专利名称：人血清中血管生成素检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程中的免疫学技术领域,具体涉及人血清中血管生成素检测方 法及其应用。
背景技术：
肿瘤的发生、发展和转移与新生血管的形成密切相关，血管生成的过程受很多重要的 血管生成因子和受体调控。 一些可溶性的血管生成因子能够在血浆中检测到，目前巳分离 和纯化了 20多种血管生成因子和相关因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF )、血管生成素(angiogenin )、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等，它们通过各种机制降解血管基底膜和周围细胞外基质，促进内皮细胞分裂、游走 和增殖，诱导宿主毛细血管新生。大量的研究表明肿瘤患者血清中血管生成因子的表达水 平与肿瘤的级别，入侵程度，肿瘤地位，远距离转移和临床阶段都是正相关的。在众多的 血管生成因子中，血管生成素是迄今为止惟一一个基于其促进血管新生能力而被发现和分 离纯化的血管生成因子，其重要性越来越受到重视，己逐渐成为研究的热点之一。时至今 日，人们通过对血管生成素结构、性质及功能等的大量研究，已初步了解了其促进血管生 成作用的机理，并在肿瘤检测、治疗和预后等方面取得了一定的成果。血管生成素在许多肿瘤中都有表达，血清中的血管生成素表达水平上升。血管生成素 与肿瘤的快速生长、浸润、转移、分期及预后均有密切关系。人们通过对肿瘤生长过程中 血管生成素表达水平的大量研究发现，血管生成素与肿瘤的快速生长、浸润、转移、分期 及预后均有密切关系。在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、 胰腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴管瘤以及黑色素瘤等多种癌症患者的血清中血管生成素 的水平都高于健康个体，而且这种水平的高低与癌症的恶性化程度相关。建立人血清中血 管生成素检测方法，有利于开发肿瘤临床诊断试剂。发明内容本发明的目的是确立一种能够用于血管生成素检测的有效方法。 本发明的方案-按常规方法表达并纯化人血管生成素蛋白，制备人血管生成素抗体，为血管生成素血 清检测提供实验基础。分别釆用竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中的血管生 成素，采用了兔抗人血管生成素多克隆抗体进行竞争ELISA，鼠抗人血管生成素单克隆抗 体和兔抗人血管生成素多克隆抗体进行夹心ELISA，检测人血清中的血管生成素，棋盘滴 定法优化ELISA实验条件，确定最适血清稀释倍数和抗原抗体稀释倍数。联合两种检测方 法，分析人血清血管生成素的检出率。本发明是采用竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素含量，并对 结果进行分析，联合两种检测方法，可以相互补充，提高了人血清血管生成素的检出率。
具体实施方式
一、双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素1) 重组人血管生成素蛋白的表达、纯化利用RT-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA 片段，测序正确后克隆入表达载体pET28-a(+)中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG 诱导，表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag 与过渡态金属离子Ni2+高亲合力结合的性质，经镍柱纯化，获得了高纯度的血管生成素融 合蛋白。2) 人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体的制备按常规方法制备人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体。3) 双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素我们采用了人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体进行夹心ELISA检测人血清中的血 管生成素。(1) ELISA实验条件的确定棋盘滴定选择优化的ELISA实验条件，以血管生成素单抗说明书建议浓度2吗/mL包 被96孔酶标板(包被液为0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，0.16gNa2CO3， 0.29g NaHC03溶于 100ml水中)，湿盒中4。C温育过夜；次日，用PBST缓冲液(含0.05%的Tween20， pH7.4)洗涤3次，每次3分钟，再用PBS液洗涤两次，每次2分钟；每孔加入10(^1含5%脱脂奶 粉的PBS缓冲液进行封闭，置于湿盒中37-C温育lh，按如上方法洗涤；按倍比稀释纵列 加血清，第一列稀释倍数为5倍，此后各列稀释倍数依次为10、 20、 40、 80、 160、 320、 640、 1280、 2560、 5120、 10240，每孔加入50nl置于湿盒中，37°。温育lh，洗涤；按倍比 稀释横排加兔抗人血管生成素多克隆抗体，第一行稀释倍数为100，此后各行稀释倍数依 次为200、 400、 800、 1600、 3200、 6400，每孔加入50pl置于湿盒中，37。