[J].湘潭大学自然科学学报，2008，30 (2): 48-51。[ll]Tong Y, Gao, L J, Xiao, G M, et al.Microwave pretreatment-assistedethanol extraction of chlorophylls from spirulina platensis[J].Journal of FoodProcess Engineering,2012,35 (5):792_799。[12]姬小明，邵惠芳，刘金霞等，类胡萝卜素的提取及分离方法研究进展[J].河南科学，2008，26 (11):1337-1339。[13]朱广廉，钟诲文，张爱琴，植物生理学实验[M].北京:北京大学出版社，1990:51-54。[14]李雪雁，陈海强，丁婷婷等，韭菜中提取类胡萝卜素[J].食品研究与开发，2009,30 (10):86-88。[15]韦进宝，从黄姜中提取类胡萝卜素[J].技术与市场，2009，16 (I)。[16]Kumar M, Moon U R, Mitra A.Rapid separation of carotenes andevaluation of their in vitro antioxidant properties from ripened fruit waste ofAreca catechu - A plantation crop of agro-1ndustrial importance[J].1ndustrialCrops and Products,40 (2012):204 - 209。
发明内容
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本发明的目的在于，提供一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，该方法以橙色大白菜球叶为材料，探讨有机溶剂提取法的最佳条件，以期得到有机溶剂提取大白菜的最佳工艺条件，为测定橙色大白菜中类胡萝卜素含量及其主要成分提供重要的科学依据。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案:一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，其特征在于，具体包括下列步骤:I)以乙醇和丙酮以体积比1:1配制提取溶剂，在料液比(g/mL)为1:20，温度60°C条件下，浸提50min，得到橙色大白菜类胡萝卜素提取液；2)测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素，以叶黄素、番茄红素、￠-胡萝卜素为标样，利用分光光度法进行类胡萝卜素总量测定；3)测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素组分，以叶黄素、番茄红素、￠-胡萝卜素为标样，建立叶黄素、番茄红素、￠-胡萝卜素测定的线性方程，采用RP-HPLC法进行类胡萝卜素主要组分测定；其中:叶黄素的线性方程为:Y=5500x+6661.8，线性范围(g/mL)=0.05 100，相关系数为0.9994 ；番茄红素的线性方程为:Y=55919x-16632，线性范围(g/mL) =0.05 100，相关系数为 0.9997 ；^ -胡萝卜素的线性方程为:Y=168727x-64974，线性范围(g/mL) =0.05 100，相关系数为0.9991 ；
RP-HPLC法测定过程所选择的流动相由甲醇和乙腈组成，即甲醇:乙腈=55:45，流速1.00mL/min,柱温30°C，检测波长440nm，进样量10 μ L。本发明的橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，通过单因素试验和L12 (43)正交试验筛选出有机溶剂的最佳提取条件，利用分光光度法对类胡萝卜素的总量进行测定，利用 RP-HPLC (reverse phase high-performance liquid chromatography)法进行类古月萝卜素主要成分的测定。结果表明，橙色叶球大白菜类胡萝卜素提取的最佳工艺是以乙醇和丙酮组成的提取溶剂，在料液比(g/mL)为1:20，温度60°C条件下，浸提50min。在此条件下，金冠I号大白菜叶球中类胡萝卜素得率最高，为3.304mg/100g.FW。以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，利用分光光度法和RP-HPLC法进行类胡萝卜素测定，两种方法测定橙色大白菜类胡萝卜素含量的相关系数达到0.973。建立了大白菜类胡萝卜素的RP-HPLC测定法，其流动相为甲醇:乙腈=55:45，流速1.00mL/min,柱温30°C，检测波长440nm，进样量10 μ L。建立了 RP-HPLC法测定叶黄素、番茄红素、β_胡萝卜素3种色素的线性方程。得到的橙色大白菜类胡萝卜素平均总含量为3.285mg/100g.FW，是普通大白菜中的类胡萝卜素含量的2.467倍，橙色大白菜类胡萝
卜素的主要成分是叶黄素、番茄红素和胡萝卜素。
