血管生成素样4及其在调节细胞渗漏中的用途
【专利摘要】肿瘤分泌的通透性因子与内皮细胞上的粘附蛋白之间的相互作用诱导的血管破坏促进转移。由于缺少对cANGPTL4怎样调节血管完整性的理解，肿瘤分泌的血管生成素样4(cANGPTL4)在血管渗漏和转移中的作用是有争议的。这里，我们显示cANGPTL4通过以时间顺序的方式与3个新的结合配对物整联蛋白α5β1、VE钙粘着蛋白和密蛋白-5直接相互作用来促成内皮连续性的破坏，因此促进转移。我们显示cANGPTL4结合并激活整联蛋白α5β1介导的Rac1/PAK信号传导以减弱细胞-细胞接触。随后cANGPTL4与VE-钙粘着蛋白和密蛋白-5相连并分离VE-钙粘着蛋白和密蛋白-5，导致内皮破坏。干扰这些cANGPTL4复合物的形成延迟血管破坏。利用注射对照或ANGPTL4敲低肿瘤的ANGPTL4敲除和野生型小鼠进行的体内血管通透性和转移测定证实cANGPTL4在小鼠中诱导血管渗漏并促进肺转移。因此，我们的发现解释了cANGPTL4怎样诱导内皮破坏。我们的发现对靶向cANGPTL4以治疗癌症和其他血管病变具有直接意义。
【专利说明】血管生成素样4及其在调节细胞渗漏中的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年8月8日提交的美国临时专利申请第61/521，031号的权益和优先权，其内容援引加入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及细胞通透性的调节。
【背景技术】
[0004]内皮细胞渗漏是在肿瘤血管中常观察到的现象，并且参与哮喘、脓毒和心血管疾病的发病机理。通常，内皮细胞形成紧密的单层，其仅允许小分子如离子和溶质通过。在病理情况下，提高的内皮细胞通透性或细胞-细胞连接的破坏引起内皮渗漏，允许大分子或细胞(例如肿瘤细胞和巨噬细胞)更容易地通过血管。另一方面，渗漏的内皮细胞层有利于药物递送至靶组织。因此，根据上下文和目的，诱导或抑制血管渗漏可以是有利的。
[0005]血管的内皮由紧密压在一起的相邻的内皮细胞组成。这些相邻的细胞形成粘附结构，包括粘附和紧密连接，这是建立细胞极性、存活以及维持屏障功能所需的。分别控制分子在两个细胞中间或跨越单个细胞移动的旁细胞和跨细胞通透性调节内皮屏障功能。但是在癌症转移中，由细胞间粘附和紧密连接控制的旁细胞通透性通常受损。
[0006]血管生成素样4(ANGPTL4)为脂肪细胞因子，并且还作为基质细胞蛋白发挥功能。ANGPTL4在多种肿瘤类型中预测较差预后的紧凑体内低氧特征中鉴定为突出的(prominent)基因。已发现ANGPTL4mRNA在许多人肿瘤的周围坏死区域、透明细胞肾癌、口腔舌鳞状细胞癌和人胃癌中上调表达。
[0007]糖尿病性溃疡的特征在于失活组织的积累、增加/延长的炎症、不良的伤口相关的血管发生以及减少的基质沉积。研究以调查这些改变以更好地理解伤口愈合异常，以及特别针对纠正这些缺陷靶向治疗。重组I3DGF-BB(贝卡普勒明)是目前为止美国食品和药物管理局批准的用于治疗糖尿病足部溃疡的唯一生长因子。已知TOGF-B是基质细胞的强效促细胞分裂剂和趋化剂，并且可以通过刺激血管发生来发挥作用以增加伤口血管形成。在糖尿病患者中需要可选治疗或方法以加速伤口修复。
[0008]肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因(I)。这主要是由血管渗漏以及内渗和外渗的关键步骤决定的，其包括肿瘤细胞定向迁移跨越被破坏的内皮。内皮提供血液与肿瘤之间的半透性边界。内皮的旁细胞通透性主要由连接至肌动蛋白细胞骨架(2)并连接相邻的内皮细胞(EC) (3)的跨膜内皮粘附连接(AJ)和紧密连接(TJ)蛋白介导。因此，AJ和TJ的主要组分如细胞间VE-钙粘着蛋白和密蛋白-5团的破坏导致肌动蛋白细胞骨架、细胞形状的改变以及细胞内信号传导途径的激活，这部分通过β_联蛋白启动基因转录(4)。除了AJ和TJ，整联蛋白也增强EC-EC接触并在细胞组织、增殖和迁移期间为细胞骨架重组提供支架(5)。具体地，整联蛋白α5β I的表达调节内皮单层完整性出)。本质上，转移需要肿瘤细胞与EC之间的通讯，其以EC-EC接触的破坏和血管基底膜的降解结束。但是，对促进这样的通讯的分子机制仍缺乏了解。
[0009]在肿瘤微环境中，肿瘤细胞之间的相互作用、它们分泌的因子和内皮诱导血管通透性以帮助肿瘤转移(5，7)。这些因子结合至同源细胞受体，引起确定恶性结果的下游分子信号传导事件的级联(8，9)。血管生成素样4(ANGPTL4)蛋白牵涉癌症(10)，但是，其在癌症生物学中的确切作用仍有争议。ANGPTL4鉴定为在癌症患者中最高度表达的基因之一(13)。尽管在癌症中大量证据涉及ANGPTL4，ANGPTL4在疾病发展中的异型作用仍不清楚。
[0010]本发明试图改善上述问题中的至少一个。
【发明内容】
[0011]因此，本发明的第一方面包括一种通过控制细胞环境中血管生成素样4(ANGPTL4)的浓度或活性来调节内皮细胞通透性的方法。
[0012]本发明的另一方面包括一种治疗患者以至少减少内皮细胞通透性的方法，所述方法包括使感染者与CANGPTL4拮抗剂接触的步骤。
[0013]本发明的另一方面包括一种方法，其包括利用佐剂和CANGPTL4制备抗体的步骤；以及向患有血管相关疾病的患者施用所述抗体。
[0014]本发明的另一方面包括一种包含治疗有效量的CANGPTL4浓度调节剂的组合物。
[0015]本发明的另一方面包括所述组合物在制备用于治疗患有血管相关疾病的患者的药物中的用途。
[0016]本发明的另一方面包括一种确定样品中内皮细胞通透性程度的方法，所述方法包括以下步骤:测量所述样品中ANGPTL4蛋白的量。
[0017]从随后参考以下优选实施方案的示图进行的说明的综述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员会变得清楚。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:CANGPTL4在转移性肿瘤中升高并破坏内皮连接完整性。(A，B)如通过qPCR和免疫印迹确定的，分别在与肿瘤外周正常组织配对的基细胞癌(BCC)和转移性黑色素瘤中cANGPTL4mRNA(A)和蛋白(B)的表达水平(n=3)。来自相同个体的数据点通过彩色线条连接。核糖体蛋白L27(L27)用作参考持家基因。β_微管蛋白用作上样和转移对照。(C，D)A-5RT3CTRL-、A-5RT3AANGPTL4-诱导的伊文思蓝染料外渗诱导不同(C)或相似(D)肿瘤体积的肿瘤。(A-5RT3CTRL1098±422mm3v.s A-5RT3 Λ ANGPTL4551 ± 135mm3, Ρ〈0.05，n=6)(E，F)cANGPTL4或PBS媒介物诱导的伊文思蓝染料外渗(G)以及通过在610nm处测量吸光度定量外渗的伊文思蓝染料(H)。*，P〈0.05.