专利名称：一种含有抑制血管增生的融合蛋白的药物组合物及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂领域，涉及包含VEGF受体片段和免疫球蛋白Fc融合而成的蛋白的药物组合物，以及其在医疗上的应用。
背景技术：
随着现代细胞分子生物学的发展，细胞因子和细胞表面相关分子在眼科疾病中的作用已经被广泛的关注和研究，VEGF是血管内皮细胞促有丝分裂素具有增加血管通透性的生物特性，在胎儿时期VEGF对血管的发生极为重要，出生后水平下降。生理状态下 VEGF呈低水平表达状态，对于维持血管的功能是必要的。最新的研究结果提示，对于老年性视网膜血管病变(Age-related macular degeneration，简称为AMD)、糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)等血管新生相关的疾病都起着广泛和重要的作用。AMD多发生于45岁以上，其患病率随年龄的增长而增高，是当前中老年人致盲的重要疾病。湿性 AMD主要为玻璃膜的破坏，脉络膜血管侵入视网膜下构成脉络膜新生血管，发生黄斑区视网膜色素上皮下或神经上皮下浆液性或出血性的盘状脱离，最终成为机化瘢痕，有效抑制导致湿性黄斑病变的血管内皮细胞生长因子VEGF，阻断VEGF或VEGF受体从而达到抑制血管新生具有重要的有着重要的治疗作用。在DR中，细胞和体液中VEGF的含量高于正常水平。 VEGF增高，引起毛细血管通透性改变，引起视网膜渗出，出血及视网膜黄斑水肿，诱导血管生成素(Angiogenin)生成增加，协同促进视网膜新生血管的形成，造成视力损害。盐键、氢键、二硫键和疏水作用是维持蛋白质构象稳定作用力。金属离子、底物、辅助因子和其他低相对分子量配体的相互作用使蛋白构象稳定。蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用。在生物体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用形成复合物，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质的稳定性。蛋白不稳定主要由以下因素引起(1)物理作用由布朗运动调节的极性水分子与蛋白质疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。( 化学作用活性部位的氨基酸残基的氧化作用是酶失活的最常见机理之一。如半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感。( 生物学作用蛋白质水解酶作用。 微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽键水解。由基因工程菌纯化真核细胞多肽时收率低， 是由于体外蛋白水解造成的。聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂，导致蛋白质可逆变性； 其次，蛋白质分子彼此缔合，以减少疏水氨基酸的不利裸露；最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫键交换反应。聚合作用有时可通过还原和再氧化再生天然二硫键，使蛋白质再活化。聚合和简单沉淀是有区别的，后者并未使蛋白质发生显著的构象变化。本发明人还观察到一个明显的问题是溶液制剂在长期储存后容易形成可溶聚合物和不可溶颗粒，如何解决这个问题，找到一种在物理和化学上都稳定的药物组合物，能够抑制聚合物生成，并能够在长期储存后形成较少的可溶聚合物和不溶颗粒。另外，由于其组分是药学上可接受的组分，可以用于治疗眼部疾病，包括玻璃体内注射和外部给药。此外，本发明人发现得到的制剂处方在注射器中比在小瓶中更加稳定。本发明中采用能够抑制血管新生，由血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1的细胞外结构域2(Flt-2)和VEGF受体2的细胞外结构域3和4(KDR-3，4)与人免疫球蛋白I(Gl) Fc的融合而成的蛋白(FP3蛋白)是通过重组技术的工作细胞表达并经过纯化后达到药用纯度，经过换液制剂分装制得合适的药物制剂。这些制剂优选液体制剂或冻干制剂，适用于眼睛疾病的治疗，尤其是用于玻璃体注射。FP3蛋白作为蛋白药物，其稳定性比普通小分子化学药物差很多，相比于天然存在的免疫球蛋白，其稳定性也更差。