C温育lh，洗涤； 加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG，每孔50nl， 37'C温 育lh，洗涤；加入底物TMB (A液:1.84gNa2HP04*12H20， 0.03g过氧化脲加水至50ml; B液0.515g柠檬酸H20， lmlTMB母液[10mgTMB溶于lmlDMSO]加水至50ml)，置室 温显色12分钟，用2mol/L H2S04溶液终止反应；在酶标仪上检测OD45Q/62()的吸光值。不 同稀释度的血清与不同稀释度的多抗进行组合，确定最适条件为血清稀释倍数为10倍，多 抗的稀释倍数为800倍。以棋盘滴定法确定的ELISA最适条件对400例健康人血清进行检测，选取临界值质控血清，以血管生成素系数(血管生成素系数-样本血清OD450nm/62ton/质控血清OD450nnV620^) 来描述CUt-0ff值，确定实验的CUt-0ff值为1.4。(2)肿瘤患者的选择及患者血清血管生成素含量的测定 利用双抗体夹心ELISA检测血清血管生成素水平，操作同上。检测时每块板上均加入 阳性对照血清、阴性对照血清、临界值质控血清，结果以血管生成素系数表示。如果血管 生成素系数大于或等于cut-off值1.4，则为血管生成素阳性。所有样本的检测均为平行双孔， 结果取两孔平均值。对273名肿瘤患者血清进行了检测，血管生成素总的阳性检出率为 23.81%，胰腺癌42.86%、膀胱癌41.67%、胃癌33.33%、乳腺癌29.41%、卵巢癌26.67%、 结直肠癌27.59%、宫颈癌25.00%、肾癌20.00%、肺癌10.75%。 二、竞争ELISA法检测血清中血管生成素1) 重组人血管生成素蛋白的表达、纯化方法同一中所述。2) 人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体的制备按常规方法制备。3) 竞争ELISA法检测血清中血管生成素(1) ELISA实验条件的确定 棋盘滴定法确定最适的包被抗原浓度和兔多抗稀释倍数。酶标板1-7行加稀释的抗原(12.8,6.4,3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2)ag/ml)，最后一行加不含抗原的包被液，每孔50nl包被，4°C 过夜。分别用PBST缓冲液(含0.05%的Tween20, pH为7.4)洗3次，PBS缓冲液洗两次， 甩干后每孔加入10(Hd 5y。脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭，置于湿盒中37'C温育lh，如上洗 涤，按l-7列分别加入稀释血清，稀释倍数为40倍，80倍，160倍，320倍，640倍，1280 倍，2560倍，第八列加不含血清的封闭液，50)Lil/孔，置于湿盒中37。C温育lh。按说明书 将HRP标记的羊抗兔IgG 1:5000稀释，每孔加50pl, 37'C温育45min，洗涤后加底物TMB， 置室温显色15 min，用2mol/L H2S04溶液终止反应，在酶标仪上检测OD45Q/62Q吸光值， 实验设两平行孔，结果取平均值。棋盘滴定法确定抗原最佳包被浓度为1.6pg/ml，兔抗血 清最佳稀释倍数为1:1280。(2)肿瘤患者血清血管生成素含量的测定 根据棋盘滴定法确定的抗原包被浓度和兔多抗稀释倍数，用竞争ELISA方法，共检测 肿瘤血清253例(包括肺癌80例，乳腺癌96例，结直肠癌26例，胃癌31例，宫颈癌12例，胰腺癌8例)，健康人血清174例，在酶标仪上检测OD450/62()的吸光值。整理数据，所检测的几种肿瘤中，检出率分别为肺癌7.50%、乳腺癌18.75%、结直肠癌23.08%、胃癌 35.48%、宫颈癌16.67%、胰腺癌12.50%。以上检测结果表明，以诱导表达、纯化后得到 的重组蛋白作为包被抗原，家兔多抗为一抗进行的竞争ELISA检测不同的肿瘤患者血清， 检出率有所不同，胃癌患者血清的检出率较高。 三、联合两种方法检测联合竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法，检出率分别为胰腺癌42.86%、胃癌 41.94% 、乳腺癌35.29%、结直肠癌30.77%、宫颈癌25.00%、肺癌11.25%。宫颈癌和胰 腺癌的病例数少，可能影响了检测效果的分析。结果表明，联合两种检测方法，提高了胃 癌、乳腺癌、结直肠癌和肺癌血清中血管生成素的阳性检出率。
权利要求
1. 双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素的方法，其特征是1)重组人血管生成素蛋白的表达、纯化利用RT-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段，测序正确后克隆入表达载体pET28-a(+)中并转化于E.coli BL21宿主菌中，经IPTG诱导，表达了N端融合6个组氨酸标签6His-tag的血管生成素融合蛋白，利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2+高亲合力结合的性质，经镍柱纯化，获得了高纯度的血管生成素融合蛋白；2)人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体的制备按常规方法制备人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体；3)双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素用人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体进行夹心ELISA检测人血清中的血管生成素(1)ELISA实验条件的确定棋盘滴定选择优化的ELISA实验条件，以血管生成素单抗说明书建议浓度2μg/mL包被96孔酶标板，包被液为0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液，0.16g