图1是不同提取温度对金冠I号球叶类胡萝卜素得率的影响图；图2是不同有机溶剂对金冠I号类胡萝卜素得率的影响图；图中的数字表示的溶剂是:1、乙醇,2、丙酮，3、异丙醇，4、四氢呋喃，5、乙醇和丙酮混合溶剂(乙醇:丙酮=1:1),
6、乙醇和丙酮混合溶剂(乙醇:丙酮=1:2);7:乙醇和丙酮混合溶剂(乙醇:丙酮=2:1)，8、四氢呋喃和丙酮混合溶剂(四氢呋喃:丙酮=1:1)。图3是提取时间对金冠I号类胡萝卜素得率的影响图；图4是萃取次数对金冠I号类胡萝卜素得率的影响图；图5是类胡萝卜素混标色谱图；图中的数字1、2、3的峰分别代表叶黄素、番茄红素、β -胡萝卜素；图6是普通大白菜秦白2号球叶的色谱7是橙色大白菜金冠2号功能外叶的色谱图；图8是橙色大白菜金冠2号球叶的色谱图。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式需要说明的是，在以下的实施例中，与本申请相关的文献会被引用。1、材料种子材料选用橙色大白菜金冠I号(张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠I号”的选育[J].北方园艺,2005,04:67-68+97)、金冠2号(张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠2号”的选育[J],西北农业学报，2007，01:204_206)、11J11(原名01S915，为金冠2号大白菜的亲本，公开于《西北农业学报》2007，01期、205页，张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠2号”的选育[J]:204-206);普通大白菜秦白2号(柯桂兰,赵利民.秦白2号大白菜的选育[J].陕西农业科学，1990,04:3_4)、秋早60(张鲁刚，惠麦侠，张明科.“秋早55”和“秋早60”大白菜特征特性与栽培技术[J].西北园艺(蔬菜)，2012，02:50_51+66)、11J15 (原名92S24，，公开于《中国蔬菜》，2010，14期、35页第16行，牛娜，郑晨光，张鲁刚，胥宇建，张立志，付文婷.大白菜裂球性状的遗传与RAH)标记[J].44-48)、12S1320 (为黄芽菜选系，韦顺恋，宋敏霞.浙江黄芽菜的收集和鉴定[J].中国蔬菜，1994，01:29-32)，是本领域公知的品种，均由西北农林科技大学园艺学院白菜研究室提供。仪器选用本领域常规的仪器，包括分光光度计SHIMADZU UV-1700，数控超声波清洗器KQ-500DE，高压液相色谱仪岛津2010AH，旋转蒸发器RE-52AA，SHZ-1II型循环水真空栗。试剂为色谱级叶黄素标准品、色谱级番茄红素标准品、色谱级P胡萝卜素标准品、色谱级甲醇、色谱级乙腈、超纯水；分析纯无水乙醇、甲醇、丙酮、碳酸钙、BHT (2，6_ 二叔丁基对甲苯酚)。2、方法2.1材料种植2011年7月20日将金冠I号、金冠2号、11J11、秦白2号、秋早60、11J15、12S1320
种子在西北农林科技大学杨凌蔬菜试验站育苗，常规管理，于2011年8月10日定值。试验地前茬一致，地势平坦，土壤质地、墒情和肥力均等。栽培后按照常规的田间栽培措施进行管理。2.2试验设计以金冠I号为试材进行类胡萝卜素提取方法试验，大白菜进入结球期采样，取叶球由外数第6-8片叶及球心部分于-80°C保存。采用单因素试验和L12 (43)正交试验设计。单因素为:提取温度、料液比、提取时间、有机溶剂体积比和提取次数。正交试验4个因素及其水平是:提取温度(A)，15°C、30°C、60°C ;提取时间(B)，30min、50min、70min ;有机溶剂乙醇:丙酮体积比(C)，1:1、1:2、2:1 ;料液比(D)，l:10、1:15、1:20。测定时，取_80°C下保存的新鲜样品2g，放于研钵中，加入适量石英砂、CaCO3、适量浓度为0.1%的BHT (2,6- 二叔丁基对甲苯酚)溶液，再加入适量有机溶剂进行研磨，提取类胡萝卜素，测定总含量。2.3分光光度法测定类胡萝卜素含量按照朱广廉的方法[13]，在440nm、645nm、663nm三个波段下测出样品的吸光值,按照公式Ck=4.7A440-5.454A645-2.1654A663求得白菜样品中的类胡萝卜素总得率。2.4RP-HPLC法测定类胡萝卜素含量色谱条件:Nova_pak C18柱(4.6mmX 15cm);流动相:由甲醇和乙腈组成，即甲醇:乙腈=55:45 ;流速:1.00mL/min ;柱温:30°C ;检测波长:440nm ;进样量=IOuL0标准曲线制作:分别精确 配制I U g/mL的叶黄素溶液、I U g/mL的番茄红素溶液和I U g/mL的P -胡萝卜素溶液，超滤后上机。进样量分别为4 ii L>8 u LUOii L>12 u L>16 u L、20 yL，经数据系统自动处理，折算为相同体积的不同样液质量浓度，并以样液浓度为X轴，峰面积为Y轴分别制作出叶黄素、番茄红素、￠-胡萝卜素标准曲线(计算回归方程)。