中国专利所述的融合蛋白是中国专利“VEGF受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用”(专利号ZL200610066257.2)中描述的处方需要在_20°C保存，对药物的生产，运输保存和应用都提出了较高的要求。众所周知，一般重组的融合蛋白的稳定性都比较差，在保存过程中会受到多种环境因素的影响，如温度，适度，氧，紫外线等都可以是融合蛋白发生多种物理或化学变化，造成蛋白质的聚合，分解，氧化或变性等。这些变化都可以使蛋白的活性降低，治疗效果下降并引起严重的毒副作用。因此，开发出稳定且易于运输和贮藏的融合蛋白制剂是具有十分重要的临床意义的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种含有的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1的细胞外结构域2(Flt-2)和VEGF受体2的细胞外结构域3和4(KDR_3，4)与人免疫球蛋白 I(Gl)Fc的融合蛋白的药物组合物，更具体的是能用于玻璃体注射的液体制剂，该液体制剂能使融合蛋白保持稳定，其最突出的特征是能有效抑制融合蛋白聚合物的产生而造成的纯度下降，从而保持有效组分的生物活性。本发明一方面提供了一种含有抑制血管增生的融合蛋白的药物组合物，其特征在于包含(a) 0. l-100mg/ml的VEGF受体1的细胞外结构域2和VEGF受体2的细胞外结构域3和4与人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，包含SEQ ID No 1的氨基酸序列；(b)5-100mM缓冲液，其中的酸选自Tris-HCl，柠檬酸，磷酸氢钠，磷酸二氢钠，醋酸，丁二酸，盐酸中的一种或多种；(C) 5-500mM碱性氨基酸选自赖氨酸，精氨酸，和组氨酸中的一种或其组合；(d)0. 1-30%盐渗透压剂调节剂，其中的糖选自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一种或多种，盐选自氯化钠或其它药学上可以接受的盐中的一种或其组合；(e) 0.01-0. 1 %的一种或多种表面活性剂或助溶剂，选自聚乙二醇，吐温20，吐温 80，丙二醇，二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种；(f)调节 pH 为 7. 5 8. 3。其中药物组合物优选为包含下列组分的药物组合物(a) 10-40mg/ml 的如 SEQ ID No 1 的融合蛋白；(b) 5-100mM的柠檬酸或磷酸二氢钠的一种或两种；(c) 5-500mM的精氨酸或组氨酸的一种或两种；(d) 8-30%的蔗糖或海藻糖的一种或两种；
(e)0. 01-0. 的吐温-20或聚乙二醇的一种或两种；(f)调节 pH 为 7. 5 8. 3。本发明所述优选的药物组合物还可以含有氯化钠。本发明更优的提供了一种由10-40mg/ml的如SEQ ID No 1的融合蛋白、IOmM的柠檬酸，5%的蔗糖，IOOmM的精氨酸，0. 05%的吐温20，pH7. 5 8. 3组成的药物组合物。本发明还进一步提供了一种10-40mg/ml的如SEQ ID No 1的融合蛋白、55mM的柠檬酸，12. 5%的蔗糖，250mM的精氨酸，0. 05%的吐温20，ρΗ7· 9缓冲液，ρΗ7· 5 8. 3。上述药物组合物制成的制剂形式可为液体制剂或冻干制剂，其中液体制剂优选为眼用制剂，尤其是滴眼液；还可以为预填充注射剂。上述药物组合物可以用于治疗血管新生或生长引起的疾病，优选为年龄相关性黄斑变性。在本发明中，所述的融合蛋白是中国专利“VEGF受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用”(专利号ZL200610066257. 2)中描述的融合蛋白，具体而言是FP3融合蛋白，因此 ZL200610066257. 2的内容可用于进一步阐述本发明。
具体实施例方式实施例1 10mg/ml FP3融合蛋白原处方在4°C下3ml玻璃安瓿中的稳定性研究处方如下FP3 融合蛋白10mg/ml丁二酸钠IOmM海藻糖9.0%吐温 200. 05%用盐酸调节系统pH到6. O 6. 5将蛋白原液换液后，无菌分装得到3ml玻璃安瓿中，4°C留样，在0，1，2，3，4，5，6， 7,8,9,10，11，12月测定样品，通过SEC-HPLC确定稳定性。结果显示，该处方不能有效抑制聚合物的生成，造成产品纯度下降，与VEGF的亲和力降低，进入体内以后可能诱发免疫反应。表1. 10mg/ml FP3融合蛋白在4°C的稳定性
