专利名称:监测细胞和生物分子生物学行为的生物传感器及传感方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器领域，特别是基于阻抗技术对细胞和核酸、蛋白等生物分子的生物学行为进行监测。本发明具体包括利用阻抗技术监测细胞和生物大分子生物学行为的器件和传感方法。
背景技术：
传统的监测细胞和生物大分子生物学行为的方法有很多，但主要是一些生化和免疫学的方法，例如用荧光染料标记，然后用紫外光激发，用荧光显微镜检测。用MTT/XTT比色法测定细胞增值能力是一个用生化方法测定细胞生物学行为的一个代表性示例，这种方法的原理是在代谢旺盛的正常细胞中，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质(如MTT、XTT、WST-1等)还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，因而紫色结晶的量反映了细胞增值能力的大小。从而，只要通过酶标仪读取OD值，就可以测定到细胞的增值状态(Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivalapplication to proliferationand cytotoxicity assays.J Immunol Methods.1983 655-63.)。MTT方法的优势主要在于其操作相对简单，灵敏度高，因而取得了比较广泛的应用。但是，这类用生物化学和免疫学手段监测细胞生物学行为的方法也存在一些难以克服的问题，例如不能连续、实时监测，需要进行荧光或抗体等化学标记，对细胞会造成一定的化学毒害，难以实现高度自动化的监测等等。
一些生物物理的方法能够在一定程度上克服上述缺点中的一项甚至多项，例如用电旋转的方法监测细胞活性和在药物作用下细胞生物学行为的改变(中国专利高通量电旋转检测的装置和方法申请(专利)号00124086.2程京；许俊泉；朱小山；刘理天；王小波；吴镭)。基于阻抗测量的细胞和生物大分子生物学行为的监测方法也是一种非常灵敏的，能够实时、连续测量，无需化学标记的生物物理方法，在下面的文献资料中有相关阐述(Giaever I.and Keese C.R.，″Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field″，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1984，vol.81，pp 3761-3764)。
细胞电阻抗主要由器件上电极与溶液界面以及溶液中的离子环境决定，同时也由细胞在电极上的贴附状态决定，例如当细胞在电极上伸展的时候，与电极的接触面积增大，这时阻抗值便会上升；反之，当细胞死亡的时候阻抗则会降低。当细胞的状态，例如细胞的形态、繁殖能力、贴附状态等发生变化的时候，阻抗值也会相应的发生变化，已经有实验证明阻抗测量的方法比一些常用的生化方法更为灵敏。
发明内容本发明的目的在于提供一种监测细胞和生物分子生物学行为的生物传感器和传感方法。该传感器的特征在于在绝缘的基质上面附着两个或两个以上的电极，绝缘的基质和电极的材料均为生物相容性好的材料；所述传感器的电极至少有两个；所述传感器的绝缘基质的材料是包含玻璃、或硅、或高分子聚合物材料或它们的组合在内的生物相容性好的绝缘材料；所述传感器的电极是包含金属、或非金属、或他们的组合在内的导电体材料。
本发明提出的监测细胞和生物分子生物学行为的传感方法，其特征在于该方法依次含有以下几个步骤第一，在传感器上培养细胞或黏附DNA、或蛋白质生物大分子；第二，将传感器与限流电阻串连后接入测量装置；第三，测量装置对传感器与电阻构成的串连电路上加载正弦交流电信号；第四，测量装置同时测量传感器上的正弦交流电压信号和加载的正弦交流电压信号，并根据测量结果计算传感器的阻抗
，计算公式如下Z.=U.2U.1R]]>其中
为传感器上的正弦交流电信号，
为加载在传感器和限流电阻两端的正弦交流电压信号，R为限流电阻的阻值。
本发明利用这种传感器和传感方法实时监测了THP-1细胞在佛波脂诱导下分化为THP-1巨噬细胞的过程，实验装置包括传感器、阻抗测量仪以及一台计算机，我们在实验中采用的激励信号的频率为1KHz、20KHz、30KHz、40KHz、50KHz、80KHz、100KHz、200KHz和250KHz，电压的幅值为2V。在实验中，我们实时监测了THP-1细胞分化全过程中阻抗曲线的变化。
