针对人血管生成素样蛋白4的人类抗体的制作方法

专利名称：针对人血管生成素样蛋白4的人类抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的人类抗体和人类抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗方法。
背景技术：
脂蛋白脂酶(LPL)在脂蛋白代谢中具有关键作用，以维持血液中的脂蛋白的正常水平，通过其活性的组织特异性调控来确定何时以及在何种组织中卸载甘油三酯(TG)。已经有报道指出在人类和啮齿类中，ANGPTL4抑制LPL并延迟脂蛋白的分解代谢。无ANGPTL4的小鼠显示出血清TG的显著下降。相反，将ANGPTL4注射进入小鼠后产生了循环脂质的迅速增加，其速率高于注射血管生成素样蛋白3 (ANGPTL3) (Yoshida et al.，2002，JLipid Res 43:1770-1772)。已知ANGPTL4的N末端卷曲螺旋区域而非C末端的纤维蛋白、原样结构域对于抑制LPL活性、并因此对于高甘油三酯血症指征具有重要意义。这些发现表明抑制ANGPTL4对于治疗那些特征在于升高的脂质水平的疾病、包括原发性血脂异常和与肥胖相关的高甘油三酯血症、代谢综合征、II型糖尿病等可能具有有益方面。还指出ANGPTL4在血管生成和癌症中具有一定作用(Galaup et al.，2006，PNAS103 (49) : 18721-18726;Kim et al.,2000,Biochem J346:603-610;and Ito et al.,2003,Cancer Res63(20):6651-6657)。人ANGPTL4的核酸和氨基酸序列已经分别显示于SEQ ID N0:475和476。针对ANGPTL4 的抗体公开于例如 WO 2006/074228 和 WO 2007/109307。

发明内容
在第一方面，本发明提供了特异性结合并中和人ANGPTL4(hANGPTL4)活性的完整的人单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段。抗体(Ab)可以是全长的(例如IgGl或IgG4抗体)，或者可以仅包含抗原结合部分(例如Fab，F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修饰以影响功能，例如，为了消除残余的效应子功能(Reddy et al.，2000，J. Immunol. 164:1925-1933)。在一个实施方式中，本发明包括包含选自SEQ ID NO:2, 18, 22, 26,42, 46, 50,66,70，74，90，94，98，114，118，122，138，142，146，162，166，170，186，190，194，210，214，218，234，238，242，258，262，266，282，286，290，306，310，314，330，334，338，354，358，362，378，382，386，402，406，410，426，430，434，450，454，458，466，468 和 487 或具有至少 90%、至少 95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链可变区(HCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自SEQID NO:26，42，46，487，74，90，94，122，138，142，146，162 和 166 的氨基酸序列的 HCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:42, 487，90，138或162的HCVR。在一个实施方式中，本发明包括包含选自SEQ ID NO: 10，20，24，34，44，48，58，68，72，82，92，96，106，116，120，130，140，144，154，164，168，178，188，192，202，212，216，226，236，240，250，260，264，274，284，288，298，308，312，322，332，336，346，356，360，370，380，384，394，404，408，418，428，432，442，452 和 456 或具有至少 90%、至少 95%、至少 98% 或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段。在另一实施方式中，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO:34, 44，48，82，92，96，130，140，144，154，164和168的氨基酸序列的LCVR0在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:44, 92，140或164的LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含选自下列的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对SEQ ID NO:2/10, 18/20，22 /24，26/34，42/44，487/44，46/48，50/58，66/68，70/72，74/82，90/92，94/96，98/106，114/116，118/120，122/130，138/140，142/144，146/154，162/164，166/168，170/178，186/188，190/192，194/202，210/212，214/216，218/226，234/236，238/240，242/250，258/260，262/264，266/274，282/284，286/288，290/298，306/308，310/312，314/322，330/332，334/336，338/346，354/356，358/360，362/370，378/380，382/384，386/394，402/404，406/408，410/418，426/428，430/432，434/442，450/452，454/456，458/394，466/404和468/408。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含选自SEQ ID NO:26/34，42/44，487/44，46/48，74/82，90/92，94/96，122/130，138/140，142/144，146/154，162/164和166/168的氨基酸序列对的HCVR和LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有 SEQ ID NO: 42/44，487/44，90/92，138/140 或 162/164 的 HCVR/LCVR 对。在第二方面，本发明涉及抗体或抗体的抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO:8，32，56，80，104，128，152，176，200，224，248，272，296，320，344，368，392，416，440 和 464或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链互补决定区 3(HCDR3)氨基酸序列；和选自 SEQ ID NO: 16，40，64，88，112，136，160，184，208，232，256，280，304，328，352，376，400，424 和 448 或具有至少 90%、至少 95%、至少 98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:32/40，80/88，128/136或152/160的HCDR3/IXDR3氨基酸序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含具有SEQ IDNO:32/40 或 80/88 的 HCDR3/LCDR3 氨基酸序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段还包含选自SEQ ID NO:4, 28，52，76，100，124，148，172，196，220，244，268，292，316，340，364，388，412，436 和 460 或具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链⑶Rl (HCDRl)氨基酸序列;和选自 SEQ ID NO:6，30，54，78，102，126，150，174，198，222，246，270，294，318，342，366，390, 414，438和462或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的重链⑶R2(HCDR2)氨基酸序列；和可选地进一步包含选自SEQ ID N0:12，36，60，84，108，132，156，180，204，228，252，276，300，324，348，372，396，420 和 444 或具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链CDRl (LCDRl)氨基酸序列；和 / 或选自 SEQ ID NO: 14，38，62，86，110，134，158，182，206，230，254，278，302，326，350，374，398，422 和 446 或具有至少 90%、至少 95%、至少 98% 或至少99%序列同一性的与其实质上相似的序列的轻链CDR2 (LCDR2)氨基酸序列。或者，本发明涉及抗体或抗体的抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO:4/6/8, 28/30/32，52/54/56，76/78/80，100/102/104，124/126/128，148/150/152，172/174/176，196/198/200，220/222/224，244/246/248，268/270/272，292/294/296，316/318/320，340/342/344，364/366/368，388/390/392，412/414/416，436/438/440 和 460/462/464 的 HCDR1/HCDR2/HCDR3 组合;和 / 或选自 SEQ ID NO: 12/14/16，36/38/40，60/62/64，84/86/88，108/110/112，132/134/136，156/158/160，180/182/184，204/206/208，228/230/232，252/254/256，276/278/280，300/302/304，324/326/328，348/350/352，372/374/376，396/398/400，420/422/424 和 444/446/448 的 LCDR1/LCDR2/LCDR3 组合。