(G)在A-5RT3CTRL-，A-5RT3AANGPTL4-诱导的肿瘤中免疫检测CD31。(H)在B16F10CTRL-和B16F10AANGPTL4-诱导的肿瘤中CD31和CANGPTL4的免疫荧光染色。比例尺:100 μ m。(I)在汇合的HMVEC单层中ZO-1的免疫荧光染色。将细胞在抗CANGPTL4的存在或不存在下用来自A-5RT3CTRL的CM处理，或者用来自A-5RT3 Δ ANGPTL4细胞的CM处理。将HMVEC用DAPI (蓝色)复染核并用鬼笔环肽(红色)复染肌动蛋白应力纤维。比例尺:40μπι。白色箭头指示内皮连接损伤。(J)用所示量的CANGPTL4处理的汇合的单层HMVEC的跨内皮电阻(TER)分析。PBS用作媒介物对照。来自3个独立实验的数据(平均值土 S.D.)。[0019]图2:cANGPTL4与整联蛋白α 5 β 1、VE_钙粘着蛋白和密蛋白_5相互作用。(A-E)显示固定的CANGPTL4与整联蛋白α 5β 1、VE-钙粘着蛋白、密蛋白_5、闭合蛋白和连接粘附分子A(JAM-A) (A) ;VE-钙粘着蛋白胞外重复结构域I (ECl)、密蛋白_5第一胞外结构域(ECDl)、VE-钙粘着蛋白EC3和密蛋白-5ECD2 (B);用免疫前IgG或所示同源抗体预封闭的整联蛋白α5β 1(C)、VE-钙粘着蛋白(D)和密蛋白-5(E)之间的结合谱的代表性传感图。(F) CANGPTL4与所示结合配对物的原位邻位连接测定(PLA)。PLA信号为红色(对于250个细胞，整联蛋白22.50 ±5.01对VE-钙粘着蛋白16.43 ±2.46对密蛋白-512.35 ±3.44PLA点/细胞，η=3)。将细胞用Alexa488_鬼笔环肽复染肌动蛋白应力纤维(绿色)并用Hoechst染料复染核(蓝色)。在抗ANGPTL4不存在下进行阴性对照。比例尺:40μπι。(G)来自用cANGPTL4(3或6 μ g/ml)处理3h的HMVEC的膜提取物的VE-钙粘着蛋白和密蛋白_5的免疫检测。媒介物(V)为PBS，并且E表示用PBS中的2.5mM EDTA处理。
[0020]图3:cANGPTL4与整联蛋白α 5 β 1、VE-钙粘着蛋白和密蛋白_5以双峰方式相互作用。(A)在用6 μ g/ml的CANGPTL4处理的HMVEC中cANGPTL4与所示结合配对物之间的各种复合物的原位动力学PLA检测。如利用BlobFinder从n=3个独立实验^OOHMVEC)确定的，值(平均值土S.D.)表示与零时间点相比相互作用数量的平均倍数改变。当在CANGPTL4处理后180min观察到显微损伤时终止实验。(B)在来自用6 μ g/ml的rhcANGPTL4处理的HMVEC的总蛋白裂解物的抗CANGPTL4免疫沉淀中整联蛋白α 5 β UVE-钙粘着蛋白和密蛋白-5的免疫检测。(C)来自总代表裂解物对用CANGPTL4处理的HMVEC的内在部分的整联蛋白β 1、整联蛋白α 5、整联蛋白β 3、VE-钙粘着蛋白和密蛋白-5的免疫检测。每10分钟(0-180分钟)收集蛋白裂解物。每条带下的值表示与同源零时间点相比蛋白水平的平均倍数改变(η=3) ο *，Ρ〈0.05;**，Ρ〈0.01。
[0021]图4:cANGPTL4:相互作用配对物复合物形成的抑制延迟内皮破坏。(A、B和D、E)汇合的HMVEC单层中ZO-1 (A，D)的免疫荧光染色和跨内膜电阻(TER)测量(B，E)。将细胞在提高的抗整联蛋白β I浓度(I: 100, 1:50)的存在下用6 μ g/ml的cANGPTL4处理(A，B)，或者用6 μ g/ml的CANGPTL4处理，然后在90min去除外源cANGPTL4 (D, E)。处理进行3或6h。将HMVEC用DAPI (蓝色)复染核并用鬼笔环肽(红色)复染肌动蛋白应力纤维。比例尺:40μπι。白色箭头指示内 皮连接损伤。来自3个独立实验的数据(平均值土S.D.)。*，Ρ〈0.05;#，Ρ〈0.01。(C)在抗整联蛋白 β I 的存在下 CANGPTL4 处理的 HMVEC 中 CANGPTL4:所示结合配对物复合物的原位动力学PLA检测。如利用BlobFinder从η=3个独立实验(~600HMVEC)确定的，值(平均值土S.D.)表示与零时间点相比相互作用数量的平均倍数改变。当观察到显微损伤时终止实验(CANGPTL4处理后360分钟)。
[0022]图5:cANGPTL4激活的整联蛋白β I通过激活的Rac/PAK信号轴介导血管通透性。(A，B)来自rh-cANGPTL4处理的HMVEC(6 μ g/ml)的总蛋白裂解物的抗Huts_21 (A)和抗CANGPTL4 (B)免疫沉淀物中所示蛋白的免疫检测。IgG免疫沉淀物用作对照。(C)来自用媒介物(PBS)或rh-cANGPTL4处理的HMVEC的抗Huts_21免疫沉淀物的所示蛋白的免疫检测。总整联蛋白1、Racl和PAK用作对照。每20分钟(0-180分钟)收集蛋白裂解物。每条带下的值表示与同源零时间点相比的来自3个独立实验的蛋白水平的平均倍数改变。*，Ρ〈0.05;**，Ρ〈0.01。(D)用组成型活化的RaclG12V或显性失活的RaclT17N转染的CANGPTL4处理的HMVEC中CANGPTL4:所示结合配对物复合物的原位动力学PLA检测。如利用BlobFinder从n=3个独立实验(~600HMVEC)确定的，值(平均值土S.D.)表示与零时间点相比相互作用数量的平均倍数改变。*，P〈0.05;**，P〈0.01。
[0023]图6:cANGPTL4:相互作用配对物复合物形成触发β -联蛋白的核易位。(A)用6 μ g/ml的cANGPTL4或2.5mM EDTA (作为阴性对照)处理3h的HMVEC单层中β -联蛋白(绿色)的免疫荧光染色。将HMVEC用DAPI (蓝色)复染核。比例尺:40μπι。白色箭头指示与减少的β -联蛋白染色相关的内皮连接损伤。利用Zen2009软件(Carl Zeiss)定量横跨核的白色虚线所示的β_联蛋白和DAPI的代表性荧光强度图。(B)在所示时间点β-联蛋白的原位PLA测定以及CANGPTL4处理的HMVEC的每核PLA点数量的定量。(Omin，1.2±0? 81;40min, 3±1.23;90min, 7.9±1.93; 140min, 13.3 ±2.44; 180min, 17.5 ±2.68) PLA 信号(红色)显示在处理后140min β -联蛋白易位入核(~250HMVEC)。将细胞用Hoechst染料复染核(蓝色)。比例尺:40 μ m。*，Ρ〈0.05;**，Ρ〈0.01。(C)用媒介物(PBS)或 cANGPTL4处理的HMVEC的膜、胞质和核级分中β-联蛋白的免疫检测。在所示时间收集蛋白裂解物。每条带下的值(平均值土S.D.)表示与同源零时间点相比蛋白水平的平均倍数改变(η=3)。*，Ρ〈0.05;**，Ρ〈0.01。(D)cANGPTL4介导的内皮连接破坏的示意图。(l)cANGPTL4:整联蛋白 α 5 β I 形成(30-50min)与(2) EC 中 Rac-GTP 和 pPAK 的激活(40_60min) —致，并且与血管渗漏一致；(3)cANGPTL4与VE-钙粘着蛋白和密蛋白_5之间的相互作用(120-140min)破坏细胞间接触形成，并且刺激(4) β -联蛋白的核易位(180min)。
