专利名称：用于将生物分子递送入植物细胞中的植物肽gamma-玉米醇溶蛋白的制作方法
用于将生物分子递送入植物细胞中的植物肽GA圖A-玉米醇溶蛋白优先权要求本申请要求2010年3月31日提交的美国临时专利申请流水号61/319，764的关于“PLANT PEPTIDE GAMMA-ZEIN FOR DELIVERY OF BIOMOLECULES INTO PLANT CELLS” 的提交日权益。
背景技术：
开发展现出特定性状的新植物系的传统植物育种策略是费时的且有时是 不可预测的。现有的策略，诸如土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化和颗粒轰击很大程度上取决于组织和基因型。细胞穿透肽(CPP)是一类新的且快速增长的短肽，已知其在将一大批包含DNA、RNA和蛋白质的货物复合物易位穿过哺乳动物和人细胞系的生物膜时发挥重要的作用(Schwartz 和 Zhang, 2000; Langel, 2002; Vives, 2002,)。虽然已经显示了 CPP有助于哺乳动物细胞中的货物递送，但是在植物细胞中使用CPP以进行转染的研究受限于许多因素。使此技术适合于植物的主要障碍在于，与动物细胞不同，植物细胞给CPP及其货物的内在化呈现出双重屏障系统(细胞壁和质膜)。因此，CPP必须克服这两种屏障来将货物分子有效移位入完整的植物细胞中。CPP已经在植物细胞中使用，但是依赖于使用透化剂以实现对完整的植物细胞递送货物分子。CPP介导的将小分子、核酸和蛋白质向完整的植物细胞中的递送很大程度上仍然是未探索的，并且对于植物系统中的体外和体内遗传和生物化学操作是有利的。纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA递送至细胞。金属纳米颗粒，诸如金(Au)纳米颗粒由于其低细胞毒性和容易用各种有生物学意义的配体官能化而已经用于DNA递送。在金属纳米颗粒外,还已经使用大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)作为载体来将分子递送到细胞中。DNA和蛋白质可以连接经由各种表面官能化附接于 QD 的配体(见例如 Patolsky, F.等，J. Am. Chem. Soc. 125，13918 (2003))。已经使用纳米颗粒来将质粒DNA递送到多种动物细胞。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的任何基因。然而，由于植物细胞壁的存在，当前的植物基因递送是挑战性的，这导致对用于植物遗传转化的侵入性递送手段的常见依赖。在期望对通常具有细胞壁的细胞进行纳米颗粒介导的递送的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前将细胞壁剥离(见Torney, F.等，Nature Nanotechnol. 2, (2007))。在植物细胞中，细胞壁给递送外源施用的分子呈现难以克服的障碍。已经采用许多侵入性方法，如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌来实现向有壁的植物细胞中的基因和小分子递送，但是仅仅通过显微注射实现了蛋白质递送。随着来自植物基因组测序项目的信息日益增多，迫切需要用于一大批基因的功能基因组研究及用于开发表达重要的农艺学性状的转基因植物的在植物中的快速、通用的(不依赖组织/基因型的)方法。发明概述
以下结合系统、工具和方法来描述各实施方案，所述系统、工具和方法意为例示性和说明性，而非对范围的限制。本发明的一个实施方案涉及一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并将ga_a-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构。然后,将所述具有细胞壁的细胞和所述gamma-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中，并容许将gamma-玉米醇溶蛋白连接的感兴趣的分子摄取入所述具有细胞壁的细胞中。本发明的另一个实施方案涉及一种表达基因的方法，该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的基因相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接基因结构。将具有细胞壁的植物细胞和ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中，并容许将gamma-玉米醇溶蛋白和基因摄取入包含细胞壁的植物细胞中。然后，表达具有植物细胞的植物的后代中的基因。在本发明的又一个实施方案中，将分子物质转移入植物细胞中。该方法包括将 gamma-玉米醇溶蛋白肽与质粒DNA相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构。在容许将gamma-玉米醇溶蛋白肽和来自质粒DNA的基因摄取入植物细胞中的条件下使所述gamma-玉米醇溶蛋白连接结构与携带完整壁的植物细胞置于接触中。在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案会因以下描述而变得显而易见。附图
简述图I显示了 gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合基因的质粒图。图2显示了关于gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽纯化的Ni螯合层析。图3显示了对gamma-玉米醇溶蛋白/YFP洗脱谱(Profile)的SDS-PAGE分析。图4显示了 gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的Maldi-TOF肽质谱。图5显示的共焦显微镜图像显示了融合肽的细胞摄取和内在化A.用Hoechst33342染色的胡萝卜单细胞，其显示细胞核；B.胡萝卜单细胞，其显示细胞核和胞质中的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP荧光定位；C.用Hoechst33342染色的胡萝卜JTNTI细胞，其显示细胞核；D.烟草JTNTl细胞，其显示细胞核和胞质中的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP荧光以及用Hoechst 33342的蓝色核染色；E.共焦图像，其展示靶向JTNTl细胞的质膜和细胞核两者的ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽；及F和G，其分别显示相应的明视野图像和共焦/明视野图像的重叠。图6显示了 pDAB3831的质粒图。发明详述在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义回交。回交是育种人员将杂种后代往回与亲本之一，例如第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一重复杂交的方法。胚。胚可以是成熟的种子内含有的小植物。玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白指自玉米面筋粗粉(gluten meal)生成的玉米蛋白。它缺乏氨基酸赖氨酸和色氨酸，因此它不合适作为饮食蛋白的唯一来源。它在水和酒精中不可溶，但是在含水酒精、二醇和乙二醇醚中是可溶的。它发挥膜和涂层功能以为坚果和谷物产物提供水分屏障。它还发挥糖果和小块商品(panned goods)糖楽;的涂层功能。纳米微粒。一种具有至少I纳米级尺寸，通常小于IOOnm的微观颗粒。适合于用于本发明的纳米微粒可以具有lnm-0. 4um的大小范围。量子点可以具有Inm-IOnm,优选地2-4nm的中值直径。纳米颗粒可以选自金纳米微粒、金包被的纳米微粒、多孔性纳米颗粒、中孔性纳米颗粒、娃土纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、鹤纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳(nanoshell)、纳米核心(nanocore)、纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、磁性纳米微粒及其组合。量子点。量子点是限制导带电子、价带空穴、或激子(导带电子和价带空穴的束缚对(bound pair))在所有三个空间方面的运动的半导体纳米结构。该限制可以由静电势(由外部电极、掺杂、应变杂质产生)、不同半导体材料间界面的存在(例如在核心-壳纳米晶体系统中)、半导体表面的存在(例如半导体纳米晶体)或这些的组合所致。量子点可以具有离散的量子化能谱。相应的波函数在空间上位于量子点内，但是延续晶格的多个周期。 量子点含有小的有限数目(1-100级)的导带电子、价带空穴、或激子(即，有限数目的基元电荷)。稳定化的或稳定的转化体。稳定化的或稳定的转化体指其基因组从一个世代可再现地(reproducibly)传递给下一世代的植物。摄取。摄取指颗粒，诸如gamma-玉米醇溶蛋白穿过细胞壁或细胞膜的易位,其中所述易位不仅仅由于除摄取颗粒的细胞外的某物对颗粒赋予的动量而发生。出于比较的目的，仅由于对颗粒赋予的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的易位的装置或方法的例子是生物射弹、基因枪、显微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。在一个具体的实施方案中，本发明涉及gamma-玉米醇溶蛋白作为CPP将有效负载有效递送入完整的植物细胞中在植物系统中在小分子递送、生物分子递送、基因递送、成像和各种生物技术诊断学和感测功能方面的用途。在本发明的其它实施方案中，可以将“添加”或“访客”分子与gamma-玉米醇溶蛋白分子偶联。此特性可以例如在细胞内的分子位点的特异性靶向和编辑中采用，用于诸如生物模拟物、靶向递送等领域，用于非遗传修饰生物体选项，及在性状和疾病抗性应用方面在多种树、蔬菜和中耕作物中的瞬时转化选项。也可以采用本发明的实施方案来开发植物中合适的生物传感器。依照本发明的实施方案，可以提供一种将感兴趣的分子导入包含细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括将含有感兴趣的分子的ga_a-玉米醇溶蛋白置于与植物细胞的接触中，并容许穿过植物细胞壁摄取gamma-玉米醇溶蛋白。在本发明的具体方面中，gamma-玉米醇溶蛋白可以可逆地或不可逆地含有感兴趣的分子，可以与感兴趣的分子相互作用，或者以其它方式结合和/或携带感兴趣的分子。依照本发明的实施方案，具有细胞壁的植物细胞可以是包含完整且全部细胞壁的任何植物细胞。具有细胞壁的细胞的例子包括但不限于藻类、烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽、棉花、棕榈、花生、大豆、甘鹿、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、和蓖麻属物种(Ricinus sp.),优选地烟草、胡萝卜、玉米、棉花、芸苔、大豆和甘蔗；更优选地烟草和胡萝卜。本发明的实施方案可以包括来自任何组织或它们存在的任何地方的包含细胞壁的细胞，包括但不限于在胚、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果、茎、组织培养物和悬浮液完整的单植物细胞中。在本发明的实施方案中，感兴趣的分子可以是可以递送到依照本发明的植物细胞的任何分子。感兴趣的分子或感兴趣分子的组分可以包含但不限于任何小分子、核酸、DNA、RNA、RNAi、miRNA分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信号传导肽、抗体、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、和/或其组合。本发明的实施方案包括用于预防或治疗疾病的方法。非限制性的例示性实施方案包括使用本发明的方法对有此需要的细胞递送杀真菌剂、抗生素、和/或其它药物。 在本发明的方面，ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构可以被摄取入多种植物细胞细胞器中。可以摄取ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构的位置的例子包括但不限于胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。在本发明的其它实施方案中，可以经由共质体或质外体途径发生包含细胞壁的细胞对ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构的摄取。本发明的其它实施方案包括经遗传修饰的植物细胞及其生成方法，其中植物细胞具有经由本发明的方法导入其中的一种或多种核酸。在实施方案的一个例子中，可以经由依照本发明的ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构将包含感兴趣的基因和选择标志的质粒导入具有细胞壁的植物细胞中。在其它实施方案中，可以选择已经稳定地整合了感兴趣的基因和/或选择标志的稳定转化体。在备选的实施方案中，可以增殖现在包含感兴趣的基因的植物细胞以生成包含感兴趣的分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣的分子的植物细胞可以是可再生细胞，其可以用于再生包含感兴趣的分子的全植物。在另一方面，本发明提供了创建在组织培养中使用的包含感兴趣分子的可再生植物细胞的方法。优选地，组织培养将能够再生与所述可再生细胞具有基本上相同的基因型的植物。此类组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果或茎。更进一步，本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的植物。或者，本发明提供了将期望的性状导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法包括将能够提供期望性状的感兴趣的ga_a-玉米醇溶蛋白基因放入具有细胞壁的植物细胞中，并允许感兴趣的ga_a-玉米醇溶蛋白连接基因被摄取穿过细胞壁。期望性状的例子包括但不限于选自下组的性状雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、对细菌性、真菌性、和/或病毒性疾病的抗性、和对最终用户赋予益处的性状，诸如改善的油谱(profile)、改变的淀粉和纤维含量、提升的维生素和氨基酸含量等。本发明的其它方面提供了生成包含期望的分子或感兴趣的基因的稳定植物系的方法，其中可以首先通过ga_a-玉米醇溶蛋白介导的易位穿过植物细胞壁来导入期望的分子或感兴趣的基因。稳定化遗传或以其它方式改变的植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且包括如下的技术，诸如但不限于自交、回交、杂种生成、与稳定群体杂交等。包含首先通过穿过细胞壁的ga_a-玉米醇溶蛋白介导的转移来导入植物细胞(或其祖先)中的期望分子或感兴趣基因的所有植物和植物细胞在本发明范围内。有利地，包含首先通过穿过细胞壁的gamma-玉米醇溶蛋白介导的转移来导入植物或细胞(或其祖先)中的感兴趣分子或基因的植物细胞可以用于与其它不同植物育种杂交以生成具有卓越特征和表型的第一代(F1)杂种细胞、种子、和/或植物。在感兴趣的分子包含一种或多种基因的实施方案中，基因可以是显性或隐性等位基因。举例而言，所述基因会赋予的性状诸如除草剂抗性、抗虫性、细菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的营养质量、和工业用途。随着使分离和表征编码特定蛋白质或RNA产物(例如RNAi)的基因成为可能的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣，即工程化改造细胞的基因组以含有和表达外来基因，或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)，以便以特定的方式改变细胞的性状。此类外来的另外的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。在过去15至20年里，已经开发了数种用于产生转基因植物细胞的方法，并且在具体的实施方案中，本发明涉及转化形式的细胞及其生成方法，其通过经由穿过植物细胞壁和膜摄取ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构将转基因导入 具有细胞壁的植物细胞来进行。在本发明的实施方案中，转基因可以包含在表达载体中。细胞转化可以牵涉构建编码会在特定细胞中发挥功能的构建体的表达载体。此类载体可以包含包括在调节元件(例如启动子)控制下的或者与调节元件(例如启动子)可操作连接的基因的DNA。表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒形式，而且可以单独或者与其它质粒联合使用，以如下文所描述的那样使用转化方法生成经转化的细胞，从而将转基因掺入包含细胞壁的植物细胞的遗传物质中。经由gamma-玉米醇溶蛋白摄取的表达载体标志物或报告物基因表达载体可以包括至少一种与调节元件(例如启动子)可操作连接的遗传标志，其容许通过负选择(即抑制不含该选择标志基因的细胞生长)或者通过正选择(即筛选由该遗传标志编码的产物)回收含有所述标志的经转化细胞。许多用于转化的选择标志基因是转化领域中公知的，包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性化学剂解毒的酶的基因，或者编码可对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正选择方法也是本领域中已知的。一种通常适合于植物转化的选择标志基因可以包括在植物调节信号控制下的新霉素磷酸转移酶II (nptll)基因，其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如Fraley等，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 80:4803 (1983)。另一种常用的选择标志基因可以是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如Vanden Elzen等，Plant Mol.Biol. ,5:299(1985)。赋予对抗生素抗性的细菌起源的另外的选择标志基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3’ -腺苷酰转移酶(adenyl transferase)和博来霉素抗性决定子。参见 Hayford 等,Plant Physiol. 86:1216 (1988)，Jones 等,Mol. Gen.Genet. , 210:86(1987) ;Svab 等，Plant Mol. Biol. 14:197 (1990)，Hille 等，Plant Mol.Biol. 7:171 (1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、草铵膦(glufosinate)或溴苯臆(bromoxynil)的抗性。参见 Comai 等，Nature 317:741-744 (1985),Gordon Kamm等，Plant Cell 2:603-618(1990);和 Stalker 等，Science 242:419-423(1988)。赋予对除草剂的耐受性的选择标志包括膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)。
其它适合于植物转化的选择标志基因不是细菌起源的。这些基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酸乳酸合酶。参见Eichholtz 等,Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987)，Shah 等,Science233:478 (1986)，Charest 等，Plant Cell Rep. 8:643 (1990)。另一类适合于植物转化的标志基因需要筛选据推测经转化的植物细胞，而不对经转化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。这些基因特别可用于量化或显现基因在特定组织中表达的空间样式，并且通常称为报告基因，因为它们可以与基因或基因调节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选经转化的细胞的基因包括葡糖醛酸糖苷酶(OTS)、β -半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。参见R. A.，Jefferson, PlantMol. Biol. Rep. 5:387 (1987)，Teeri 等，EMBO J. 8:343 (1989)，Koncz 等，Proc. Natl. Acad.SciU. S. A. 84:131(1987)，DeBlock 等，EMBO J.3:1681(1984)。最近，已经可获得用于显现⑶S活性的体内方法，其不需要破坏植物组织。Molecular Probes publication 2908, Imagene, GreenTM,第 I 页-第 4 页(1993)；和 Naleway等，J. Cell Biol. 115:151a(1991)。然而，还没有证明这些用于显现⑶S活性的体内方法对于回收经转化的细胞是有用的，这是由于低灵敏度、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为选择标志有关的限制。新近，已经利用编码荧光蛋白(例如，GFP、EGFP, EBFP, ECFPjP YFP)的基因作为原核和真核细胞中基因表达的标志物。参见Chalfie等，Science 263:802(1994)。荧光蛋白和荧光蛋白突变体可以作为可筛选标志物使用。经由gamma-玉米醇溶蛋白摄取的表达载体启动子表达载体中包含的基因必须由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。数种类型的启动子现在是转化领域中公知的，可以单独使用或者与启动子联合使用的其它调节元件也是如此。如本文中所使用的，“启动子”包括提及如下的DNA区域，其可以在转录起始的上游，而且可以牵涉识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白质以启动转录。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为“组织优选性的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中驱动表达。“诱导型”启动子可以是可在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选性的、细胞类型特异性的、和诱导型启动子构成“非组成性”启动子类。“组成性”启动子可以是可在大多数环境条件下有活性的启动子。A.诱导型启动子可以将诱导型启动子与细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。通过诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而升高。可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见Ward等，Plant Mol.Biol. 22:361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于:那些响应铜的ACEI系统的启动子(Mett等，PNAS 90:4567-4571(1993));响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的 In2 基因(Hershey 等，Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)；和 Gatz 等，Mol. Gen.Genetics 243:32-38 (1994));和来自 TnlO 的 Tet 阻抑物(Gatz 等，Mol. Gen. Genetics227:229-237(1991))。特别有用的诱导型启动子可以是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例示性诱导型启动子可以是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以受糖皮质激素诱导。Schena 等,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:0421 (1991)。B.组成性启动子 将组成性启动子与细胞中表达的基因可操作连接，或者可以将组成性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。可以在本发明中利用不同的组成性启动子。例示性的组成性启动子包括但不限于来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子(Odell等，Nature313:810-812(1985))和木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(见例如美国专利7，053，205和6，664，384);来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy 等，Plant Cell 2:163-171(1990))；来自泛素的启动子(Christensen 等，Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989)，和 Christensen等，Plant Mol. Biol. 18:675-689(1992));来自 pEMU 的启动子(Last 等，Theor. Appl.Genet. 81:581-588(1991));来自 MAS 的启动子(Velten 等，EMBO J. 3:2723-2730 (1984))；和来自玉米 H3 组蛋白的启动子(Lepetit 等，Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992)，和Atanassova 等，Plant Journal 2 (3) : 291-300 (1992))。ALS 启动子，即欧洲油菜(Brassicanapus) ALS3结构基因5’的Xbal/Ncol片段(或与所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表一种特别有用的组成性启动子。参见PCT申请WO 96/30530。C.