Na2CO3，0.29g NaHCO3溶于100ml水中，湿盒中4℃温育过夜；次日，用含0.05％的Tween20，pH7.4PBST缓冲液洗涤3次，每次3分钟，再用PBS液洗涤两次，每次2分钟；每孔加入100μl含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液进行封闭，置于湿盒中37℃温育1h，按如上方法洗涤；按倍比稀释纵列加血清，第一列稀释倍数为5倍，此后各列稀释倍数依次为10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120、10240，每孔加入50μl置于湿盒中，37℃温育1h，洗涤；按倍比稀释横排加兔抗人血管生成素多克隆抗体，第一行稀释倍数为100，此后各行稀释倍数依次为200、400、800、1600、3200、6400，每孔加入50μl置于湿盒中，37℃温育1h，洗涤；加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔50μl，37℃温育1h，洗涤；加入底物TMB，置室温显色12分钟，用2mol/L H2SO4溶液终止反应；在酶标仪上检测OD450/620的吸光值；不同稀释度的血清与不同稀释度的多抗进行组合，确定最适条件为血清稀释倍数为10倍，多抗的稀释倍数为800倍；以棋盘滴定法确定的ELISA最适条件对数百例健康人血清进行检测，选取临界值质控血清，以血管生成素系数来描述cut-off值，确定实验的cut-off值为1.4，血管生成素系数＝样本血清OD450nm/620nm/质控血清OD450nm/620nm；(2)患者血清血管生成素含量的测定利用双抗体夹心ELISA检测血清血管生成素水平，操作同上，检测时每块板上均加入阳性对照血清、阴性对照血清、临界值质控血清，结果以血管生成素系数表示，如果血管生成素系数大于或等于cut-off值1.4，则为血管生成素阳性，所有样本的检测均为平行双孔，结果取两孔平均值；。
2、 竞争ELISA法检测血清中血管生成素的方法，其特征是1) 重组人血管生成素蛋白的表达、纯化 方法同权利要求l中1)中相同；2) 人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体的制备 按常规方法制备；
3 )竞争ELISA法检测血清中血管生成素 (1) ELISA实验条件的确定棋盘滴定法确定最适的包被抗原浓度和兔多抗稀释倍数，酶标板l-7行加稀释的抗原分 别为12.8ng/ml、 6.4(ig/ml、 3.2pg/ml、 1.6ng/ml、 0.8pg/ml、 0.4|tig/ml、 0.2pg/ml，最后一行 加不含抗原的包被液，每孔5(^1包被，4。C过夜，分别用含0.05%的Tween20， pH为7.4PBST 缓冲液洗3次，PBS缓冲液洗两次，甩干后每孔加入10(^1 5。/。脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭， 置于湿盒中37。C温育lh，如上洗涤，按1-7列分别加入稀释血清，稀释倍数为40倍，80 倍，160倍，320倍，640倍，1280倍，2560倍，第八列加不含血清的封闭液，50nl/孔,置 于湿盒中37。C温育lh，按说明书将HRP标记的羊抗兔IgG 1:5000稀释，每孔加5(^1, 37°C 温育45min，洗涤后加底物TMB，置室温显色15min，用2mol/L H2S04溶液终止反应，在 酶标仪上检测OD450/620吸光值，实验设两平行孔，结果取平均值，棋盘滴定法确定抗原最佳 包被浓度为1.6ng/ml，兔抗血清最佳稀释倍数为1: 1280; (2)患者血清血管生成素含量的测定根据棋盘滴定法确定的抗原包被浓度和兔多抗稀释倍数，用竞争ELISA方法，共检测肿瘤血清数百例，健康人血清一百多例，在酶标仪上检测OD45()/62()的吸光值，整理数据。3、 联合双抗体夹心ELISA、竞争ELISA两种方法检测血清中血管生成素的方法，其 特征是同时进行竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素，进行检测效果 的对比分析，得出血清中血管生成素的检测结果。
全文摘要
本发明属于生物医学工程中的免疫学技术领域，具体涉及人血清中血管生成素检测方法及其应用。按常规方法表达并纯化人血管生成素蛋白，制备人血管生成素抗体，为血管生成素血清检测提供实验基础。分别采用竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中的血管生成素，采用了兔抗人血管生成素多克隆抗体进行竞争ELISA，鼠抗人血管生成素单克隆抗体和兔抗人血管生成素多克隆抗体进行夹心ELISA，检测人血清中的血管生成素，棋盘滴定法优化ELISA实验条件，确定最适血清稀释倍数和抗原抗体稀释倍数。联合两种检测方法，分析人血清血管生成素的检出率。可以相互补充，提高检出率。
文档编号G01N33/577GK101271115SQ20081005067
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者丽 王, 田 邱 申请人:东北师范大学