[0024]图7:cANGPTL4促进转移(A-C)肺的代表性显微图像㈧；黑素A的相对表达⑶；肺切片的代表性伊红染色图像(C)，来自(3mg/kg，每周3次)。(C)中的黑色小节指示进入血管(intravasated)的黑色素瘤(n=5)。比例尺:100ym(D, E)来自用 5xl05B16F10CTRL或B16F10 AANGPTL4细胞静脉内注射的野生型和ANGPTL4敲除C57BL/6J小鼠的小结数量(D)和肺重量(E) (n=12)。林，P〈0.01; ***，Ρ〈0.0Ol。
【具体实施方式】
[0025]这里，我们显示肿瘤来源的CANGPTL4通过以时间顺序的方式与整联蛋白α 5β 1、VE-钙粘着蛋白和密蛋白-5直接相互作`用来引起内皮连续性的破坏。肿瘤来源的CANGPLT4和重组人cANGPTL4 (rh-cANGPTL4)在体外和体内提高血管通透性。利用注射对照或ANGPTL4敲低肿瘤的ANGPTL4敲除和野生型小鼠证实cANGPTL4在小鼠中诱导血管渗漏并促进肺转移。CANGPTL4结合并激活整联蛋白α 5 β I介导的PAK/Rac信号传导，所述PAK/Rac信号传导减弱EC-EC接触并提高血管渗漏。CANGPTL4与VE钙粘着蛋白和密蛋白_5的粘附结构域相关，导致它们解簇(declustering)并内化，β _联蛋白易位至核以及内皮渗漏。这些结果鉴定CANGPTL4为内皮通透性的新上游介质以及治疗癌症和其他血管相关病理中的潜在靶标。
[0026]因此，考虑一种通过控制细胞环境中血管生成素样4(ANGPTL4)的浓度或活性来调节内皮细胞通透性的方法。
[0027]细胞通透性指两个细胞之间的“旁细胞通透性”以及“跨细胞”通过细胞。
[0028]在一实施方案中，所述细胞环境在体内。在另一实施方案中，所述细胞环境在体外。
[0029]当ANGPTL4的调节包括提高血管生成素样4 (ANGPTL4)和/或cANGPTL4的浓度或活性时，则内皮细胞通透性提高。
[0030]或者，当ANGPTL4的调节包括去除、降解或中和血管生成素样4 (ANGPTL4)和/或CANGPTL4的浓度或活性时，则内皮细胞通透性最小化减少或被抑制。在一实施方案中，通过如本文所述的CANGPT4L特异性抗体去除、降解或中和血管生成素样4(ANGPTL4)和/或CANGPTL4。在一实施方案中，所述抗体是催化性的。在另一实施方案中，通过ANGPTL4多肽表达特异性的siRNA或其他反义技术去除、降解或中和血管生成素样4(ANGPTL4)和/或CANGPTL4。
[0031]另一方面包括一种治疗患者以至少减少内皮细胞通透性的方法，所述方法包括使细胞与CANGPTL4拮抗剂接触的步骤。优选地，所述拮抗剂为CANGPTL4的抗体。在一实施方案中，所述抗体为CANGPTL4的中和抗体。优选地，所述拮抗剂干扰提高的内皮细胞通透性。优选地，所述拮抗剂包含占据(engage)ANGPTL4的cANGPTL4结构域的化合物以防止提高的内皮细胞通透性。
[0032]另一方面包括一种方法，其包括利用佐剂和CANGPTL4多肽制备抗体的步骤；以及向患有血管相关疾病的患者施用所述抗体。
[0033]在一实施方案中，通过将所述佐剂和CANGPTL4多肽作为抗原以疫苗形式直接注射入患者来在患有血管相关疾病的患者中形成所述抗体。
[0034]优选地，所述血管相关疾病选自炎症性水肿、糖尿病、动脉粥样硬化。
[0035]在一实施方案中，所述血管相关疾病为癌症转移。在这个实施方案中，所述方法还可以包括向所述患者施用抗癌剂。
[0036]另一方面包括一种包含治疗有效量的CANGPTL4调节剂浓度的组合物。
[0037]在一实施方案中，所述调节剂为CANGPTL4拮抗剂。优选地，所述拮抗剂为CANGPTL4抗体如CANGPTL4催化抗体。
[0038]优选地，所述组合物包含占据ANGPTL4的cANGPTL4结构域的化合物以防止提高的内皮细胞通透性。
[0039]在一实施方案中，所述组合物用作治疗患有血管相关疾病的患者的药物。血管相关疾病可以包括炎症性水肿、糖尿病、动脉粥样硬化或癌症转移。
[0040]本发明的另一方面包括一种包含治疗有效量的CANGPTL4调节剂浓度的组合物。
[0041]另一方面包括所述组合物在制备用于治疗患有血管相关疾病的患者的药物中的用途。所述血管相关疾病可以包括或选自炎症性水肿、糖尿病、动脉粥样硬化和癌症转移。
[0042]在其中所述血管相关疾病为癌症转移的实施方案中，所述组合物可以包括所述患者的抗癌剂。
[0043]另一方面包括一种确定样品中内皮细胞通透性程度的方法，所述方法包括以下步骤:测量所述样品中ANGPTL4蛋白的量。优选地，所述方法还可以包括根据ANGPTL4蛋白的量是否指示提高的内皮细胞通透性来决定患者的治疗的步骤。
[0044]杭体
[0045]抗体可以包括特异性地结合ANGPTL4蛋白C端的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链。
[0046]优选地，免疫球蛋白为IgGlK免疫球蛋白。最优选地，免疫球蛋白包含所述免疫球蛋白重链内的人IgGl恒定区和所述免疫球蛋白轻链内的人恒定区。免疫球蛋白在所述重链的可变结构域内和所述轻链的可变结构域内可以包含全部或部分人框架区。免疫球蛋白在所述重链的可变结构域内和所述轻链内可以包含小鼠框架区。
[0047]免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缀合至选自治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、月旨质、生物反应调节剂、药剂和PEG的物质。
[0048]多克隆抗体
[0049]抗体可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的。多克隆抗体可以例如通过一次或多次注射免疫剂和佐剂(如果期望)来在哺乳动物中产生。
[0050]通常，通过多次皮下或腹腔内注射将免疫剂和/或佐剂注射入哺乳动物。应答强度由几个因素决定，包括免疫原分子的大小、其化学特征以及其与动物自身的蛋白怎样不同。最天然的免疫原是具有5kDa以上分子量的蛋白，其来自系统发育远离宿主动物的来源(即，注射入兔或山羊的人蛋白)。期望使用高度纯化的蛋白作为免疫原，因为动物会对即使少量存在的杂质以及主要组分产生抗体。抗体应答随着重复暴露于免疫原而增加，因此需要一系列定期注射以实现高水平的抗体产生和高亲和力抗体。
