用探针，使用制造例3中得到的SH-HRP标记BNC-ZZ与源自兔的 抗小鼠 IgG抗体的混合复合体。向各为测定而准备的板的孔中添加上述探针并使其反应，进 行清洗后，采用与实施例9同样的方法测定Abs 450nm。测定值如下得到:使用标准抗体制作 标准曲线，基于标准抗体的抗体效价，以mean 土 std (单位/mL，η = 3)的形式算出各抗体的抗 体效价。
[0289]关于小鼠血清中的抗OVAIgE的抗体效价，使用HRP标记BNC-ZZ/抗小鼠IgE复合体 时为3807 ± 1439纳单位/mL，使用HRP标记抗小鼠IgE时为3558 ± 935纳单位/mL，两者显示出 了同样的值。
[0290] 此外，抗OVA小鼠 IgG的抗体效价为4175±8717微单位/mL。上述结果表明，使用了 上述复合体的测定体系能够充分测定IgE、IgG的抗体效价，具有实践上的有用性。
[0291] 实施例27
[0292] 使用制造例8中制备的HRP标记BNC-SA/源自兔的抗小鼠 IgG抗体的复合体，进行实 验以确认其与小鼠 I gG的结合反应。将源自对照小鼠的IgG固定化于ELI SA板，然后使用1 % 的Blockace进行封闭。作为探针，使制造例8中得到的用HRP标记BNC-SA/源自兔的抗小鼠 IgG抗体复合体。作为对照探针，使用制造例3中得到的NH2-HRP标记BNC-ZZ与抗小鼠 IgG兔 抗体(Bethyl制）的混合复合体、及源自兔的HRP标记抗小鼠 IgG抗体。将上述各探针分别以 0、0.55、1.65、4.94、14.8、44.4、133、400ng/mL的浓度添加至各孔中并使其反应，进行清洗 后，采用与实施例9同样的方法测定Abs450nm。需要说明的是，探针中添加有终浓度为 0.05%的Pluronic F-127。结果示于图 13。
[0293]随着各探针浓度的增加，反应均增强，而与所使用的探针的种类无关。HRP标记 BNC-SA/抗体复合体的结合活性，为经由相同的NH2基团被HRP标记而得的HRP标记BNC-ZZ与 抗体的混合复合体的约1/2。考虑到前者的HRP酶活性为后者的约1/3的话，可知与NH 2-HRP 标记BNC-ZZ与抗体的混合复合体相比，HRP标记BNC-SA/抗体复合体具有更高的对抗体的结 合能力。另一方面，与HRP标记抗体相比，HRP标记BNC-SA/抗体复合体显示出了约2倍的反 应。上述结果表明，HRP标记BNC-SA/抗体复合体对抗体的结合能力高于HRP标记抗小鼠 IgG 抗体，具有有用性。
[0294] 实施例28
[0295] 与实施例13的方法同样地，对HuH7细胞的提取液进行We s t ern印迹分析。使用5 % 的脱脂乳进行膜的封闭，使用源自小鼠的抗波形蛋白抗体(Progen制，1/1000稀释)作为第 一抗体。作为探针，使用含有1 %脱脂乳的源自兔的HRP标记抗小鼠 IgG抗体(Rockland制，1/ 10000;图14中的第二抗体）、或含有0.1%的？11^〇11化？-127及1%脱脂乳的制造例3中的 HRP标记BNC-ZZ。结果示于图14。
[0296] 在使用源自兔的HRP标记抗小鼠IgG抗体作为探针进行检测的情况下，在将提取液 稀释至1/10时，没有检测到条带的信号。与之相对地，在使用HRP标记BNC-ZZ的情况下，即使 在将提取液稀释至1/10时，也得到了同等的信号。因此，可知HRP标记BNC-ZZ对于高灵敏度 检测是有效的。
[0297] 实施例29
[0298]采用与实施例28同样的方法进行Western印迹分析。作为第一抗体使用上述抗波 形蛋白小鼠抗体的1/3000稀释液，作为第二抗体使用HRP标记抗小鼠 IgG抗体(Rockland 制，#611-1302,1/10000稀释），进行检测（图15中的检测-1)。进一步，溶解于含有0.1 % Lipidure 802的溶液中后，使用HRP标记BNC-ZZ作为追加探针进行检测（图15中的检测-2)。 结果示于图15。
