专利名称：：治疗癌症的促血管生成素-2拮抗剂和VEGF-A、KDR和/或FIt1的拮抗剂的组合的制作方法治疗癌症的^iii管生成素-2拮抗剂和VEGF-A、KDR和/或Fltl拮抗剂的组合本发明涉及具有抗血管生成活性并因此可用于治疗与动物或人体中的血管发生有关的疾病状态的方法的组合物。更具体的说，本发明涉及促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂的组合，以及这种拮抗剂的用途。这种组合还可用于治疗与促血管生成素-2及VEGF-A和/或KDR和/或Fltl的活性有关的疾病。血管发生，即从现有血管系统形成新血管，是几乎所有的器官的形成和生理功能所需的复杂生物过程。它是胚胎发生、正常生理生长、修复和病理过程如肿瘤扩展的必需要素。通常，血管发生受到涉及内皮细胞所致的血管萌发、分支和小管形成(涉及到诸如内皮细胞(EC)的激活、血管去稳定化、降解酶的合成和释放、EC迁移、EC增殖、EC组织化和分化及血管成熟的过程)的多步骤过程中的血管发生因子和血管发生抑制因子的局部平衡的严密调节。在成人中，生理性血管发生主要限于创伤愈合和女性生殖功能和胚胎发育的几种情形(component)。在疾病相关性血管发生中，包括任何异常的、不需要的或病理性的血管发生，血管发生因子和血管发生抑制因子的局部平衡受到异常调节，从而导致不适当的和/或结构上异常的血管形成。已将病理性血管发生与包括糖尿病性牙见网膜病、牛皮癣、癌症、类风湿性关节炎、动脉粥样化、卡波济氏肉瘤和血管瘤在内的疾病状态关联起来(Fanetal，1995,TrendsPharmacology.Science.16:57-66;Folkman,1995，NatureMedicine1:27-31)。在癌症中，大于1-2mm3的原发性和继发性肿瘤需要血管发生(Folkman,J.NewEnglandJournalofMedicine1995;33，1757-1763)。已有许多信号转导系统被指牵涉到血管发生的调节，有多种因子是体外EC应答和体内血管生长的已知调节剂。受体酪氨酸激酶(RTKs)是将生化信号跨细胞的质膜传输的重要递质。这些跨膜分子特征性地由胞外配体结合域通过质膜中的区段(segment)与胞内酪氨酸激酶结构域连接而组成。配体与受体的结合导致受体相关酪氨酸激酶活性受到刺激，而这又导致受体和其它胞内分子上的酪氨酸残基被磷酸化。这些酪氨酸磷酸化方面的变化引发信号转导级联，从而导致多种细胞应答。到目前为止，已鉴定出至少19个由氨基酸序列同源性确定的独特RTK亚家族。VEGF被认为是正常血管发生和疾病相关性血管发生(Jakeman，etal.1993Endocrinology:133,848-859;Kolch,etal.1995BreastCancerResearchandTreatment:36，139國155)和血管通透性(Connolly,etal.1989J.Biol.Chem:264,20017-20024)的重要刺激剂。通过用抗体隔绝VEGF来拮抗VEGF作用，能导致肿瘤生长受到抑制(Kim，etal.1993Nature:362,841-844)。VEGF基因的杂合破坏(heterozygousdisruption)导致致命性的血管形成(vascularisation)不足(Carmeliet，etal.1996Nature380:435-439;Ferrara，etal.1996Nature380:439-442)。VEGF是已知最强效和普遍的血管生长因子。在VEGF的角色被鉴定为分泌的针对内皮细胞的促细胞分裂原之前，它被鉴定为血管通透性因子，突出了VEGF控制内皮细胞行为的许多独特方面(包括增殖、迁移、特化和存活)的能力(Ruhrberg,2003BioEssays25:1052-1060)。VEGF也称VEGF-A,是属于待鉴定的血小板衍生生长因子超家族的结构相关二聚糖蛋白的VEGF家族的第一个成员。除了这个开创性成员(foundingmember)外，VEGF家族还包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(PIGF)和内分泌腺"f汙生的VEGF(EG-VEGF)'。VEGF的活性形式是作为同型二聚体合成，或者作为与其它VEGF家族成员的异型二聚体合成。VEGF-A以交替剪接所产生的六种同种型存在VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF则和VEGF206。这些同种型主要差别在于它们的生物利用度，其中VEGFi65是最主要的同种型(Podar,etal.2005Blood105(4):1383-1395)。在胚胎发生过程中剪接受到调节从而产生出阶段和组织特异性比例的各种同种型，这为内皮细胞响应VEGF的独特和背景依赖性(contextdependent)行为创造了巨大的潜力。VEGF家族的成员已知能以不同的亲和力结合三种相关的受体酪氨酸激酶VEGFR1(fms样酪氨酸激酶受体，Fit或Fltl)、VEGFR2(含激酶插入结构域的受体，KDR(也称Flk-l))和VEGFR3(另一种fms样酪氨酸激酶受体，Flt4)。这些相关RTKs中的两种即Fltl和KDR已被证实能以高亲和力结合VEGF(DeVriesetal,1992,Science255:989-991;Te醒netal，1992，Biochem.Biophys.Res.Comm.1992,187:1579-1586)。已将VEGF与异源细胞中表达的这些受体的结合与细胞蛋白质酪氨酸磷酸化状态和钩运转的变化关联起来。敲除小鼠研究已证实，Fltl或KDR的破坏会导致急性血管缺陷所致的孕中期死亡。但是，表现型却是不同的；KDR的不足会导致EC和发育中的造血系统的缺乏(Shalaby，etal.1995Nature376:62-66),Fltl的不足不会影响造血祖细胞和EC,但这些细胞不能装配成功能性血管(Fong,etal.1995Nature376:66-70)。Flt4在胚胎中得到广泛表达，之后在成人中局限于淋巴血管。Flt4敲除小鼠证实Flt4在心血管系统的早期发育中、在初级血管网络重塑和成熟为更大血管中的必要角色(Dumont,etal.1998Science282:946-949)。除了VEGF家族外，促血管生成素也^皮认为涉及血管发育和出生后血管发生。促血管生成素包括天然激动剂即促血管生成素-l及天然拮抗剂即促血管生成素-2。促血管生成素-1的角色据认为在成人中是保守的，在成人中促血管生成素-1得到广泛地和组成型地表达(Hanahan,^SWe,，277:48-50(1997);Zagzag,"a/.,~A^wra/o^,159:391-400(1999))。相反，促血管生成素-2表达主要限于血管重塑部位，促血管生成素-2被认为在该部位能阻断促血管生成素-1的组成型稳定化或成熟化功能，让血管回复到和保持在可能对萌发信号更具响应性的塑性状态(Hanahan,1997;Holash""/.,O"coge"e18:5356-62(1999);Maisonpierre,1997)。对疾病相关血管发生中的促血管生成素-2表达的研究发现了许多肿瘤类型能显示血管促血管生成素-2表达(MaisonpierreC5We膨277:55-60(1997))。功能研究提示了促血管生成素-2涉及肿瘤血管发生，并将促血管生成素-2过量表达与小鼠异种移植模型中的肿瘤生长增加关:^来(Ahmad，W"/.，及"'，61:1255-1259(2001))。其它的研究也将促血管生成素-2过量表达与胂瘤血管过多性(hypervascularity)关联起来(Etoh,efa/"61:2145-53(2001);Tanaka"a/.，G3"c^及仏62:7124-29(2002))。Valenzuelaetal.(1999)使用基于同源性的克隆方法鉴定了2种新型促血管生成素小鼠中的促血管生成素-3和人体中的促血管生成素-4。尽管与促血管生成素-1和促血管生成素-2的小鼠和人变型之间的差异相比，促血管生成素-3和促血管生成素-4在结构上相互间差异更大，但它们似乎代表着相同基因座的小鼠和人对等物(counterpart^对促血管生成素家族的这些成员的生物学特性知之甚少。例如，促血管生成素-4只在肺中高水平表达，但在文献中见不到促血管生成素-4所激活的生物作用或信号转导途径(Tsigkos，etal.,ExpertOpin.Investig.Drugs12(6):933-941(2003);Valenzuela,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.96:1904-1909(1999))。促血管生成素-4表达水平已知能响应低氧而增力口，且内皮细胞生长因子会导致成胶质细胞瘤细胞系和内皮细胞中的促血管生成素-4表达水平提高。但是，表达调节的机制以及所产生的对生理性和疾病相关性血管发生的作用未知(Lee，etal.,FASEBJ.18:1200-1208(2004)。促血管生成素最初是作为在血管内皮当中选择性表达的Tie受体酪氨酸激酶家族的配体被发现(Yancopoulos&"/.,A^we4(K7:242-48(2000)。促血管生成素-1、促血管生成素-2、促血管生成素-3和促血管生成素-4主要结合Tie-2受体，因此也称为Tie-2配体。促血管生成素-1与Tie-2的结合，会引发通过自身磷酸化进行的受体的酪氨酸磷酸化和随后的通过信号转导进行的对其信号转导途径的活化(Maisonpierre,P.etal.1997Science:277，55-60)。促血管生成素-2是促血管生成素-1的天然拮抗剂，通过对促血管生成素-1诱导的Tie-2受体的激酶激活的竟争性抑制起作用(Hanahan,1997;DavisWa/.,Ce〃87:1161-69(1996);Maisonpierre&a/"5We"ce277:55-60(1997))。对Tie-2和促血管生成素-1进行的敲除小鼠研究证实了类似的表现型，提示促血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化能介导发育中的血管的重塑和稳定化，从而促进血管发生过程中的血管成熟和内皮细月包支持细胞黏附的维持(Dumont&(ewas<§:Deve/o/wewf,8:1897-1909(1994);Sato，A^wre,376:70-74(1995);(Thurston,G.etal.,2000NatureMedicine:6,460-463))。在最近几年，已将促血管生成素-l、促血管生成素-2和/或Tie-2提i义为可能的抗癌治疗靶标。例如，US6166185、US5650490和US5814464各自公开了抗Tie-2配体和受体的抗体。用可溶性Tie-2进行的研究据报道降低了啮齿动物中的肿瘤数量和大小(Lin,1997;Lin1998)。Siemesteretal.