[0051]如果拮抗剂是占据ANGPTL4的纤维蛋白原样片段的c端以防止细胞增殖的抗体，则免疫原选自包含ANGPTL4的纤维蛋白原样片段的c端的氨基酸。优选地，所述氨基酸序列选自人ANGPTL4蛋白中的约186-406或者小鼠ANGPTL4蛋白中的约190-410区域。来自这个区域的至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30个氨基酸序列一般用来产生那些抗体。期望的是，所选序列产生特异性干扰ANGPTL4结合细胞内信号传导途径的组分的抗体。
[0052]但是，并非所有免疫原分子均产生期望水平的抗体。为了提高免疫应答的强度，将免疫原与称为佐剂的复杂混合物组合。佐剂是天然或合成化合物的混合物，当与抗原一起施用时，其增强免疫应答。佐剂用来(I)刺激对不是固有免疫原性的抗原的免疫应答，
(2)提高免疫应答的强度，(3)优先刺激细胞或体液应答(即，防护疾病对抗体产生)。可以采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成的海藻糖二白喉菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。佐剂的更广泛讨论以及它们在免疫方案中的使用在 Immunology Methods Manual, vol.2, 1.Lefkovits, ed., Academic Press, SanDiego, CA, 1997，ch.13 中给出。Immunology Methods Manual 可用作四卷集，(产品编号Z37, 435-0);在 CD-ROM 上(产品编号 Z37，436-9);或两者(产品编号 Z37，437-7)
[0053]如果免疫原仍不能产生可接受的应答，可以将其缀合至更免疫原性的载体蛋白。小分子如药物、有机化合物，以及具有少于2-5kDa的分子量的肽和寡糖，例如ANGPTL4的小片段，如在它们的结构中具有纤维蛋白原样片段的那些，可能没有免疫原性，甚至在佐剂的存在下施用时也是如此。为了产生对这些化合物的免疫应答，必需将它们连接至蛋白或其他化合物，称为免疫原性的载体。当连接至载体蛋白时，小分子免疫原称为半抗原。还将半抗原缀合至载体蛋白用于免疫测定。载体蛋白提供将半抗原连接至固体支持物如微量滴定板或硝化纤维素膜的手段。当连接至琼脂糖时，它们可以用于纯化抗半抗原抗体。它们还可以用来产生能够形成大的抗原-抗体复合物的多价抗原。在选择载体蛋白时，记得动物会对载体蛋白以及连接的半抗原形成抗体。因此，选择与在测定样品中可以找到的蛋白无关的载体蛋白用于免疫是有意义的。如果对于免疫和测定，半抗原均为缀合的，则两种载体应当尽可能不同。这允许使用抗血清而不必分离抗半抗原抗体与抗载体抗体。
[0054]当免疫剂为纤维蛋白原样片段部分如来自c端时，优选将所述纤维蛋白原样片段部分缀合至已知在免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白。
[0055]这类免疫原性蛋白的实例包括但不限于匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂以及类毒素如破伤风类毒素。
[0056]KLH是在软体动物中发现的呼吸蛋白。其大小很大，使其非常具有免疫原性，并且可用于缀合的大量赖氨酸残基使其作为半抗原的载体非常有用。哺乳动物与软体动物之间的进化分离提高免疫原性并减少针对KLH载体和哺乳动物样品中天然存在的蛋白的抗体之间交叉反应性的风险。
[0057]以其天然形式提供KLH，用于通过胺缀合，以及琥珀酰化的用于通过羧基缀合。琥珀酰化的KLH可以通过与新引入的KLH的羧基与半抗原的胺基之间的碳二亚胺交联来缀合至包含胺基的半抗原(例如肽)。
[0058]将半抗原缀合至载体蛋白的方案是已知的。
[0059]本领域技术人员可以选择免疫方案而不需要过多的实验。制备免疫原、免疫动物和收集抗血清的方案也是已知的。
[0060]单克降杭体
[0061]或者，抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤方法来制备，例如那些已知的杂交瘤方法。在杂交瘤方法中，通常用如上文所述的免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物以引出淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性地结合所述免疫剂的抗体。或者，可以体外免疫淋巴细胞。
[0062]通常，如果期望人源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(〃PBL〃)，或者如果期望非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后利用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以将杂交瘤细胞在合适的培养基中培养，所述培养基优选包含抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT缺陷细胞的生长。
[0063]优选的永生化细胞系是这样的永生化细胞系，其高效融合，通过所选的抗体产生细胞支持稳定的高水平抗体表达，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。更优选的永生化细胞系为小鼠骨髓瘤系，其可以例如获得自Salk Institute Cell DistributionCenter, San Diego, Calif.和 the American Type Culture Collection, Manassas, Va0 还已描述人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于制备人单克隆抗体。
[0064]然后可以测定其中培养杂交瘤细胞的培养基中针对ANGPTL4和/或ANGPTL4的c端或者序列SEQ ID N0.1-3中任一个的单克隆抗体的存在。
[0065]鉴定期望的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释法亚克隆克隆并通过标准方法使其生长。用于这个目的的合适的培养基包括例如达尔伯克改良伊格尔培养基和RPM1-1640培养基。或者，杂交瘤可以作为腹水在哺乳动物体内生长。
[0066]可以通过常规免疫球蛋白纯化方法如A蛋白-Sepharose、轻磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱从培养基或腹水分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体。
[0067]单克隆抗体还可以通过重组DNA方法制备，例如那些已知的方法。[0068]抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域公知的。例如，一种方法包括重组表达免疫球蛋白轻链和修饰的重链。一般将重链在Fe区的任何点截短以防止重链交联。或者，将相关半胱氨酸残基用另一氨基酸残基取代或缺失以防止交联。