在一个实施方式中，HCDRl, HCDR2和HCDR3选自SEQ IDNO:28/30/32，76/78/80，124/126/128 和 148/150/152;和 / 或 LCDRl, LCDR2 和 LCDR3 选自SEQ ID NO:36/38/40，84/86/88，132/134/136 和 156/158/160。在另一实施方式中，重链和轻链 CDR 氨基酸序列包含选自 SEQ ID NO :28/30/32/36/38/40, 76/78/80/84/86/88, 124/126/128/132/134/136 和 148/150/152/156/158/160 的 CDR 序列组合。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO :28/30/32/36/38/40或76/78/80/84/86/88的重链和轻链⑶R序列。在相关的实施方式中，本发明包含特异性结合hANGPTL4的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含包含于选自SEQ ID NO:2/10, 18/20, 22/24, 26/34,42/44，487/44，46/48，50/58，66/68，70/72，74/82，90/92，94/96，98/106，114/116，118/120，122/130，138/140，142/144，146/154，162/164，166/168，170/178，186/188，190/192， 194/202，210/212，214/216，218/226，234/236，238/240，242/250，258/260，262/264，266/274，282/284，286/288，290/298，306/308,310/312，314/322，330/332，334/336，338/346，354/356，358/360，362/370，378/380，382/384，386/394，402/404，406/408，410/418，426/428，430/432，434/442，450/452，454/456，458/394，466/404 和 468/408 的 HCVR/LCVR 对中的重链和轻链⑶R结构域。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的⑶R的方法和技术是本领域已知的并且可用于鉴定本文公开的指定的HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定⑶R的边界的常规定义包括Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义是基于序列差异性，Chothia定义是基于结构环区的定位，AbM定义是Kabat和 Chothia 方法的折衷。见，例如 Kabat, "Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, "National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991);A1-Lazikani etal. , J. Mol. Biol. 273:927-948(1997);和 Martin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:9268-9272(1989)。用于鉴定抗体内的⑶R序列的公共数据库也是可获得的。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含包含于选自SEQ ID NO:26/34, 42/44, 487/44, 46/48，74/82，90/92，94/96，122/130，138/140，142/144，146/154，162/164 和 166/168 的 HCVR和LCVR对中的⑶R序列。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含包含于SEQ IDNO: 42/44，487/44，90/92，138/140 或 162/164 的 HCVR 和 LCVR 对中的 CDR 序列。在另一个相关实施方式中，本发明提供了与包含SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40,76/78/80/84/86/88,124/126/128/132/134/136 或 148/150/152/156/158/160 的重链和轻链CDR序列的抗体或抗原结合片段竞争与hANGPTL4的特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段与包含SEQ IDNO:42/44, 487/44，90/92, 138/140 或 162/164 的 HCVR/LCVR 序列对的抗体竞争与 hANGPTL4的特异性结合。
在另一个相关实施方式中，本发明提供了这样的抗体或其抗原结合片段其结合至被包含 SEQ ID NO:28/30/32/36/38/40, 76/78/80/84/86/88, 124/126/128/132/134/136或148/150/152/156/158/160的重链和轻链CDR序列的抗体或其片段识别的hANGPTL4上的表位。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段识别被包含SEQ IDNO:42/44，487/44，90/92, 138/140 或 162/164 的 HCVR/LCVR 序列对的抗体识别的 hANGPTL4上的表位。在第三方面，本发明提供了编码抗ANGPTL4抗体或其片段、特别是上文描述的那些抗体或其片段的核酸分子。本发明还包括携带本发明的核酸的重组表达载体和宿主细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌或哺乳动物细胞，例如CHO细胞，其中导入了此类载体；还包括通过在允许产生抗体的条件下培养所述宿主细胞并回收所产生的抗体而生产抗体的方法。在一个实施方式中，本发明提供了包含由选自SEQ ID NO: 1，17，21，25，41，45，49，、65，69，73，89，93，97，113，117，121，137，141，145，161，165，169，185，189，193，209，213，217，233，237，241，257，261，265，281，285，289，305, 309, 313，329，333，337，353，357，361，377，381，385，401，405，409，425，429，433，449，453，457，465，467 和 486 的核酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCVR的抗体或其片段。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO:25，41，45，73，89,93, 121，137，141，145，161，165和486的核酸序列编码的HCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID N0:41, 89，137，161或486的核酸序列编码的HCVR。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含由选自SEQ ID N0:9, 19, 23, 33,43，47，57，67，71，81，91，95，105，115，119，129，139，143，153，163，167，177，187，191，201，211，215，225，235，239，249，259，263，273，283，287，297，307, 311，321，331，335，345，355，359，369，379，383，393，403，407，417，427，431，441，451 和 455 的核酸序列或与其具有至少90%,至少95%，至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO:33，43，47，81，91，95，129，139，143,153，163和167的核酸序列编码的LCVR。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ IDNO:43，91，139或163的核酸序列编码的LCVR0在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO: 1/9, 17/19,21/23,25/33，41/43，486/43，45/47，49/57，65/67，69/71，73/81，89/91，93/95，97/105，113/115，I17/119， 121/129， 137/139， 141/143， 145/153， 161/163， 165/167， 169/177， 185/187， 189/19I, 193/201, 209/211,213/215，217/225，233/235，237/239，241/249，257/259，261/263，265/273，281/283，285/287，289/297，305/307, 309/311, 313/321，329/331，333/335，337/345，353/355，357/359，361/369，377/379，381/383，385/393，401/403, 405/407, 409/417, 425/427，429/431，433/441，449/451，453/455，457/393，465/403 和 467/407 的核酸序列对编码的HCVR和LCVR (HCVR/LCVR)序列对。在一个实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO:25/33，41/43，486/43，45/47，73/81，89/91，93/95，121/129，137/139，141/143，145/153，161/163和165/167的核酸序列对编码的HCVR/LCVR序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:41/43, 486/43，89/91，137/139或161/163的核酸序列对编码的HCVR/LCVR对。
在一个实施方式中，本发明涉及这样的抗体或抗体的抗原结合片段其包含由选自 SEQ ID NO:7，31，55，79，103，127，151，175，199，223，247，271，295，319，343，367，391，415，439和463的核苷酸序列或与其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCDR3结构域；和由选自SEQ ID NO: 15，39，63，87，111，135，159，183，207，231，255，279，303，327，351，375，399，423 和 447 的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的IXDR3结构域。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID N0:31/39，79/87，127/135或151/159的核酸序列对编码的HCDR3和LCDR3序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由SEQ ID NO:31/39或79/87的核酸序列对编码的HCDR3和LCDR3序列对。在另一实施方式中，所述抗体或其片 段还包含由选自SEQ ID NO:3，27，51，75，99，123，147，171，195，219，243，267，291，315，339，363，387，411，435 和 459 的核苷酸序列或与其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCDRl结构域；和由选自 SEQ ID NO:5, 29，53，77，101，125，149，173，197，221，245，269，293，317，341，365，389，413，437和461的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的HCDR2结构域；可选地还包含由选自SEQ ID NO:11，35，59，83，107，131，155，179，203，227，251，275，299，323，347，371，395，419 和 443 的核苷酸序列或与其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的 LCDRl 结构域；和 / 或由选自 SEQ ID NO: 13，37，61，85，109，133，157，181，205，229，253，277，301，325，349，373，397，421和445的核苷酸序列或与其具有至少90%,至少95%,至少98%或至少99%同源性的实质上相同的序列编码的IXDR2结构域。或者，本发明涉及这样的抗体或其抗原结合片段，其包含由选自SEQ ID NO:3/5/7，27/29/31，51/53/55，75/77/79，99/101/103，123/125/127，147/149/151，171/173/175，I95/197/199，219/221/223，243/245/247，267/269/271，291/293/295，315/317/319，339/341/343，363/365/367，387/389/391，411/413/415，435/437/439 和 459/461/463 的核苷酸序列组合编码的 HCDR1/HCDR2/HCDR3 组合；和 / 或由选自 SEQ ID NO: 11/13/15，35/37/39，59/61/63，83/85/87，107/109/111，131/133/135，155/157/159，179/181/183，203/205/207，227/229/231，251/253/255，275/277/279，299/301/303, 323/325/327，347/349/351，371/373/375，395/397/399，419/421/423 和 443/445/447 的核苷酸序列组合编码的 LCDR1/LCDR2/LCDR3组合。