[0299]结果表明，使用HRP标记抗小鼠抗体作为第二抗体的检测获得了较差的检测灵敏 度(检测-1)，而与之相对地，使用HRP标记BNC-ZZ作为追加探针而进行的再次检测(检测-2) 则能够增强条带信号。需要说明的是，虽数据未示出，但发现即使补加第二抗体，信号也几 乎没有上升。因此，由于仅通过追加HRP标记BNC-ZZ即可使信号灵敏化，所以有用性非常高。
[0300] 实施例30
[0301] 采用与实施例28同样的方法进行Western印迹分析。作为第一抗体使用抗波形蛋 白小鼠抗体(Progen制，1/2000稀释）、抗GATOH兔抗体(EPIT0MICS制，1/10000稀释）、或它们 两者，作为第二抗体使用HRP标记抗小鼠 IgG抗体（Rockland制）、HRP标记抗兔IgG抗体 (Santa Cruz制）、或HRP标记BNC-ZZ(HRP-ZZ)，进行检测。需要说明的是，HRP标记BNC-ZZ与 终浓度为0.1%的？11^〇11。？-127-同使用。结果示于图16 〇
[0302]结果表明，使用HRP标记BNC-ZZ时，在用各第二抗体进行检测的位置，能够一次性 地检测出波形蛋白和GAPDH。此外，结果还表明，使用HRP标记BNC-ZZ时，即使抗体源自于不 同的动物物种，也能够同等地同时对波形蛋白和GAPDH进行检测。
[0303] 实施例31
[0304]作为试样，向HuH7细胞提取液中添加以2倍稀释系列浓度制备的GFP-Histag蛋白 质，采用与实施例28同样的方法对其进行Western印迹分析。使所得到的产物与作为第一抗 体的抗GAPDH兔抗体(EPIT0MICS制，1/10000)及抗GFP兔抗体(Rockland制，1/2000)反应，然 后，使用经含有0.1 %的Lipidure 206的PBS-T稀释的HRP标记BNC-ZZ(HRP-ZZ)，同时对 GAPDH和GFP进行检测。结果示于图17。
[0305]使用HRP标记BNC-ZZ时，随着添加的GFP蛋白质的浓度增加，信号增强，这表明该检 测是定量检验。
[0306] 实施例32
[0307]采用与实施例28同样的方法进行Western印迹分析。预先将抗波形蛋白小鼠抗体 (Progen制，1/2000稀释）和HRP标记BNC-ZZ等量混合，将其混合复合体添加至PVDF膜，从而 采用一步法进行检测。需要说明的是，HRP标记BNC-ZZ与抗体的混合复合体的反应液中，使 用了含有〇.l%Pluronic F-127的TBS-T。作为对照，还通过两步法进行检测，具体而言，进 行与抗波形蛋白小鼠抗体的反应，还进行与HRP标记抗小鼠抗体(Rockland制，1/5000)的反 应。结果示于图18。一步法中，在将蛋白质转印至PVDF膜后到进行检测为止的操作的总时间 为65分钟左右，所述操作依次为:封闭5分钟（图18中的Q1)或15分钟（图18中的Q2)，然后清 洗5分钟，然后反应(第一抗体+HRP标记BNC-ZZ)30分钟，然后清洗25分钟（5分钟X5:Q1)或 15分钟（3分钟X 5: Q2)。与之相对地，使用HRP标记抗小鼠抗体的两步法（图18中的Μ)中，进 行下述操作的总时间为230分钟左右，所述操作依次为:封闭60分钟，然后清洗10分钟（5分 钟X 2)，然后进行第一抗体反应60分钟，然后清洗15分钟(5分钟X 3)，然后进行第二抗体反 应60分钟，然后清洗25分钟(5分钟X 5)。
[0308] 在常规方法两步法中，到利用蛋白质转印膜检测信号为止，需要总计230分钟的工 序，而与之相对地，使用HRP标记BNC-ZZ的一步法(图19中的Q1、Q2)的情况下，能够缩短清洗 时间、其他操作时间，从而能够在将时间缩短至65分钟的同时获得同等的结果。因此，可以 确认HRP标记BNC-ZZ能够用于快速检测Western印迹。