[0069]体外方法也适合制备单价抗体。可以利用本领域已知的常规技术完成抗体的消化以产生其片段，特别是Fab片段。
[0070]人和人源化抗体
[0071]本发明的抗体还可以包含人源化抗体或人抗体。人源化形式的非人(例如，小鼠)抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗体的其它抗原结合子序列)，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基代替。人源化抗体还可以包含这样的残基，其在受体抗体或者引入的CDR或框架序列中均未发现。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有⑶R区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最优选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。
[0072]人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常来自“输入”可变结构域。人源化基本上可以按照已知的方法通过用相应的人抗体序列取代啮齿动物CDR或CDR序列来进行。因此，这类“人源化”抗体为嵌合抗体，其中基本上少于完整人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化的抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
[0073]还可以利用本领域已知的包括噬菌体展示文库在内的各种技术制备人抗体。相似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物如小鼠来制备，其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。当攻击时，观察到人抗体产生，其在所有方面与人中看到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体谱。
[0074]双特异性抗体
[0075]双特异性抗体是单克隆的，优选人或人源化抗体，其对至少两种不同抗原具有结合特异性。在目前情况下，结合特异性之一是对ANGPTL4和/或包含ANGPTL4的纤维蛋白原样片段的c端部分的ANGPTL4片段，另一结合特异性是对与ANGPTL4相互作用的另一化合物。
[0076]制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性。
[0077]异源缀合(heterocon jugate)抗.体
[0078]异源缀合抗体也在本发明的范围内。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞。考虑可以利用合成蛋白化学中已知的方法体外制备抗体，包括涉及交联剂的那些方法。例如，可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于这个目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基_4_巯基丁酰亚氨酸以及本领域技术人员已知的其他试剂。
[0079]免疮缀合物
[0080]本发明还涉及免疫缀合物，其包含缀合至细胞毒剂如化疗剂、毒素(例如，针对血凝素的酶促活性毒素)或放射性同位素(即，放射性缀合物(radioconjugate))的抗体。
[0081]利用各种双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二甲基己二亚酰胺化物HCL(dimethyl adipinamidate HCL))、活性酯(例如辛二酸二琥拍酰亚胺酯)、醒(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双_(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如双_(对重氮苯甲酰基)_乙二胺)、二异氰酸酯(例如tolyene2，6-二异氰酸盐)以及双活性氟化合物(例如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)制备抗体与细胞毒剂的缀合物。
[0082]本发明的抗体的治疗和或使用方法
[0083]本发明还提供一种治疗患者以至少影响增殖性病症的方法，所述方法包括以下步骤:使细胞与拮抗剂接触，例如(a)血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)特异性的抗体或(b)血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的C端区域特异性的抗体。优选地，所述拮抗剂通过中和血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)表达来干扰细胞增殖。
[0084]本发明的可选形式在于使用血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)特异性的抗体或血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的C端区域特异性的抗体治疗癌症，优选使用至少影响细胞增殖。
[0085]癌症可以包括表现出过量表达血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的所有类型的已知肿瘤。癌症转移包括展现出由于提高的细胞通透性而血管渗漏的细胞。细胞增殖或肿瘤指不受控制地生长的细胞。
[0086]“治疗(Treatment) ”和“治疗(treat) ”及其同义词指治疗性处理，其中目的是防止或减缓(减轻)肿瘤或者减少来自提高的细胞通透性的血管渗漏。治疗可以包括预防性被动免疫或者患者的免疫疗法治疗。需要这类治疗的患者包括患有增殖性病症的患者。
[0087]如本文所用，化合物的“治疗有效量”是能够防止或至少减缓(减轻)来自提高的细胞通透性的细胞血管渗漏的活性剂的量。药物组合物中本发明的拮抗剂的剂量和施用可以由临床药理学或药物动力学领域的技术人员决定。例如，治疗性采用的拮抗剂的有效量取决于治疗目标、施用途径以及哺乳动物的疾病状况。因此，临床医学家必须按照需要滴定剂量并修改施用途径以获得最佳疗效。典型的每日剂量可以范围从每天约IOng/kg直至100mg/kg哺乳动物体重或更多,优选约I μ g/kg/天-10mg/kg/天。剂量可以包括0.l_20mg/kg体重范围或更优选l、5、10mg/kg体重的抗体量。
[0088]本发明的组合物