在一个实施方式中，HCDRl，HCDR2和HCDR3由选自SEQ IDNO:27/29/31, 75/77/79，123/125/127 和 147/149/151 的核苷酸序列组合编码；和 /或 LCDR1，LCDR2 和 LCDR3 由选自 SEQ ID NO:35/37/39，83/85/87， 131/133/135 和155/157/159的核苷酸序列组合编码。在另一实施方式中，所述抗体或其片段包含由选自 SEQ ID NO:27/29/31/35/37/39;75/77/79/83/85/87;123/125/127/131/133/135;和147/149/151/155/157/159的核苷酸序列组合编码的重链和轻链CDR序列。在另一实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO:27/29/31/35/37/39或75/77/79/83/85/87的核苷酸序列组合编码的重链和轻链CDR序列。在第四方面，本发明涉及特异性结合hANGPTL4的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含 HCDR3 和 LCDR3，其中 HCDR3 包含式 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-Xi9-X20(SEQ ID N0:471)的氨基酸序列，其中 X1 是 Ala，X2 是 Arg 或 Lys，X3是Gly或Glu，X4是Gly，Asp或不存在，X5是Asp或不存在，X6是Leu，Arg或不存在，X7是Arg 或 Ser, X8 是 Phe, Gly 或 Arg, X9 是 Leu, His 或 Asn, X10 是 Asp, Pro 或 Tyr, X11 是 Trp,Tyr 或 Phe, X12 是 Leu, Phe, Val 或 Asp, X13 是 Ser, Tyr 或 Gly, X14 是 Ser, Tyr 或 Asp, X15 是Tyr, X16 是 Phe 或 Gly, X17 是 Leu 或不存在，X18 是 Asp, X19 是 Tyr, Val 或 Phe, X20 是 Trp ;并且 LCDR3 包含式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici (SEQ ID NO:474)的氨基酸序列，其中 X1 是Gin, X2 是 Asn 或 Gin, X3 是 Tyr 或 Leu, X4 是 Asn, His, Ser 或 Asp, X5 是 Thr 或 Ser, X6疋Ala或 Tyr, X7 是 Pro, Ser 或 Phe, X8 是 Leu 或 Arg, X9 是 Thr, X10 是 Phe。
在另一实施方式中，所述抗体或其片段还包含包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:469)的氨基酸序列的 HCDRl 序列，其中 X1 是 Gly，X2 是Gly 或 Phe, X3 是 Ser 或 Thr, X4 是 Phe, X5 是 Ser, X6 是 lie, Ser 或 Thr, X7 是 His 或 Tyr, X8 是His，Gly 或 Asp ;包含式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO:470)的氨基酸序列的 HCDR2 序列，其中 X1 是 lie，X2 是Asn, Ser 或Gly,X3 是His,Phe, Ser 或 Val, X4 是Arg, Asp 或 Ala,X5 是GlyjX6 是Gly 或不存在，X7 是 Ser，Asn 或 Asp，X8 是 Thr 或 Lys ;包含式 X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQID NO:472)的氨基酸序列的LCDRl序列，其中X1是Gln，X2是Gly或Ser，X3是lie，X4是Ser 或 Asn，X5 是 Asp，Ser 或 Arg，X6 是 Tyr 或 Trp ;和包含式 X1-X2-X3 (SEQ ID NO: 473)的氨基酸序列的 LCDR2 序列，其中 X1 是 Ala 或 Lys，X2 是 Ala，X3 是 Ser。H1H268P, H1H284P,H1H291P和H1H292P单克隆抗体的序列比对显示于图I (HCVR)和图2 (LCVR)。在第五方面，本发明涉及人的抗ANGPTL4抗体或其抗原结合片段，其包含由衍生自Vh，Dh和Jh种系序列的核苷酸序列区段编码的重链可变区(HCVR)和由衍生自Vk和Jk种系序列的核苷酸序列区段编码的轻链可变区(LCVR)，其中HCVR和LCVR由衍生自选自(i)Vh3-30, Dh5-12，Jh6，VkI-9 和 JK4; (ii)VH4_34，DH3_3，JH4，VK1_27 和 JK4 ;和(iii)VH3_13，Dh1-26，Jh4，Vk1-5和JkI的种系基因组合的核苷酸序列区段编码。在第六方面，本发明涉及以大约InM或更低的平衡解离常数(Kd)特异性结合hANGPTL4的抗体或其抗原结合片段，如通过表面等离子共振测定法(例如BIAC0RE )所测定。在一些实施方式中，本发明的抗体显示出大约500pM或更低、大约400pM或更低、大约300pM或更低、大约200pM或更低、大约150pM或更低、大约IOOpM或更低，或大约50pM或更低的Kd。在第七方面，本发明提供了结合SEQ ID N0:476的hANGPTL4蛋白但不与相关蛋白、例如人血管生成素样蛋白3(hANGPTL3 ；SEQ ID NO:485)交叉反应[如通过例如ELISA、表面等离子共振测定法或Luininex XMAP Technology所测定，如本文所描述]的抗_hANGPTL4抗体或其抗原结合片段。ANGPTL3是已知的另一种降低LPL活性并且具有N末端卷曲螺旋和C末端纤维蛋白原样结构域的分泌的蛋白(Ono et al.，2003，JBiol Chem 43:41804-41809)。在相关的实施方式中，本发明提供了结合hANGPTL4蛋白并且与hANGPTL3蛋白交叉反应的抗_hANGPTL4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，hANGPTL4抗体或其片段与hANGPTL3蛋白的结合亲和性是该抗体或片段与hANGPTL4蛋白的结合亲和性的大约75%或更低，或大约50%或更低。在另一个相关实施方式中，本发明提供了不与小鼠ANGPTL4(mANGPTL4:SEQ ID NO:478)交叉反应但是与猕猴(Macacafascicularis;N末端的1-148残基的氨基酸序列和编码DNA序列分别显示于SEQ IDNO:490和489)和/或恒河猴(Macaca mulatta;N末端的1_148残基的氨基酸序列和编码DNA序列分别显示于SEQ ID NO: 492和491)的ANGPTL4交叉反应的抗_hANGPTL4抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗_hANGPTL4抗体。在一些应用中，旨在除去不希望的糖基化位点的修饰可能是有用的，或者，例如，除去岩藻糖部分以增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能(见Shield et al. (2002) JBC 277:26733)。在其它应用中，除去N末端糖基化位点可以减少不希望的针对治疗抗体的免疫反应，或增加抗体的亲和性。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。在第八方面，本发明涉及包含特异性结合hANGPTL4的重组人类抗体或其片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方式中，本发明涉及这样的组合物其为本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂的组合。所述第二治疗剂可以是下列任意试剂的一种或多种例如，(1)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂，例 如西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、罗舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等；(2)胆固醇摄取和/或胆汁酸重吸收的抑制剂；(3)烟酸(niacin)，其增加脂蛋白分解代谢；(4)贝特类或两亲性羧酸类，其降低低密度脂蛋白(LDL)水平，改善高密度脂蛋白(HDL)和TG水平，并减少非致命性心脏病发作数目；和(5) LXR转录因子的激活剂，该转录因子在胆固醇、例如22-羟基胆固醇的消除中具有重要作用，或固定的组合，例如依泽替米贝+辛伐他汀；抑制素(statin)与胆汁树脂(例如考来烯胺、考来替泊、考来维仑)，尼克酸+抑制素的固定的组合(例如尼克酸+洛伐他汀)；或与其它降脂试剂，例如《-3_脂肪酸乙基酯(例如omacor)。此外，第二治疗剂可以是一种或多种其它的ANGPTL4抑制剂，以及其它分子的抑制剂，其它分子是例如ANGPTL3、ANGPTL5、ANGPTL6和前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)，其参与在脂质代谢尤其是胆固醇和/或甘油三酯平衡。这些分子的抑制剂包括小分子和特异性结合这些分子并阻断它们的活性的抗体。在相关的实施方式中，第二治疗剂可以是一种或多种抗癌剂，例如化疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、细胞毒性试剂、细胞凋亡试剂和本领域熟知的用于治疗癌症或其它增殖疾病或病症的其它试剂，以及其它治疗剂，例如镇痛剂、抗炎剂，包括非留体抗炎药物(NSAIDS)，例如Cox-2抑制剂等，以缓解和/或减少伴随癌症/肿瘤的症状。在第九方面，本发明涉及使用本发明的抗_hANGPTL4抗体或其抗原结合部分抑制hANGPTL4活性的方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段和任选包含一种或多种另外的上文描述的治疗剂的药物组合物。所治疗的疾病或病症是通过消除、抑制或减少ANGPTL4活性而被改善、缓解、抑制或预防的任何疾病或病况，或者相对于不以抗_hANGPTL4抗体治疗其发生率降低的疾病或病况(例如，ANGPTL4介导的疾病或病症)。可通过本发明的方法治疗的疾病或病症的实例包括但不限于涉及脂质代谢的疾病或病症，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括导致动脉粥样化的血脂异常、糖尿病性血脂异常、高甘油三酯血症，包括具有>1000mg/dL的TG的严重高甘油三酯血症，高胆固醇血症，乳糜微粒血症，混合的血脂异常(肥胖、代谢综合征、糖尿病等)，脂肪代谢障碍，脂肪营养不良等，其是由下列引起的，例如降低的LPL活性和/或LPL缺乏、降低的LDL受体活性和/或LDL受体缺乏、改变的ApoC2、ApoE缺乏、增加的ApoB、极低密度脂蛋白(VLDL)的增加的产生和/或减少的消除、某些药物治疗(例如，糖皮质激素治疗诱导的血脂异常)，任何遗传体质，膳食，生活方式等。本发明的方法还预防或治疗与高脂血症、高脂蛋白血症和/或血脂异常相关或由其引起的疾病或病症，包括但不限于心血管疾病或病症,例如动脉硬化症、动脉瘤、高血压、绞痛、中风、脑血管疾病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、外周血管疾病等；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH);血糖异常，例如糖尿病；肥胖症等。可通过本发明的方法治疗的疾病或病症的其它实例包括癌症/肿瘤，以及非肿瘤性血管形成相关性疾病或病症，包括眼睛血管形成性疾病或病症，例如老年性黄斑变性、视网膜中央静脉阻塞或视网膜分支静脉阻塞，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变等，炎性疾病或病症，例如关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣等。其它实施方式将通过阅读下面的详细描述而变得明显。