(1999)产生了表达Tie-2的胞外结构域的人黑素瘤细胞系，并将这些细胞系注射到棵鼠中，报道说可溶性Tie-2导致了肿瘤生长和肿瘤血管发生受到显著抑制。鉴于促血管生成素-1和促血管生成素-2都能结合Tie-2，从这些研究并不清楚促血管生成素-1、促血管生成素-2和/或Tie-2是否会成为引人注目的抗癌疗法靶标。但是，有效的抗^i管生成素-2疗法被认为在治疗诸如癌症的疾病上是有益的，这些疾病的*依赖于异常血管发生，阻断这个过程能阻止疾病发展(Folkman,J.，iVafweMecfc/"e.1:27-31(1995)。另外，一些研究小组报道了使用能结合促血管生成素-2的抗体，参见例如美国专利6,166,185和美国专利申请公开说明书2003/0124129Al。对促血管生成素-2的局灶表达(focalexpression)的作用的研究证实，拮抗促血管生成素-l/Tie-2信号能松开紧密的血管结构，从而使EC暴露于来自血管发生诱导物如VEGF的激活信号(Hanahan,1997)。这一由对促血管生成素-1的抑制产生的促血管发生作用表明抗促血管生成素-1疗法不会成为有效的抗癌治疗法。国际公开号WO200197850描述了对VEGF/VEGF受体系统和促血管生成素/Tie受体系统进行组合功能干扰，以抑制血管形成和抑制肿瘤生长。该申请范围广泛，包括对VEGF八^EGF受体系统和促血管生成素/Tie受体系统的任何组分(component)的功能干扰的任何可以想到的组合；也就是说'Fltl、KDR、Flt4、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF或EG-VEGF中的任何一个与对促血管生成素-1、促血管生成素-2、促血管生成素-3、促血管生成素-4或Tie-2中的任何一个的功能干扰的组合。该申请提出，功能干扰可通过以下方面来实现i)能抑制受体酪氨酸激酶活性的化合物，ii)能抑制配体与受体的结合的化合物，m)能抑制受体的胞内途径的激活的化合物，iv)能抑制或激活配体的表达或者VEGF或Tie受体系统的受体的表达的化合物，v)能通过识别VEGF/VEGF受体系统或促血管生成素/Tie受体系统将细胞毒性剂或凝结诱导剂靶向内皮的递送系统，如抗体、配体、高亲和力结合寡核苷酸或寡肽或者脂质体5或vi)^皮耙向内皮并诱导坏死或凋亡的递送系统，如抗体、配体、高亲和力结合寡核苷酸或寡肽或者脂质体。为进一步扩大提出本申请的保护范围，该申请还规定，被该发明的各个组合所包含的化合物可以是小分子量物质、寡核苷酸、寡肽、重组蛋白质、抗体或者它们的缀合物或融合蛋白。尽管包括众多的任选组合，但并没有教导具体组合的用途/选择。尽管WO200197850对很大的范围提出了权利要求，但该发明的例证却限于人Tie-2受体酪氨酸激酶(sTie-2)的胞外配体中和性结构域和A或B的組合。后者可以是A.VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(4-氯苯基)[4-(4-吡咬基曱基)-酞溱-l-基]琥珀酸氢铵(Woodetal"CancerRes.602178-2189，2000),或B.抗VEGF抗体；为VEGF-A中和性单克隆抗体4301-42-35(Schlaeppietal.,J.CancerRes.Clin.Oncol.125,336-342,1999)或特异性识别人VEGF-A/VEGF受体I复合物的单链抗体(scFv)(W09919361)。该申请的广泛范围的其余部分没有例证。具体的说，没有除了sTie-2用于实现对促血管生成素/Tie受体系统的功能干扰的用途之外的例证。因此，本领域技术人员并不清楚乂人很大范围的可能排列(permutation)中还有什么其它组合会在治疗上有效。本发明涉及促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂的组合以及这种组合的用途。本发明的一个方面提供促血管生成素-2生物活性拮抗剂和以下物质的生物活性拮抗剂的组合i.VEGF-A，.和/或ii.KDR,和/或iii.Fltl。在一个实施方案中，提供上述组合，其中促血管生成素-2生物活性拮抗剂是抗体。优选地，促血管生成素-2的拮抗剂是单克隆抗体。更优选地，促血管生成素-2的拮抗剂是完全人单克隆抗体。更优选地，该完全人单克隆抗体结合的表位与以下任何一个完全人单克隆抗体相同:3.31.2、5,16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3。最优选地，该完全人单克隆抗体选自以下4壬何一个3.31.2或5.16.3或5.86.1或5.88.3或3.3.2或5.103.1或5.101.1或3.19.3或5.28.1或5.78.3。在另一个实施方案中，提供上述组合，其中促血管生成素-2生物活性拮抗剂可能不结合Tie-2的ATP结合位点。在另一个实施方案中，提供上述组合，其中促血管生成素-2生物活性拮抗剂不是sTie-2。在另一个实施方案中，提供上述组合，其中KDR生物活性拮抗剂是抗体。优选地，该拮抗剂是单克隆抗体。更优选地，该拮抗剂是完全人单克隆抗体。在另一个实施方案中，提供上述组合，其中Fltl生物活性拮抗剂是抗体。优选地，该拮抗剂是单克隆抗体。更优选地，该拮抗剂是完全人单克隆抗体。在另一个实施方案中，提供上述組合，其中VEGF-A生物活性拮抗剂是抗体。优选地，该拮抗剂是单克隆抗体。该单克隆抗体可以是DC101(Imclone)。更优选地，该拮抗剂是完全人单克隆抗体。最优选地，VEGF-A生物活性拮抗剂是阿瓦斯汀(贝伐单抗)(RosenLS.,CancerControl9(suppl2):36-44，2002)、CDP791(Celltech)或IMC1121b(Imclone)。在另一个实施方案中，提供上述组合，其中KDR生物活性拮抗剂是化合物。在又一个实施方案中，提供上述组合，其中Fltl生物活性拮抗剂是化合物。优选地，该拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。更优选地，酪氨酸激酶抑制剂选自Zactima(ZD6474(WedgeSRetal.ZD6474inhibitsVEGFsignalling,angiogenesisandtumourgrowthfollowingoraladministration(ZD6474在口服给药后能抑制VEGF信号转导、血管发生和肿瘤生长).CancerResearch2002;62:4645-4655))、AZD2171(WedgeSRetal.AZD2171:Ahighlypotent，orallybioavailable，vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2tyrosinekinaseinhibitorforthetreatmentofcancer(AZD2171:癌症治疗用的强效、口服生物可利用、血管内皮生长因子受体-2酪氨酸激酶抑制剂).CancerResearch2005;65:4389-4400)、SU11248(Sutent，Pfizer)、SU14813(Pfizer)、Vatalanib(Novartis)、BAY43-9006(sorafenib，Bayer)、XL-647(Exelixis)、XL-999(Exelixis)、AG-013736(Pfizer)、AMG706(Amgen)、BIBF1120(Boehringer)、TSU68(Taiho)、GW786034、AEE788(Novartis)、CP-547632(Pfizer)、KRN951(Kirin)、CHIR258(Chiron)、CEP-7055(Cephalon)、OSI-930(OSIPharmaceuticals)、ABT-869(Abbott)、E7080(Eisai)、ZK-304709(Schering)、BAY57-9352(Bayer)、L-21649(Merck)、BMS582664(BMS)、XL-880(Exelixis)、XL-184(Exdixis)或XL-820(Exelixis)。更优选地，酪氨酸激酶抑制剂选自Zactima或AZD2171。为避免疑义，KDR生物活性拮抗剂除了抑制KDR外还可抑制其它酪氨酸激酶，例如Fltl、EGFR或PDGFR。在一个实施方案中，KDR生物活性拮抗剂是KDR信号转导抑制剂。在另一个实施方案中，KDR生物活性拮抗剂是KDR信号转导抑制剂，但不是EGFR的抑制剂。本发明的另一个方面提供包含上述组合的药物组合物。本发明的另一个方面提供上述组合用于制造治疗疾病相关性血管发生用的药物的用途。促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或F1U生物活性拮抗剂的组合，可以单独给予，或者可以与另外的抗体或化疗药物或放射疗法一起组合给予。本发明的另一个方面提供拮抗促血管生成素-2的生物活性和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl中的任何一个的生物活性的方法，所述方法包括给予上述组合。优选地，所述方法包括选择需要进行疾病相关性血管发生的治疗的动物，和给予所述动物治疗有效剂量生物活性拮抗剂的组合。本发明的另一个方面提供治疗哺乳动物中的疾病相关性血管发生的方法，所述方法包括给予治疗有效量的上述组合。优选地，所述方法包括选择需要进行疾病相关性血管发生的治疗的动物，和给予所述动物治疗有效剂量的促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂的组合。本发明的另一个方面提供治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的上述组合。优选地，所述方法包括选择需要进行疾病相关性血管发生的治疗的哺乳动物，和给予所述哺乳动物治疗有效剂量的促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂的组合。在一个优选的实施方案中，本发明特别适用于拮抗患有单独地或部分上依赖于促血管生成素-2和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl的胂瘤的患者中的促血管生成素-2生物活性和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性。