[0089]因此，本发明还涉及包括药物组合物的组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的(a)血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)特异性的抗体和，或(b)血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的C端区域特异性的抗体。如本文所用，如果能够影响细胞通透性，则化合物是治疗有效的。
[0090]适合注射使用的本发明的药物形式包括无菌水溶液如无菌磷酸盐缓冲盐水(水溶性的)，或者分散剂，以及用于临时制备无菌注射溶液和或一种或多种载体的无菌粉末。或者，注射溶液可以包裹在脂质体中递送以辅助它们转运通过细胞膜。可选地或额外地，这类制剂可以包含自组装的孔结构的组分以便转运通过细胞膜。其必须在制备和储存条件下稳定，并且必须针对微生物如细菌和真菌的污染/破坏作用保持原样。
[0091]载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物以及植物油。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在本发明的组合物中防止微生物的作用是通过添加抗细菌剂和/或抗真菌剂来完成的，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。注射组合物延长的吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的物质来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。
[0092]通过将所需量的活性化合物掺入具有上文所列的几种其他成分(按照需要)的适当的溶剂，然后过滤除菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种无菌活性成分掺入包含基本的分散介质和所需的来自上文所列的那些的其他成分的无菌媒介物来制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥以获得来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分加上任何额外的期望成分的粉末。
[0093]活性成分可以装在控制活性剂释放的基质内。优选地，所述基质包含这样的物质，所述物质选自脂质、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚己酸内酯、聚(乙醇)酸、聚(乳)酸、聚己酸内酯、聚乳酸、聚酐、聚交酯-共-乙交酯、聚氨基酸、聚环氧乙烷、丙烯酸封端的聚环氧乙烷、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯腈、聚磷腈、聚(原酸酯)、蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)以及它们的组合和其他化合物。优选地，所述基质持续释放抗体。
[0094]药学可接受的载体和/或稀释剂还可以包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这类介质和物质用于药学活性物质的使用是本领域公知的。除了与活性成分不相容的任何常规介质或物质，考虑其在治疗性组合物中使用。
[0095]多肽
[0096]术语“多肽”指氨基酸的聚合物及其等同物，并且不指具体长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白均包括在多肽的定义内。这个术语还不指或排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该定义包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如天然氨基酸等)的多肽，具有经取代的键以及本领域已知的其他修饰的多肽。
[0097]我们的组织微阵列分析显示在多达40种已知的人上皮肿瘤类型中升高的ANGPTL4表达，并且其表达随着肿瘤从良性状态发展至转移状态而增加。我们已鉴定肿瘤来源的ANGPTL4为氧化还原癌症生物学中的新成员，并且通过自分泌粘附模仿赋予肿瘤失巢凋亡抗性。肿瘤来源的ANGPTL4与整联蛋白相互作用，截断(hijack)整联蛋白介导的信号传导以保持升高的致癌的02_:H202比例，因此，促进细胞存活和肿瘤生长。重要的是，在体外和体内通过RNAi或用单克隆抗体免疫抑制来抑制ANGPTL4会调节细胞内ROS产生以减少与增加的凋亡相关的肿瘤生长。许多转移癌症中升高的ANGPTL4表达还表明ANGPTL4在通过淋巴管浸润转移中的作用。重要的是，ANGPTL4不同于VEGF，因为其不结合VEGR受体。此外，VEGF敲除小鼠是胚胎致死的，与ANGPTL4敲除小鼠相比，表明ANGPTL4的不同作用。我们表明肿瘤来源的Angptl4可以诱导血管渗漏并促进肿瘤细胞传播。在这种情况下，针对ANGPTL4的拮抗剂如抗体或siRNA会抑制转移，并且鉴定ANGPTL4为不同于VEGF的新靶标。
[0098]诱导血管渗漏的重组ANGPTL4会辅助糖尿病伤口修复。ANGPTL4功能为基质细胞蛋白以加速细胞迁移，增加的血管渗漏允许炎症细胞和骨髓来源的前体流出至损伤部位，加速伤口修复。我们已证实通过与基质蛋白、整联蛋白β I和整联蛋白β 5相互作用，CANGPTL4促进细胞迁移和伤口愈合，两者均为使人容易想到转移的过程。
[0099]实施例
[0100]材料和方法
[0101]抗体.[0102]内部制备PAKl 和 pPAKl(Serl99/Ser204) (Cell Signaling, USA)、整联蛋白 P1[JB1A]、α 5 β I [JBS5], β 3 [2008]和 c-Jun (Millipore, USA) ;CD29/ 活化的整联蛋白 β 1[HUTS-21] (BD, USA) ;β -微管蛋白、β -联蛋白[12F7]、EGFR[1005](Santa Cruz Biotechnologies, USA) ；VE-钙粘着蛋白[BV9]、密蛋白-5 (Abeam, USA)；CD31(DAKO, Denmark);闭合蛋白(Invitrogen, USA) ；Z0-1(Zymed Laboratories, USA)；TieU Tie2、JAM-C, β -微管蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠、HRP缀合的山羊抗兔、HRP缀合的驴抗山羊(Santa Cruz Biotechnologies, USA);小鼠单克隆抗人cANGPTL4mAb4AllH5和兔多克隆抗人CANGPTL4由内部产生16 ;还使用二抗Alexa Fluor488缀合的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor594缀合的山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes, USA)。