图 I 显示了抗体 H1H268P、H1H284P、H1H291P 和 H1H292P 的重链可变区(HCVR)的序列比对。图 2 显示了抗体 H1H268P、H1H284P、H1H291P 和 H1H292P 的轻链可变区(LCVR)的序列比对。图3A和3B显示了野生型小鼠(图3A)和表达人ANGPTL4的转基因小鼠[hAngptl4(+/+)小鼠；或“人源化的ANGPTL4小鼠”](图3B)中的抗-ANGPTL4抗体的药代动力学清除。MH268P2 (口 ) ;H4H284P( A ) ;hIgG4 对照( )。图4显示了抗-ANGPTL4抗体H4H268P2对于与ApoE空小鼠杂交的人源化ANGPTL4小鼠中的血清甘油三酯(TG)水平的影响。显示了 H4H268P2引起的血清TG水平的百分率变化，与具有不相关特异性的对照抗体相比较。对照Ab (〇)；H4H268P2 ( ■)。图5显示了抗-ANGPTL4抗体H4H268P2和降低TG的药物非诺贝特(单独或组合)对于人源化ANGPTL4小鼠中的血清TG水平的影响。图6显示了关于抗-ANGPTL4抗体对于肥胖恒河猴(Macaca mulatta)的空腹血清TG水平的影响的I期初步研究的结果。所有的猴子在第-5天接受介质(IOmM组氨酸，pH6)静脉内(IV)输注，在第 0 天接受 10mg/kg IV 的 H4H268P2 (n=3) ( )或 H4H284P (n=3) ( □)。从基线期直至给药后第35天收集血清样品。在第_7、-5和0天获取的样品确定每只动物的平均基线，并测定相对于所测的基线的血清TG水平的百分率变化并对每个抗体组取平均值。 图7显示了关于抗-ANGPTL4抗体H4H268P2对于肥胖猴子的空腹血清TG水平的影响的II期初步研究的结果，如针对图6所描述，区别在于不进行介质输注的步骤。基于在第_7、-3和0天获取的样品获得每只猴子的平均基线。根据它们的基线将猴子分组A. TG〈150mg/dL(n=3; □ ) ;B. 150mg/dL<TG<500mg/dL (n=4; ) ;C. TG>1000mg/
dL (n=l； V)。测定每只猴子的相对于基线的空腹TG水平的百分率变化并对每个组取平均值。所有图形中的误差线表示平均值土SEM。详细描述在详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式，不是为了限制，因为本发明的范围将仅由随附的权利要求限制。除非另有指明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。虽然与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可用于实施或测试本发明，但是现在描述优选方法和材料。定义 如本文使用的术语“人血管生成素样蛋白4”或〃hANGPTL4〃是指具有如SEQ IDNO:475所示的核酸序列和SEQ ID NO:476的氨基酸序列的hANGPTL4，或其生物活性片段。如本文使用的术语“抗体”是指由4个多肽链组成的免疫球蛋白分子，即通过二硫键连接的2个重链(H)和2个轻链(L)。每个重链由重链可变区(HCVR)和重链恒定区(CH;由结构域^^^^和^^组成)组成。每个轻链由轻链可变区(LCVR)和轻链恒定区(Q)组成。HCVR和LCVR可进一步细分为高变区，其被称作互补决定区(CDR)，散布于更加保守的、被称作框架区(FR)的区域之间。每个HCVR和LCVR由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列FR1，CDR1，FR2, CDR2，FR3, CDR3和FR4。置换一个或多个⑶R残基或删除一个或多个⑶R也是可能的。在科学文献中已经描述了这样的抗体，其中可以删除一个或两个⑶R以进行结合。Padlan et al. (1995FASEBJ. 9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区域，并得出结论实际上，仅有大约1/5至1/3的⑶R残基与抗原接触。Padlan还发现很多这样的抗体其中一个或两个⑶R不具有与抗原接触的氨基酸(另见，Vajdos et al. 2002J Mol Biol320:415-428)。可以基于之前的研究(例如，⑶RH2中的残基H60-H65通常是不需要的)，通过分子模拟和/或经验，从Chothia⑶R之外的Kabat⑶R的区域鉴定不接触抗原的⑶R残基。如果一个CDR或其残基被删除，其通常是被另一个人类抗体序列或此类序列的共有序列中的对应位置上的氨基酸置换。也可以通过经验选择⑶R内的置换位置和待置换的氨基酸。经验置换可以是保守性的或非保守性置换。 如本文使用的术语“人类抗体”意在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类单克隆抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或位点特异性诱变在体外导入的突变，或通过体细胞突变在体内导入的突变)，例如，在CDR中，尤其是CDR3中的残基。然而，如本文使用的术语“人类抗体”不包括这样的单克隆抗体源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人FR序列上。相对于对应的种系序列，如本文公开的全长人抗_hANGPTL4抗体可以在重链和轻链可变域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或删除。此类突变可以通过将本文公开的氨基酸序列与可以从例如公开的抗体序列数据库获得的种系序列进行比较而容易地确定。本发明包括抗体及其抗原结合片段，所述片段源自本文公开的任意氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被突变为该抗体所衍生自的种系序列的对应的残基，或突变为另一人类种系序列的对应残基，或突变为对应的种系残基的保守性氨基酸置换(此类序列变化在本文中合称“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发，能够容易地产生包含一个或多个单一种系回复突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，％和/或'结构域内的所有框架和/或CDR残基都回复突变为该抗体所衍生自的原始种系序列中存在的残基。在其它实施方式中，仅有某些残基回复突变为原始种系序列，例如，仅有FRl的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅有CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其它实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列的对应残基(即，不同于该抗体最初所衍生自的种系序列的种系序列)。此外，本发明的抗体可以在框架和/或⑶R区内包含两个或更多个种系突变的任意组合，例如，其中一些单一残基突变为特定种系序列的对应残基，而一些不同于原始种系序列的其它残基被保持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得后，可以就一种或多种希望的性质、例如改善的结合特异性、增加的结合亲和性、改善或增强的拮抗性或激动性生物性质(视情况而定)、降低的免疫原性等来容易地测试包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段。通过这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包括在本发明内。 本发明还包括包含具有一个或多个保守性置换的本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体的抗-ANGPTL4抗体。例如，本发明包括相对于本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，具有含有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、2个或I个保守性氨基酸置换的HCVR、LCVR和/或⑶R氨基酸序列的抗-ANGPTL4抗体。在一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID N0:487的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID N0:487的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ IDN0:487的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，HCVR包含SEQ ID NO:487的氨基酸序列，其中具有2个或I个保守性氨基酸置换。在一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID N0:44的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID N0:44的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ IDNO: 44的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守性氨基酸置换。在另一个实施方式中，LCVR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其中具有2个或I个保守性氨基酸置换。除非另有明确指明，否则如本文使用的术语“抗体”应该被理解为包括包含2个免疫球蛋白重链和个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“完整抗体分子”)及其抗原结合片段。如本文使用的术语“抗体的抗原结合部分”、“抗体的抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然产生的、酶促可获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以衍生自例如完整抗体分子，使用任何合适的标准技术，例如蛋白水解消化或重组遗传工程技术，其涉及编码抗体可变域和(任选)恒定域的DNA的操作和表达。此类DNA是已知的，和/或可以容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体显示抗体库)获得，或者可以被合成。可以对DNA进行测序并化学地操作或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，以将一个或多个可变域和/或恒定域排列为合适的构型，或导入密码子、产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实例包括(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的超变区的氨基酸残基组成的最简识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR))。其它工程化的分子，例如diabody、triabody、tetrabody和minibody,也包括在如本文中使用的词语〃抗原结合片段〃内。抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变域。可变域可以是任何大小或氨基酸组成，一般将包含邻近一个或多个框架序列或与一个或多个框架序列同框的至少一个CDR0在具有与\结构域结合的Vh结构域的抗原结合片段中，V1^P \结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并包含VH-VH、VH-'或二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体的Vh或\结构域。在一些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以包含与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以存在于本发明的抗体的抗原结合片段中的可变域和恒定域的非限制性的示例性构型包括⑴ Vh-ChI ; (ii) Vh-Ch2 ; (iii) Vh-Ch3 ; (iv) Vh-ChI-CH2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi)VH-CH2-CH3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-ChI ; (ix)VL-CH2; (x) VL-CH3 ; (xi) Vl-ChI-Ch2 ; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3 ; (xiii) VL-CH2-CH3;和(xiv) Vl-CL。