细菌发酵方法以及组合物的制作方法
【专利说明】细菌发酵方法以及组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年5月31日提交的美国专利申请序列号61/829,987的权益，将其 全部公开内容以引用的方式并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] -个碳的有机化合物如甲烷和甲醇，在自然界广泛存在，并且被分类为甲烷氧化 菌和甲基营养菌的细菌用作碳源。甲烷氧化细菌包括下述属中的菌种：甲基杆菌属 (]\^七1171〇匕&(^61')、甲基单胞菌属(]\^七1171〇111011&8)、甲基微菌属(]\^七1171〇111；!_(31'〇13；!_11111)、甲基 球菌属(]^七1171〇(30(3(3118)、甲基弯曲菌属(]^七1171〇8；!_11118)、甲基抱囊菌属(]^七1171〇〇78^8)、 甲基球形菌属（10让71〇8口1136^)、甲基暖菌属（16让71〇〇31(111111)以及甲基细胞菌属 (Methylocella) (Lidstrom，2006)。甲烷氧化菌具有甲焼单加氧酶，该酶将来自〇2的氧原子 掺入甲烷，形成甲醇。所有甲烷氧化菌都是专性的一个碳的利用者，其不能利用含有碳-碳 键的化合物。另一方面，甲基营养菌还可利用更复杂的有机化合物，如有机酸、高级醇、糖类 等。因此，甲基营养细菌是兼性甲基营养菌。甲基营养细菌包括下述属中的菌种：甲基杆菌 属(Methylobacterium)、生丝微菌属（Hyphomicrobium)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲 基菌属(]^七1171〇匕&(3；!_11118)、卩麓甲基菌属(]^七1171〇卩11&8&)、氨基杆菌属(六111；!_11〇匕&(^61')、耗甲 Slf ^M(Methylorhabdus) >Methylopila>Methylosulfonomonas>Marinosulfonomonas> 副球菌属(Paracoccus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、屈曲杆菌属(Ancylobacter)(也被称 为微环菌属（Microcyclus))、硫杆菌属（Thiobacillus)、红假单胞菌属 (1?110(1(^8 611(1〇1110仙8)、红杆菌属（1?110(1(^3(^61')、醋杆菌属（八0 6七(^3(^61')、芽抱杆菌属 (Baci 1 lus )、分枝杆菌属（Mycobacterium)、节杆菌属（Arthobacter)以及诺卡氏菌属 (Nocardia)(Lidstrom,2006)〇
[0005] 大部分甲基杆菌属的甲基营养细菌是粉红色的。它们通常指PPFM细菌，其为粉红 色的兼性甲基营养菌。Green(2005,2006)在甲基杆菌属中鉴定了 12个确认的菌种，具体为 嗜胺甲基杆菌(M.aminovorans)、氯甲烧甲基杆菌(M. chloromethanicum)、二氯甲烧甲基杆 菌（M.dichloromethanicum)、扭脱甲基杆菌（M.extorquens)、藤泽氏甲基杆菌 (M.fujisawaense)、嗜中温甲基杆菌（M.mesophilicum)、嗜有机甲基杆菌 (M.organophilum)、耐福射甲基杆菌（M.radiotolerans)、罗得西亚甲基杆菌 (M.rhodesianum)、玫瑰红甲基杆菌(M.rhodinum)、硫氛酸盐甲基杆菌(M. thiocyanatum)以 及扎氏甲基杆菌(M.zatmanii)。然而，巢状甲基杆菌(M.nidulans)为非PPFM的固氮甲基杆 菌(Sy et al.，2001)。甲基杆菌在自然界普遍存在，它们存在于土壤、灰尘、淡水、沉积物和 叶表面中，以及存在于工业环境和临床环境中(Green，2006)。
