与细胞的抗衰老相关的生物分子群的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及类Muse细胞(Muse-like cell)的生产方法、或延长细胞群的寿命的方法等。
【背景技术】
[0002]2012年的诺贝尔生理学.医学奖被颁发给初次制成iPS细胞的山中伸弥教授和进行该制成技术的基础研究的约翰.格登博士。人们所期待的是，该iPS细胞将目前没有的全新的治疗战略带到医疗行业中。
[0003]作为与该iPS细胞相关的技术，例如在专利文献1中记载了将4个基因(0ct3/4、Klf4、SOX2、c-Myc)导入细胞的结果，细胞多能干细胞化。此外，作为与多能干细胞相关的技术，例如，在专利文献2中，记载了通过将3个基因(0ct3/4、Klf4、Sox2)和一个miRNA(hsa-miR-372等)导入细胞来制备多能干细胞。另外，在非专利文献1中，记载了当导入所述的4个或3个基因时，如果缺少多能干细胞化的细胞的p53基因，则多能干细胞的制备效率上升。另夕卜，在专利文献3以及4中，记载了通过将特定的RNA链(miR-520d-5p等)导入细胞来制备多能干细胞。
[0004]另一方面，为了将iPS细胞应用于实际的医疗中，在癌变控制和分化控制方面存在改善的余地。其中，作为与多能干细胞相关的新的方法，在专利文献5中，报告了分离出含有Muse细胞的细胞分离组分。在该专利文献5中，记载了专利文献5的Muse细胞可以分化为所有的组织、作为iPS细胞的来源是有用的(iPS细胞的制成效率高)、可以不经过基因的导入而分离。
[0005]现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2007/069666号专利文献2:国际公开第2009/075119号专利文献3:国际公开第2012/008301号专利文献4:国际公开第2012/008302号专利文献5:日本专利第5185443号公报。
[0006]非专利文献
非专利文南犬1Suppress1n of induced pluripotent stem cell generat1n bythe p53-p21 pathway.’ Hong et al., Nature.2009 Aug 27;460(7259):1132-5.Epub2009 Aug 9o
【发明内容】
[0007]然而，虽然存在如上述的成功制备多能干细胞的事例，但作为治疗用途，不存在从官方获得制造销售批准的产品。这是由于多能干细胞的制备方法被限制，该领域的研究无法进行而造成。另外，如果除去少量的方法中确认了副作用(例如，基于c-Myc的培养初期的癌变等)的方法，则有效的方法进一步受到限定。
[0008]如上所述，还公开了一种基于Muse细胞的新的方法。然而，专利文献5的Muse细胞需要从生物体的间充质组织或培养间充质细胞中以SSEA-3的表达为阳性为指标进行分离，为了调整原料以及分离Muse细胞，将产生复杂的操作以及高成本。
[0009]本发明是鉴于所述问题而完成的，目的在于提供一种新型类Muse细胞的生产方法、或延长细胞群的寿命的方法等。
[0010]本发明的发明人发现如后述的实施例所记载的那样，如果抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达，则出现类Muse细胞，从而完成本发明。另外，令人吃惊的是细胞制品的寿命延长。
[0011]S卩，根据本发明的一方式，提供一种类Muse细胞的生产方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD 1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。
[0012]另外，根据本发明的一方式，提供一种通过所述生产方法得到的类Muse细胞或其类Muse细胞群。
[0013]另外，根据本发明的一方式，提供一种再生医疗用材料，该材料通过培养介由所述生产方法得到类Muse细胞而得到。
[0014]另外，根据本发明的一方式，提供一种治疗药或化妆品，其中含有所述类Muse细胞或类Muse细胞群。
[0015]另外，根据本发明的一方式，提供一种类Muse细胞诱导剂、治疗药、化妆品、或细胞群的寿命延长剂，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。
[0016]另外，根据本发明的一方式，提供一种延长细胞或细胞群的寿命的方法、寿命延长后的细胞或细胞群的生产方法、CD105 mRNA高表达细胞的生产方法、成纤维细胞产生细胞的生产方法、或使类Muse细胞活性化的方法，并且这些方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。
[0017]根据本发明，可以通过新型的方法来生产类Muse细胞。或者，根据本发明，可以大大地延长细胞或细胞群的寿命。
【附图说明】
[0018]图1是培养成纤维细胞时的照片。
[0019]图2是培养第0天的成纤维细胞的照片。
[0020]图3是培养第一个月的成纤维细胞的照片。
[0021]图4是培养第一个月和第3周的成纤维细胞的照片。
[0022]图5是当使培养第一个月的成纤维细胞感染导入慢病毒之后，培养3周时的照片。[0023 ]图6是将图5的细胞群进一步在ReproStem培养基中培养1周时的照片。