在可变域和恒定域的任何构型中，包括上述的示例性构型中的任一项，可变域和恒定域可以直接彼此相连，或可以通过完整或部分铰链或连接区而彼此连接。铰链区可以由至少2个(例如5，10，15，20，40，60或更多个)氨基酸组成，其产生单一多肽分子内的邻近的可变域和/或恒定域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含以非共价方式彼此结合和/或与一个或多个单体的Vh或\结构域结合(例如，通过二硫键)的上述任意可变域和恒定域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。如完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少2个不同的可变域，其中每个可变域能够特异性结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括如本文公开的示例性的双特异性抗体形式，可以使用本领域可获得的常规技术适用于本发明的抗体的抗原结合片段的情景下。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗体片段可以缀合于治疗部分(“免疫缀合物”)，例如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。术语“特异性结合”意思是抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可以通过大约IxlO-6M或更低的平衡解离常数来表征(S卩，较小的Kd代表更紧密的结合)。用于测定两个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。但是，特异性结合hANGPTL4的分离的抗体可以显示出与其它抗原的交叉反应性，例如来自其它物种的ANGPTL4分子，例如，猕猴ANGPTL4，和/或具有SEQ ID N0:485的氨基酸序列的hANGPTL3。此外，结合hANGPTL4和一种或多种另外的抗原的多特异性抗体(例如双特异性的)被认为是如本文使用的“特异性结合1ANGPTL4的抗体。术语“高亲和性”抗体是指具有大约1x10_9M或更低、大约0. 5xlO_9M或更低、大约0. 25x10_9M或更低、大约IxKTwM或更低、大约0. 5xlO_10M或更低的Kd的与hANGPTL4的结合亲和性的抗体，所述Kd是通过表面等离子共振测定的，例如BIAC0RE 或溶液亲和ELISA。如本文使用的术语％〃是指特定的抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“缓慢解离速率”、“Koff”或“kd”意思是，抗体以IxKT3s-1或更低、优选IxKT4s-1或更低的速率常数从hANGPTL4分离，如通过表面等离子共振例如BIAC0RE 所测定。术语“内在亲和常数”或“ka”意思是以大约IxlO3Ir1S4或更高的速率常数与hANGPTL4结合的抗体，如通过表面等离子共 振例如BIAC0RE 所测定。如本文使用的“分离的抗体”是指实质上不含具有不同的抗原特异性的其它单克隆抗体的抗体(例如，特异性结合hANGPTL4的分离的抗体实质上不含特异性结合除了hANGPTL4以外的抗原的单克隆抗体)。但是，特异性结合hANGPTL4的分离的抗体可以与其它抗原具有交叉反应性，例如来自其它物种、例如猕猴的ANGPTL4分子，和/或其它相关蛋白，例如人ANGPTL3。如本文使用的〃中和抗体"(或〃中和ANGPTL4活性的抗体")是指这样的抗体其与ANGPTL4的结合导致ANGPTL4的至少一种生物活性被抑制。ANGPTL4的生物活性的这种抑制可以通过以一种或多种本领域已知的标准的体外或体内测定法测定ANGPTL4生物活性的一个或多个指示物来测定(另外见以下实施例)。如本文使用的术语〃表面等离子共振〃是指允许通过例如，使用BIAC0RE 系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N. J.)检测生物传感器基质内的蛋白浓度的变化来实时分析生物特异性相互作用的光学现象。术语“表位”是抗体所结合的抗原的区域。表位可以定义为结构性的或功能性的。功能性表位一般是结构性表位的子集，并且具有直接影响相互作用的亲和性的残基。表位也可以是构象型的，即，由非线性氨基酸构成。在一些实施方式中，表位可以包括决定簇，其为分子的化学活性表面聚集，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在一些实施方式中，可以具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特征。当指称核酸或其片段时，术语〃实质上同一性〃或〃实质上相同〃表示当具有合适的核苷酸插入或删除的核酸与另一核酸(或其互补链)优化比对时，在至少大约90%，更优选至少大约95%，96%, 97%, 98%或99%的核苷酸碱基中有核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法例如FASTA、BLAST或GAP所测定，如下文所讨论。就适用于多肽而言，术语〃实质上相似性〃或〃实质上相似〃意思是当例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省空隙权重进行优化比对时，两个肽序列具有至少90%的序列同一性，更优选为至少95%，98%或99%序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差异为保守性氨基酸置换。〃保守性氨基酸置换〃是这样的置换其中一个氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基置换。一般地，保守性氨基酸置换将不会实质性改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此差别为保守性置换的情况下，可以上调相似性的百分率或程度，以校正置换的保守性性质。进行该调整的方法是本领域技术人员熟知的。见,例如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24:307-331。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸；和7)含巯基侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换是在如Gonnet et al. (1992) Science 256:144345公开的PAM250对数可能性基质中具有正值的任何改变。“中等保守性”替代是在PAM250对数可能性基质中具有非负值的任何改变。通常使用序列分析软件来测定多肽的序列相似性。蛋白分析软件使用分配给各个置换、删除和其它修饰(包括保守性氨基酸置换)的相似性测量值而匹配相似序列。例如，GCG软件含有程序，例如GAP和BESTFIT，其可以以缺省参数使用以测定密切相关的多肽(例如来自生物的不同物种的同源多肽)之间的或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见,例如GCG Version 6. I。也可以使用FASTA以缺省或推荐的参数比较多肽序列；其为GCG Version6. I中的一个程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间的最佳重叠的区域的比对和百分率序列同一性(Pearson(2000)见上)。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN，使用缺省参数进行。见，例如Altschulet al. (1990)J. Mol. Biol. 215:403410and(1997)Nucleic Acids Res. 25:3389402。、术语“治疗有效量”意思是产生施用它所希望获得的效应的量。精确的量将取决于治疗目的、被治疗的受试者的年龄和体型大小、施用途径等，其是本领域技术人员使用已知技术可以确定的(见，例如 Lloyd(1999)The Art, Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)。人类抗体的制备在转基因小鼠中产生人类抗体的方法是本领域已知的。任何此类已知的方法可用于本发明的情景中以制备特异性结合ANGPTL4的人类抗体。使用VEL0CIMMUNE 技术或任何其它已知的用于产生单克隆抗体的方法，最初分离的针对ANGPTL4的高亲和性嵌合抗体具有人可变区和小鼠恒定区。如下文实验部分所述，就需要的性质、包括亲和性、选择性、表位等等表征并选择抗体。一般地。本发明的抗体具有非常高的亲和性，通常具有大约KT12M至大约KT9M的KD(通过与固定于固相或处于溶液相中的抗原结合时所测定)。小鼠恒定区被替换为需要的人恒定区，例如野生型IgGl (SEQ ID N0:481)或IgG4(SEQ ID NO: 482)，或修饰的IgGl或IgG4(例如，SEQ ID N0:483)，以产生本发明的完全人类抗体。虽然所选的恒定区可以根据特定用途而变化，但是抗体的高亲和性抗原结合和靶标特异性性质存在于可变区中。表位定位和相关的技术为了筛选结合特定表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，例如在Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb. , NY)中所描述的。其它的方法包括丙氨酸筛选突变体、肽印迹(Reineke (2004) Methods Mol Biol248:443-63)，或肽切割分析。另外，可以使用例如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer (2000) Protein Science 9:487-496)。术语“表位”是指抗原上的、B和/或T细胞针对其作出应答的位点。B细胞表位可以形成于连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而毗邻的非连续氨基酸。形成于连续氨基酸的表位通常在暴露于变性溶剂后仍然保持，而通过三级折叠形成的表位通常在以变性溶剂处理之后会丧失。表位通常包括至少3个，更通常为至少5个或8-10个以独特空间构象存在的氨基酸。
修饰辅助谱(MAP)，也称作基于抗原结构的抗体谱(ASAP)，是根据每种抗体与化学或酶学修饰的抗原表面的结合谱的相似性而将针对同一抗原的大量的单克隆抗体(mAb)进行归类的方法(US2004/0101920)。每个类别可以反映出与另一个类别代表的表位截然不同或部分重叠的独特表位。该技术允许对遗传上相同的mAb进行迅速过滤，从而表征可聚焦于遗传上不同的单克隆抗体。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可以促进产生具有需要的性质的单克隆抗体的稀少的杂交瘤克隆的鉴定。MAP可用于将本发明的抗-ANGPTL4单克隆抗体分为结合不同表位的单克隆抗体的组。 ANGPTL4含有氨基末端的卷曲螺旋结构域和羧基末端的纤维蛋白原样结构域，全长的ANGPTL4蛋白通过分子间二硫键形成寡聚体( Ge et al. , 2004, J Bio Chem279(3) :2038-2045)。已经有报道指出N末端卷曲螺旋结构域介导ANGPTL4的寡聚化(Ge etal.,见上文)，该结构域在LPL活性的抑制中也具有重要作用(Ge et al. , 2005, J LipidRes46:1484-1490;和 Ono et al.，2003，J Biol Chem 278:41804-41809)。因此，在一些实施方式中，抗-MNGPTL4抗体或抗体的抗原结合片段结合hANGPTL4(SEQ ID NO:476)的N末端卷曲螺旋结构域(残基1-123)内的表位。在一些实施方式中，抗_hANGPTL4抗体或其片段结合hANGPTL4(SEQ ID NO:476)的大约残基I至大约残基25、大约残基25至大约残基50、大约残基50至大约残基75、大约残基75至大约残基100、大约残基100至大约残基125、大约残基125至大约残基150的区域内的表位。在一些实施方式中，抗体或抗体片段结合这样的表位，其包括一个以上的所列举的hANGPTL4的N末端卷曲螺旋结构域内的表位。在其它实施方式中，抗_hANGPTL4抗体或其片段结合hANGPTL4的一个或多个片段，例如，SEQ ID NO:476的残基26-406、残基26-148、残基34-66、和/或残基165-406的片段。本发明包括与本文描述的任何特异性示例性抗体结合相同表位的hANGPTL4抗体。