[0103]细胞培养.[0104]在37C下于潮湿空气中在EndoGRO-MV-VEGF培养基(Millipore, USA)中培养原代人微血管内皮细胞(HMVEC;Lonza，Switzerland)。用PBS中的0.1%明胶预包被培养表面。在补充了 10% FBS的DMEM中培养所有其他细胞系。条件培养基(CM)获得自在Iml无血清培养基中生长3天的1x105肿瘤细胞。
[0105]瞬时转染法.[0106]按照制造商的方案(Promega，USA)用组成型活化的RaclG12V或显性失活的RaclT17N进行HMVEC的转染。
[0107]重组CANGPTL4蛋白的表达和纯化.[0108]如以前所述进行全长ANGPTL4和重组cANGPTL4的表达和纯化17，18。
[0109]体内致瘤性和Miles血管通透性测定.[0110]向6周龄的BALB/c无胸腺的雌性裸鼠(20_22g)在背部相邻的位置皮内注射CANGPTL4 (6 μ g/ml)或0.9%盐水缓冲液。为了确定血管通透性，包含肿瘤的小鼠接受伊文思蓝染料的静脉内注射。20min之后，将小鼠处死并如Miles血管通透性测定所述从肿瘤和正常肌肉提取伊文思蓝19。利用甲酰胺提取外渗的染料，并且通过在610nm处测量吸光度来定量其量。为了确定肿瘤血管体积，还将2MDa FITC缀合的葡聚糖(10mg/kg)静脉内注射20min。利用Nanodrop3300Fluorospect;romete;r获得突光读数。对于另一组实验,将小鼠在肩胛间区用2X106或8X106个细胞(A-5RT3CTRL或A-5RT3 Λ ANGPTL4)皮下注射。在C57B/L6J野生型和ANGPTL4敲除小鼠中利用B16F10CTRL或B16F10 Λ ANGPTL4细胞进行相同的过程。轮换注射部位以避免部位偏差。允许注射的肿瘤细胞生长8周。
[0111]体内转移测定.[0112]将野生型和ANGPTL4敲除的C57BL/6J小鼠用5xl05B16F10CTRL或B16F10AANGPTL4 静脉内注射。对于 cANGPTL4 处理，将用 2xl06B16F10CTRL 或B16F10 AANGPTL4 细胞 1.v 注射的野生型 C57BL/6J 小鼠用 PBS 或 cANGPTL4 (3mg/kg)每周处理3次。3周之后，将小鼠处死并收获肺用于进一步的分析。通过黑素A的RT-PCR定量总转移负担。如以前所述从肺提取总mRNA并进行反转录。17，18
[0113]邻位连接测定(PLA).[0114]根据制造商的方案(Olink Bioscience, Sweden)利用所示抗体对进行PLA。利用Zeiss LSM710共聚焦显微镜用63x物镜和ZEN2009软件采集图像。利用BlobFinder软件定量PLA信号。20
[0115]跨内膜电阻(TER)测量.[0116]利用电细胞-基底阻抗传感系统(ECIS，Applied BioPhysics)测量TER。将HMVEC以2x105个细胞/孔接种在用纤连蛋白预包被的无菌8-孔镀金电极阵列上，并且允许在37°C下粘附和扩散4h。在以5min间隔的实验时间过程中获得来自电阻实验的数据。使用在给予所示处理之前具有稳定的TERlh的汇合的HMVEC单层。随着细胞粘附并散布在微电极上，TER增加，而TER减少反映细胞回缩、变圆或丧失粘附。将每个微电极的电阻值归一化为测量的电阻比基线电阻的比值并作图为时间的函数。
[0117]内化测定.[0118]将汇合的HMVEC单层用PBS或cANGPTL4(6 μ g/ml)处理3h。在所示时间点，如以前所述进行内化测定。17
[0119]免疫荧光染色.[0120]通过紧密连接-1 (zona occludens-1) (Z0-1)的免疫荧光染色来使破坏的紧密连接可见。将HMVEC用4%多聚甲醛固定15min，用0.2%Triton_X100透化15min，并且在室温下于潮湿箱中用包含0.l%Triton-X100的2%牛血清白蛋白(BSA)封闭lh。将细胞在4°C下与0.2%BSA中的抗人Z0-1抗体(1: 100)温育过夜。在PBS中洗涤2次之后，将细胞在室温下与Alexa488-二抗(1:250)温育lh。将细胞用Alexa594_鬼笔环肽复染F-肌动蛋白并用DAPI复染核。不用一抗进行的免疫染色用作阴性对照。对于β_联蛋白染色，将细胞用包含5%蔗糖的4%多聚甲醛固定15min，用PBS中的0.5%Triton_X100透化4min，并且用具有0.l%Triton-X100的5%正常山羊血清(NGS)封闭。将细胞与3%NGS中的抗人β -联蛋白抗体(1:200)在4oC下温育过夜，然后Alexa594-二抗。利用Zeiss LSM710共聚焦显微镜用63x物镜和ZEN2009软件获得图像。
[0121]表面等离子共振(SPR).[0122]如以前所述17，18 利用 BIAcore2000 系统(BIAcore, Uppsala, Sweden)进行 SPR。使用6个浓度(0.16、0.32、0.63、1.25、2.50和5.ΟμΜ)的重组整联蛋白β 1、VE-钙粘着蛋白的第一胞外结构域(ECDl)、VE-钙粘着蛋白的胞外重复I结构域(EC1)、闭合蛋白或JAM-A。整联蛋白在 果蝇S2细胞中表达17，并且VE-钙粘着蛋白的各种胞外结构域和密蛋白-5购自Abnova。如以前所述进行SPR数据的整体拟合以确定KD。用所示抗体或免疫前IgG预先注射或预先温育以确定特异性相互作用。通过减去获得自没有固定蛋白的参考流动细胞的传感图来修正每个传感图。利用针对固定的CANGPTL4的抗CANGTL4抗体确定Rmax值为283.1共振单位。值为平均值土 S.D.(n=3)。[0123]统计分析.[0124]利用双尾Mann-Whitney测试用SPSS软件进行统计分析。所有统计测试均为双面的。认为< 0.05的P值是显著的。
[0125]人肿瘤中升高的CANGPTL4表达.[0126]为了检测CANGPTL4在肿瘤中的表达谱，我们利用抗cANGPTL4抗体对两个人肿瘤组织阵列进行免疫荧光，所述人肿瘤组织阵列覆盖源自各种解剖部位的良性、恶性和转移性肿瘤。与相应的正常组织样品相比，CANGPTL4在所有上皮肿瘤样品中均升高(图S1A-C)。虽然荧光信号在不同肿瘤类型之间不同，它们清楚地显示升高的CANGPTL4是肿瘤的共同特征。与上述观察一致，当与非致瘤系(HaCaT和BJ)相比时，cANGPTL4蛋白水平在所有癌症细胞系中均升高(图SlD)。有趣的是，我们在转移性癌细胞系中观察到与非转移性癌细胞系相比相对较高的CANGPTL4水平，这表明CANGPT14在肿瘤转移中的作用。