[0006] PPFM细菌作为大部分(如果不是全部)植物(范围从藻类、藓类和苔类以及被子植 物和裸子植物)物种的叶表面的定殖者的存在，表明PPFM细菌可能在植物生理中发挥重要 作用（Corpe and Rheem，1989;Holland and Polacco，1994;Holland，1997;Kutschera， 2007)。植物产生并分泌的甲醇可能作为生长的植物细胞壁中果胶新陈代谢的废物的事实 提示这些研究者存在共生关系，其中PPFM细菌以植物产生的甲醇为食，并反过来为植物提 供积极的益处。PPFM细菌对植物生理的表明的益处包括对氮代谢、种子萌发以及通过提供 PPFM产生的植物激素细胞分裂素刺激植物生长方面的积极作用。将PPFM细菌用于改善植物 生长、植物产量、种子萌发、雄性可育性以及植物的营养品质已经公开于美国专利5,512， 069、美国专利5，961，687、美国专利6,174,837、美国专利6,329,320、美国专利7，435,878， 以及美国专利申请公开号2006/0228797中。此外，已经发现PPFM细菌能够增加栽培藻类的 产量，这暗示它们在产生藻类来源的生物燃料中的应用（美国专利申请公开号2011/ 0269219)〇
[0007] 甲基杆菌在行栽作物、蔬菜和其它栽培植物以及在基于藻类的生物燃料的产生中 的广泛应用需要高效且廉价地培养大量的甲基杆菌培养物。甲基杆菌的其它工业应用也可 从高效的甲基杆菌生产技术中获益。此类工业应用包括将甲基杆菌用作环境污染指示剂 (因为某些甲基杆菌可生长于烟尘中）以及将其用作包装食物产业中的辐射质量控制监测 剂（因为某些甲基杆菌对γ射线辐射显示出高抗性）。其它工业应用包括利用甲基杆菌降解 环境污染物（美国专利第US 5,418,161 号、US 5,487,834号、US 6,107,067号、US 7,214， 509号），以产生有用的工业化合物、聚合物前体或生物聚合物(US 5,236,930、US 5,686， 276、US 6,107，067)以及重组蛋白（美国专利申请公开号20060234336)。
[0008] 然而，PPFM培养的主题范围内的多种出版物显示，为实现这些细菌的高效且廉价 的大规模培养，需要克服重大障碍。Holland和P 〇laCC〇(1994)报道"分离的PPFM在植物组织 培养基中不能很好地生长"，所述培养基为富含营养素的培养基，并且报道"PPFM生长缓 慢"。Madhaiyan等(2004)阐述了PPFM细菌，"它们生长缓慢的性质以及在整个植株中的分布 表明随着植物组织扩增远离生长点，它们的数量通过稀释被简单地调节"。Abanda-Nkpwatt 等（2006)报道了PPFM细菌的生长："在液体培养中，溶液在4-5天内变浑浊"，但没有具体说 明达到的滴度(滴度指每毫升中细菌细胞的数量或者菌落形成单位）。
[0009] 这些生长缓慢的一致性报道被表明PPFM细菌仅可以生长至相对低的滴度的其它 研究进一步证实并扩展。这些生长研究在标准液体微生物培养基中进行，所述培养基是特 别制备的以使其为"水-澄清的(water-clear)"。此类培养基允许目测观察并检测期望的和 非期望的（即污染的)微生物生长，显示随肉眼可见的浊度的发展。
[0010] Corpe和Basile(1982)提出了不同PPFM细菌对多种碳源的生长响应的系统研究。 他们将Stanier et al. (1966)利用的标准矿物基质作为他们的基础培养基。在该出版物 中，Stanier等阐述了他们的基础培养基，"它与氮川乙酸和EDTA重度螯合，并在高压灭菌时 形成很多沉淀。所述沉淀随着培养基冷却再溶解，从而形成水-澄清的溶液"。
[0011]利用该"水-澄清的"溶液作为他们的基础培养基，Corpe和Basile(1982)对多种碳 源支持PPFM细菌生长的能力进行了测试。他们发现一些碳源相对优于所有其它碳源，即甘 油、谷氨酸盐、甲醇、葡萄糖、天冬氨酸盐、琥珀酸盐以及苹果酸盐。然而，即使在孵育7天之 后(分配给每个生长测试的时间），这些培养物中没有一个达到大于0.7个光学单位的光密 度（在660纳米处，其为测量微生物生长的标准波长），并且大部分远低于该密度。Sy等 (2005)报道光密度为约0.05个光学单位的PPFM细菌的悬浮物包含约5 X106个菌落形成单 位(CFU)的PPFM细菌/毫升。因此，Corpe和Basil在用最佳碳源孵育一周后达到的最高滴度 鉴定为约7 X 107个菌落形成单位/毫升。
[0012] Sy等(2005)还报道，用包含琥珀酸盐作为碳源的的最低盐培养基，他们获得的扭 脱甲基杆菌的最终滴度为约2.5X 108个菌落形成单位/毫升。