本发明的另一个方面提供这样的本发明組合，它另外还包含医学胂瘤学中所用的抗增殖/抗肺瘤药物和它们的组合，如烷基化剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢药(例如抗叶酸制剂如氟嘧啶类如5-氟尿嘧啶和替力口氟、雷替曲塞、吉西他滨、卡培他滨、甲氨喋呤、培美曲塞、胞嘧啶阿拉伯糖苷和羟基脲，或者例如欧洲专利申请号562734中所公开的优选抗代谢药中的一种，如(2S)-2-^-氟苯曱酰胺基卜4-(四唑-5-基)丁酸)；包含烷基化剂和抗代谢药的组合(例如Folfox，其包含氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素和光辉霉素)；抗有丝分裂药(例如长春花生物碱类如长春新碱、长^、长春地辛和长春瑞滨及紫杉类化合物如紫杉醇和泰索帝)；和拓朴异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素如依托泊苦和替尼泊苷、伊立替康、安吖啶、托泊替康和喜树碱)。在一个优选的实施方案中，提供另外包含Folfox的本发明组合。在一个优选的实施方案中，本发明的组合还包含保护剂，例如能产生防止贫血或者减少抗增殖/抗胂瘤药物副作用的效果的药剂。优选地，保护剂是还原形式的叶酸，优选亚叶酸。本发明的组合预期能抑制疾病相关性血管发生，因此能充当各种血管发生相关性疾病的强效疗法。在包含抗体的本发明实施方案中，可将某个组合给予患者，然后给予清除剂。优选地，该清除剂能将过量的循环抗体从血液中除去。本发明还包括制备本发明的各个组合的方法。本发明的又一个方面提供包舍促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂的组合的药盒。本发明的又一个方面提供包含以下物质和容器的药盒a)第一单位剂量形式的促血管生成素-2生物活性拮抗剂；b)第二单位剂量形式的VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂；和c)装着所述第一和第二剂量形式的容器。本发明的又一个方面提供包含以下物质和容器的药盒a)第一单位剂量形式的促血管生成素-2生物活性拮抗剂及药物可接受赋形剂或载体；b)第二单位剂量形式的VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂及药物可接受赋形剂或载体；和c)装着所述第一和第二剂量形式的容器。在另一个实施方案中，本发明提供包括容器的制造品(articleofmanufacture^该容器装着促血管生成素-2生物活性拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂的组合以及包装插页或标签，该包装插页或标签说明该组合能用来治疗与促血管生成素-2和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl的活性和/或过量表达有关的血管发生相关性疾病。本发明的又一个方面提供治疗用组合治疗法(therapeuticcombinationtreatment),该组合治疗法包括将有效量的促血管生成素-2生物活性拮抗剂或其药物可接受盐，任选与药物可接受赋形剂或载体一起，给予需要这种组合治疗法的温血动物如人，并同时地、序贯地或单独地给予有效量的VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗剂或其药物可接受盐，其中后者可任选与药物可接受赋形剂或载体一起给予。本文所定义的本发明組合治疗法可通过同时地、序贯地或单独地给予所述治疗法的各个成分来实现。本文所定义的组合治疗法可作为单独疗法施用，或者除了本发明的组合治疗法外还可涉及到另外的手术或》t射疗法或另外的化学治疗剂。组合制剂用于给定患者的剂量，要由主治医师在考虑到各种已知会改变药物的作用的因素下进行确定，这些因素包括疾病的严重程度和类型、患者体重、性别、膳食、给药时间和途径、其它药物和其它相关临床因素。治疗有效剂量可通过体外或体内方法进行确定。待进行治疗性采用的本文所述组合的有效量，要取决于例如治疗目标、给药途径和患者情况。因此，优选的是治疗医师按需确定(titer)剂量和改变给药途径以获得最佳治疗效果。依上述因素而定，典型的日剂量可从约0.001mg/kg直到100mg/kg或更多。通常，临床医师要给予治疗性抗体至达到能实现所需的效果的剂量为止。这个疗法的进程可容易地通过常规测定法或者如本文所述进行监测。抗体给予途径与已知方法是相合的，所述已知方法例如通过静脉内、Hi^内、脑内、肌肉内、目艮内、动脉内、鞘内注射或输注，通过吸入或伤口内(intralesion)途径，或者通过下述的IC释系统。抗体优选通过输注连续给予或通过推注给予。待进行治疗性采用的抗体的有效量，要取决于例如治疗目标、给药途径和患者情况。因此，优选的是治疗医师按需确定(titer)剂量和改变给药途径以获得最佳治疗效果。通常，临床医师要给予抗体至达到能实现所需的效果的剂量为止。这个疗法的进程可容易地通过常规测定法或者通过本文所述的测定法进行监测。本文所述的组合可以为适合口服给药的形式，例如片剂或胶嚢剂；为适合鼻内给药或吸入给药的形式，例如散剂或溶液剂；为适合胃肠外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内注射，或输注)的形式，例如无菌溶液剂、混悬剂或乳剂；为适合局部给药的形式，例如软膏剂或乳膏剂；为适合直肠给药的形式，例如栓剂，或者给药途径可以是通过直接注射到肿瘤中或通过区域递送(regionalddivery)或通过局部递送。在本发明的其它实施方案中，组合治疗法可以以内窥镜、气管内、伤口内、经皮、静脉内、皮下、腹膜内或肿瘤内方式进行递送。优选地，本发明的组合进行口服给予。一般来说，本文所述的组合可用常规赋形剂以常规方式制备。本发明的组合有利地以单位剂型呈现。本文所述的抗体可以与药物可接受载体混合在一起制备。这个治疗性组合物可以静脉内给予或者通过鼻或肺给予，优选作为液体或粉末气溶胶(冻干)给予。该组合物还可按需进行胃肠外或皮下给予。当进行系统给予时，治疗用组合物应无菌、无热原和在胃肠外可接受溶液中，要充分注意溶液的pH、等渗性和稳定性。这些条件是本领域技术人员公知的。简单的说，本文所述化合物的制剂是通过将具有所需纯度的化合物与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备，以进行储藏或给药。这种材料在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括緩沖剂如TRISHC1、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或其它有机酸盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(小于约十个残基)肽如聚精氨酸、蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA;糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；反荷离子如钠和/或非离子型表面活性剂如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。本发明的实施方案包括可用作疾病治疗剂的无菌抗体药物制剂。这种制剂会抑制抗原的生物活性，从而有效治疗其中例如血清或组织抗原异常升高的疾病状况。抗体优选具有足够的亲和力，以强效地中和抗原，并优选具有足够的作用时间，以便不用在人体中频繁给药。作用时间的延长会使得可以通过另选的胃肠外途径如皮下或肌肉内注射，进行的频率更少、方便性更高的给药方案。无菌制剂可例如通过在抗体的冻干和复溶之前或之后滤过无菌过滤膜来制备。抗体通常要以冻干形式或者在溶液中储藏。治疗性抗体组合物通常是放入具有无菌存取口(accessport)的容器中，例如具有能使制剂得以取用的配接器(adapter)的静脉内溶液剂袋子或小瓶，该配接器例如是可被皮下注射针刺穿的塞子(stopper)。注射用无菌組合物可4姿照77ze5Wewcea"d户raWceo/尸Aar顧c少(20ed，LippincottWilliams&WilkensPublishers(2003))中描述的常规制药规范进行配制。例如，宜将活性化合物溶解或悬浮于载体中，所述栽体例如水或者天然植物油如芝麻油、花生油或棉籽油或者合成脂肪性载体如油酸乙酯等。緩沖剂、防腐剂、抗氧化剂等可按照公认的制药规范来掺入。本发明的组合可作为緩释制剂进行递送。緩释制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质(matrix),该基质为成型物品、膜或微胶嚢的形式。緩释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如Langer"B/owW及仏，(1981)15:167-277和Langer，C7zem.rec/7.，(1982)12:98-105所述的聚(2-幾乙基曱基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利3,773,919、EP58,481)、L國谷氨酸和L-谷氨酸-y-乙酯共聚物(Sidman&B/opofymers，(1983)22:547-556)、非可降解乙烯-醋酸乙烯酯(LangerW"/.，出处同上)、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能使得分子可释放长达100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。蛋白质当进行包嚢时会在体内长时间保持，他们可能会因为暴露于37°C潮湿的环境下而变性或聚集，导致生物活性损失和可能的免疫原性变化。可根据所涉及的机制设计出合理的策略进行蛋白质稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过二硫化物互换形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。緩释组合物还包括抗体晶体悬浮于能够将晶体维持在悬浮液中的合适制剂所成的制品。这些制品当皮下或腹膜内注射时能产生緩释效果。其它组合物还包括脂质体包埋抗体。含有这种抗体的脂质体是通过本身7>知的方法来制备美国专利DE3,218,121;''『Epstein"a/.,尸亂胸/.^cad腺，(1985)82:3688-3692;Hwang"a/.,Ato/.(1980)77:4030-4034;EP52,322;EP36,676;EP88，046;EP143,949;142，641;日本专利申请83-118008;美国专利4,485,045和4,544,545;和EP102,324。应认识到，按照本文的组合物和方法进行的治疗性实体(therapeuticentity)的给予，要用合适的载体、赋形剂和其它被掺入到制剂中以使转移、递送、耐受性得以改进的物质来进行给予。