[0309] 实施例33
[0310]采用与实施例28同样的方法进行Western印迹分析。作为第一抗体，使用抗p53兔 抗体（Santa Cruz制，1/200)。作为第二抗体，使用ALP标记抗兔IgG抗体（Sigma制，1/ 50000)、或制造例4中得到的SH-ALP标记BNC-ZZ。作为ALP用底物，使用CDP-Star (NEB制）。结 果示于图19。
[0311] 使用ALP标记抗兔IgG抗体进行检测的情况和使用ALP标记BNC-ZZ进行检测的情况 下，获得了几乎同等的信号。该结果表明，ALP标记BNC-ZZ在Western印迹中也是非常有用的 探针，可用于使用了 HRP标记BNC-ZZ的本申请的实施例中所述的各种使用方法。
[0312] 实施例34
[0313]采用与实施例28同样的方法进行Western印迹分析，但是替代性地使用A431细胞 提取液。使该提取液与作为第一抗体的抗体种类为小鼠 I g G i的抗E G F R抗体（C e 11 Singnaling制，1/1000稀释）、或抗p53兔抗体(Santa Cruz制，1/200稀释)反应后，使其与经 含有0.1%的？11^〇11化？-127的了85-1'稀释的制造例6中得到的!11^标记466-8%-22或制造 例3中得到的HRP标记BNC-ZZ反应。结果示于图20。
[0314]使用作为小鼠 IgGj^jtEGFR抗体的情况下，用HRP标记BNC-ZZ(图20中的Z)完全不 能检测到，而与之相对地，使用HRP标记AGG-BNC-ZZ(图20中的A)时，则能检测到该抗体。另 一方面，使用作为兔IgG的抗p53抗体的情况下，使用HRP标记BNC-ZZ或使用HRP标记AGG-BNC-ZZ均能够良好地检测到该抗体。
[0315] 上述结果与下述情况非常一致，即，由于HRP标记AGG-BNC-ZZ具有源自蛋白质G的 抗体结合部位，因此也容易与小鼠 IgG!结合；由于HRP标记BNC-ZZ仅具有源自蛋白质A的抗 体结合部位，因此几乎不与小鼠 IgGi结合。上述结果证明了HRP标记AGG-BNC-ZZ的有用性。
[0316] 制造例9: HRP标记BNC-L的制备
[0317] 使用过氧化物酶标记试剂盒-SH，经由制造例1中得到的BNC-L的SH基团实施HRP标 记，得到HRP标记BNC-L。
[0318] 实施例35
[0319]将作为乙型肝炎病毒的表面抗原的肽的Pre_S2固定化于ELISA板，并将该板封闭。 向各孔中添加各种浓度的抗Pre-S2抗体。接着，添加制造例9中得到的HRP标记BNC-L并使其 反应，进行清洗后，采用实施例9所示的方法测定Abs 450nm(抗原夹心ELISA)。结果示于图 21〇
[0320] 结果明确地表明，HRP标记BNC-L能够充分地作为ELISA测定用探针使用。
[0321] 制造例 10: SH-HRP 标记 BNC-(糖链)_AGG
[0322] 使用Na I 〇4对制造例1中得到的BNC-L进行氧化处理，在附加至BNC-L的糖链中的糖 残基上形成醛基。接着，使所得产物与AGG蛋白质反应，使醛基与AGG肽的赖氨酸残基结合。 向反应混合物中添加 NaBH4溶液，进行凝胶过滤处理而得到BNC-AGG。进一步，使用过氧化物 酶标记试剂盒-SH，经由得到的BNC-AGG的SH基团实施HRP标记。即，得到的BNC经由其糖链而 结合有AGG，并且还经由其SH基团而结合有HRP (下文中有时称为SH-HRP标记BNC-(糖链)-AGG〇)〇
[0323] 实施例36
[0324] 使用各种浓度的兔IgG将固定化的ELISA板封闭，向各孔中添加 SH-HRP标记BNC-(糖链)_AGG(制造例10中得到的）并使其反应，进行清洗后，采用实施例9所示的方法测定 Abs 450nm。结果示于图22。