时间(月)外观Pt^浓度(mg/ml)聚合物(％ )亲和力(PM)0合格6. 010. 00. 310. 61合格6. 09. 41. 99. 52合格6. 010. 22. 89. 13合格6. 010. 23. 68. 76合格6. 010. 09. 18. 权利要求
1.一种含有抑制血管增生的融合蛋白的药物组合物，其特征在于包含(a)0.l-100mg/ml的VEGF受体1的细胞外结构域2和VEGF受体2的细胞外结构域3 和4与人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，包含SEQ ID No 1的氨基酸序列；(b)5-100mM缓冲液，其中的酸选自Tris-HCl，柠檬酸，磷酸氢钠，磷酸二氢钠，醋酸，丁二酸，盐酸中的一种或多种；(c)5-500mM碱性氨基酸选自赖氨酸，精氨酸，和组氨酸中的一种或其组合；(d)0. 1-30 %盐渗透压剂调节剂，其中的糖选自蔗糖，海藻糖，甘露醇，甘油，丙二醇，山梨酯醇中的一种或多种，盐选自氯化钠或其它药学上可以接受的盐中的一种或其组合；(e)0.01-0. 的一种或多种表面活性剂或助溶剂，选自聚乙二醇，吐温20，吐温80， 丙二醇，二甲基亚砜或其它药学上可以接受的表面活性剂中的一种或多种；(f)调节pH为7.5 8. 3。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于包含(a)10-40mg/ml 的如 SEQ ID No 1 的融合蛋白；(b)5-100mM的柠檬酸或磷酸二氢钠的一种或两种；(c)5-500mM的精氨酸或组氨酸的一种或两种；(d)8-30%的蔗糖或海藻糖的一种或两种；(e)0.01-0. 的吐温-20或聚乙二醇的一种或两种；(f)调节pH为7.5 8. 3。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于还可以含有氯化钠。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于由以下组分组成10-40mg/ml的如 SEQ ID No :1的融合蛋白、IOmM的柠檬酸，5%的蔗糖，IOOmM的精氨酸，0.05%的吐温20， ρΗ7· 5 8. 3。
5.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于由以下组分组成10-40mg/ml的如 SEQ ID No :1的融合蛋白、55mM的柠檬酸，12. 5%的蔗糖，250mM的精氨酸，0. 05%的吐温 20，ρΗ7· 5 8. 3。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于所述的如SEQID No :1的融合蛋白为 10mg/mlo
7.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其特征在于制成液体制剂或冻干制剂。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于制成的液体制剂为眼用制剂，尤其是滴眼液。
9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于制剂形式为预填充注射剂。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其特征在于在制备治疗由血管新生或生长引起的疾病的药物中的用途，尤其是年龄相关性黄斑变性。
全文摘要
本发明公开了一种含有抑制血管增生的融合蛋白的药物组合物及用途，具体涉及一种含有的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1的细胞外结构域2(Flt-2)和VEGF受体2的细胞外结构域3和4(KDR-3，4)与人免疫球蛋白1(G1)Fc的融合蛋白的药物组合物，该药物组合物能使融合蛋白保持稳定，其最突出的特征是能有效抑制融合蛋白聚合物的产生而造成的纯度下降，从而保持有效组分的生物活性。
文档编号A61P27/02GK102380096SQ20101026750
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者柯潇, 郑强 申请人:成都康弘生物科技有限公司