这些制剂包括例如散剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)嚢泡(如Lipofectin1^)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、碳蜡乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。任何前述混合物都可适用于本发明的治疗和疗法，条件是制剂中的活性成分不受制剂^/f匕，且制剂在生理上与给药途径相容和可耐受。关于与药物化学家公知的制剂、赋形剂和载体有关的另外信息，另参见BaldrickP."Pharmaceuticalexcipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance(药物赋形剂开发临床前指导的需要)."及egw/.7b;dco/.尸/7。maco/.32(2):210-8(2000),WangW."Lyophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals(固体蛋白质药4勿的冻干和开发)."/"f./尸/wwz.203(l-2):l-60(2000),CharmanWN"Lipids,lipophilicdrugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts(脂质、亲脂药物和口服药物递送——一些新出现的概念)."/P/zanw.89(8):967-78(2000)，Powell&a/."Compendiumofexcipientsforparenteralformulations(胃肠外制剂用赋形剂概要)"尸DJJ尸/^wz5Wrec/wo/.52:238-311(1998)和这些文献中的引文。通过永久组织培养细胞系制造具有预确定特异性的单克隆抗体，这最初描述于1975年(Kohler,G"&Milstein,C"Nature256,495-497,1975)。小鼠骨髓瘤和来自被免疫供体的小鼠脾细胞的融合产生出分泌抗绵羊红细胞(SRBC)抗体的细胞系。随后的发展意味着现在有可能通过体外方法^"生人抗体。合适的实例包括但不限于嗟菌体展示(CAT,Morphosys,Dyax，Biosite/Medarex，Xoma，Symphogen,Alexion(原为Proliferon)，Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母菌展示等。本文所述的抗体是通过利用下文所述的XenoMouse⑧技术制备的。这种小鼠因而能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，在鼠免疫球蛋白分子和抗体的产生方面则不足。用以实现这一点的技术在本文给出的专利、申请和参考文献中有公开。不过具体的说，转基因产生小鼠和从该小鼠转基因产生抗体的一个优选实施方案，公开于1996年12月3日提交的美国专利申请系列号08/759,620和1998年6月11日公布的国际专利申请WO98/24893和2000年12月21日公布的国际专利申请WO00/76310中，这些专利的7>开内容通过引用结合到本文中。另参见Menofeze,。/.A^wreCe"幼'cs15:146-156(1997),该文献的^^开内容通过引用结合到本文中。通过使用这种技术，已经产生出抗多种抗原的完全人单克隆抗体。概要地说，用目的抗原免疫XenoMouse⑧系的小鼠，从超免疫小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)，将回收的淋巴细胞与骨髓类型的细胞系融合，以制备无限增殖的杂交瘤细胞系。对这些杂交瘤细胞系进行筛选和选择，以鉴定出产生了对目的抗原有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供用以产生多个能产生抗体的杂交瘤细胞系的方法。此外，本文提供由这种细胞系产生的抗体的表征，包括对这种抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。或者，可直接对B细胞进行测定，而不是将与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。例如，可从超免疫XenoMoused、鼠分离CD19+B细胞，并让它增殖和分化成分泌抗体的浆细胞。然后通过ELISA对细胞上清液中的抗体进4亍对免疫原的反应性方面的筛选。还可对上清液进行对免疫原片段的免疫反应性方面的筛选，以进一步对不同抗体进行与免疫原上具有功能意义的结构域的结合方面的作图(map)。还可将抗体进行针对其它相关人蛋白质和针对大鼠、小鼠和非人灵长类动物如食蟹猴免疫原直向同源物(orthologue)的筛选，以确定物种交叉反应性。来自含目的抗体的各孔的B细胞可通过各种方法无限增殖化，这些方法包括将各孔B细胞分别进行融合或者将各孔B细胞合并后进行融合以制备杂交瘤，或者是通过用EpsteinBarr病毒感染或用已知的无限增殖基因转染，然后接种在合适的培养基中。或者，然后用抗原特异性溶血空斑试-验分离能分泌具有所需特异性的抗体的单一浆细胞(参见例如Babcook"a/.,A^/.jcadt/W93:7843-48(1996))。被革巴向进行裂解的细胞优选是包被有抗原的绵羊血细胞(SRBCs)。在含有能分泌目的免疫球蛋白的浆细胞的B细胞培养物和补体存在下，空斑的形成表明了目的浆细胞周围的绵羊红细胞的特异性抗原介导裂解。可将空斑中央的单一抗原特异性浆细胞分离，并从该单一浆细胞分离编码抗体的特异性的遗传信息。进行反转录后再进行聚合g反应(RT-PCR),可克隆出编码抗体的重链和轻链可变区的DNA。这种克隆DNA然后可再插入到合适的表达载体中，优选载体盒如pcDNA，更优选含有免疫球蛋白重链和轻链的恒定域的pcDNA载体。然后可将所产生的载体转染到宿主细胞例如HEK293细胞、CHO细胞中，在常规的营养培养基(在适当情况下进行了改进以诱导转录)中培养，选择出转化子，或者扩增编码所需序列的基因。一般来说，融合杂交瘤所产生的抗体是连接有完全人K或人轻链的人IgG2重链。本文所述的抗体具有人IgG4重链及IgG2重链。抗体还可以是其它的人同种型，包括IgGl。抗体经固相和溶液相技术测出具有高亲和力，通常具有约10"至约10"M或更低的Kd。欧洲专利申请773288和843961描述了从其中通过^f效细胞融合引入了大段染色体或整个染色体的小鼠产生人抗体，所述专利的公开内容通过引用结合到本文中。另外，还产生出了KMTM小鼠，这些小鼠是将日本麒麟哞酒公司(Kirin)的Tc小鼠与美国Medarex公司的微小基因座(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(tmnschromosome)和Genpharm小鼠(Ishida&a/.,CloningStemCells,(2002)4:91-102)的k链转基因。要认识到，抗体可以在杂交瘤细胞系之外的细胞系中表达。可用编码特定抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可以通过任何已知的用以将多核苷酸引入到宿主细胞中的方法来进行，所述方法包括例如将多核苷酸包装在病毒中(或者包装到病毒杂体中)并用该病毒(或者栽体)转导宿主细胞，或者转化可通过本领域公知的转染程序来进行，所述转染程序例见美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(这些专利通过引用结合到本文中)。所用的转化程序取决于所要转化的宿主。将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的，包括葡聚糖介导转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸包嚢在脂质体中和DNA直接微注射到细胞核中。可供作为表达用宿主的哺乳动物细胞系是本领域^S知的，包括许多可获自美国模式培养物保藏所(ATCC)的无限增殖化细胞，这些细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)、人上皮肾293细胞和多种其它细胞系。特别优选的细胞系是通过确定哪些细胞系具有高表达水平和能产生具有组成型抗原结合特性的抗体来选出。理解的含义，除非另有定义。此外，除非上下文另外要求，否则单数形式的术语应包括复数含义，复数形式的术语应包括单数含义。一般来说，在细胞和组织培养、分子生物学及蛋白质和寡或多核普酸化学和杂交方面所用的术语及这些方面的技术，是本领域公知和常用的那些术语和技术。在重组DNA、寡核芬酸合成及组织培养和转化上使用标准的技术(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术按照厂商说明书来进行，或者如本领域通常所执行的或如本文所述的来进行。前述技术和程序通常是按照本领域公知的常规方法来进行，和如本说明书当中所引述和论述的各种一般和更为具体的参考文献中所述的来进4亍。参见例^口SambrookWa/.A/o/ecw/arC7om'"g.'^Za6orato7Afowwa/(3rded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)),这篇文献通过引用结合到本文中。本文所述的在分析化学、合成有机化学及医学和药物化学方面所用的术语及这些方面的实^^室程序和技术，是本领域7>知和常用的那些术语及程序和技术。在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送及患者的治疗上使用标准的技术。以下术语应理解为具有以下含义，除非另有指明拮抗剂可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义、重组蛋白质、抗体或者它们的缀合物或融合蛋白。有关RNAi的综述参见MilhavetO,GaryDS，MattsonMP.(PharmacolRev.2003Dec;55(4):629-48.Review.),有关反义的综述参见OpalinskaJB，GewirtzAM.(SciSTKE.2003Oct28;2003(206):pe47.)。促血管生成素-2的拮抗剂可以是促血管生成素-2生物活性的任何拮抗剂，包括能拮抗促血管生成素-2和其它促血管生成素(包括促血管生成素-1、促血管生成素-3和/或促血管生成素-4)的生物活性的拮抗剂。促血管生成素-2拮抗剂可以结合单独的配体，或者当配体与其受体结合时结合该配体。VEGF-A的拮抗剂可以是VEdF-A生物活性的任何拮抗剂，其中该拮抗剂可以结合单独的配体，或者当配体与其受体结合时结合该配体。该拮抗剂可以防止VEGF-A介导的Fltl或KDR信号转导，从而抑制血管发生。这一抑制的作用机制可包括该拮抗剂与VEGF-A结合和抑制VEGF-A与其受体(Fltl或KDR)的结合。