组织特异性或组织优选性启动子可以将组织特异性启动子与用于在细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于根优选性启动子，诸如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai 等,Science 23:476-482 (1983)，和 Sengupta Gopalan 等,Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 82:3320-3324 (1985))；叶特异性和光诱导型启动子，诸如来自cab或1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶(rubisco)的启动子(Simpson 等，EMBO J. 4 (11) : 2723-2729 (1985)，和Timko等，Nature 318:579-582(1985));花药特异性启动子，诸如来自LAT52的启动子(Twell 等，Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989));花粉特异性启动子，诸如来自 Zml3 的启动子(Guerrero等，Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993))或小孢子优选性启动子，诸如来自 apg 的启动子(Twell 等，Sex. Plant Reprod. 6:217-224(1993))。可以通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。可以在蛋白质合成和加工过程中测定在结构基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中编码的蛋白质最后可以被区室化(compartmentalized)。或者,可以将此类亚细胞区室祀向性蛋白质与gamma-玉米醇溶蛋白直接连接以将用感兴趣的分子引导至期望的亚细胞区室。信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室，或者分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等，PlantMol. Biol. 20:49 (1992), Close, P. S. , Masterj s Thesis, Iowa StateUniversity (1993), Knox,C.等,“Structure and Organization of Two DivergentAlpha-Amylase Genes from Barley，，，Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987), Lerner等,Plant Physiol. 91 : 124-129 (1989) , Fontes 等,Plant Cell3:483-496 (1991), Matsuoka 等,Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991), Gould 等,J. Cell.Biol.108:1657 (1989)，Creissen 等，Plant J.2:129 (1991)，Kalderon 等，A short aminoacid sequence able to specify nuclear location, Cell 39:499-509(1984)，Steifel等，Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene inearly leaf and root vascular differentiation, Plant Cell 2:785-793(1990)。外来蛋白质基因和农艺学基因 通过根据本发明的转基因植物，可以以商业量生产外来蛋白质。如此，用于选择和繁殖经转化植物的技术(它们是本领域中充分了解的)产生多种转基因植物，它们以常规方式收获，然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如Heney和Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质提取。在本发明的各方面，为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物可以是细胞或植物。在其它方面，感兴趣的生物量可以是种子。对于相对少数的显示较高表达水平的转基因植物，可以主要经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合DNA分子的近似染色体位置)来产生遗传图谱。关于这方面的例示性方法,参见Glick和Thompson, Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton 269:284(1993)。关于染色体位置的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护可以是有用的。如果可以进行未经授权的繁殖和与其它种质进行杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是否与主题植物具有共同亲本(parentage)。图谱比较会牵涉杂交、RFLP, PCR、SSR和测序，它们都是常规技术。同样地，可以在经转化的细胞或其后代中表达农艺学基因。更具体地，可以经由本发明的方法对植物进行遗传工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。可以在这方面使用的例示性基因包括但不限于下文进行归类的基因。I.赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)产物与病原体中相应无毒力(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如Jones等，Science266:789(1994)(克隆对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)有抗性的番茄Cf_9基因)；Martin 等,Science 262:1432 (1993)(对丁香假单胞菌番爺致病变种(Pseudomonassyringae pv. tomato)有抗性的番爺Pto基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等，Cell78:1089 (1994)(对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)有抗性的拟南芥(Arabidops)RSP2基因)。B)赋予对害虫诸如大豆胞囊线虫有抗性的基因。参见例如PCT申请W096/30517 ；PCT 申请 WO 93/19181。C)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以其为模型的合成多肽。参见例如Geiser等，Gene 48:109 (1986)，其披露了 Bt δ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码S-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) ,Manassas,Va.,例如以ATCC保藏号40098、670136、31995 和 31998 购得。D)凝集素。参见例如 Van Damme 等，Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)的公开内容，其披露了数种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。E)维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白。参见PCT申请US93/06487。该申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。 F)酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等，J. Biol. Chem. 262:16793 (1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列)，Huub等，Plant Molec. Biol. 21:985(1993)(编码烟草蛋白水解酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)，Sumitani 等,Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993)(硝抱链霉菌(Streptomycesnitrosporeus) alpha-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)和美国专利号5，494，813 (Hepher和Atkinson, 1996 年 2 月 27 日公开)。