同样，本发明也包括与本文描述的任何特异性示例性抗体竞争结合hANGPTL4或hANGPTL4片段的抗_hANGPTL4抗体。可以通过使用本领域已知的常规方法容易地确定一个抗体是否与参考抗-hANGPTL4抗体结合相同表位或与参考抗-hANGPTL4抗体竞争。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗_hANGPTL4抗体结合相同的表位，可以在饱和条件下使参考抗体结合hANGPTL4蛋白或肽。然后，测定测试抗体结合hANGPTL4分子的能力。如果测试抗体能够在参考抗_hANGPTL4抗体饱和结合之后结合hANGPTL4，则可以得出结论该测试抗体与参考抗_hANGPTL4抗体结合不同的表位。另一方面，如果测试抗体在参考抗_hANGPTL4抗体饱和结合之后不能结合hANGPTL4分子，则该测试抗体可能与本发明的参考抗_hANGPTL4抗体结合相同的表位。为了测试抗体是否与参考抗_hANGPTL4抗体竞争，以两个方向进行上述结合方法。在第一个方向中，使参考抗体在饱和条件下结合hANGPTL4分子，然后测定测试抗体与hANGPTL4分子的结合。在第二个方向中，使测试抗体在饱和条件下与hANGPTL4分子结合，然后测定参考抗体与ANGPTL4分子的结合。如果在两个方向中，只有第一个(饱和)抗体能够结合ANGPTL4分子，则得出结论测试抗体和参考抗体竞争与hANGPTL4的结合。如本领域普通技术人员所认识到的，与参考抗体竞争的抗体不一定与该参考抗体结合相同的表位，而是可能通过结合重叠表位或邻近表位而空间上阻断参考抗体的结合。如果两个抗体各自竞争性抑制(阻断)另一个与抗原的结合，则这两个抗体结合相同表位或重叠表位。即，1-，5_，10-，20-或100-倍过量的一种抗体抑制另一种的结合达至少50%、优选75%，90%或甚至99%，如在竞争性结合测定中所测定(见，例如Junghans etal. , Cancer Res, 1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减少或消除另一种的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变也减少或消除另一种的结合，则两种抗体具有重叠的表位。然后可以进行另外的常规实验(例如肽突变和结合分析)以确认所观察到的测试抗体的结合的缺乏是否事实上是由于与参考抗体结合相同的表位引起的，或者是否是空间阻断(或另一种现象)造成所观察到的结合的缺乏。这种类型的实验可以使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定法来进行。免疫缀合物、本发明包括缀合于治疗部分、例如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性标记物的人抗_hANGPTL4单克隆抗体(“免疫缀合物”)。细胞毒素试剂包括任何对于细胞有毒性的试剂。用于形成免疫缀合物的合适的细胞毒素试剂和化疗试剂的实例是本领域已知的，见例如 WO 05/103081。双特异性本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性的单克隆抗体可以特异于一个靶多肽的不同表位或者可以包含特异于多个靶多肽的抗原结合结构域。见，例如 Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69。人抗-hANGPTL4 单克隆抗体可以连接于另一个功能分子，例如另一个肽或蛋白，或者与其一起表达。例如，抗体或其片段可以与一个或多个其它分子实体、例如另一个抗体或抗体片段功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合)，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。可用于本发明的情景中的示例性的双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)Ch3结构域和第二 IgCH3结构域，其中第一和第二 IgCH3结构域彼此的区别为至少一个氨基酸，并且其中相对于不含该氨基酸差异的双特异性抗体而言，该至少一个氨基酸差异减少双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，第一 IgC^结构域结合蛋白A，第二IgCH3结构域包含减少或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据MGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。第二 Ch3可以进一步包含Y96F修饰(根据MGT ;根据EU为Y436F)。在IgGl抗体的情况下，可以存在于第二 Ch3内的其它修饰包括D16E，L18M, N44S, K52N, V57M和 V82I (根据 IMGT ;根据 EU 为 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 和 V422I);在 IgG2 抗体的情况下为 N44S, K52N 和 V82I (根据 IMGT;根据 EU 为 N384S, K392N 和 V422I);在 IgG4 抗体的情况下为 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 和 V82I (根据 IMGT;根据 EU 为 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q和V422I)。上述描述的双特异性抗体形式的变化在本发明的范围内。生物等同物本发明的抗_hANGPTL4抗体和抗体片段包括这样的蛋白其具有不同于所描述的单克隆抗体的氨基酸序列，但是保持与人ANGPTL4结合的能力。此类变体单克隆抗体和抗体片段相对于亲代序列具有一个或多个氨基酸的添加、删除或置换，但是显示出与描述的单克隆抗体基本上等同的生物活性。同样，本发明的hANGPTL4抗体的编码DNA序列包括相对于所公开的序列具有一个或多个核苷酸的添加、删除或置换、但是编码与本发明的抗-hANGPTL4抗体或抗体片段基本上生物等同的抗_hANGPTL4抗体或抗体片段的序列。此类变体氨基酸和DNA序列的实例在上文中有讨论。如果，例如，两个抗原结合蛋白或抗体是药学上等同的或药学上可替代的，当在相似的实验条件下以单一剂量或多个剂量以相同摩尔剂量施用时，它们的吸收速率和程度未显示出显著差异，则它们被认为是生物上等同的。如果一些抗体在吸收程度上等同但是在吸收速率上不同，这些抗体将被认为是等同或药学可替代的，仍然可以被考虑为生物等同的，因为此类吸收速率上的差异是有意而为，在标记中有所反映，并且对于临床使用上的有效身体药物浓度的达到不是必不可少的，对于所研究的特定药物产品，其被认为是医学上不重要的。在一个实施方式中，如果两个抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度和效力上没有临床意义上的差异，则它们是生物等同的。 在一个实施方式中，如果患者可以在参考产品和生物产品之间转换一次或多次而无预期的副作用风险的增大、包括免疫原性上的临床上显著的变化，或减小的有效性(相对于不进行此类转换的连续治疗)，则两个抗原结合蛋白是生物等同的。在一个实施方式中，如果两个抗原结合蛋白通过共同的机制或作用机理针对条件或使用条件而发挥作用(达到此类机制已知的程度)，则它们是生物等同的。可以通过体内和体外方法证明生物等同性。生物等同性测定包括，例如(a)人或其它哺乳动物中的体内测试，其中测定血液、血浆、血清或其它生物液体中的抗体或其代谢物的浓度，作为时间的函数；(b)与人体内生物可利用性数据相关联并且合理预测人体内生物可利用性的体外测试；(C)人或其它哺乳动物中的体内测试，其中测定抗体(或其靶标)的适当的急性药理学效应，作为时间的函数；和(d)在建立抗体的安全性、有效性或生物可利用性或生物等同性的良好控制的临床试验中。本发明的抗_hANGPTL4抗体的生物等同变体可以这样构建例如,进行残基或序列的多种置换，或删除末端或中间的残基或序列，所述残基或序列不是生物活性所需的。例如，对于生物活性而言不是必不可少的半胱氨酸残基可以被删除或被替换为其它氨基酸以防止复性后形成非必要的或不正确的分子内二硫桥。治疗施用和制剂本发明提供了包含本发明的抗_hANGPTL4抗体或其抗原结合片段的治疗组合物以及使用它的治疗方法。根据本发明的治疗组合物的施用可以与合适的载体、赋形剂和掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等的其它试剂一起施用。在所有的药物化学家已知的处方集中可以找到多种合适的制剂Remington’s Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Company, Easton, PA。这些制剂包括,例如,粉末、糊、膏、胶、腊、油、脂、含脂(阳离子或阴离子)囊泡(例如LIPOFECTIN ) ,DNA缀合物、无水吸收糊、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含碳蜡的半固体混合物。另外参见Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations〃PDA(1998) JPharm Sci Technol 52:238-311。剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型大小、目标疾病、治疗目的、状况、施用途径等来决定。当本发明的抗体用于治疗成人患者中的与ANGPTL4直接或间接相关的多种病况和疾病时，包括高胆固醇血症、与LDL和载脂蛋白B相关的病症、脂代谢病症等病症时，有利的是通过静脉内或皮下施用本发明的抗体，单一剂量为大约0. 01至大约20mg/kg体重、更优选大约0. 02至大约7、大约0. 03至大约5,或大约0. 05至大约3mg/kg体重。取决于病况的严重性，治疗频率和持续时间可以调整。在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以至少大约0. Img至大约800mg、大约I至大约500mg、大约5至大约300mg,或大约10至大约200mg、至大约IOOmg,或至大约50mg的最初给药施用。在一些实施方式中，最初给药之后可以施用抗体或其抗原结合片段的第二次给药或多个随后给药，数量可以与最初给药大体相同或小于最初给药的数量，其中随后的给药间隔大约I天至3天；至少I周；至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。有多种递送系统是已知的并可用于施用本发明的 药物组合物，例如，封装于脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞(见，例如Wu etal. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。导入方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬脑膜外和经口途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，经由表皮或粘膜皮肤内层吸收(例如，口粘膜、直肠和肠粘膜等)，并且可以与其它生物活性试剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。药物组合物也可以在囊泡中递送，尤其是脂质体(见Langer(1990)Science 249:1527-1533;Treat et al. (1989)in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(eds. ), Liss, NewYork, pp. 353-365; Lopez-Berestein,同前，第 317-327 页;一般性参见，同上)。在一些情况下，药物组合物可以通过控释系统递送。在一个实施方式中，可以使用泵(见 Langer,见上文;Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201) 在另一实施方式中，可以使用聚合物材料；见Medical Applications of Controlled Release, Langerand Wise (eds. ), CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974)。在另一实施方式中，可以将控释系统置于组合物的靶标的附近，因此仅需要一部分的系统性剂量(见，例如Goodson，inMedical Applications of Controlled Release,见上文，第 2 卷，第 115-138 页，1984)。