或者，该拮抗剂可在VEGF-A与受体(Fltl或KDR)締合时结合VEGF-A，从而防止VEGF-A介导的Fltl或KDR信号转导。或者，该拮抗剂可增强对其中的VEGF-A的清除，从而降低VEGF-A结合Fltl或KDR的有效浓度。组合物优选是包含一种或多种拮抗剂的药物组合物。组合物的拮抗剂可单独地、序贯地或同时地给予。疾病相关性血管发生可以是任何异常的、不需要的或病态的血管发生，例如肺瘤相关性血管发生。血管发生相关性疾病包括但不限于非实体瘤如白血病、多发性骨髓瘤、血液恶性肺瘤或淋巴瘤，以及实体瘤和它们的转移瘤如黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝脏)癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、胃癌、脑/CNS癌、头颈癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、皮肤癌、宫颈癌、肺癌、肌肉癌、神经元癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、子宫癌、阴户癌、子宫内膜癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胸膜/腹膜癌、唾腺癌和表皮样嚢肿。过量的血管生长还会促成多种非肿瘤性疾病。这些非肿瘤性血管发生相关性疾病包括动脉粥样硬化、血管瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管畸形(例如遗传性出血性毛细血管扩张症(HHT)或Osler-Weber综合征)、疣、化脓性肉芽肿、毛发过度生长、Kaposis肉瘤、瘢痕疙瘩、过^t性水肿、牛皮癣、功能不良性子宫出血、滤泡嚢肿、卵巢过度刺激、子宫内膜异位症、呼吸窘迫、腹水、透析患者中的腹膜硬化症、腹部手术所致的粘连形成、肥胖症、类风湿性关节炎、滑膜炎、骨髓炎、血管翳生长、骨赘、出血性关节、炎症和感染过程(例如肝炎、肺炎、血管球性肾炎)、哞喘、鼻息肉、肝再生、肺高压、早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、白质软化症、新生血管性青光眼、角膜移植新血管形成、沙眼、曱状腺炎、曱状腺肿大和淋巴增生性疾病。化合物指任何分子量小于2000道尔顿的小分子量化合物。术语"抗体"指由至少一个结合域组成的多肽或多肽群，该结合域是由多肽链的折叠形成，具有三维结合空间，该空间具有与抗原的抗原决定簇的特征互补的内部表面形状和电荷分布。抗体通常具有四聚形式，这种形式包含完全相同的两对多肽链，每对具有一个"轻链"和一个"重链"。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。抗体可以是单独的寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体、抗独特型抗体和能以可溶性或结合形式被标记的抗体以及它们的片段、变体或衍生物，或者这些抗体以及它们的片段、变体或衍生物与公知技术所提供的其它氨基酸序列的组合。抗体可来自任何物种。术语抗体还包括本发明抗体的结合片段，示例性的片段包括Fv、Fab、Fab，、单链抗体(svFC)、二聚可变区(双抗体)和二硫化物稳定的可变区(dsFv)。术语"中和性"当指抗体时涉及到抗体消除或显著降低靶标抗原的活性的能力。因此，"中和性"抗促血管生成素-2抗体能够消除或显著降低促血管生成素-2的活性。中和性促血管生成素-2抗体可例如通阻断促血管生成素-2与其受体Tie-2的结合来起作用。通过阻断这一结合，Tie-2介导的信号转导被显著地或完全地消除。理想地，抗促血管生成素-2中和性抗体能抑制血管发生。本文所用的术语"多肽，，作为通称是指多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。因此，天然蛋白质、片段和类似物是多肽上位概念(genus)中的下位概念(species)。本发明的优选多肽包含人重链免疫球蛋白分子和人k轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子(如k或X轻链免疫球蛋白分子)的组合(反之亦然)所形成的抗体分子，以及它们的片段和类似物。本发明的优选多肽还可单单包含人重链免疫球蛋白分子或其片段。本文所用术语"天然的"应用于物体时是指该物体能在自然界中找到的这一事实。例如，存在于可从自然界中的某个来源分离的生物(包括病毒)中的、未曾被人类在实验室中或以其它方式有意修饰的多肽或多核苷酸序列，是天然的。本文所提到的术语"多核苷酸"意指长度至少10个碱基的核苷酸聚合形式，该核苷酸是核糖核苦酸或脱氧核苦酸或这两种类型的核苷酸的修饰形式，或者意指RNA-DNA异源双链体。该术语包括单链和双链形式的DNA。本文所提到的术语"寡核苷酸"包括通过天然的和非天然的连键连接在一起的天然的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苦酸的子集，多核苷酸通常包含200个减基或更少的长度。优选地，寡核苷酸长10-60个碱基，最优选长12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。寡核苦酸通常是单链的，例如对于探针而言；不过寡核苷酸也可是双链的，例如供用于基因突变体构建的寡核苷酸而言。寡核苷酸可以是有义寡核香酸或反义寡核苦酸。如果两个氨基酸序列的序列之间有部分的或完全的同一性，则是"同源的"。例如85%同源性意指当将两个序列进行比对以找出最大匹配时，有85%的氨基酸是相同的。空隙(在进行匹配的两个序列的任何一个中)在使匹配最大化中是允许的；优选5或以下的空隙长度，更优选2或以下。或者且优选地，两个蛋白质序列(或者衍自它们的、长度至少约30个氨基酸的多肽序列)，如果用ALIGN程序以突变数据矩阵和6或更大的空隙罚分得出它们具有超过5(按标准偏差单位)的比对分数，则它们是同源的，这是同源这个术语在本文用到的意思。参见Dayhoff，M.O.,q/Trato'"^^e"ceaw/5Vracfwe，第101-110页(第5巻,NationalBiomedicalResearchFoundation(1972))和这一巻的增刊2第1-10页。两个序列或它们的部分如果在用ALIGN程序进行最佳比对时它们的氨基酸大于或等于50%相同，则是更优选的同源。应认识到，在两个直向同源(orthologous)序列当中可能会有同源性有差异的区域。例如，小鼠和人直向同源物的功能位点可比非功能区域具有更高程度的同源性。本文用到的20个常见氨基酸及它们的缩写遵循常规用法。参见/w扁wo/ogy-」jSy"/Z2e^(2ndEdition,E.S.GolubandD.R.Gren,Eds.,SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))，这篇文献通过引用结合到本文中。20个常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如ot-，a-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常见氨基酸也可以是本发明多肽的合适组分。非常见M酸的实例包括4-羟基脯氨酸、，羧基谷氨酸、s-N,N，N-三曱基赖氨酸、s-N-乙酰赖氨酸、O-磷丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-曱酰曱疏氨酸、3-曱基组氨酸、5-羟基赖氨酸、a-N-曱基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，按照标准的用法和常规，左手方向是氨基末端方向，右手方向是g末端方向。同样，除非另有指定，否则单链多核苷酸的左手末端是5，末端，双链多核苷酸序列的右手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'-3，添加的方向称为转录方向；DNA链上的具有与RNA相同的序列且在RNA转录物5'末端的上游的序列区域称为"上游区域"，DNA链上的具有与RNA相同的序列且在RNA转录物3'末端的下游的序列区域称为"下游区域"。本文所论述到的抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变异也认为被本发明所涵盖，条件是氨基酸序列的变异保持与本文所述抗体或免疫球蛋白分子有至少75%、更优选至少80%、90%、95%、更优选99%的序列同一性。具体的说，构思了保守氨基酸氨基酸置换。保守置换是在具有相关侧链的一族氨基酸当中发生的置换。遗传编码的氨基酸通常分成以下几族(1)酸性氨基酸=天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸和(4)不带电极性氨基酸=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的氨基酸族是丝氨酸和苏氨酸是脂族羟基族氨基酸；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺族氨基酸；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族氨基酸；而苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族氨基酸。例如，有理由认为，用异亮氨酸或缬氨酸单独置换亮氨酸、用谷氨酸单独置换天冬氨酸、用丝氨酸单独置换苏氨酸或者用结构相关的氨基酸进行类似的氨基酸置换，不会对所产生的分子的结合功能或特性有重大影响，尤其是如果该置换不涉及到构架位点当中的氨基酸的话。酸变化是否会导致产生功能肽，这可容易地通过测定该多肽^f汙生物的比活性来确定。测定法在本文中有详细描述。本领域普通技术人员可容易地制备出抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基末端和羧基末端出现在功能域的边界近旁。结构和功能域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私有的序列数据库进行比较来鉴定。优选地，使用计算机化比较方法来鉴定在其它已知结构和/或功能的蛋白质中出现的序列基序或被预测蛋白质构象域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是^^知的。Bowiee^/.5We"ce253:164(1991)。因此，前述的实例i正明，本领域技术人员能识别出可用来确定与本文所述的抗体一致的结构和功能域的序列基序和结构构象。