G)昆虫特异性激素或信息素，诸如蜕皮类固醇或保幼激素，其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等，Nature344:458 (1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达的内容。H)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参见Regan, J. Biol. Chem. 269:9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)，和Pratt等,Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989)(可以在太平洋折翅爐(Diplopterapuntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin))的公开内容。还可参见Tomalski等的美国专利号5，266，317，其披露了编码昆虫特异性、麻痹性神经毒素的基因。I)在自然界由蛇、黄蜂(wasp)或任何其它生物体生成的昆虫特异性毒液。例如参见Pang等，Gene 116:165 (1992)，是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。J)酶，其负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物或另一具有杀昆虫活性的非蛋白质分子。K)牵涉对生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。参见以Scott等名义的PCT申请W093/02197，其披露了 callase基因的核苷酸序列。含有壳多糖酶编码序列的DNA分子可以例如从ATCC以保藏号39637和67152获得。还可参见Kramer等,Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)(其教导了编码烟草天蛾壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，Plant Molec. Biol. 21:673(1993)(其提供了欧芹ubi4_2多聚泛素基因的核苷酸序列)。
L)刺激信号转导的分子。例如参见Botella等，Plant Molec.Biol. 24:757 (1994)(关于绿豆I丐调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPysiol. 104:1467(1994)(其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公开内容。M)疏水矩妝(hydrophobic moment peptide)。参见 PCT 申请 WO 95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公开内容)和PCT申请WO95/18855(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。N)膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见Jaynes等，PlantSci. 89:43 (1993)公开的杀菌肽-β 溶胞肽类似物(cecropin-β lytic peptide analog)的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。0)病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化植物细胞中的积累赋予对由可衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等，Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990)。已经对经转化的植 物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。P)昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，这杀死昆虫。参见Taylor等，摘要号497，Seventh Int’ ISymposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland)(1994)(经由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活)。Q)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等，Nature 366:469 (1993),其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。R)在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌内a -I, 4_D_多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-a-1，4-D-半乳糖醒酸酶(galacturonase)来促进真菌定殖(colonization)和植物营养物释放。参见Lamb等，Bio/Technology 10:1436(1992)。编码豆内多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以由Toubart等，Plant J. 2:367(1992)描述。S)在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology10:305(1992)显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。2.赋予对除草剂的抗性的基因A)抑制生长点或分生组织的除草剂，诸如咪唑啉酮或磺酰脲。在这类中的例示性基因编码突变的ALS和AHAS酶，如分另Ij由例如Lee等，EMBO J. 7:1241 (1988)和Miki等,Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)所描述的。B)草甘膦(分别由例如突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(经由导入重组核酸和/或天然EPSP基因的体内诱变的各种形式)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因赋予的抗性)、其它膦酰基化合物诸如草铵膦(glufosinate)(来自链霉菌属物种(Streptomycesspecies),包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的草铵膦乙酰基转移酶(PAT)基因)、和卩比唳氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)，见例如Shah等的美国专利No. 4，940, 835和Barry等的美国专利6，248，876，其披露了可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏号39256获得，并且突变体基因的核苷酸序列可以在Comai的美国专利No. 4，769，061中披露。Kumada等的欧洲专利申请No. O 333 033和Goodman等的美国专利No. 4，975，374披露了对除草剂诸如L-膦丝菌素(L-phophinothricin)赋予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以参见Leemans等的欧洲申请No. O 242 246, DeGreef等，Bio/Technology7:61(1989)描述了生成表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物。赋予对苯氧基丙酸和环己酮，诸如稀禾定(sethoxydim)和卩比氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括 Marshall 等，Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)描述的 AcclSl、AcclS2 和 AcclS3 基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于Castle等的WO 2005012515。赋予对2，4-D、苯氧基丙酸和卩比唳基氧基生长素除草剂的抗性的基因记载于归于Dow AgroSciencesLLC的WO 2005107437。