[0013] Corpe和Rheem(1989)报道PPFM细菌"在营养肉汤培养基和其它常见的异养培养基 中具有比其它叶异养生物长的倍增时间"，并且推断植物产生的甲醇"可能允许PPFM与叶表 面的其它细菌成功竞争"。Corpe和Reehm获得的最高滴度(在未具体说明的孵育期之后)为 约3 X 108个菌落形成单位/毫升。
[0014]因此，这些出版物表明在标准的"7K-澄清的"微生物生长培养基中，PPFM细菌生长 缓慢，并且通常停滞在约3X108个菌落形成单位/毫升的相对低的终滴度。
[0015] 为了满足对PPFM细菌在行栽作物、蔬菜和其它栽培植物以及在基于藻类的生物燃 料的商业应用中的潜在需求，需要产生大量的这些细菌的制造能力。
[0016] 仅将玉米作为一个实例，在美国每年种植大约4000万公顷的玉米。对于该国内该 单一农作物的每个1 %的市场渗透(400，000公顷）而言，估计对PPFM细菌的需求范围可以是 约每公顷30公升的滴度为约3 X108个菌落形成单位/毫升的PPFM培养物，将其以种子处理 或叶面喷洒施用。这相当于每年需要约1200万公升该滴度的PPFM培养物以处理美国1%的 玉米作物。如果每批的生产时间为7天，即使是具有市场上最大体积的发酵罐设备(每批生 产60，000公升)满负荷运转(每年约250天），也将需要5台或6台该类大型发酵罐(再次，仅是 为供应美国玉米1%的市场渗透的需求）。此类设备可能无法建造或者以商业上可行的方式 操作。
[0017]因此，存在发展高效且廉价地大规模生产甲基杆菌的需求。
[0018] 发明概述
[0019] 本文提供用于高效生产大量的甲基杆菌的方法。这些方法可产生高滴度的甲基杆 菌培养物，其中每批的生产时间显著缩短。本文提供的甲基杆菌生产方法也可利用由廉价 且易得的成分组成的培养基。本文还提供包含甲基杆菌的有用的发酵液、发酵液产品、发酵 产品以及组合物。本文还提供了利用包含甲基杆菌的所述发酵液、发酵液产品、发酵产品以 及组合物来处理植物或植物部分的方法。本文提供的方法和组合物可被用于生产大量的甲 基杆菌，所述甲基杆菌用于施用至植物或植物部分，用作生物修复中的接种物，用于生产有 用的产品以及用于生产重组蛋白。通过本文提供的方法和组合物可获得的有用产品包括但 不限于:聚 -3_羟基丁酸、1,3-丙二醇以及噁唑吡略喹啉(oxazopyrroloquinolines)。
[0020] 本文提供了获得甲基杆菌制备物的方法，其包括使甲基杆菌在包含连续相以及在 连续相中不可混合的或仅部分可混合的分散相的乳状液中生长。在某些实施方案中，所述 甲基杆菌为甲基杆菌的单一培养物或共培养物。在某些实施方案中，（a)所述分散相包含非 水性液体且所述连续相包含水性液体，或者(b)所述分散相包含水性液体且所述连续相包 含非水性液体。在某些实施方案中，所述非水性液体在25°C下于水中的混溶性等于或者低 于正戊醇的混溶性。在某些实施方案中，相对于通过使甲基杆菌在除了于非乳状液中生长 之外的相同条件下生长而获得的收率而言，所述分散相提供了增加的所述甲基杆菌的收 率，所述非乳状液包含对应于连续相的液体的液体。在某些实施方案中，所述方法还包括收 获生长于所述培养基中的甲基杆菌。在某些实施方案中，乳状液还包含足以使所述乳状液 稳定的量的乳化剂。在某些实施方案中，所述乳化剂选自增稠剂、表面活性剂以及它们的组 合。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述非水性液体包含醇、醛、酮、脂肪酸、磷 脂或者它们的任何组合。在某些实施方案中，所述醇选自包含至少5个碳原子的脂肪醇和甾 醇。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述非水性液体包含一种或多种动物油、微 生物油、合成油或植物油。在某些实施方案中，所述植物油选自玉米、大豆、棉花、花生、向日 葵、橄榄、亚麻、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻籽、红花以及它们的组合。在任何前面提及的方法 的某些实施方案中，所述乳状液不包含光合微生物。在任何前面提及的方法的某些实施方 案中，所述乳状液还包含除甲基杆菌之外的预先确定身份的一种或多种非光合微生物。在 任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述分散相包含所述乳状液的至少约0.02质量％ 至约20质量％。