优选的氨基酸置换是这样的置换(l)能减少对蛋白酶解的易感性，(2)能减少对氧化的易感性，(3)能改变形成蛋白质复合物所需的结合亲和力，(4)能改变结合亲和力和(4)能赋予或修饰这种类似物的其它理化或功能特性。类似物可包括天然肽序列之外的序列所成的各种突变蛋白质。例如，可在天然序列中(优选在多肽的位于形成分子间接触的结构域外部的部分中)作出单个或多个氨基酸置换(优选保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换不应实质上改变母体序列的结构特性(例如置换的氨基酸不应趋向于毁坏母体序列中出现的螺旋，或者破坏其它类型的表征母体序列的二级结构)。本领域ziH人的多肽二级和三级结构的实例描述于iVoto'm,S^cfw^sMo/ecw/ar/W"")/m(Creighton,Ed"W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));(C.Brandenand丄Tooze,eds,，GarlandPublishing,NewYork，N.Y.(1991))和Thorntonetal.A^wre354:105(1991)，这些文献通过引用结合到本文中。本文所用的术语"多肽片段"指具有氨基末端和/或羧基末端缺失、但剩余的氨基酸序列与从例如全长cDNA序列推导的天然序列中的对应位置相同的多肽。片段的长度通常是至少5、6、8或10个氨基酸，优选至少14个氨基酸，更优选至少20个氨基酸，往往至少50个氨基酸，甚至更优选至少70个氨基酸。本文所用的术语"类似物"指由至少25个氨基酸的这样的区段所组成的多肽，该区段与推导的M酸序列的一部分具有实质同一性，且具有至少以下特性之一(1)在合适的结合条件下能特异性结合促血管生成素-2，(2)能够阻断适当的促血管生成素-2结合或(3)能够抑制促血管生成素-2活性。通常，多肽类似物相比于天然序列包含有保守氨基酸置换(或添加或缺失)。类似物的长度通常是至少20个氨基酸，优选至少50个氨基酸或更长，且往往可与全长天然多肽一样长。肽类似物常常在制药工业中用作其特性类似于模板肽的特性的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为"肽模拟物"或"模拟肽"。Fauchere,/柚.D，版15:29(1986);VeberandFreidingerp.392(1985)和EvansWa/.JOzew.30:1229(1987)，这些文献通过引用结合到本文中。这种化合物往往是借助计算机化分子建模来开发的。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽^^莫拟物可用来产生等同的治疗或预防效果。通常，模拟肽在结构上类似于典范多肽(即具有生化特性或药理活性的多肽)如人抗体，但有一个或多个肽键任选被以下的键用本领域公知方法取代-CH2NH-、-CH2S-、—CH2-CH2—、—CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2-----CH(OH)CH2—和-CH2SO—。可采耳又将共有序列的一个或多个氨基酸用相同类型的D-氨基酸进行系统性置换(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)，来产生更加稳定的肽。另外，包含共有序列或实质上相同的共有序列变异的受约束肽(constrainedpeptide)可用本领域公知的方法产生(RizoandGieraschj朋.及ev.所oc/zem.61:387(1992),其通过引用结合到本文中)；例如，通过加入能够形成将肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基来产生。抗体的"结合片段"通过重组DNA技术产生，或者通过酶促或化学切割完整的抗体来产生。结合片段包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv和单链抗体。"双特异性"或"双功能性"抗体之外的抗体应理解为其每个结合位点都相同。当某过量的抗体减少与反受体结合的受体的量达至少约20%、40%、60%或80%、更通常超过约85%(如体外竟争性结合测定中所测量)时，则该抗体实质上抑制该受体与该反受体的黏合。术语"表位"包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面簇(grouping)如氨基酸或糖侧链组成，且可以但不总是具有特异性的三维结构特性以及特异性的电荷特性。某抗体当解离常数S1^M、优选S100nM、最优选S10nM时可称为特异性结合表位。本文所用的术语"物质(agent)"表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制备的提取物。对促血管生成素-2或促血管生成素-2多肽言的"活性的，，或"活性"是指该多肽的具有天然多肽的生物或免疫活性的部分。本文所用的"生物(的)"是指由天然多肽的活性产生的生物功能。例如，优选的促血管生成素-2生物活性包括促血管生成素-2诱导的血管发生。哺乳动物"指所有哺乳动物，但优选哺乳动物是人。用木瓜蛋白酶消化抗体会产生出两个相同的抗原结合片段，也称"Fab"片段和"Fc"片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用胃蛋白酶消化抗体会产生出F(ab，)2片段，其中抗体分子的两臂保持连接和包含两个抗原结合位点。F(ab，)2片段具有交联抗原的能力。本文所用的"Fv"是指抗体的保持了抗原识别位点和抗原结合位点的最小片段。本文所用的"Fab"是指抗体的包含轻链的恒定域和重链的CH1域的片段。术语"mAb"指单克隆抗体。本文所用的"脂质体"是指可用来将药物递送给哺乳动物的小嚢泡，该药物可包括本发明的促血管生成素-2多肽或抗这种促血管生成素-2多肽的抗体。本文所用的"标记"或"标记的"是指将可检测部分加到多肽上，例如放射标记、荧光标记、酶促标记、化学发光标记的或生物素酰化基团。放射性同位素或放射性核素可包括"H、14C、15N、35S、9QY、"Tc、mIn、125I、13II,焚光标记可包括罗丹明、镧系磷(lanthanidephosphors)或FITC,酶促标记可包括辣根过氧化物酶、P-半乳糖苷酶、萤光素酶、《威性磷酸酶。本文所用的术语"药剂或药物，，是指当适当给予患者时能够引起所需的治疗效果的化学化合物、組合或組合物。本文的其它化学术语是按照本领域常规用法使用，例见7TzeMcGraw-州7/D/cf/0"a7o/C7zemz'ca/!Tems(Parker,S.，Ed.,McGraw-Hill,SanFrancisco(1985))(通过引用结合到本文中)。术语"患者，，包括人和兽医对象。现通过以下非限制性实施例说明本发明，这些实施例只是出于说明性目的来提供，并不能被解释为限制本文的教导内容。本文的附图解释如下图la,显示在荷A431异种移植肺瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制剂(-4-(4-氟-2-曱基吲咪-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉》处理后的组合功效。图lb.显示在荷A431异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制剂(-4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉》组合处理后对宿主体重变化的影响。图2a,显示在荷Colo205异种移植胂瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制剂(-4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)会唑啉))处理后的组合功效。图2b.显示在荷Colo205异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制剂(-4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉))组合处理后对宿主体重变化的影响。图3a,显示在荷HT29异种移植胂瘤的小鼠中用mAb3.19.3和AZD2171处理后的组合功效。图3b.显示在荷HT29异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和AZD2171组合处理后对宿主体重变化的影响。图4a,显示在荷LoVo异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和Zactima处理后的组合功效。图4b.显示在荷LoVo异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和Zactima组合处理后对宿主体重变化的影响。图5a,显示在荷SW620结肠异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和mAbDC101处理后的组合功效。图5b.显示在荷SW620异种移植肿瘤的小鼠中用mAb3.19.3和mAbDC101組合处理后对宿主体重变化的影响。实施例1:抗体产生免疫将获自R&DSystems,Inc.(Minneapolis,MN目录号623-AM7CF)的重组人促血管生成素-2用作抗原。抗促血管生成素-2单克隆抗体是通过连续免疫XenoMouse⑧小鼠(XenoMouse品系XMG2和XMG4(3C画1品系)，Abgenix，Inc.Fremont,CA)来开发。XenoMouse动物对于所有注射都是通过足垫途径进行免疫。每次注射的总量为50^1/小鼠，每个足垫25pl。第一次注射是每只小鼠注射2.35吗重组人促血管生成素-2(rh促血管生成素-2,目录号623-AM/CF;批号BN023202A)，该重组人促血管生成素-2是在无热原的Dulbecco，sPBS(DPBS)中并与10吗CpG(15|nl的ImmunEasy小鼠佐剂，目录号303101;批号11553042;Qiagen)1:1v/v混合。后面的6次加强注射是每只小鼠注射2.35(igrh促血管生成素-2和10pgCpG,该rh促血管生成素-2是在无热原DPBS中并与25吗Adju-Phos(磷酸铝凝胶，目录号1452-250,批号8937，HCIBiosector)混合，最后的加强注射是注射在无热原DPBS中、但不加佐剂的2.35(igrh促血管生成素-2。XenoMouse小鼠是在第0、3、6、10、13、17、20和24天进行这个方案的免疫，在第29天进行融合。通过滴度选择收获用动物被免疫XenoMouse小鼠的血清中的抗促血管生成素-2抗体滴度是通过ELISA进行测定。