C)抑制光合作用的除草剂，诸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，Plant Cell 3:169(1991)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美国专利号4,810, 648，并且含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435、67441、和67442获得。 编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达可以由Hayes等，Biochem. J. 285:173(1992)描述。3.赋予或促成增值(value-added)性状的基因,诸如A)经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 89:2624(1992)。B)降低的肌醇六磷酸盐含量——I)肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六磷酸盐的分解，向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt等，Gene 127:87 (1993),关于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容。2)可以导入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。例如在玉米中，这可以如下实现，即克隆与单一等位基因有关的DNA，然后再次导入，所述单一等位基因可以负责特征为低水平肌醇六磷酸的玉米突变体。参见Raboy等，Maydica 35:383(1990)。C)例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳水化合物组成。参见 Shiroza 等，J. Bacteol. 170:810 (1988)(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列),Steinmetz等，Mol. Gen. Genet. 20:220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的核苷酸序列可以是果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因)，Pen 等，Bio/Technology 10:292 (1992)(表达地衣芽胞杆菌(Bacillus lichenifonn)α-淀粉酶的转基因植物的生成)，Elliot等，Plant Molec. Biol. 21:515 (1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard等，J. Biol. Chem. 268:22480 (1993)(定点诱变可以是大麦α-淀粉酶基因的)，和Fisher等，Plant Physiol. 102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶 II)。在本发明的具体实施方案中，可以将gamma玉米醇溶蛋白与纳米颗粒融合。可以将纳米颗粒的表面官能化，其可以例如容许靶向摄取或者容许将其它物质可逆或不可逆结合至纳米颗粒表面。作为非限制性例子，可以用例如烷烃硫醇盐(alkanethiolate)的自身装配单层官能化纳米颗粒(例如，金纳米颗粒或量子点)的表面，所述烷烃硫醇盐可以进一步官能化或衍生物。在又一个非限制性例子中，可以用接头衍生化纳米颗粒的表面，所述接头自身可以进一步官能化或衍生物。在一个实施方案中，可以将纳米颗粒进行PEG化。在其它实施方案中，纳米颗粒可以包含下列一种或多种，或者可以用下列一种或多种多官能化核心(活性或无活性)、空间外层(steric coat)(活性或惰性)、可切割连接和/或祀向分子或配体。纳米颗粒可以选自金纳米颗粒、金包被的纳米颗粒、多孔性纳米颗粒、中孔性纳米颗粒、娃土纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、鹤纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳(nanoshell)、纳米核心(nanocore)、纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、磁性纳米颗粒及其组合。同样地，在本发明的具体实施方案中，可以将ga_a玉米醇溶蛋白与量子点融合。在本发明的各方面中，可以将g amma玉米醇溶蛋白和纳米颗粒摄取入细胞的各个部分中。可以摄取纳米颗粒的位置的例子包括但不限于胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。在本发明的其它实施方案中，摄取入包含细胞壁的细胞中的纳米颗粒可以经由共质体或质外体途径发生。在本发明的其它方面中，可以将ga_aS米醇溶蛋白和量子点摄取入细胞的前述各部分中。
实施例本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例作为例示提供，而并不意图以任何方式限制本发明。实施例Igamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白的构建将编码蛋白质gamma-玉米醇溶蛋白(GenBank登录号#AAL16977. 1，GI: 16305109)的修饰的玉蜀黍N-端区的DNA序列与Philadium黄色突光蛋白(YFP) (Evrogen, Moscow,Russia)的N端融合。修饰6个氨基酸的gamma-玉米醇溶蛋白基序,其中将第二个残基从组氨酸改变成精氨酸。进行此修饰以将融合序列引导至细胞核。已经显示了精氨酸改善蛋白质易位入细胞的胞质溶胶和细胞核中的效率。(Mitchell，等，(2000)，The Journal ofPeptide Research, 56(5) : 318-325)。将gamma-玉米醇溶蛋白的N-端区的经修饰的6个氨基酸(VRLPPP)的三聚体与YFP融合。另外，将6x-His标签在gamma-玉米醇溶蛋白三聚体和YFP编码序列间放置。添加6x-His基序以便于蛋白质纯化。此融合蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO: I呈现。融合基因序列(SEQ ID NO:2)经由自动化DNA合成仪使用亚磷酰胺化学以化学方式合成。此序列的化学合成外包给DNA2. O(Menlc) Park，CA)。使用DNA2. O专有算法将序列进行密码子优化以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达，从而生成“大肠杆菌优化的”核苷酸序列。该算法鉴定在期望的宿主生物体内不频繁使用的密码子，并用更频繁使用的密码子替换这些密码子。另外，该算法除去顺式调节序列(例如RNA酶位点、RNA 二级结构、转录终止位点)和过多的限制酶。将额外的序列添加至ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合基因的末端以便于克隆和表达。将 Shine-Dalgarno 序列(Shine J, Dalgarno L (1975). Nature254(5495) :34 - 8.)和独特的SpeI限制酶位点添加至基因序列的5，端。将独特的XhoI限制酶位点添加至基因序列的3’端。将所得的载体标记为pJ201:18056(图I)。
I. IpET表达载体的构建经由标准克隆技术将gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合序列克隆入大肠杆菌表达载体 pET280 中。pET280 是 pET28 质粒的一种改良型式(Novagen, Gibbstown, NJ)。自 pET28除去多克隆位点和核糖体结合位点，由此创建PET280。将含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP编码序列的SpeI-XhoI片段自pJ201:18056载体切出，并连接入pET280表达载体的相应限制位点中。经由限制酶消化和测序确认所得的质粒。将质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。将单菌落分离并以甘油储液忙存，直至进一步使用。I. 2Gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白的表达和分离使用以下条件诱导gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白将含有pET280/gamma-玉米醇溶蛋白/YFP表达构建体的培养物在2升(L) Luria-Bertani培养基和50 μ g/ml卡那霉素中于25° (培养至0.0.6(|(|为0.6。在达到期望的0.0.6(|(|后，用0.1禮IPTG(异丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)于25° C将培养物诱导16小时。 分离并纯化表达的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白。将2L细胞培养物以24，OOOxg离心10分钟，并弃去上清液。将5g含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的细胞浆在PBS中的IOOml冷提取溶液(O. 5M NaCl,5%甘油和O. 5mlSigma蛋白酶抑制剂混合物(产品目录编号# 8849)中重悬)。使用超声处理(Branson Sonifier 450型)在冰上破坏细胞达15分钟。将样品于4° C以24，OOOx g离心20分钟，并将上清液过滤通过