[0325] 结果表明，虽然与使用制造例4中得到的SH-HRP标记BNC-ZZ作为对照的情况相比， 利用SH-HRP标记BNC-(糖链)-AGG得到的Abs 450nm值较低，但是仍具有充分的检测能力。
[0326] 制造例11: HRP标记HVJ-E的制备
[0327] 使用过氧化物酶标记试剂盒-SH，通过作为包含仙台病毒的包膜蛋白的病毒样颗 粒的HVJ-E(Gen〇me One，石原产业）的颗粒表面上存在的蛋白质的半胱氨酸残基中的SH基 团进行HRP标记，得到HRP标记HVJ-E。
[0328] 实施例37
[0329] 采用与实施例1同样的方法，测定制造例11中得到的HRP标记HVJ-E的HRP活性，结 果为 0.05U/yg。
[0330] 在具有跨膜型的蛋白质的病毒样颗粒中，常常在蛋白质的跨膜区域内或在该区域 附近具有SH基团。本实施例表明：HVJ-E也能够经由SH基团而被标记，病毒样颗粒中存在的 SH基团作为标记的靶标是有用的。
【主权项】
1. 蛋白质免疫检验用病毒样颗粒，所述颗粒包含具有自组织能力的，所述病毒样颗粒 在所述具有自组织能力的蛋白质的至少1个半胱氨酸残基上经由其一个或多个巯基被生物 学活性分子修饰。2. 如权利要求1所述的病毒样颗粒，其中，所述具有自组织能力的蛋白质为HBsAg蛋白 质。3. 如权利要求1的病毒样颗粒，其中，所述具有自组织能力的蛋白质含有序列号1所示 的氨基酸序列。4. 如权利要求1~3中任一项所述的病毒样颗粒，其中，所述具有自组织能力的蛋白质 具有抗体结合结构域。5. 如权利要求1~4中任一项所述的病毒样颗粒，其中，所述生物学活性分子为选自由 酶、抗体结合结构域、生物素、荧光染料、发光染料及亲和素化合物组成的组中的至少一种。6. 如权利要求5所述的病毒样颗粒，其中，所述抗体结合结构域为选自由蛋白质A的抗 体结合结构域、蛋白质G的抗体结合结构域及蛋白质L的抗体结合结构域组成的组中的至少 一种。7. 如权利要求4或5所述的病毒颗粒，其中，所述抗体结合结构域由序列号3~5中任一 所示的氨基酸序列构成。8. 病毒样颗粒，其为权利要求1~7中任一项所述的病毒样颗粒，其中，所述生物学活性 分子为抗体结合结构域，并且抗体结合于所述抗体结合结构域。9. 封闭剂，其为用于使用权利要求1~8中任一项所述的病毒样颗粒的免疫检验中的封 闭剂，所述封闭剂包含选自由羟烷基纤维素、聚乙烯醇、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物及2-甲 基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的共聚物组成的组中的至少1种。10. 如权利要求9所述的封闭剂，其中，所述环氧乙烷/环氧丙烷共聚物为Pliimnic?.。11. 如权利要求9所述的封闭剂，其中，所述环氧乙烷/环氧丙烷共聚物为 卩11^〇11匕@['1.27和/或['>1111*〇11丨(：@卩105。12. 免疫检验用试剂盒，包含权利要求1~8中任一项所述的病毒样颗粒和权利要求9~ 12中任一项所述的封闭剂。
【专利摘要】本发明的一个目的是提供一种检测灵敏度优异且能显著抑制检测背景的免疫检验方法。本发明的解决手段为提供一种病毒样颗粒，所述颗粒包含具有自组织能力的蛋白质，并且所述颗粒在该具有自组织能力的蛋白质的至少1个半胱氨酸残基上经由其一个或多个巯基而被生物学活性分子修饰。
【IPC分类】G01N33/53, C12N7/00, C12N15/09
【公开号】CN105492605
【申请号】CN201480034006
【发明人】乡保正, 织田康则
【申请人】比科尔公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年8月1日
【公告号】US20160202251, WO2016017037A1