筒单的说，将重组促血管生成素-2(1昭/ml)在抗原包被緩冲液(0.1M碳酸盐緩冲液，pH9.6NaHC038.4g/L)中在4°C下过夜包^皮到CostarLabcoatUniversalBindingPolystyrene96孔板(Corning，Acton,MA)上。第二天，4吏用Biotek洗板机，用洗涤緩冲液(0.05。/。Tween20,于lxPBS中)将各板洗涤三次。然后将各板用200inl/孔封闭緩沖液(0.5。/。BSA、0.1%Tween20、0.01%硫柳汞，于lxPBS中)封闭，在室温下温育l小时。封闭1小时后，使用Biotek洗板机，用洗涤緩冲液洗涂各板三次。将来自促血管生成素-2免疫的XenoMouse小鼠或首次用于实验的XenoMouse动物的血清在0.5%BSA/PBS緩冲液中重复两次滴定，该BSA是进行1:100初始稀释后再进行1:3稀释。最后一个孔当作空白。将这些板在室温下温育2小时，然后使用Biotek洗板机，用洗涤緩沖液洗涤各板三次。加入山羊抗人IgGFc特异性辣根过氧化物酶(HRP,Pierce,Rockford，IL)缀合抗体，最终浓度达1|ug/ml,在室温下温育1小时。然后使用Biotek洗板机，用洗涤緩冲液洗涤各板三次。洗涤后，加入TMB发色底物(BioFxBSTP-0100-01)保持10-20分钟或者直到阴性对照孔开始显示颜色，对各板进^f亍显色。然后加入终止溶液(650nMTMB终止试剂(BioFxBSTP-0100-01),每瓶用100mlH20复溶)终止ELISA。从650nrn处的光密度测定每只XenoMouse动物的比滴度。淋巴细胞的回收、B细胞分离、融合和杂交瘤的产生通过颈推脱位处死被免疫小鼠，将每组的流出淋巴结收获并合并。将淋巴样细胞通过在DMEM中研磨进行解离，以从组织释放出细胞，并将细胞悬浮于DMEM中。对细胞进行计数，将0.9mlDMEM/108个淋巴细胞加到细胞沉淀，轻柔地但完全地使细胞重悬。用100^1lCD90+磁珠/l()8个细胞，通过将细胞与磁珠在4。C下温育15分钟，对细胞进行标记。将含有多达108个阳性细胞(或总共多达2xl09个细胞)的磁性标记细胞悬浮液加到LS+柱上，用DMEM洗涤柱子。收集全部的洗脱液，作为CD卯阴性流分(大多数这些细胞被认为是B细胞)。融合是通过将上述的洗涤富集B细胞与购自ATCC目录号CRL1580的非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(Kearneyetal，丄Immunol.123，1979,1548-1550)以1:1比例混合来进行。将细胞混合物以800xg离心轻柔地进行沉淀。完全除去上清液后，用2-4mL的链霉蛋白酶溶液(Ca旧iochem,目录号53702,0.5mg/ml于PBS中)处理细胞不超过2分钟。然后加入3-5mlFBS终止酶活性，用电细胞融合溶液(electrocellflisionsolution)(ECFS，0,3M蔗糖，Sigma,目录号S7卯3，O.lmM乙酸镁，Sigma，目录号M2545,O.lmM乙酸钾，Sigma,目录号C4705)将悬浮液调至40ml总体积。离心后除去上清液，将细胞重悬于40mlECFS。重复这个洗涂步骤，将细胞再重悬于ECFS中至2xl(^个细胞/ml的浓度。用融合发生器(ECM2001型，Genetronic，Inc.,SanDiego，CA)进行电细胞融合。所用的融合室大小为2.0ml,使用以下仪器设置;f交准条件电压50V,时间50秒膜破裂在电压3000V,时间30insec融合后保持时间3秒。电细胞融合后，将细胞悬浮液在无菌条件下小心地从融合室取出，转移到装有等体积的补充有L-谷氨酰胺、pen/strep、OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐、牛胰岛素)(均自Sigma)和IL-6(BoehringerMannheim)的杂交瘤培养基(DMEM,JRHBiosciences),15%FBS(Hyclone)的无菌管中。将细胞在37。C下温育15-30分钟，然后以400xg(1000rpm)离心5分钟。将细胞轻柔地重悬在少量的杂交瘤选择培养基(补充有0.5xHA(Sigma目录号A9666)的杂交瘤培养基)中，才艮据每个96孔板最终总共接种5xl()S个B细胞和每孔200pl，用更多的杂交瘤选择培养基对体积进行适当调整。将细胞轻柔混合，用移液管转移到96孔板中，让其生长。在第7天或第10天，除去一半的培养基，给细胞再流加杂交瘤选择培养基。通过ELISA选择候选抗体培养14天后，对杂交瘤上清液进行促血管生成素-2特异性单克隆抗体的筛选。将ELISA板(Fisher,目录号12-565-136)包被上50j^l/孔的人促血管生成素-2(2jug/ml，于包被緩冲液(O.lM碳酸盐緩沖液，pHS>.6,NaHC038.4g/L)t),然后在々。C下温育过夜。温育后，用洗涤緩冲液(0.0S。/。Tween20,于PBS中)洗涤各板三次。加入200iul/孔的封闭緩冲液(0.5。/。BSA、0.1%Tween20、0.01%^克柳汞，于lxPBS中)，将各板在室温下温育1小时。温育后，用洗涤緩沖液洗涤各板三次。加入50pl/孔的杂交瘤上清液及阳性和阴性对照，将各板在室温下温育2小时。所用的阳性对照总是来自促血管生成素-2免疫的XenoMouse小鼠(XMG2促血管生成素-2组1,足垫(Q))N160-7)的血清，阴性对照是来自KLH免疫的XenoMouse小鼠(XMG2KLH组，足垫(fp)L627-6)的血清。温育后，用洗涤緩冲液洗涤各板三次。加入100^1/孔的检测抗体山羊抗huIgGFc-HRP(目录号No.H10507),将各板在室温下温育1小时。在第二次筛选中，将第一次筛选的阳性者分两组进行筛选，第一组进行hlgG检测，另一组进行hlgK轻链检测(山羊抗hlgK-HRP(SouthernBiotechnology,目录号2060-05),以证明IgG和IgK的完全人组成。温育后，用洗涤緩冲液洗涤各板三次。加入100nl/孔的TMB(BioFXLab.目录号TMSK-0100-01)，让各板显色约10分钟(直到阴性对照孔刚刚开始显示颜色)。然后加入50p1/孔的终止溶液(TMB终止溶液，(BioFXLab.目录号STPR-0100-01),将各板在ELISA读板器上于450nm处读数。有185个抗促血管生成素-2完全人IgGK抗体。促血管生成素-1的结合方面的反筛选，以鉴定能与促血管生成素-l交叉反应的那些抗体。将ELISA板(Fisher,目录号12-565-136)包被上50jul/孔的于包被緩冲液(0.1M碳酸盐緩冲液，pH9.6，NaHC038.4g/L)中的重组促血管生成素-l(2pg/ml,获自R&DSystems,目录号293-AN-025/CF)，然后在4。C下温育过夜。抗体标识号和SEOIDNO下表1给出了抗促血管生成素-2抗体的标识号及相应重链和轻链基因的SEQIDNO。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>对促血管生成素-2与Tie-2的结合的抑制如上所述，促血管生成素-2是通过结合Tie-2受体发挥其生物作用。抑制促血管生成素-2/Tie-2结合的单克隆抗体通过用改进的ELISA进行竟争性结合测定得到了鉴定。所用的单克隆抗体是从对促血管生成素-2有特异性的杂交瘤库(hybridomapool)的50ml无遗漏上清液(exhaustivesupernatant)微量纯化得到的产物。将96孔的NuncImmplates很用100pl的4吗/ml重组人Tie-2/Fc融合蛋白(R&DSystems,Inc.,目录号313-TI-100)在4。C下温育过夜进行包被。使用SkanWasher300station(SKATRON),用磷酸緩冲盐水(PBS)洗涤各板四次。将各孔用100pi的ABX封闭緩冲液(0.5%BSA、0.1%Tween、0.01%石充柳汞，于PBS中)封闭l小时。将100ng/ml的生物素酰化重组人促血管生成素-2(R&DSystems,Inc.目录号BT623)加到每个孔，同时加入或不加入100吗/ml的抗促血管生成素-2mAb。将各板在室温下温育两小时，然后洗去未结合的分子。然后将结合的生物素酰化促血管生成素-2通过与100nl/孔的链霉亲和素-HRP缀合物以1:200比例室温下温育半小时进行检测。洗涤两次后，通过HRP底物(R&DSystems,目录号DY998)检测结合的链霉亲和素。将各板温育30分钟，然后加入450终止溶液(100ili1/孔，BioFX,目录号BSTP-0100-01)终止反应。用SpectramaxPlus读数器测定450nm处的吸光度。使用比促血管生成素-2摩尔过量10倍的可溶性重组Tie-2/Fc融合蛋白作为阳性对照。在这个浓度下，Tie-2/Fc抑制促血管生成素-2与固定化Tie-2的结合达80。/。。以此为判断标准，175个结合mAb的促血管生成素-2中有74个显示抑制活性。每个杂交瘤用有限稀释方法按照标准程序进行克隆。从每个杂交瘤收集三个姊妹克隆。对于每个克隆，如上所述用ELISA对上清液进行与人促血管生成素-2的结合和与促血管生成素-1的反结合方面的测试，以确保每个抗体只对促血管生成素-2有特异性。测定无遗漏上清液中的IgG浓度，从每个杂交瘤的三个姊妹克隆当中选出产量最高的一个克隆进行IgG纯化。从每个上清液纯化得到0.5-1mg的IgG作进一步的表征。为定量mAb对促血管生成素-2与Tie-2的结合的抑制活性，用竟争性结合测定法测定最佳候选者(topcandidate)的纯化mAb的滴度。每个mAb浓度重复试验两次。用GraphpadPrismTM图形软件进行曲线拟合(非线性，S型曲线)，得出浓度-响应关系。由该软件计算出最大抑制(功效)和IC50(效应强度)。选出了IO个同时显示高功效和效应强度的单克隆抗体；这些单克隆抗体的功效和效应强度在表2中显示。表2.抗促血管生成素-l/促血管生成素-2单克隆抗体的功效和效应强度<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*功效以与mAb(30吗/ml)结合的促血管生成素-2和不与mAb结合的促血管生成素-2之比表示。然后通过测量mAb3.19.3与促血管生成素-1的亲和力研究该mAb与促血管生成素-l的交叉反应性。用Biacore分片斤法测定抗促血管生成素-l抗体亲和力通过测量单克隆抗体与促血管生成素-1的亲和力进一步研究该抗体与促血管生成素-1的交叉反应性。与如基于ELISA的反结合中所述的固定化促血管生成素-1不同的是，将单克隆抗体固定化到CM5Biacore芯片，注射促血管生成素-1溶液来测定开速率(on-rate)和关速率(off-mte)。试验了以下六个单克隆抗体3.3.2、3.31.2、5.16.3、5.86,1、5.88.3和3.19.3。