O.45 μ m]V1inipore''〈过滤装置。将咪唑以终浓度IOmM添加至样品。使用Akt Explorer100系统(GE’ Pharmacia)将含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的溶胞物以5ml/分钟加载到串联的2x 5mlHisTrap 柱(GE/Pharmacia，产品目录编号#17-5248-02)上。用缓冲液A (PBS中的IOmM咪唑，O. 5M NaCl)清洗柱，直至A280的吸光度达到基线。然后，用10%和20%缓冲液B(缓冲液A中的O. 2M咪唑)以约4x柱体积(CV)的体积序贯清洗柱。在10-15个CV里用20-100%缓冲液B洗脱样品，并收集4ml级分(图2)。L3SDS-PAGE 分析将蛋白质凝胶运行以显现分级的蛋白质。使用XCellSureLock Mini-Cell (Invitrogen,产品目录编号#EI0001)将10-20 μ I每份样品加载到预制的10%Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Invitrogen,产品目录编号#NP0302B0X)上以进行电泳。将样品以200V在MES-SDS运行缓冲液(Invitrogen,产品目录编号#NP0002)中运行35分钟。用考马斯蓝R-250 (Bio-Rad,产品目录编号#161-0436)染色凝胶，如图3中显示的。将含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP样品的级分合并，并转移入具有IOkDa MWCO的Millipore旋转柱中，并使用台上式Eppendorf离心机(5810R型)以4，OOOrpm于4° C离心20分钟。离心后，将无菌PBS溶液添加多至15ml以进行缓冲液更换。将此旋转和渗滤方法重复三次。将合并的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP样品转移入具有IOkDa MWCO的SnakeSkin 打褶式(pleated)透析管道(Thermo Scientific,产品目录编号#68100)中，并于4° C针对2LPBS透析过夜以除去咪唑残留。使用Bradford测定法(Bio-Rad,产品目录编号#500-0006)用牛血清清蛋白(BSA)标准品测定蛋白质浓度(图3)。I. 4Maldi-TPF肽质量指纹法将来自SDS-PAGE凝胶的Iyg蛋白质条带(约I Ug)切出，并在Speed-Vac中在具有12. 5mM碳酸氢铵的25%乙腈中干燥。在过夜温育期间于37° C通过胰蛋白酶(12. 5ng/μ I)消化蛋白质。使用C18Zip Tip(Millipore,产品目录编号#2TC18S096)循环制造商的用法说明书纯化肽。使用Voyager活组织分光度测量术(PerSeptive Biosystems, DESTR型)实施质谱分析，并以阳离子反射器模式收集质谱(图4)。将数据输入分析程序PAWS (Proteometrics Inc.)中以搜索妝身份。实施例2单细胞植物材料的制备2. IJTNTl 细胞JTNTl细胞是自烟草分离的光合自养细胞。转化前3至4天，通过将2mlJTNl细胞 转移入250ml烧瓶中含有50nM DAS-PMTI-I (微管抑制剂)和O. 5-0. l%(v/v) DMSO的40mlNTlB或LSBY2培养基中将悬浮培养物传代培养至新鲜培养基。在微管抑制剂处理后第4天或第7天时收集单细胞(如记载于例如WO 2008/083233的)。将细胞在极限培养基和5%二氧化碳中维持。通过转移Iml O. D. _3. O的悬浮液将细胞每14天传代培养一次。使用这些细胞类型作为祀细胞以递送并定位ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽。2. 2胡萝卜细胞将可再生的胡萝卜冷藏系(D2-40-018)融化，并在Linsmeier-Skoog(LS)培养基(记载于 Nagata, T.，Nemoto, Y.和 Hasezawa, S. (1992) Int. Rev. Cyto 132,1-30)中培养。培养基盐购自PhytoTechnology Laboratories,产品目录编码#L689。将活跃生长的悬浮系在一周内建立，并通过将2ml PCV(压紧细胞体积)转移至58ml LSBY2悬浮20培养基于28。C在轨道摇动器(Innova-3300)上以125rpm在漫射光下按7天培养周期传代培养维持系。对于单细胞生成，将ImlPCV的稳定期的胡萝卜悬浮液添加入30ml具有ImM秋水仙素(Sigma，产品目录编号#C3915)的LS悬浮培养基中，并培养7天。自3_7天培养物生成单细胞，并将其准备好进行转化实验。可以通过添加60ml新鲜的LS BY2液体培养基通过在第14天时稀释培养物将胡萝卜的单细胞于稳定期维持多至28天。实施例3用gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白处理细胞用15yg Hoechst于37° C将细胞预先染色10分钟。在温育期后，除去过量的染料。将细胞以4000rpm离心5分钟，并弃去上清液。用含有3%蔗糖的ImlPBS溶液将细胞
清洗二次。将gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白以50 μ M浓度添加至eppendorf管内的Iml胡萝卜单细胞或JTNTl细胞。将管以IOOrpm于25。C放置于摇动器上达60分钟。实施例4植物细胞内gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白积累在10分钟、30分钟和60分钟时取出100 μ I融合蛋白/细胞混合物的等分试样以进行成像。将细胞以5，OOOrpm离心5分钟，并用PBS清洗三次。最后，将细胞在100 μ IPBS中重悬。监测融合肽内在化并定位入植物细胞和组织的亚细胞区室中的效率。将细胞在LSM-Leica TCS SP2/UV或Zeiss LSM上成像。使用高数值孔径(I. 2-1. 3)水浸物镜(63x)和来自氩离子以激发YFP的488nm或514nm激光线。
分别使用405nm和488nm激光用430_480nm和LP560nm滤光器捕捉共焦和微分干涉相差(DIC)图像。显示gamma-玉米醇溶蛋白黄色荧光信号在10分钟后定位于胡萝卜和JTNTl单细胞两者的核仁和胞质(在图5中显示)。实施例5在植物中，通过浸花法(floral dip)用肽和质粒DNA转化拟南芥(Arabidopsis)将纯化的gamma-玉米醇溶蛋白肽与质粒DNA pDAB3831 (在图6中显示)混合。将
O.25mg gamma-玉米醇溶蛋白肽添加至.5mg质粒DNA,并在水中温育30分钟以形成肽/DNA复合物。PDAB3831含有由拟南芥泛素10启动子(AtUbilO)驱动的PAT选择标志基因和由木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV)驱动的Philadium黄色荧光蛋白基因(PhiYFP)。对拟南芥哥伦比亚栽培种(Arabidopsis thaliana cv Columbia)的4周龄花芽施用gamma-玉米醇溶蛋白肽/pDAB3831复合物和仅pDAB3831质粒DNA的不同对照实验。将20mL肽/DNA复合物和20ml DNA对照在玻璃槽中与渗透培养基(5%蔗糖和O. 04%Silwet-77)混合30秒。使用改良的Clough和Bent方案使用含有肽/DNA溶液的渗透培养基来转化拟南芥植物(Clough SJ和Bent AF, 1998. Plant J16:735-43) 在浸溃后，将渗透复合物于4° C贮存，随后在两天后使用相同方案用于浸溃相同植物。完成重复转化步骤以提高转化频率。通过塑料罩覆盖植物以维持湿度达24小时。在24小时后，将罩除去，并将植物在ConvilOn (CMP4030 和 CMP3244 型，Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada)中在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150 μ mol/m2/sec的光强度在恒定的温度(22° C)和湿度(40-50%)下正常培养，并容许成熟并生成种子。