[0127]为了临床上进一步证实CANGPTL4在转移中的作用，我们通过定量实时PCR(qPCR)和免疫印迹分析确定6个人基细胞癌(良性)和黑色素瘤(转移性)活组织检查中cANGPTL4mRNA和蛋白水平。我们观察到当与它们的同源肿瘤周围正常样品(PNS)相比时，这些上皮癌症中cANGPTL4mRNA和蛋白水平显著上调。值得注意的是，当与良性基细胞癌相比时，黑色素瘤表达较高水平的cANGPTL4mRNA和蛋白。当比较来自3个乳腺癌患者的细针抽吸物(FM)与4个人转移性肿瘤系(A-5RT3、MDA-MB231、MCF-7和HT29)和2个非致瘤系(HaCaT和BJ)的cANGPTL4蛋白水平时，观察到相似的趋势。平均cANGPTL4蛋白浓度为
12.4 μ g/ml (FNA)、5.9 μ g/ml (转移系)和0.8 μ g/ml (非致瘤系)(图SlE)。这些数据表明上皮肿瘤分泌升高水平的CANGPTL4，这与我们最近的发现一致，我们最近的发现显示与周围基质中的基础表达水平相比，肿瘤组织表达高水平的CANGPTL4。总的来说，我们的发现表明CANGPTL4在癌症转移中的作用。
[0128]在体内肿瘤中CANGPTL4增加血管渗漏.[0129]然后我们研究了 CANGPTL4在肿瘤发生中的作用。如以前所述，用零乱(对照)siRNA (A-5RT3CTRL 或 B16F10CTRL)或针对 ANGPTL4 的 siRNA (A-5RT3 Λ ANGPTL4 或B16F10AANGPTL4)转导转移性 人鳞状细胞癌细胞系A-5RT3和小鼠黑色素瘤B16F10 (图S2A)以抑制内源性ANGPTL4。16，18将A-5RT3CTRL细胞注射入免疫缺陷小鼠在第8周诱导大的原发性肿瘤，但是A-5RT3 Δ ANGPTL4诱导的肿瘤表现出低30%的肿瘤体积(A-5RT3CTRL1098±422mm3v.s A-5RT3 Λ ANGPTL4551 ± 135mm3, Ρ〈0.05，η=6)(图 1C)。如减少的伊文思蓝染料外渗所证实的，Miles测定显示A-5RT3 Λ ANGPTL4诱导的肿瘤中血管渗漏减少(低~5倍)(图1D、表1)。当确定肿瘤血管通透性时虑及肿瘤类型之间血管体积的差异(表1)。如在A-5RT3CTRL-和A-5RT3 Λ ANGPTL4诱导的肿瘤中观察到的，这种差别血管通透性独立于肿瘤体积(图1D)。此外，没有用A-5RT3AANGPTL4注射的小鼠发展远处转移至淋巴结，而83%用A-5RT3CTRL注射的小鼠表现出转移(图S2B)。
[0130]值得注意的是，当与PBS对照相比时，rh-cANGPLT4足以诱导血管渗漏(rh-cANGPTL40.084±0.014v.s PBS0.04±0.01，Ρ〈0.05，η=3)(图1E, F)。与 A-5RT3CTRL和B16F10CTRL诱导的肿瘤中增加的血管体积一致，当与它们的同源ANGPTL4缺陷肿瘤相比时，EC标记⑶31的表达升高(图1G，H)。⑶31和cANGPTL4的双免疫染色也是证实上皮肿瘤是CANGPTL4的主要制造者，这与利用激光捕获的显微解剖样品的较早发现一致(图1H)。因此，体内的这些观察促使我们研究CANGPTL4诱导的上皮通透性的分子机制。
[0131]表1.ANGPTL4增加血管通透性和血管体积
【权利要求】
1.一种通过控制细胞环境中血管生成素样4(ANGPTL4)的浓度或活性来调节内皮细胞通透性的方法。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞环境是体内。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞环境是体外。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中提高血管生成素样4(ANGPTL4)和/或cANGPTL4的浓度或活性诱导内皮细胞通透性。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中去除、降解或中和血管生成素样4(ANGPTL4)和/或CANGPTL4的浓度或活性抑制内皮细胞通透性。
6.权利要求5的方法，其中通过CANGPT4L特异性抗体来去除、降解或中和血管生成素样 4 (ANGPTL4)和 / 或 cANGPTL4。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体是催化性的。
8.一种治疗患者以至少减少内皮细胞通透性的方法，所述方法包括以下步骤: a.使所述细胞与CANGPTL4拮抗剂接触。
9.权利要求8的方法，其中所述拮抗剂为CANGPTL4的抗体。
10.权利要求9的方法，其中所述抗体为CANGPTL4的中和抗体。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述拮抗剂干扰提高的内皮细胞通透性。
12.权利要求8的方法，其中所述拮抗剂包含占据ANGPTL4的cANGPTL4结构域的化合物以防止增加的内皮细胞通透性。`
13.一种方法，其包括以下步骤: a.使用佐剂和CANGPTL4多肽制备抗体；以及 b.向患有血管相关疾病的患者施用所述抗体。
14.权利要求13的方法，其中所述血管相关疾病选自炎症性水肿、糖尿病和动脉粥样硬化。
15.权利要求13的方法，其中所述血管相关疾病为癌症转移。
16.权利要求15的方法，其还包括向所述患者施用抗癌剂。
17.—种组合物，其包含治疗有效量的CANGPTL4浓度调节剂。
18.权利要求17的组合物，其中所述调节剂为CANGPTL4拮抗剂。
19.权利要求18的组合物，其中所述拮抗剂为CANGPTL4的抗体。
20.权利要求19的组合物，其中所述抗体为CANGPTL4的催化抗体。
21.权利要求17的组合物，其中所述调节剂包含占据ANGPTL4的cANGPTL4结构域的化合物以防止提高的内皮细胞通透性。
22.权利要求17-21中任一项的组合物，其用作治疗患有血管相关疾病的患者的药物。
23.权利要求18-24中任一项的组合物在制备用于治疗患有血管相关疾病的患者的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述血管相关疾病选自炎症性水肿、糖尿病和动脉粥样硬化。
25.权利要求23的用途，其中所述血管相关疾病为癌症转移。
26.权利要求25的用途，其还包括向所述患者施用抗癌剂的步骤。
27.一种确定样品中内皮细胞通透性程度的方法，所述方法包括以下步骤:a.测量样品中ANGPTL4蛋白的量。
28.权利要求27的方法，其还包括以下步骤:b.根据ANGPTL4蛋白的量是否 指示提高的内皮细胞通透性来决定患者的治疗。
【文档编号】A61P7/10GK103782177SQ201280043626
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年8月8日 优先权日:2011年8月8日
【发明者】陈源顺 申请人:南洋理工大学