可注射的制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、点滴输注的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以这样制备例如，将上文描述的抗体或其盐溶解于、悬浮于或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中。用于注射的水性介质有，例如，生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助试剂的等渗溶液，其可以与合适的增溶剂组合使用，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]等等。油性介质可以使用例如芝麻油、豆油等，其可以与增溶剂组合使用，例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。由此制备的注射制剂优选装入适当的安瓿。本发明的药物组合物可以使用标准的针头和注射器皮下或静脉内递送。另外，就皮下递送而言，笔递送装置可容易地用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是重复使用的或一次性的。重复使用的笔递送装置一般利用可替代的包含药物组合物的药筒。一旦该药筒内的所有药物组合物都已被施用并且药筒是空的，则可以容易地丢弃空药筒并替代为新的包含药物组合物的药筒。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性的笔递送装置内，没有可替代的药筒。相反，一次性笔递送装置中预装了保持在装置内的贮库内的药物组合物。一旦该贮库中的药物组合物耗尽，则丢弃整个装置。有多种可重复使用的笔和自动注射递送装置可用于本发明的药物组合物的皮下递送。实例包括但不限于AUT0PEN (Owen Mumford, Inc. , Woodstock, UK)、DISETRONIC 笔(Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland) > HUMALOG MIX75/25 笔、HUMALOG 笔 HUMALIN 70/30 笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis, IN)、N0V0PEN I, II 和 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR (NovoNordisk,Copenhagen, Denmark)、BD 笔(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPEN 、OPTIPEN PRO 、0PTIPEN STARLET 和 0PTICLIK (sanofi-aventis，Frankfurt,Germany)，仅举数例。用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包括但不限于S0L0STAR 笔(sanofi-aventis)、FLEXPEN (Novo Nordisk)和 KWIKPEN (EliLilly)。有利地，用于上文描述的口服或胃肠外使用的药物组合物被配制为适合于一剂活 性成分的单元剂量的剂型。单元剂量的此类剂型包括，例如，片剂、药丸、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。包含的上述抗体的量一般是大约0. I至大约SOOmg/单元剂量剂型；特别是注射的形式，包含的上述抗体是大约I至大约500mg、大约5至300mg、大约8至200mg和大约10至大约lOOmg，用于其它剂型。组合治疗本发明还提供了用于治疗与hANGPTL4直接或间接相关的疾病或病症的治疗方法与一种或多种另外的治疗剂组合施用本发明的抗_hANGPTL4抗体或其片段。所述另外的治疗剂可以是与本发明的抗体或其片段有利地组合的一种或多种任意试剂，包括HMG-CoA还原酶抑制剂，例如西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、罗舒伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等；尼克酸；多种贝特类、例如非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝丁酯、吉非贝齐等；LXR转录因子激活剂等。此外，本发明的hANGPTL4抗体或其片段可以与其它ANGPTL4抑制剂以及其它分子的抑制剂共同施用，所述其它分子是例如ANGPTL3、ANGPTL5、ANGPTL6和前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)，其参与脂质代谢，特别是胆固醇和/或甘油三酯平衡。这些分子的抑制剂包括小分子和特异性结合这些分子并阻断它们的活性的抗体(见，例如，U. S. 2010/0166768A1中公开的抗-PCSK9抗体)。此外，另外的治疗剂可以是一种或多种抗癌剂，例如化疗剂、抗血管生成剂、生长抑制剂、细胞毒性试剂、细胞凋亡试剂和本领域熟知的治疗癌症或其它增殖性疾病或病症的其它试剂。抗癌剂的实例包括但不限于抗有丝分裂剂，例如多西紫杉醇、紫杉酚等；基于钼的化疗化合物，例如顺钼、卡钼、异丙钼、奥沙利钼等；或其它常规细胞毒性试剂，例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、伊立替康、亚叶酸、吉西他滨等，和抗血管生成试剂，包括血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂，例如抗VEGF抗体，例如bevacizumab( AVASTIN ，Genentech)和基于受体的VEGF阻断剂，例如描述于美国专利号7，070，959中的“VEGFtrap”，A-样配体4(D114)拮抗剂，例如美国专利申请公开号2008/0181899中描述的抗-D114抗体，和包含D114的细胞外结构域的融合蛋白，例如美国专利申请公开号2008/0107648中描述的D114_Fc ;受体酪氨酸激酶和/或血管生成的抑制剂，包括索拉非尼(Bayer Pharmaceuticals Corp.的NEXAVAR )、舒尼替尼(Pfizer 的SUTENT )、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline 的 V0TRIENT )、托西尼布(Pfizer 的 PALLADIA )、凡德他尼(AstraZeneca 的 ZACTIMA )、西地尼布(AstraZeneca 的RECENTIN )、瑞戈非尼(Bayer 的 BAY73-4506)、阿昔替尼(Pfizer 的 AG013736)、来妥替尼(C印halon 的 CEP-701)、埃罗替尼(Genentech 的TARCEV)、吉非替尼(AstraZeneca 的 IRESSA )、BIBff2992 (Boehringer Ingelheim 的 TOVOK )、拉帕替尼(Glaxo SmithKline 的TYKERB )、奈拉替尼(Wyeth/Pfizer的HKI-272)等等，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，其它治疗剂，例如镇痛剂、抗炎剂包括非留体抗炎药物(NSAIDS)、例如Cox-2抑制剂等，也可以与本发明的hANGPTL4抗体或其片段 共同施用，以缓解和/或减少伴随癌症/肿瘤的症状。本发明的hANGPTL4抗体或其片段和另外的治疗剂可以一起或分开地共同施用。当使用分开的剂量制剂时，本发明的抗体或其片段和另外的试剂可以同时或在错开的时间施用，即按照合适的顺序顺次施用。抗体的诊断应用本发明的抗-ANGPTL4抗体还可用于检测和/或测定样品中的ANGPTL4，例如，用于诊断目的。例如，抗-ANGPTL4抗体或其片段可用于诊断特征在于ANGPTL4的异常表达(例如，过表达、表达不足、不表达等)的病况或疾病。ANGPTL4的示例性诊断测定可以包括例如，将获自患者的样品与本发明的抗-ANGPTL4抗体接触，其中抗-ANGPTL4抗体用可检测标记物或报告分子标记，或用于从患者样品选择性捕获和分离ANGPTL4蛋白。或者，未标记的抗-ANGPTL4抗体可以与本身为可检测地标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记物或报告分子可以是放射性标记物，例如3H, 14C, 32P, 35S, 131I或125I ;荧光或化学发光部分，例如荧光素异硫氰酸酯或若丹明；酶，例如碱性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于检测或测定样品中的ANGPTL4的测定法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活的细胞分选(FACS)等等。
实施例以下实施例是为了给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的详细公开和描述，不是意在限制本发明人所认为的本发明的范围。已经付出了努力以确保所用的数字的精确性，但是有一些实验误差和偏差。除非另有指明，否则分子量是指平均分子量，温度是指摄氏温度，压力是大气压或接近大气压。实施例I :针对人ANGPTL4的人类抗体的产生使用人ANGPTL4免疫VEL0CIMMUNE 小鼠，使用从这些小鼠获得的血清，通过抗原特异性免疫测定监视抗体免疫应答。从经免疫的小鼠(显示出具有升高的抗_hANGPTL4抗体效价)的脾脏收获表达抗_hANGPTL4的B细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。使用如下文描述的测定法筛选杂交瘤并进行选择以鉴定表达hANGPTL4特异性抗体的细胞系。所述测定法鉴定了产生嵌合抗_hANGPTL4抗体(被称作H1M222，H1M223, H1M224, H1M225，H1M234和H1M236)的数个细胞系。还从不与骨髓瘤细胞融合的抗原免疫的B细胞中直接分离了人ANGPTL4特异性抗体，如U. S. 2007/0280945A1中所描述。克隆重链和轻链可变区以产生完整的人抗-hANGPTL4 抗体，这些抗体被称作 H1H257, H1H268, H1H283, H1H284, H1H285, H1H291, H1H292，H1H295, H1H624, H1H637, H1H638, H1H644 和 H1H653。建立了稳定的表达重组抗体的 CHO
细胞系。实施例2 :可变基因使用分析(Variable Gene Utilization Analysis)为了分析所产生的抗体的结构，克隆并测序了编码抗体可变区的核酸。根据抗体
的核酸序列和预测的氨基酸序列，就每个重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)鉴定了
基因使用。表I显示了根据本发明的所选抗体的基因使用。表I

权利要求
1.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含选自 SEQ ID NO: 28/30/32，76/78/80，4/6/8，52/54/56，100/102/104，124/126/128，148/150/152，172/174/176，196/198/200，220/222/224，244/246/248，268/270/272，292/294/296，316/318/320, 340/342/344, 364/366/368，388/390/392, 412/414/416, 436/438/440 和 460/462/464 的重链互补决定区 I (HCDRl)/HCDR2/HCDR3 组合。
2.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含选自 SEQ ID NO:36/38/40，84/86/88，12/14/16，60/62/64，108/110/112，132/134/136，156/158/160，180/182/184，204/206/208，228/230/232，252/254/256，276/278/280，300/302/304，324/326/328，348/350/352，372/374/376，396/398/400，420/422/424 和444/446/448 的轻链互补决定区 I (LCDRl)/LCDR2/LCDR3 组合。
3.权利要求I或2的抗体或抗原结合片段，其包含包含选自SEQID NO:28/30/32/36/38/40，76/78/80/84/86/88，4/6/8/12/14/16，52/54/56/60/62/64，100/102/104/108/11 0/112， 124/126/128/132/134/136， 148/150/152/156/158/160， 172/174/176/180/182/184 ，196/198/200/204/206/208, 220/222/224/228/230/232, 244/246/248/252/254/256，268/ 270/272/276/278/280，292/294/296/300/302/304，316/318/320/324/326/328，340/342/344/348/350/352,364/366/368/372/374/376，388/390/392/396/398/400, 412/414/416/420/422/424，436/438/440/444/446/448 和 460/462/464/396/398/400 的 CDR 序列组合的重链和轻链 CDR 序列 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3。
4.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或抗体的抗原结合片段，其包含选自 SEQ ID NO:487, 90，2，18，22，26，42，46，50，66，70，74，94，98，114，118，122，138，142，146，162，166，170，186，190，194，210，214，218，234，238，242，258，262，266，282，286，290，306，310，314，330，334，338，354，358，362，378，382，386，402，406，410，426，430，434，450，454，458，466 和 468 的重链可变区(HCVR)。
5.权利要求4的抗体或抗原结合片段，其还包含选自SEQID NO:44，92，10，20，24，34，48，58，68，72，82，96，106，116，120，130，140，144，154，164，168，178，188，192，202，212，216，226，236，240，250，260，264，274，284，288，298，308，312，322，332，336，346，356，360，370，380，384，394，404，408，418，428，432，442，452 和 456 的轻链可变区(LCVR)。
6.权利要求1-5任一项的抗体或抗原结合片段，其包含选自SEQID NO:487/44, 90/92，2/10，18/20，22/24，26/34，42/44，46/48，50/58，66/68，70/72，74/82，94/96，98/106，114/116， 118/120， 122/130， 138/140， 142/144， 146/154， 162/164， 166/168， 170/178， 186/188，190/192，194/202，210/212，214/216，218/226，234/236，238/240，242/250，258/260，262/264，266/274，282/284，286/288，290/298，306/308，310/312，314/322，330/332，334/336，338/346，354/356，358/360，362/370，378/380，382/384，386/394，402/404，406/408，410/418，426/428，430/432，434/442，450/452，454/456，458/394，466/404 和 468/408 的 HCVR/LCVR序列对。
7.权利要求1-6任一项的抗体或抗原结合片段，其包含HCVR/LCVR序列对SEQIDNO :487/44 或90/92。
8.特异性结合hANGPTL4的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含包含于根据权利要求6或7的抗体或抗原结合片段的HCVR/LCVR序列对内的重链和轻链CDR序列。
9.抗体或其抗原结合片段，其与权利要求3、6和7任一项的抗体或抗原结合片段竞争与hANGPTL4的结合。
10.抗体或其抗原结合片段，其与权利要求3、6、7和9任一项的抗体或抗原结合片段结合相同的表位。
11.权利要求3、6和7任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与猕猴ANGPTL4和恒河猴ANGPTL4交叉反应。
12.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含 (a)包含式Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-Xii-Xi2-Xi3-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20 (SEQ IDNO: 471)的氨基酸序列的重链互补决定区3 (HCDR3)，其中X1是Ala, X2是Arg或Lys, X3是Gly或Glu, X4是Gly, Asp或不存在，X5是Asp或不存在，X6是Leu, Arg或不存在，X7是Arg或 Ser, X8 是 Phe, Gly 或 Arg, X9 是 Leu, His 或 Asn, X10 是 Asp, Pro 或 Tyr, X11 是 T r p, Tyr 或Phe, X12 是 Leu, Phe, Val 或 Asp, X13 是 Ser, Tyr 或 Gly, X14 是 Ser, Tyr 或 Asp, X15 是 Tyr, X16是 Phe 或 Gly, X17 是 Leu 或不存在，X18 是 Asp, X19 是 Tyr, Val 或 Phe，X20 是 Trp;和 (b)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici (SEQ ID NO:474)的氨基酸序列的轻链互补决定区 3 (LCDR3)，其中 X1 是 Gin, X2 是 Asn 或 Gin, X3 是 Tyr 或 Leu, X4 是 Asn, His, Ser 或Asp, X5 是 Thr 或 Ser, X6疋Ala 或 Tyr, X7 是 Pro, Ser 或 Phe, X8 是 Leu 或 Arg, X9 是 Thr, X10 是Phe0
13.权利要求12的抗体或抗原结合片段，还包含 (C)包含式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:469)的氨基酸序列的 HCDRl，其中 X1 是Gly, X2 是 Gly 或 Phe, X3 是 Ser 或 Thr, X4 是 Phe, X5fiSer, X6 是 lie, Ser 或 Thr, X7 是 His 或Tyr, X8 是 His, Gly 或 Asp; (d)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO:470)的氨基酸序列的 HCDR2，其中 X1 是He, X2 是 Asn, Ser 或 Gly, X3 是 His, Phe, Ser 或 Val, X4 是 Arg, Asp 或 Ala, X5 是 Gly, X6 是Gly 或不存在，X7 是 Ser, Asn 或 Asp, X8 是 Thr 或 Lys;(e)包含式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO:472)的氨基酸序列的 LCDRl，其中 X1 是Gin, X2是 Gly 或 Ser, X3 是 He, X4 是 Ser 或 Asn, X5 是 Asp, Ser 或 Arg, X6 是 Tyr 或 Trp;和 (f)包含式X1-X2-X3(SEQ ID NO: 473)的氨基酸序列的LCDR2，其中X1是Ala或Lys，X2是 Ala，X3 是 Ser。
14.特异性结合人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含由衍生自VH、Dh和Jh种系基因区段的核苷酸序列区段编码的重链可变区(HCVR)，和由衍生自Vk和Jk种系基因区段的核苷酸序列区段编码的轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR和LCVR由衍生自下列组合的核苷酸序列区段编码(i)Vh4-34, Dh3-3, Jh4, Vk1_27 和 JK4;或(ii)VH3-30, DH5_12，JH6, VK1_9 和 JK4。
15.编码前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
16.包含权利要求15的核酸分子的表达载体。
17.包含权利要求16的表达载体的宿主细胞。
18.产生抗-hANGPTL4抗体或其抗原结合片段的方法，包括在允许产生所述抗体或其片段的条件下生长权利要求17的宿主细胞，和回收所产生的抗体或其片段。
19.包含权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。
20.权利要求19的药物组合物，还包含选自下列的一种或多种另外的治疗剂HMG-CoA还原酶的抑制剂；胆固醇摄取或胆汁酸重吸收的抑制剂，或二者；增加脂蛋白分解代谢的试剂；减少非致命心脏病发作次数的试剂；和LXR转录因子的激活剂。
21.权利要求19的药物组合物，还包含选自下列的一种或多种另外的治疗剂抑制素、尼克酸、贝特和抗-PCSK9抗体。
22.预防或治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症通过减少或抑制ANGPTL4活性而被预防、缓解、改善或抑制，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求19-21任一项的药物组合物。
23.权利要求22的方法，其中所述疾病或病症选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、导致动脉粥样化的血脂异常、心血管疾病或病症、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
24.权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段，其用于改善、缓解、抑制或预防ANGPTL4介导的疾病或病症。
25.权利要求24的抗体或抗原结合片段，其中所述ANGPTL4介导的疾病或病症选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、导致动脉粥样化的血脂异常、心血管疾病或病症、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
26.权利要求1-14任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于改善、缓解、抑制或预防ANGPTL4介导的疾病或病症的药物中的用途。
27.权利要求26的用途，其中所述ANGPTL4介导的疾病或病症选自高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症、导致动脉粥样化的血脂异常、心血管疾病或病症、急性胰腺炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病和肥胖症。
全文摘要
提供了特异性结合并抑制人血管生成素样蛋白4(hANGPTL4)的完整的人类抗体或人类抗体的抗原结合片段。所述人的抗-hANGPTL4抗体在治疗与ANGPTL4相关的疾病或病症中是有用的，例如高脂血症、高脂蛋白血症和血脂异常，包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症、乳糜微粒血症等等。此外，可以向有此需要的受试者施用抗-hANGPTL4抗体以预防或治疗疾病或病症，对于所述疾病或病症而言异常脂质代谢是风险因子。此类疾病或病症包括心血管疾病，例如动脉硬化症和冠状动脉疾病；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；糖尿病；肥胖症等。
文档编号C07K16/22GK102741284SQ201080062862
公开日2012年10月17日 申请日期2010年12月23日 优先权日2009年12月24日
发明者G·陈, J·H·金, V·古萨罗瓦, W·M·斯利曼 申请人:瑞泽恩制药公司