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述非水性液体为农业上可接 受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，生长包括 下述步骤:将所述乳状液接种所述甲基杆菌，并在足以提供所述接种的甲基杆菌生长的条 件下孵育所述接种过的乳状液。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述甲基杆菌 选自：嗜胺甲基杆菌、氯甲烧甲基杆菌、二氯甲烧甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、藤泽氏甲基杆 菌、嗜中温甲基杆菌、嗜有机甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、玫瑰红甲基杆 菌、硫氛酸盐甲基杆菌、结瘤甲基杆菌（M. nodulans)、寄奴花甲基杆菌（M. cerastii )、 ]\1.区0881口；[；[(301&、甲基杆菌属1^66378菌株、]\1.口11711〇8口11&6抑6、稻甲基杆菌(]\1.0^2&6)、 M.platani、M.populi以及扎氏甲基杆菌。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述 乳状液基本不含污染性微生物。在任何前面提及的方法的某些实施方案中，所述方法还包 括从所述乳状液中回收全部或部分甲基杆菌。在任何前面提及的方法的某些实施方案中， 所述方法还包括使所回收的甲基杆菌部分脱水。
[0021] 还提供了通过任何前面提及的方法获得的甲基杆菌制备物，其中分散相或连续相 包含这样的非水性液体，其在25°C下于水中的混溶性等于或低于正戊醇的混溶性。
[0022] 还提供了用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，其包括下述步骤:将包含任何 前面提及的甲基杆菌制备物的组合物施用于所述植物或植物部分。在某些实施方案中，所 述组合物还包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在任何前面提及的方法的 某些实施方案中，所述组合物没有固体物质。在某些实施方案中，所述植物部分为种子，并 且所述组合物具有至少约5 X 108个菌落形成单位/克所述组合物至约5 X 1013个菌落形成单 位/克所述组合物的甲基杆菌滴度。在某些实施方案中，所述植物部分为种子、茎、根、花、子 叶、胚芽鞘、果实或叶。在某些实施方案中，所述植物或植物部分为玉米、芸苔属植物、紫花 苜蓿、稻、黑麦、高粱、珍珠粟、糜子、小米、龙爪稷、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、 棉花、番薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄 榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆、 萌芦科植物、观赏植物或针叶植物或者植物部分。在某些实施方案中，用前面提及的甲基杆 菌制备物至少部分地涂布所述植物或植物部分。本文还提供了从任何前面提及的植物或植 物部分获得的经加工的植物产品，其中所述经加工的产品含有乳状液。在某些实施方案中， 所述经加工的植物产品为膳食、糊状物、粉状物、片状物或饲料。在某些实施方案中，所述经 加工的产品是非可再生的。
[0023] 本文提供包含乳状液和甲基杆菌的单一培养物或共培养物的发酵产品，所述乳状 液包含连续相以及在连续相中不可混溶的或仅部分可混溶的分散相。在某些实施方案中， (a)所述分散相包含非水性液体且所述连续相包含水性液体，或者(b)所述分散相包含水性 液体且所述连续相包含非水性液体。在某些实施方案中，所述非水性液体在25°C下于水中 的混溶性等于或低于正戊醇在水中的混溶性。在某些实施方案中，所述发酵产品基本不含 污染性微生物。在某些实施方案中，所述发酵产品还包含除甲基杆菌之外的预先确定身份 的一种或多种微生物。在某些实施方案中，所述发酵产品不含固体物质。在某些实施方案 中，所述发酵产品不含光合微生