将TO种子收集并灭菌。另外，将种子于4° C春化2天。为了选择阳性转化体，将种子在含·有 10 μ g/ml BASTA 的 MS 培养基(0. 43%Murashige 和 Skoog 盐混合物、2. 5mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸、IxGamborg氏维生素溶液、0. 9%细菌用琼脂，pH 5.7-5.9)上分配，并在培养箱(22° C，100 μ mole量子m-2s_l)中培养7_10天。将推定的转化体鉴定，并转移至土壤，并培养至成熟。实施例6转基因PAT和YFP的分子分析使用植物DNAZOL试剂盒(Invitrogen Inc)自6周龄植物的叶材料提取来自拟南芥转基因植物的gDNA和来自拟南芥生态型哥伦比亚野生型对照的gDNA。仅自转基因植物PCR扩增PAT和YFP基因片段。50 μ L PCR反应混合物含有IOOng模板DNA、Ix ExTaq反应缓冲液(TaKaRa Bio)、0· 2mM dNTP、IOpmol 每种引物和 0. 025 个单位 / μ L ExTaq0 YFP引物以 SEQ ID Ν0:3 和 SEQ ID Ν0:4 显示。PAT 引物以 SEQ ID Ν0:5 和 SEQ ID Ν0:6 显示。使用下列PCR循环条件于96° C持续5分钟的I个循环，下列PCR程序的31个循环94° C，15秒；65° C，30秒；72° C，I分钟，并于72° C实施最终延长达7分钟以完成产物合成。使用QIAquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc)凝固纯化扩增的片断。使用PAT正向引物(SEQ ID NO:5)和YFP正向引物(SEQ ID NO:3)使用先进的Sanger测序技术(MWGBiotechnologies, Inc)使用 PAT 正向引物(SEQ ID NO:5)和 YFP 正向引物(SEQ ID NO:3)测序PCR片段，并使用Sequencher 软件分析序列。实施例7鉴定同源基序和诱变Gamma-玉米醇溶蛋白序列以实现改善的蛋白质易位效率
将与gamma-玉米醇溶蛋白域同源的其它基序鉴定，并测试胞内蛋白质易位。自目前的公共数据库，诸如NCBI (国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information))鉴定这些序列。使用gamma-玉米醇溶蛋白序列作为输入以进行 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul 等，1997)算法。使用缺省设置，针对存放的NCBI蛋白质序列比较所述序列。搜索返回几种同源蛋白质序列。将鉴定的gamma-玉米醇溶蛋白基序修饰为增强胞内蛋白质易位的效率。经由定点诱变方案改变VRLPPP序列的多个残基。使用上文所描述的方案，使用经修饰的gamma-玉米醇溶蛋白序列将蛋白质和DNA递送入植物细胞中。 实施例8使用嵌合Ga_a-玉米醇溶蛋白序列靶向细胞细胞器进行其他实验以测试经由嵌合gamma-玉米醇溶蛋白/细胞细胞器靶向基序对细胞细胞器进行肽靶向。在一个具体的例子中，将ga_a-玉米醇溶蛋白和叶绿体靶向序列与荧光蛋白，诸如YFP的N端融合。经由荧光显微术成像YFP蛋白质对叶绿体的靶向。将本领域中已知的各种其它细胞细胞器(例如，线粒体、内质网、细胞核等)的其它靶向序列与gamma-玉米醇溶蛋白序列一起融合，并用于靶向特定的细胞细胞器。将蛋白质或DNA靶向至鉴定的细胞细胞器。虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述，但是可以在本公开内容的精神和范围内进一步修饰本发明。因此，本申请意图覆盖本发明使用其一般原理的任何变型、用途、或改编。此外，本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内和落入所附权利要求书及其等同方案的限定内的本公开内容的偏离。
权利要求
1.一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括 提供具有细胞壁的植物细胞； 将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构； 将所述具有细胞壁的细胞和所述ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中；并 容许将所述ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构摄取入所述具有细胞壁的细胞中。
2.依照权利要求I的方法，其中将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用包括将所述感兴趣的分子与所述gamma-玉米醇溶蛋白肽融合。
3.依照权利要求I的方法，其进一步包括容许将所述gamma-玉米醇溶蛋白连接结构摄取入包含细胞壁的植物细胞的区室中。
4.依照权利要求3的方法，其中所述区室选自下组胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。
5.依照权利要求I的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、蓖麻属物种(Ricinus sp.)、和甘鹿细胞。
6.依照权利要求I的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。
7.依照权利要求I的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。
8.依照权利要求I的方法，其中所述感兴趣的分子包括选自下组的组分核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信号传导肽、抗体、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、及其组合。
9.依照权利要求8的方法，其中所述感兴趣的分子包含基因。
10.依照权利要求9的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农学基因、或标志物基因。
11.依照权利要求9的方法，其进一步包括选择已经稳定整合所述基因的细胞。
12.依照权利要求11的方法，其中选择的细胞是可再生细胞。
13.依照权利要求12的方法，其进一步包括自所述可再生细胞再生能育植物。
14.一种表达基因的方法,该方法包括 提供具有细胞壁的植物细胞； 将gamma-玉米醇溶蛋白肽与基因相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构； 将所述具有细胞壁的植物细胞和所述ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构置于彼此接触中； 容许将所述gamma-玉米醇溶蛋白肽和所述基因摄取入所述包含细胞壁的植物细胞中；并 在具有所述植物细胞的植物的后代中表达所述基因。
15.依照权利要求14的方法，其中所述基因在叶绿体中表达。
16.依照权利要求14的方法，其进一步包括选择稳定表达所述基因的细胞。
17.依照权利要求14的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。
18.一种用于将分子物质转移入植物细胞中的方法，包括将gamma-玉米醇溶蛋白肽与质粒DNA相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构；并 在容许将所述gamma-玉米醇溶蛋白肽和来自所述质粒DNA的基因摄取入所述植物细胞中的条件下使所述ga_a-玉米醇溶蛋白连接结构与携带完整壁的植物细胞接触。
19.权利要求18的方法，其进一步包括在具有所述植物细胞的植物的后代中稳定表达所述基因。
20.依照权利要求18的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。
全文摘要
一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法包括将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接结构。然后，将gamma玉米醇溶蛋白连接结构置于与具有细胞壁的植物细胞的接触中，并容许将gamma玉米醇溶蛋白连接结构摄取入植物细胞中。或者，可以在具有完整细胞壁的植物细胞中表达感兴趣的基因，其通过将gamma-玉米醇溶蛋白肽与感兴趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白连接基因结构，容许将gamma玉米醇溶蛋白连接基因结构摄取入植物细胞中，并在植物细胞及其后代中表达感兴趣的基因。
文档编号C12N15/29GK102933073SQ201180027026
公开日2013年2月13日 申请日期2011年3月8日 优先权日2010年3月31日
发明者N.C.萨姆伯朱, J.P.萨缪尔, G.林, S.R.韦布, F.G.伯劳格斯 申请人:陶氏益农公司