样品测定:制备好的样液10 μ L注入高效液相色谱，在前述测定条件下记录叶黄素、番茄红素、胡萝卜素的峰面积，依保留时间分别通过标准曲线查得样液中的各组分质量浓度，用外标法计算各组分含量。2.5数据处理试验数据采用EXCEL和DPS软件处理分析。3结果与分析3.1有机溶剂提取法的单因素优化3.1.1提取温度由图1可知，橙色大白菜金冠I号球叶样品，用乙醇:丙酮=1:1作提取剂，在料液比1: 15，提取时间30min的条件下，类胡萝卜素得率在15°C _60°C之间呈现缓慢的直线上升，在60°C时达到最大，60°C -70°C缓慢下降，70°C _90°C呈直线下降。3.1.2有机溶剂的确定称取金冠I号(整株白菜橙色叶球去除主叶脉，将叶片切碎混匀)，各2g，料液比为1: 15，提取温度15°C，提取时间60min，分别用丙酮、四氢呋喃、异丙醇、甲醇、乙醇、乙醇:丙酮(1:1)、乙醇:丙酮(1:2)、乙醇:丙酮(2:1)、四氢呋喃:丙酮(1:1)、正己烷:丙酮:乙醇(2:1:1)、石油醚、三氯甲烷、正己烷等13种提取液提取，结果发现用石油醚、三氯甲烷、正己烷提取时，提取物贴在研钵壁上，说明类胡萝卜素不溶于这类有机溶剂，不易被提取。用正己烷、丙酮和乙醇混合溶剂(正己烷:丙酮:乙醇=2:1:1)提取时，溶液分成上下两层，大部分类胡萝素溶于上层溶液，但仍有小部分溶解在下层溶液中，萃取不完全。由图2可知，有机溶剂5 (乙醇:丙酮=1:1)的提取效果最好。3.1.3 料液比取金冠I号叶球部分鲜样，按料液比(g/mL)分别为1:10、1:15、1:20、1:25、I:30,向锥形瓶中加入乙醇和丙酮的混合溶剂(乙醇:丙酮=1:1)在15°C下避光浸提Ih0结果表明，料液比(g/mL)从I:10到I:20时，类胡萝卜素得率由1.476mg/100g.Fff上升到2.473mg/100g.Fff,料液比大于1:20后，类胡萝卜素得率趋于平缓，分别为
2.356mg/100g.Fff,2.322mg/100g.FW。后三组料液比处理间差异不显著，从节省有机溶剂考虑，选择料液比(g/mL) 1:20为宜。3.1.4提取时间用30mL 乙醇:丙酮(1:1)在 60°C下分别提取 30min、50min、60min、70min、80min、90min。结果表明，随着提取时间增加，类胡萝卜素的得率逐渐增加，提取70min时得率最闻，因此提取时间以70min最好(图3)。3.1.5提取次数用30mL的乙醇和丙酮混合溶剂(乙醇:丙酮=1:1)在60°C下，每次提取时间lh，每次加入提取溶剂30mL，紫外分光光度计下测金冠I号叶片提取液中叶黄素、番茄红素、胡萝卜素的吸光值如图4所示。由图4可知，第一次萃取，叶黄素在λ = 443nm下，紫外分光光度计测得的吸光值是0.500 ;第二次萃取后，吸光值为0.048 ;第三次萃取后，吸光值为0.010,可见萃取两次即可把98.21%的叶黄素提取出来。随着萃取次数的增多，提取液由最初的黄色渐渐过渡到无色透明状。
3.2有机溶剂提取影响因素的正交优化从以上单因素试验可以看出，白菜类胡萝卜素提取得率受到提取时间、有机溶剂、提取温度、料液比这4个因素的影响较大，为了全面考察这4个因素的作用大小和优化组合，设计了如表I所示的4因素3水平的正交试验。表1:正交试验级差及显著性分析
权利要求
1.一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，其特征在于，具体包括下列步骤: 1)以乙醇和丙酮以体积比1:1配制提取溶剂，在料液比(g/mL)为1:20，温度60°C条件下，浸提50min，得到橙色大白菜类胡萝卜素提取液； 2)测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素，以叶黄素、番茄红素、胡萝卜素为标样，利用分光光度法进行类胡萝卜素总量测定； 3)测定橙色大白菜提取液中类胡萝卜素组分，以叶黄素、番茄红素、胡萝卜素为标样，建立叶黄素、番茄红素、β_胡萝卜素测定的线性方程，采用RP-HPLC法进行类胡萝卜素主要组分测定； 其中:叶黄素的线性方程为:Υ=5500χ+6661.8，线性范围(g/mL)=0.05 100，相关系数为 0.9994 ； 番茄红素的线性方程为:Y=55919x-16632，线性范围(g/mL) =0.05 100，相关系数为0.9997 ； β-胡萝卜素的线性方程为:Υ=168727χ-64974，线性范围(g/mL)=0.05 100，相关系数为 0.9991 ； RP-HPLC法测定过程所选择的流动相由甲醇和乙腈组成，即甲醇:乙腈=55:45，流速1.00mL/min,柱温30°C,检测波长440nm,进样量10 μ L。
全文摘要
本发明公开了一种橙色大白菜类胡萝卜素提取与测定方法，以乙醇和丙酮以体积比11配制提取溶剂，在料液比(g/mL)为120，温度60℃条件下，浸提50min，提取效果最好；利用分光光度法进行类胡萝卜素总量测定；利用RP-HPLC法进行类胡萝卜素组分测定，建立了大白菜类胡萝卜素的RP-HPLC测定法，测定过程选择的流动相由甲醇和乙腈组成，流速1.00mL/min，柱温30℃，检测波长440nm，进样量10μL；以叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素为标样，建立了RP-HPLC法测定叶黄素、番茄红素、β-胡萝卜素的线性方程。
文档编号G01N21/31GK103149165SQ201310031708
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者张鲁刚, 莫玉楠 申请人:西北农林科技大学