[0024]图7是将图6的类Muse细胞进一步在ReproStem培养基中培养4天时的照片。
[0025]图8是将图5的细胞群进一步在FBM+FGM-2培养基中培养1周时的照片。
[0026]图9是将图8的细胞群进一步在FBM+FGM-2培养基中培养4天时的照片。
[0027]图10是针对导入或未导入siETG的细胞，测定⑶105 mRNA表达量的结果。
[0028]图11是随时间变化来测定⑶105 mRNA表达量的结果。
[0029]图12是随时间变化来测定hTERT mRNA表达量的结果。
[0030]图13是随时间变化来测定0ct4mRNA表达量的结果。
[0031]图14是随时间变化来测定SIRT1mRNA表达量的结果。
[0032]图15是随时间变化来测定P53mRNA表达量的结果。
[0033]图16是随时间变化来测定NanogmRNA表达量的结果。
[0034]图17是随时间变化来测定胶原质(Collagen)产生能力的结果。
[0035]图18是对293FT细胞导入hsa-miR-520d-5p的结果。
【具体实施方式】
[0036]以下，针对本发明的实施方式详细地进行说明。另外，针对相同的内容，为了避免重复，适当地省略说明。
[0037]本发明的一实施方式是新型的类Muse细胞的生产方法。该生产方法例如是类Muse细胞的生产方法，其中包含抑Φ丨jELAVL2、TEADl、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该生产方法，可以简便地生产类Muse细胞或类Muse细胞群。该生产方法不一定需要复杂的操作，并且在效率以及成本方面优良。
[0038]该生产方法也可以包含将抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达的RNA链导入细胞群的工艺和从导入有所述RNA链的细胞群中回收类Muse细胞的工艺。所述回收也可以以细胞形态、或基因表达为指标来回收。所述回收包含分离或游离的操作。
[0039]所述类Muse细胞也可以高表达内源性的hTERT以及SIRTUhTERT以及SIRT1是年轻的细胞中表达量高的基因，因此，高表达hTERT以及SIRT1的类Muse细胞可以说是相对未老化的年轻细胞。另外，所述类Muse细胞也可以高表达内源性的P53453是分类为恶性肿瘤抑制基因的基因，因此，可以说高表达P53的类Muse细胞的恶性肿瘤化的风险低。
[0040]所述类Muse 细胞也可以是 CD105、SIRTl、hTERT、P53、0ct4、Nanog、SSEA-3 阳性。类Muse 细胞的 CD105、SIRTl、hTERT、P53、0ct4、Nanog、SSEA-3(以下，有时称为“CD105等”)的表达量例如相对于对照试样(例如，hiPSC(HPS0002 253G1)、CD105等基因剔除细胞、正常细胞、非多能性细胞、或来自这些的试样等)的CD105等表达量，优选显著地高表达。另外，该CD105等表达量例如相对于对照试样的⑶105等表达量，也可以是1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、100、500、或1000倍以上。CD105 等表达量的测定方法考虑到实现测定精度以及简便性，优选为实时PCR。
[0041]类Muse细胞的存在也可以以细胞为眼球(黑眼球和白眼球)那样的形态为指标来判断。另外，类Muse细胞也可以是粘合性或浮游性的。另外，类Muse细胞成为眼球那样的形态之后，可以变化为细长的成纤维细胞那样的形态，另外，之后也可以变化为眼球那样的形态。另外，类fcse细胞包含所述专利文献5所记载的Muse细胞、或实质上性质与该Muse细胞相同的细胞。是否是类Muse细胞例如也可以通过与所述专利文献5的Muse细胞的形态比较、或基因表达量比较等来评估。其中，介由本实施方式的生产方法得到的类Muse细胞与所述专利文献5所记载的Muse细胞相比，优选高表达hTERT的、更年轻的细胞。另外，是否是类Muse细胞例如也可以通过对对照细胞高表达⑶105等一个以上来评估。
[0042]所述类]?1186细胞的直径也可以是1、5、10、20、50、75、或10(^111以上，也可以在这些任意两个值的范围内。从细胞群中有效地分离类Muse细胞的观点出发，优选直径为5μπι以上，更优选为ΙΟμπι以上。
[0043]另外，与ELAVL2等相关的碱基序列等的细节可以从HGNC(HUG0 GeneNomenclature Committee)或NCBI(Nat1nal Center for B1technology Informat1n)的WEB网站上看到。HGNC所记载的HGNC ID中，ELAVL2为HGNC:3313,TEAD 1 为HGNC: 11714,GATAD2B为HGNC:30778ALAVL2 mRNA也可以包含序列编号29的碱基序列。TEAD1 mRNA也可以包含序列编号30的碱基序列。GATAD2B mRNA也可以包含序列编号31的碱基序列。另外，各基因有时冠以其他名称，其他名称记载在HGNC的WEB网站中。因此，各基因也可以使用成为其他名称。例如，ELAVL2包括被称为HEL-N1或HuB的基因。
[0044]本发明的一实施方式是一种再生医疗用材料的生产方法，该方法包含培养所述类Muse细胞的工艺。再生医疗用材料例如是再生医疗用脏器。另外，另一实