该方法还具有灵敏，能够实时、连续测量，无需化学标记，不会对细胞造成化学毒害，并且易于实现自动化测量等优点。
图1A和图1B是细胞电阻抗测量器件的示意图，其中图1B是图1A中局部的放大图。1-电极，2-绝缘基质。
图2是测量装置的原理框图。
图3阻抗计算的原理图及其公式说明。
具体实施方式本发明的技术方案是在利用微加工技术制作的微电极器件上进行细胞培养，同时，在电极上加以微弱的交流电场，当细胞在微器件上贴壁生长的时候会对电场造成阻碍作用(即阻抗)，当细胞由于生长、增值、分化以及收到药物刺激而导致其形态发生变化的时候，其对电场的阻碍作用(即阻抗)便会发生变化，因而，通过对其阻抗的监测，便可以间接监测细胞的生物学行为。同样，当生物大分子附着在微电极器件上时，也会对微弱的交流电场带来阻碍作用，当生物分子的某些生物学行为发生变化时，例如抗原和抗体发生结合，也会带来阻抗的改变，通过对其阻抗的监测，便可以间接监测生物大分子的生物学行为。
本发明所提供的器件包括附着在绝缘体上的非绝缘电极，绝缘体可以是玻璃、硅、高分子聚合物，例如聚碳酸脂等材料。电极可以是金等金属，也可以是氧化铟锡等金属氧化物。一个器件上有两个或两个以上的电极，并用引线把电极引出器件，与测量装置相连，测量阻抗值。测量时，需要产生一定频率和幅值的正弦波信号，通过串连的电阻(K欧姆——M欧姆数量级，具体阻值根据器件的阻抗确定)接入测量装置，电阻的阻值约为传感器阻抗值的千倍左右，从而使传感器工作在恒流源模式。数据采集模块分别将传感器上的电压信号和总电压模拟信号转换为数字信号，采集到控制模块，通过软件分析，得出传感器的阻抗信息，包括阻抗的模和相位。该测量装置可以提供多个频率下的阻抗信息，测量每个频率下的阻抗只需要最多5秒，也就是说如果只测量一个频率下的阻抗，可以每隔5秒中测量一次，达到了实时测量的要求。
在此所用，“生物学行为”包括但并不仅仅包括细胞的形态变化、细胞的增值、分化以及细胞在药物作用下所发生的变化；包括并不仅仅包括蛋白、核酸等生物大分子的相互作用等。
器件的加工和封装本发明中，用于阻抗测量的电极是在玻璃基质上用微加工中常用的光刻工艺，刻出电极的图形，然后用真空蒸镀工艺将金蒸镀在玻璃基质表面，去除光刻胶后形成传感器的电极部分。用紫外胶将上述电极粘接在塑料培养皿底部，并用导电胶将导线与电极粘接在一起，导电胶固化后上面覆盖紫外胶，防止在进行细胞培养时对细胞可能造成的毒性，导线引出培养皿并与测量装置相连。
权利要求
1.监测细胞和生物分子生物学行为的生物传感器，该传感器的特征在于在绝缘的基质上面附着两个或两个以上的电极，绝缘的基质和电极的材料均为生物相容性好的材料。
2.如权利要求
1所述的监测细胞和生物分子生物学行为的生物传感器，其特征在于，该传感器的电极至少有两个。
3.如权利要求
1所述的监测细胞和生物分子生物学行为的生物传感器，其特征在于，该传感器的绝缘基质的材料是包含玻璃、或硅、或高分子聚合物材料或它们的组合在内的生物相容性好的绝缘材料。
4.如权利要求
1所述的监测细胞和生物分子生物学行为的生物传感器，其特征在于，该传感器的电极是包含金属、或非金属、或他们的组合在内的导电体材料。
5.监测细胞和生物分子生物学行为的传感方法，其特征在于该方法依次含有以下几个步骤第一，在传感器上培养细胞或黏附DNA、或蛋白质生物大分子；第二，将传感器与限流电阻串连后接入测量装置；第三，测量装置对传感器与电阻构成的串连电路上加载正弦交流电信号；第四，测量装置同时测量传感器上的正弦交流电压信号和加载的正弦交流电压信号，并根据测量结果计算传感器的阻抗
，计算公式如下Z.=U.2U.1R]]>其中
为传感器上的正弦交流电信号，
为加载在传感器和限流电阻两端的正弦交流电压信号，R为限流电阻的阻值。
专利摘要
本发明涉及生物传感器领域，特别是基于阻抗技术对细胞和核酸、蛋白质等生物大分子的生物学行为进行监测。本发明所涉及的传感器的特征在于在绝缘基质上附着两个或两个以上的电极，绝缘基质和电极的材料均为生物相容性较好的材料。本发明所涉及的传感方法的特征在于通过测量传感器的阻抗，实现间接、实时测量细胞和生物大分子的生物学行为。本发明是一种对细胞和生物分子的生物学行为进行自动化、实时监测的方法，具有灵敏，能够实时、连续测量，无需化学标记，不会对细胞造成化学毒害，并且易于实现自动化测量等优点。
文档编号C12Q1/00GK1996001SQ200610011110
公开日2007年7月11日 申请日期2006年1月6日
发明者王磊, 郭旻, 程京 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan