血管生成素样4蛋白抑制剂，组合，以及其用途的制作方法

专利名称：血管生成素样4蛋白抑制剂，组合，以及其用途的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及人疾病和病理状况诸如癌症的治疗。本发明涉及血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)抑制物以及ANGPTL4抑制物与其它治疗剂的组合，以及利用所述组合物进行疾病或病理状况的诊断和治疗的方法。
背景技术：
癌症是美国的首要死亡原因。已经采用各种类型的治疗来治疗癌症。例如，采用手术方法去除癌性或死亡组织。通过减小固体肿瘤起作用的放射治疗以及杀灭快速分裂细胞的化疗用作癌症治疗。1971年，Folkman提出抗血管生成可能是有效的抗癌策略。Folkman,N. Engl. J. Med. 285，1182-1186 (1971)。血管生成是从已经存在的血管和/或循环的内皮干细胞形成新血管的发展过程(见例如，Ferrara&Alitalo, NatureMedicine5(12) 1359-1364(1999))。血管生成是以下过程组成的级联1)蛋白酶释放后局部位点的细胞外基质的降解，2)毛细血管内皮细胞的増殖，和3)毛细小血管向血管生成性刺激的迁移。Ferrara et al. Endocrine Rev. 13 :18-32 (1992)。心血管的生长是胚胎和出生后发育的正常生理过程如胚胎形成，伤ロ愈合以及月经的先决条件。见例如 Folkman and Klagsbrun Science 235 :442-447 (1987)。心血管从预存在的毛细血管的这种增殖还在各种疾病的病理发展中起重要作用，包括但不限干，例如肿瘤，增殖性视网膜疾病，年龄相关的黄斑变性，银屑病，炎症，糖尿病和类风湿性关节炎(RA)。见例如，Ferrara, RecentProg. Horm. Res. 55 :15-35 (2000), discussion 35-6。由于血管生成的重要的生理和病理重要性，进行大量工作说明能调节该过程的因素。提示血管生成过程受到促-和抗-血管生成分子之间平衡的调节，并且在各种疾病具体是癌症中出现异常。见例如 Carmeliet and Jain Nature407 :249-257 (2000)。 例如,血管生成有赖于分泌的因子如血管内皮生长因子_A(VEGF,也已知为血管通透性因子(VPF))以及纤维母细胞生长因子(FGF)。见例如，Ferraraand Davis-SmythEndocrine Rev. 18 :4-25(1997);和，Ferrara J. Mol. Med. 77 :527-543 (1999) 除了作为血管生成和脉管形成中的生血管因子以外，VEGF作为多向性生长因子，在其它生理过程中显示多重生物作用，诸如内皮细胞存活，血管通透性和血管扩张，单核细胞趋化以及钙内流。Ferrara andDavis-Smyth(1997), supra。此外，研究报道了 VEGF对少数非内皮细胞类型的促有丝分裂效应，诸如视网膜色素内皮细胞，胰导管细胞和雪旺细胞。见例如，Guerrin et al. J. Cell Physiol. 164 :385-394(1995) ；0berg-ffelsh et al. Mol. Cell.Endocrinol. 126 :125-132(1997);和，Sondell et al. J. Neurosci. 19 :5731-5740 (1999)。VEGF 属于包括胎盘生长因子(PlGF)，VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 和 VEGF-E 的基因家族。这些配体结合并连接于内皮细胞上表达的酪氨酸激酶受体。例如，VEGF酪氨酸激酶受体家族包括 Fltl (VEGF-Rl) (VEGF, VEGF-B 和 P1GF)，Flkl/KDR(VEGF-R2)(其结合VEGF, VEGF-C, VEGF-D,和 VEGF-E)，和 Flt4 (VEGF-R3)(其结合 VEGF-C 和 VEGF-D)。见例如，Ferraraet al. , Nature Medicine 9(6) :669-676(2003);和 Robinson&Stringer, JournalofCell Science,114(5) :853-65 (2001)。血管生成素是另ー组血管内皮生长因子。见例如，Davis et al. , Cell,87 :1161-1169(1996) ；Suri et al.，CelI，87 :1171-1180(1996) ；Maisonpierre etal.Science 277 :55-60(1997)；和 Valenzuela et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA96 1904-1909(1999)。血管生成素与VEGF的作用互补且协同，其中VEGF在血管发育中起作用而血管生成素可通过调节血管的重构、成熟以及稳定化起作用。见例如，Holash et al.，Oncogene 18:5356-5362(1999)。血管生成素I,血管生成素2,血管生成素3和血管生成素4结合酪氨酸激酶Tie2(也称为Tek)受体，其是见于内皮细胞上的受体。见例如，ffard&Dumont, Seminars inCell&Developmental Biology, 13 :19-27 (2002)。还有 Tiel 孤儿受体。血管生成不仅有赖于生长因子，还受细胞粘附分子(CAM)的影响，其中包括整合素，它们结合细胞基质中存在的配体。见例如，Ferrara&Alitalo, Nature Medicine5(12) 1359-1364(1999);和 Carmeliet，Nature Medicine, 6 (3) :389-395 (2000)。整合素促进细胞粘附并迁移到见于细胞间隙以及基底膜的细胞外基质蛋白。细胞粘附蛋白的整合素家族由至少18α和8β亚基构成，所述亚基在至少22个α β异源ニ聚体组合中表达。见例如，Byzova et al.，Mol. Cell. , 6 (4) :851-860 (2000);和 Hood and Cheresh, NatureReviews, 2 :91-99 (2002)。其中，至少 6 种(ανβ3，ανβ5, α5β17 α2β17 CiJ1 和 Q1^1)组合见于血管生成(见例如，Hynes and Bader, Thromb. Haemost. , 78 (I) :83-87(1997);以及，Hynes et al. , Braz. J. Med. Biol. Res. , 32 (5) :501-510 (1999)) 发现编码特异性粘附受体的各种基因的灭活或在动物模型中给药封闭型抗体对于内皮细胞的血管生成反应有影响。见例如，Elicieri and Cheresh, Mol. Med. , 4 :741-750 (1998)。
这些分子已经成为癌症治疗的靶。例如，认识到VEGF是病理疾病中血管生成的主要调节物导致封闭VEGF活性的多种尝试。抑制性抗-VEGF受体抗体，可溶受体构建体，反义策略，针对VEGF的RNA适体以及低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制物均可用于干扰 VEGF 信号。见例如，Siemeister et al. CancerMetastasis Rev. 17 :241-248(1998) 抗-VEGF中和抗体已经显示可抑制裸小鼠中多种人肿瘤细胞系的生长(Kim etal.Nature362 :841-844(1993) ；ffarren et al. J. Clin. Invest. 95 :1789-1797(1995)；Borgstrom et al. Cancer Res. 56 :4032-4039 (1996);和 Melnyk et al. Cancer Res. 56 921-924(1996))，并且也抑制缺血视网膜疾病中的眼内血管生成(Adamis etal. Arch.Ophthalmol. 114 :66-71(1996))。事实上，人源化的抗-VEGF 抗体，bevacizumab (AVASTIN ,Genentech)已经得到US FDA的证实可作为转移性结肠直肠癌的ー线治疗。见例如，Ferrara et al. , Nature Reviews DrugDiscovery, 3 :391-400 (2004)。然而，目前的癌症治疗方法不总是最优化的。通常，单ー类型的治疗不能完全抑制病理疾病。例如，外科手术通常不能去除所有癌性生长物。其它癌症疗法，诸如化疗，有许多副作用，和/或治疗由于例如癌症对于药物或治疗产生抗性而变得无效。VEGF或VEGR受体或Tie2受体系统的抑制有时不能完全抑制肿瘤生长。见例如,Gerber et al. ,CancerResearch,60 :6253-6258(2000) ；Ferrara et al. , Nature Reviews Drug Discovery,3 :391-400(2004) ；Millauer et al. , Nature 367,576-579(1994) ；Kim et al. , Nature362 :841-844(1993) ；Millauer et al. , Cancer Res. 56 :1615-1620(1996) ；Goldmanetal. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :8795-8800(1998) ；Asano et al. , CancerResearch,55:5296-5301 (1995) ；ffarren et al.，J. Clin. Invest.，95 :1789-1797 (1995) ;Fong etal. , Cancer Res. 59 :99-106(1999) ；ffedge et al. , Cancer Res. 60 :970-975 (2000)；Wood et al. Cancer Res.60 :2178-2189(2000) ；Siemeister etal. , Cancer Res. 59 3185-3191(1999) ；Lin et al. , J. Clin. Invest. 103 :159-165(1999) ；Lin et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA 95 :8829-8834(1998) ；and, Siemeister et al. , Cancer Res. 59,3185-3191， (1999)。因此，迫切需要新的且更为有效的调节癌症的疗法。本发明强调这些以及其它需要，其从以下公开中显而易见。

发明内容
本发明涉及血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的抑制剂以及利用所述抑制剂治疗疾病和病理情况的方法，例如阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长，阻断或减慢复发性肿瘤生长等。本发明提供ANGPTL4抑制剂与抗癌药剂的组合，以及利用所述组合抑制肿瘤生长和/或涉及血管生成的疾病例如肿瘤形成(例如肿瘤生长)和非肿瘤形成疾病的方法。ANGPTL4的调节物，例如ANGPTL4拮抗剂或激动剂也在本发明提供。本发明的ANGPTL4拮抗剂是抑制或降低ANGPTL4活性的分子。ANGPTL4抑制剂包括小分子量物质，多核苷酸，反义分子，RNA适体，针对ANGPTL4或其受体多肽的核酶，多肽，ANGPTL4的拮抗剂变体，分离的蛋白，重组蛋白，抗体，或其偶联物或融合蛋白，所述抑制剂可直接或间接抑制ANGPTL4活性。本发明的一些实施方案中，拮抗剂ANGPTL4抗体是通过与ANGPTL4蛋白的特异性亚序列或区域结合来抑制或降低ANGPTL4活性的抗体，所述特异性亚序列活区域例如人ANGPTL4的N末端，N末端螺旋区，C末端，C末端纤维蛋白原样区，或ANGPTL4 (1-183)，ANGPTL4(23-183)，ANGPTL4 (I 到约 162)，ANGPTL4(约 162-406)，ANGPTL4(23-406)，或 ANGPTL4(184-406)氨基酸亚序列，和/或鼠 ANGPTL4 的 mANGPTL4(1-183)，mANGPTL4 (23-183)，mANGPTL4(l 到约 165)，mANGPTL4 (23 到约 165)，mANGPTL4 (23-410)或mANGPTL4(184-410)氨基酸亚序列。其他序列还包括但不限于例如，hANGPTL4的40-183，60-183,80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和 160-406，和例如 mANGPTL4 的 40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410 和 160-410。本发明的ー些实施方案中，ANGPTL4拮抗剂包括杭-α ν β 5抗体，例如拮抗剂抗-α ν β 5抗体。一些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。本发明的一些实施方案中，ANGPTL4拮抗剂是SiRNA分子。一个实施方案中，SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子，该分子靶向编码ANGPTL4的核酸的 DNA 序列(例如，GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA) (SEQ ID NO :3)。提供了阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素4样(ANGPTL4)拮抗剂。另ー实施方案中，ANGPTL4拮抗剂是拮抗剂抗_ανβ5抗体。有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。抑制肿瘤细胞迁移的方法也在本发明提供。例如，这样的方法，包括将有效量的ANGPTL4拮抗剂给药肿瘤细胞，由此抑制它们的迁移。本发明ー个实施方案中，ANGPTL4拮抗剂的给药抑制转移。其它治疗剂，例如一或多种抗癌药剂，针对相同或不同抗原的多重抗体，一或多种抗血管生成药剂或抑制剂，疼痛药物等可与ANGPTL4拮抗剂联用和/或一起给药。其它治疗方法，例如手术方法，放射疗法等也可在本发明的方法中或与本发明的组合物一起联用和/或给药肿瘤和/或癌细胞。本发明还提供联用组合物，例如包括抗癌药剂(例如，抗血管生成药剂，等)，ANGPTL4拮抗剂，和载体(例如可药用载体)的组合物。抗癌药剂包括但不限于，例如本领域抑制的抗癌药剂以及本文描述的那些。一些实施方案中，抗癌药剂包括一或多种抗血管生成药剂，例如VEGF拮抗剂和抑制物等。一个实施方案中，VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体或其活性片段(例如人源化的Α4. 6. 1，Avastin ,等)。一些实施方案中，抗癌药剂包括一或多种化疗剂。也提供了阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的联用疗法。一些实施方案中，所述方法包括给药肿瘤或癌细胞有效量的抗癌药剂，以及给药肿瘤或癌细胞有效量的tANGPTL4拮抗剂。可选或此外，可给药包含有效量抗癌药剂(例如抗血管生成药剂等)和有效量、ANGPTL4拮抗剂的联用组合物。联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法也在本发明提供。本发明一些实施方案中，受试者曾经或正在接受利用至少ー种抗癌药剂进行的癌症疗法，并且给药受试者有效量的ANGPTL4拮抗剂。给药有效量的ANGPTL4拮抗剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。一些实施方案中，受试者曾经或正在接受利用ANGPTL4拮抗剂进行的癌症疗法，并且给药受试者有效量的抗癌药剂(例如抗血管生成药剂)，给药有效量的抗癌药剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。通常，肿瘤或癌细胞在受试者内。一些实施方案中，受试者曾经或正在接受利用至少ー种抗癌药剂进行的癌症疗法。通常，受试者是哺乳动物(例如人)。一些实施方案中，将本发明的药剂给药受试者。给药或方法步骤可以任何顺序进行。一个实施方案中，它们依次进行。另ー实施方案中，它们同时进行。可选或此外，所述步骤作为依次和同时的组合，以任何顺序进行。 还提供了 ANGPTL4调节物的试剂盒。一些实施方案中，试剂盒包含ANGPTL4拮抗齐 ，可药用载体，递送物或稀释剂和容器。一个实施方案中，试剂盒包含第一量的抗癌药剂(例如抗血管生成药剂等)，第二量的ANGPTL4拮抗剂以及可药用载体、递送物或稀释剂，和容器。另ー实施方案中，试剂盒包含一定量的抗癌药剂(例如抗血管生成药剂等)，以及可药用载体、递送物或稀释剂，上述物质为第一单位剂量形式；一定量的ANGPTL4拮抗剂以及可药用载体、递送物或稀释剂，上述物质为第二单位剂量形式；和容器。它们的使用说明也包含在其中。本申请涉及下述各项。I.阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的方法，所述方法包括a)给药肿瘤或癌细胞有效量的抗癌药剂；和b)给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)拮抗剂，其中联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。2.项I的方法，其中所述抗癌药剂包括抗血管生成药剂。3.项2的方法，其中所述抗血管生成药剂是VEGF拮抗剂。4.项3的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。5.项4的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化的A4. 6. I。6.项I的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-ANGPTL4抗体。7.项6的方法，其中所述抗-ANGPTL4抗体结合ANGPTL4 (184-406)。8.项I的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-α V β 5抗体。9.项4，6或8的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。10.项I的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂包括SiRNA分子。11.项10的方法，其中所述SiRNA分子是ANGPTL4_SiRNA分子。12.项11的方法，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。13.项I的方法，还包括将第三抗癌药剂给药肿瘤或癌细胞。14.项13的方法，其中所述第三抗癌药剂是化疗剂。15.项13的方法，其中所述第三抗癌药剂是其它血管生成抑制剂。
16.项I的方法，其中所述给药步骤(a)和(b)依次进行。17.项I的方法，其中所述给药步骤(a)和(b)同时进行。18.项I的方法，其中所述给药步骤(a)和(b)以依次和同时的组合的方式进行。19.项I的方法，其中所述给药步骤以任何顺序进行。
20.项I的方法，其中所述肿瘤或癌细胞在受试者中。21.项20的方法，其中所述受试者是人。22.项20的方法，其中所述受试者患有复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。23.阻断或减慢受试者中肿瘤细胞生长或癌细胞生长的方法,所述方法包括给药受试者包含有效量抗血管生成药剂和有效量血管生成素样4 (ANGPTL4)拮抗剂的联用组合物，其中所述联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞的生长。24.项23的方法，还包括给药其它药剂，其中所述其它药剂是抗癌药剂。25.阻断或减慢受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，所述方法包括给药受试者有效量的血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂,其中所述受试者曾经或正在接受利用抗癌药剂进行的癌症治疗，其中给药有效量的ANGPTL4拮抗剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。26.项25的方法，其中所述抗-癌药剂是一或多种化疗剂。27.项25的方法，其中所述抗-癌药剂包括抗血管生成药剂。28.项27的方法，其中所述抗血管生成药剂包括抗-VEGF抑制剂。29.项28的方法，其中所述抗-VEGF抑制剂是抗-VEGF抗体。30.项29的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化的A4. 6. I。31.项25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-ANGPTL4抗体。32.项25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-α V β 5抗体。33.项29，31，或32的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。34.项25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂包括SiRNA分子。35.项34的方法，其中所述SiRNA分子是ANGPTL4_SiRNA分子。36.项35的方法，其中所述ANGPTL4_SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。37.项25的方法，还包括给药其它药剂，其中所述其它药剂是抗癌药剂。38.阻断或减慢肿瘤细胞生长或癌细胞生长的方法，所述方法包括给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素样4 (ANGPTL4)拮抗剂，其中所述ANGPTL4拮抗剂是结合ANGPTL4(184-406)的抗体且其中所述有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。39.组合物，其包含结合ANGPTL4(184-406)的抗体和VEGF拮抗剂。40.组合物，其包含ANGPTL4-SiRNA分子，其中所述ANGPTL4_SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。41.试剂盒，包含第一量的抗血管生成药剂，第二量的血管生成素样4(ANGPTL4)药剂，以及可药用的载体，递送物或稀释剂，以及容器。42.试剂盒，其包含一定量的抗血管生成药剂以及可药用的载体，递送物或稀释齐U，上述物质为第一单位剂量形式；一定量的血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂以及可药用的载体，递送物或稀释剂，上述物质为第二单位剂量形式；以及容器。附图简述图IA和IB显示人ANGPTL4的核酸序列(SEQ ID NO :1)。图2A和2B显示人ANGPTL4的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图3A显示纯化的重组鼠ANGPTL4(23-410)，其在存在(IOmM)或缺失ニ硫苏糖醇(DTT)的条件下在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (4-20% )上分离。图3B显示野生型(泳道I)和变体hANGPTL4 (泳道2)，其在SDS凝胶上分离并通过western印迹检出，其中变体hANGPTL4具有取代R162G和R164E。图4A，4B，和4C图示通过利用ANGPTL4表达构建体转导肿瘤细胞，以及通过ANGPTL4表达构建体(2)转导的COS细胞(C)的经调节的培养基(图4C)，ANGPTL4刺激A673肿瘤细胞(图4A和4B)以及U87MG肿瘤细胞(图4B)増殖。图B中，肿瘤细胞利用
(1)AdLacZ表达构建体对照，(2)Ad-ANGPTL4表达构建体或(3) Ad-SiRNA ANGPTL4构建体转导。图4C中，A673肿瘤细胞增殖通过来自H印a (A) ,HMVEC(B)或利用(I)LacZ表达构建体，
(2)ANGPTL4表达构建体或(3)ANGPTL3表达构建体转导的COS细胞(C)的经调节的培养基进行。图5图示了 mANGPTL4涂覆于培养皿时促进A673増殖。图6A和6B图示了结合A673肿瘤细胞的ANGPTL4的各种形式(图6A)以及各种条件下的情况(图6B)。图7A和7B图示了利用含有ANGPTL4的培养基，生长7天(图7A)或4天(图7B)时，A673的増殖。图7A中，(I)是AdLacZ表达构建体对照，(2)是Ad_hANGPTL4表达构建体，(3)是AdLacZ表达构建体和rmANGPTL4。图7B中，(I)是没有添加，(2)是缓冲液对照，
(3)mANGPTL4(2. 5 μ g/ml)，(4)是 hANGPTL4 (2. 5 μ g/ml)，(5)是 hIgG_hANGPTL4 (2. 5 μ g/ml)，(6)hIgG-mANGPTL4(2. 5 μ g/ml)。图8A，8B和8C图示了 ANGPTL4促进体内肿瘤生长(图8A和图8B)，以及逃离抗肿瘤治疗的趋势，例如利用抗-VEGF抗体(AVASTIN (Genentech, South SanFrancisco)),在肿瘤中利用腺病毒-Angptl4构建体肿瘤内给药(图8C)。图8A和8C显示肿瘤植入后肿瘤体积(cm3)相对于天数的变化。图8B显示植入20天后，异种移植的A673
肿瘤的重量。图9显示ANGPTL4诱导肿瘤细胞，A673和4T_1的细胞迁移，其中(I)没有添加血清，(2) 10%胎牛血清(FCS)，(3)PDGF-BB，和(4)ANGPTL4。图IOA和IOB显示抗_hANGPTL4抗体抑制肿瘤细胞生长，例如

图10A(HeLa_S3和 Caki 细胞)以及图 10B(U87MG，293 和 A673 cells)，其中(I)抗 _hANGPTL4 抗体，(2)抗-down综合征(anti-down syndrome)关键区I蛋白(Dscr)抗体对照,和(3)没有添加物质，其中条状图下方的数目表示抗体浓度(μ g/ml)。图11显示293-1953 (ανβ5)细胞粘附于ANGPTL4或玻连蛋白包被的板，其浓度在下方表示(μ g/ml), BSA用作对照。图12显示抗-α ν β 5和抗_hANGPTL4抗体消除ANGPTL4细胞粘附活性，其中(I)BSA, (2)玻连蛋白，(3)ANGPTL4。图13A，13B，13C显示ANGPTL4与整合素ανβ5的结合。图13Α显示利用说明的量的蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)结合ανβ5包被的板。图13Β显示抗-hANGPTL4抗体抑制蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4_N末端，或hANGPTL4_C末端)与α ν β 5包被的板的结合。消除ANGPTL4细胞粘附活性，其中⑴是BSA，(2)是玻连蛋白，(c)是mANGPTL4。图13C显示ANGPTL4与ανβ的结合，其中(I)包被在板上的hANGPTL4_C末端，
(2)包被在板上并与抗hANGPTL4—起保温的hANGPTL4-C#· (3)包被在板上并与抗-Dscr一起保温的hANGPTL4-C#iS，(4)包被在板上的玻连蛋白，(5)包被在板上的BSA，所述情况为添加ανβ5之前的情况。详细描述定义具体描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的组合物或生物系统，其当然可变化。也应理解本文术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不用作限制。本发明的说明书和权利要求中，単数形式“一”，“一种”，“该”包括复数含义，除非另外明确说明。因此，例如“ー种分子”可选包括两或多个所述分子的组合。除非另有定义，所有科学和技术术语应理解为与它们所述技术领域所用的常见含义相同。为了本发明的目的，在下文描述了以下术语。术语“ANGPTL4或“Angptl4”指血管生成素-样4多肽或蛋白，以及其天然存在的等位基因形式、分泌的形式以及加工的形式。例如，人ANGPTL4是406氨基酸的蛋白，而小鼠ANGPTL4是410氨基酸的蛋白。术语“ANGPTL4”也指该多肽的片段(例如亚序列，截断的形式等)，包括例如N末端片段，螺旋区，C末端片段，纤维蛋白原样区，人血管生成素样4蛋白的氨基酸 1-183,23-183,1 到约 162，23 到约 162，23-406，184-406，约 162-406，或 23-184，以及鼠血管生成素样4蛋白的氨基酸1-183，23-183，I到约165，23到约165，23-410，或184-410。其他片段包括但不限于，例如，hANGPTL4 的 40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和 160-406，和例如，mANGPTL4 的 40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410,120-410，140-410和160-410。ANGPTL4的任何所述形式的參考也可在本申请中鉴定，例如，通过“ANGPTL4(23-406)，”“ANGPTL4(184-406)，，*‘ANGPTL4(23-183)，”“mANGPTL4(23-410)，，*‘mANGPTL4(184-410)，”等，其中m表示鼠序列。天然ANGPTL4片段的氨基酸位置根据在其天然ANGPTL4中的位置编号。例如，ANGPTL4片段中的氨基酸位置22 (Ser)也是天然人ANGPTL4中的位置22 (Ser)。例如參见图2A和2B。总体来看，天然ANGPTL4片段具有生物活性。术语“ANGPTL4调节物”指可活化ANGPTL4或其表达的分子例如激动剂或者可抑制ANGPTL4的活性或其表达的分子例如拮抗剂(或抑制剂)。ANGPTL4激动剂包括抗体和活性片段。ANGPTL4拮抗剂指能中和、阻断、抑制、消除，降低或干扰ANGPTL4活性(例如细胞增殖或生长、迁移、粘附或代谢例如脂质)，调节或其表达包括其与ANGPTL4受体例如，α νβ 5的结合的分子。ANGPTL4拮抗剂包括例如抗ANGPTL4抗体和其抗原结合片段，受体分子以及特异性结合ANGPTL4由此隔绝其与一或多个受体的结合的衍生物，抗-ANGPTL4受体抗体和ANGPTL4受体拮抗剂诸如受体的小分子抑制物。其他ANGPTL4拮抗剂也包括ANGPTL4的拮抗剂变体，反义分子(例如ANGPTL4-SiRNA)，RNA适体，以及针对ANGPTL4或其受体的核酶。一些实施方案中，拮抗剂ANGPTL4抗体是通过与ANGPTL4的特异性亚序列或区域结、合而抑制或降低ANGPTL4活性的抗体，所述亚序列或区域例如N末端片段，螺旋区，C末端片段，纤维蛋白原样区，人血管生成素样4蛋白的氨基酸1-183，23-183，I到约162，23到约 162，23-406，184-406,约 162-406 或 23-184，鼠血管生成素样 4 蛋白的ト 183，23-183，I到约165，23到约165，23-410，或184-410。其他亚序列还包括但不限于，例如，hANGPTL4的 40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和 160-406，例如，mANGPTL4 的 40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410 和 160-410。术语“抗-ANGPTL4抗体”是以足够的亲和力和特异性结合ANGPTL4的抗体。本发明的一些实施方案中，本发明的抗-ANGPTL4抗体可用作靶向和干预与ANGPTL4活性有关的疾病和病症的治疗剂。通常，抗-ANGPTL4抗体不结合其他ANGPTL4同系物，例如，ANGPTL3。术语"VEGF"和“ VEGF-Α”可互换使用，意指165个氨基酸的血管内皮细胞因 子和相关的121-, 145-, 183-, 189-,和206-氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leunget al. Science,246 1306 (1989), Houck et al. Mol. Endocrin. ,5 :1806(1991),和Robinson&Stringer, Journal of Cell Science, 144 (5) :853-865 (2001)所述，以及其天然存在的等位基因和加工的形式。术语“VEGF”也指多肽的片段，例如包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8 -109的片段。任何所述形式的VEGF在本发明中可称为例如“VEGF(8-109)，” "VEGF(1-109) ”或“VEGF165”。“片段”天然VEGF的氨基酸位置根据天然VEGF序列中所示的进行编号。例如，片段活性VEGF的氨基酸位置17 (蛋氨酸)也是天然VEGF中的位置17 (蛋氨酸)。片段活性VEGF与天然VEGF相比对KDR和/或Flt-I具有结合未和力。“抗-VEGF抗体”是以足够的亲和力和特异性结合VEGF的抗体。本发明的抗-VEGF抗体可用作靶向并干扰与VEGF活性有关的疾病或病症的治疗剂。抗-VEGF抗体通常不结合其它VEGF同系物诸如VEGF-B或VEGF-C，也不结合其它生长因子诸如P1GF，PDGF或bFGF。见例如，U. S. Patents6, 582，959，6，703，020 ；W098/45332 ；W0 96/30046 ；W094/10202 ；EP0666868B1 ;美国专利申请 20030206899，20030190317，20030203409，和 20050112126 ；Popkov et al. , Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004);以及AttorneyDocket number P2072R1。抗-VEGF 抗体“Bevacizumab (BV) ” 也已知为 “rhuMAb VEGF” 或“Avastin ”,其为重组人源化抗-VEGF单克隆抗体,根据Presta et al. Cancer Res. 57 4593-4599(1997)产生。其包括突变的人IgGl框架区以及阻断人VEGF与其受体的结合的小鼠抗-hVEGF单克隆抗体A4. 6. I的抗原结合互补决定区。Bevacizumab大约9. 3%的氨基酸序列包括大部分框架区，源自人IgGl,大约7%的序列源自鼠抗体A4. 6. I。Bevacizumab的分子量为大约149，000并且是糖基化的。Bevacizumab以及其它人源化的抗-VEGF抗体在2005-2-26提交的美国专利6，884，879中进ー步描述。“VEGF拮抗剂”指能中和、封闭、抑制、消除、减小或干扰VEGF活性包括其与一或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体和其抗原结合片段，受体分子以及特异性集合阿VEGF由此锁定与一或多种受体的结合的衍生物，抗-VEGF受体抗体以及VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制物，以及融合蛋白，例如VEGF-Trap (Regeneron), VEGF121-gelonin (Peregine)。VEGF 拮抗剂还包括 VEGF 的拮抗剂变体，针对VEGF的反义分子，RNA适体，以及针对VEGF或VEGF受体的核酶。
“天然序列”多肽包括具有与源自自然的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可分离自自然或可通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽具体包括该多肽的天然存在的截短或分泌的形式(例如细胞外区序列)，天然存在的变体形式(例如可选拼接的形式)，以及天然存在的等位基因变体。“多肽链”是其中每个结构域都通过肽键(与共价作用或ニ硫键不同)与其他结构域相连的多肽。多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物 活性多肽或其片段。所述变体包括例如，在所述多肽的N和/或C末端添加或缺失了ー个或多个氨基酸残基(天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸)的多肽。通常，变体与天然序列多肽或其片段具有至少约80%氨基酸序列同一性，或至少约90%氨基酸序列同一性，或至少约95%或更高的氨基酸序列同一性。变体也包括天然序列的多肽片段(例如亚序列，截短等)，通常具有生物活性。本文的“氨基酸序列相同性百分数) ”定义为对位排列该序列且按需要导入间隔以达到最大序列相同性百分数后与所选序列中氨基酸残基相同的候选序列氨基酸残基的百分数，且任何保守取代都不作为该序列相同性的一部分。以测定氨基酸序列相同性百分数为目的的序列对比可按本领域技术内的各种方法完成，例如，使用公众可得到的计算机软件,例如 BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2 或Megalign (DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于測量序列对比的合适參数，包括在所比较的序列全长上达到最大对位排列所需的任何算法。然而，为达到本文目的，氨基酸序列相同性值％可通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2按下文所述获得。AL IGN-2序列比较计算机程序由Genentech, Inc.创作在美国版权局，华盛顿区，20559以用户文件存档，以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序通过 Genentech, Inc. , South San Francisco, California 可公开得到。编译 ALIGN-2程序应基于UNIX操作系统平台，优选数字UNIX V4. OD。所有序列比较參数由ALIGN-2程序设定且不改变。为达到本文目的，给定氨基酸序列A与，和，或者对给定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性1^ (任选可表述为具有或者包含与，和，或者对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列相同性1^的给定氨基酸序列A)计算如下100乘以分数X/Y其中X是通过序列对比程序ALIGN-2在A和B经该程序进行序列对比中评分为相同性匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可预料到如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B的氨基酸序列相同性％不等干B与A的氨基酸序列相同性1^。术语“ANGPTL4变体”在本文中用于指上述变体和/或在天然ANGPTL4序列中包括一或多个氨基酸突变的ANGPTL4。可选，所述ー或多个氨基酸突变包括一或多个氨基酸取代。本发明所用的ANGPTL4及其变体可通过本领域已知的多种方法制备。ANGPTL4的氨基酸序列变体可通过在ANGPTL4DNA中进行突变来制备。所述变体中包括，例如，在ANGPTL4的氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代，例如保藏号为ATCC 209284的核酸编码的人氨基酸序列，或如图2A和2B所示。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得具有所需活性的最终构建体。编码所述变体内的突变必需不能位于读码框内并优选不产生可产生ニ级mRNA结构的互补区。EP 75，444A。ANGPTL4变体可选通过在编码天然ANGPTL4的DNA中进行定点诱变或噬菌体展示技术来制备，由此产生编码所述变体的DNA，并由此在重组细胞培养物中表达该DNA。预先确定导入氨基酸序列变异的位点后，所述突变本身无需预确定。例如，为优化突变在给定位点的表现，可在靶密码子或区域进行随机诱变并筛选表达的ANGPTL4变体以获得所需活性的优选组合。在序列已知的DNA中的预先确定位点产生取代突变的技术是已知的，诸如例如定点诱变。本文所述的ANGPTL4变体的制备可通过噬菌体展示技术实现,诸如PCT W000/63380公开中描述的那些。选出所述克隆以后，可去除突变的蛋白区域并置于适宜载体中以产生蛋白，通常可采用可用于转化适宜宿主的表达载体类型。氨基酸序列缺失通常约1-30个残基，优选1-10个残基，优选1-5或更少个残基， 通常是连续的。氨基酸序列缺失包括ー个残基到基本上长度不受限制的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入(即天然ANGPTL4序列内的插入)可从约1-10个残基，可选1-5，或可选1-3个残基。末端插入的实例包括单个序列与N末端的融合，而无论该单个序列是与宿主细胞异源还是同源，所述融合促进自重组宿主的分泌。其他ANGPTL4变体是天然ANGPTL4中的至少ー个氨基酸序列被去除并在其位置插入不同的残基的那些。本发明的一个实施方案中，ANGPTL4变体包括ANGPTL4的162和/或164的取代或mANGPTL4的169的取代。所述取代可根据表I中所示的那些进行。ANGPTL4变体也可包括本文描述的非天然氨基酸。氨基酸可根据它们侧链性质的相似性分组(在A. L. Lehninger, inBiochemistry,second ed. , pp. 73-75, Worth Publishers, New York(1975)中)(I)非极性Ala(A),Val(V),Leu (L), lie (I)，Pro (P)，Phe (F)，Trp (W)，Met (M)(2)不带电的极性Gly (G), Ser(S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn(N), Gln(Q)(3)酸性Asp (D)，Glu (E)(4)碱性:Lys (K), Arg (R), His (H)可选，天然存在的残基可根据共有的侧链特性分成几组(I)疏水型正亮氨酸，met, ala, val, leu, ile ；(2)中性亲水型cys, ser, thr ；(3)酸性asp, glu ；(4)碱性 :asn，gin, his，lys，arg ；(5)影响链方向的残基gly, pro ;和(6)芳香基trp, tyr, phe。表I
权利要求
1.阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的方法，所述方法包括 a)给药肿瘤或癌细胞有效量的抗癌药剂；和 b)给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)拮抗剂， 其中联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。
2.权利要求I的方法，其中所述抗癌药剂包括抗血管生成药剂。
3.权利要求2的方法，其中所述抗血管生成药剂是VEGF拮抗剂。
4.权利要求I的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-ANGPTL4抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述抗-ANGPTL4抗体结合ANGPTL4(184-406)。
6.权利要求I的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂包括SiRNA分子。
7.组合物，其包含结合ANGPTL4(184-406)的抗体和VEGF拮抗剂。
8.组合物，其包含ANGPTL4-SiRNA分子，其中所述ANGPTL4_SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
9.试剂盒，包含第一量的抗血管生成药剂，第二量的血管生成素样4(ANGPTL4)药剂，以及可药用的载体，递送物或稀释剂，以及容器。
10.试剂盒，其包含一定量的抗血管生成药剂以及可药用的载体，递送物或稀释剂，上述物质为第一单位剂量形式；一定量的血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂以及可药用的载体，递送物或稀释剂，上述物质为第二单位剂量形式；以及容器。
全文摘要
本申请涉及血管生成素样4蛋白抑制剂，组合，以及其用途。提供了血管生成素样4蛋白的调节物以及它们用于治疗疾病和病理情况的方法。也提供了ANGPTL4拮抗剂与其它治疗剂例如抗癌药剂的组合，以及它们用于治疗易患或诊断为患有癌症或复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的哺乳动物的方法。
文档编号A61P35/00GK102641503SQ20121005894
公开日2012年8月22日 申请日期2005年7月19日 优先权日2004年7月20日
发明者梁小浣, 汉斯-彼得.格伯, 纳波利昂.费拉拉 申请人:健泰科生物技术公司