中等分辨率筛选利用无标记表面等离子共振(SPR)或Biacore2000仪器，测量抗体对促血管生成素-1的亲和力。为此目的，用常规的胺偶联在CM5Biacore芯片上制备出高密度山羊oc-人抗体表面。对于展开实验，将纯化的mAbs(克隆3.3.2、3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3和3.19.3)在含有100吗/mlBSA的HBS-P运行緩沖液中稀释至大约2.5-3.5吗/ml。每个mAb的捕捉水平大约为150RU。每个捕捉循环后进行5分钟洗涤以使mAb基线稳定化。将在运行緩冲液中稀释到87.4nM的单一促血管生成素-1样品注射在所有捕捉表面上1分钟。发现促血管生成素-1结合mAb3.19.3。通过将mAb捕捉水平提高到完全超过500-600RU并注射380nM促血管生成素-l持续l分钟，重复进行这个实验。还是发现促血管生成素-1结合mAb3.19.3。实施例2:组合研究已评估了mAb3.19.3与小分子VEGF酪氨酸激酶抑制剂的组合的活性。mAb3.19.3与4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氣基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合在A431和Colo2Q5异种移植模型中的治疗功岁丈的测定用A431和Colo205细胞系分别在人皮肤表皮样癌异种移植模型中(研究A)和在结肠直肠癌模型中(研究B)评估单克隆抗体3,19.3与VTKI4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)全唑啉的组合的抗肿瘤活性。将A431和Colo205细胞按常规在烧瓶中培养，直到细胞达到亚铺满。使用免疫缺陷的6-8周龄雌性小鼠(Ncr/nu/nu)。收获细胞，悬浮于基质凝胶(Matrigel)中。将含有1-5x106个细胞的细胞悬浮液皮下注射到小鼠侧腹中。各小鼠随机分成不同的组，每组10-15只小鼠。当肿瘤体积达到200mn^时，将小鼠在每组中随机化，开始进行处理。每周两次持续2周腹膜内注射mAb3.19.31Omg/kg(盐水中)。每日经口处理4-(4-氟_2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉，剂量为1.5-6mg/kg(于含1°/。Tween80的水中)。每周测量每个肿瘤的大小两次。肿瘤的体积如下计算体积=长x(宽)2x0.5(cm3)。研究A:mAb3.19.3与4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氣基)-6-甲氣基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合在A43l人肿瘤异种移植中的治疗功效的测定A431组合异种移植功效研究的结果在图la中显示，图中证明该组合比单独的任一药剂产生显著大得多的活性。所实现的％胂瘤生长抑制如下3.19.3(10mg/kg2xwk)=46%;(pO.Ol)4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)*唑啉(3mg/kg/天)=69%;(pO.OOl)3.19.3+4-(4-氟-2-甲基口引哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合=89%抑制(组合对单一药剂的pO.OOl)。通过体重变化的测定，没有观察到该组合与单独的单一药剂处理相比较有另外的毒性(图lb)。这些结果证明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3与VTKI4-(4-氟-2-曱基P引哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合处理在临床前模型中导致功效改进而又没有增添毒性，为对这个组合作进一步的临床研究提供了基础。研究B:mAb3.19.3与4-(4-氟-2-甲基。引咮-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合在人Colo205结肠肿瘤异种移植中的治疗功效的测定Colo205组合异种移植功效研究的结果在图2a中显示，图中证明该组合比单独的任一药剂产生显箸大得多的活性。所实现的％抑制如下3.19.3(10mg/kg2xwk)=35%;(p<0.05)4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌咬子基丙氧基)喹唑啉(6mg/kg/天)-57。/。；(p<0.01)3.19.3+4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合-87。/。抑制(组合对单一药剂的p0.001)。通过体重变化进行测定，没有观察到该组合与单独的单一药剂处理相比较有另外的毒性(图2b)。这些结果证明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3与VTKI4-(4-氟-2-甲基吲咮-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的组合处理在临床前模型中导致功效改进而又没有增添毒性，为对这个组合作进一步的临床研究提供了基础。mAb3.19.3与AZD2171的组合在人HT29结肠肿瘤异种移植中的治疗功效的测定评估了mAb3.19.3与AZD2171的组合在人HT29异种移植中的功效。简单的i兌，将O.lml无血清RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)-1640培养基中的5xl()S个HT29肺瘤细胞皮下注射到60只无胸腺("w/m/基因型)小鼠的侧腹。当肿瘤达到200-400mn^的体积时(9_10天)，将小鼠随机分组(每组8只)，开始处理(第O天)。对照组(组l)每日口服(经口，p.o.)仅仅给予载体，连续28天(第0-27天)。组2处理是每日经口单独给予AZD2171,1.5mg/kg/给予，连续28天(第0-27天)。AZD2171制备成于l。/。聚山梨醇酯80(即聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯在去离子水中的1%(v/v)溶液)中的悬浮液。组3在第0、3、7、10、14、17、21和24天接受八次腹膜内(i.p)注射mAb3.19.3,10mg/kg/注射。组4每日经口给予AZD2171,1.5mg/kg/给予，连续28天(第0-27天)，同时在第O、3、7、10、14、17、21和24天八次腹膜内注射mAb3.19.3，10mg/kg/注射。AZD2171的给予体积为10.0ml/kg(即对于20g小鼠给予200iil)。mAb3.19.3的注射体积为10.0ml/kg(即对于20g小鼠注射200jal)。表3.剂量方案<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>通过双边游标卡尺测量评估肺瘤体积(mm3)，每周至少两次，长度取跨肿瘤的最长直径，宽度取相应的垂线，计算公式(tt/6)x(长度x宽度)xV(长度x宽度)。从处理的开始算起的生长抑制，通过比较对照组和处理组之间的胂瘤体积差异来评估。对于所有小鼠，研究在28天后停止。对于所有小鼠，将肿瘤切除，记录研究终止时的重量。表4.处理对肿瘤生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如图3a和表4所示，mAb3.19.3与AZD2171的组合比单独的3.19.3显示显著更高的肿瘤生长抑制作用(组合对单一药剂的pO.001:P值得自假设等方差的单尾两样品W企验)。通过体重变化进行测定，没有观察到该组合与单独的单一药剂处理相比较有另外的毒性(图3b)。这些结果证明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3与VEGF抑制剂AZD2171的组合处理在临床前模型中导致功效改进而又没有增添毒性，为对这个组合作进一步的临床研究提供了基础0mAb3.19.3与Zactima的组合在人LoVo结肠肿瘤异种移植中的治疗功效的测定在结肠直肠癌的LoVo异种移植模型中评估了单克隆抗体3.19.3的抗胂瘤活性。简单的说，将LoVo细胞按常规在烧瓶中培养，直到细胞达到亚铺满。使用了免疫缺陷的8周龄雄性NCr棵鼠。将含有3x106个细胞的细胞悬浮液皮下注射到小鼠右侧腹中，肿瘤体积达到200mn^后，将小鼠随机分组，开始处理。每周两次持续2周腹膜内注射mAb3.19.310mg/kg(盐水中)。每日经口处理Zactima,剂量为25-50mg/kg(于含l°/。Tween80的水中)。每周测量每个肿瘤的大小两次。肿瘤的体积如下计算体积=长x(宽)2x0.5(cm3)。如图4a所示，mAb3.19.3和ZactimaTM作为单一药剂显著地延迟了LoVo肺瘤的生长。但是，由以下肺瘤抑制数值证明，mAb3.19.3和ZD6474的組合比单独的单一药剂具有显著更大的效果3.19.3(10mg/kg2xwk)=48%;(pO.OOl)Zactima顶(50mg/kg/天)-46。/。；(pO.OOl)3.19.3+ZactimaW组合=83%抑制(组合对单一药剂的p〈0連)。通过体重变化进行测定，没有观察到该组合与单独的单一药剂处理相比较有另外的毒性(图4b)。这些结果证明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3与VEGF抑制剂Zactima的组合处理在临床前模型中导致功效改进而又没有增添毒性，为对这个组合作进一步的临床研究提供了基础。mAb3.19.3与mAbDC101的组合在人SW620结肠肿瘤异种移才A中的治疗功效的测定评估了mAb3.19.3与单克隆抗体DC101(抗VEGFR-2/KDR)的组合在SW620结肠直肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性。简单的说，将SW620细胞在常规组织培养条件下在烧瓶中培养，直到细胞达到亚铺满。使用了免疫缺陷的8-10周龄NCr棵鼠，将含有大约lx106个细胞的细胞悬浮液皮下注射到小鼠右侧腹中。肿瘤体积达到100miV后，将小鼠随机分组，开始处理。每周两次持续3周腹膜内注射mAb3.19.310mg/kg(盐水中)。还腹膜内注射mAbDC10115mg/kg(盐水中)，同样是每周两次持续3周。每周测量每个肿瘤的大小两次。肺瘤的体积如下计算体积=长x(宽)2x0.5(cm3)。如图5a所示，mAb3.19.3和DC101的组合显示出比单独的单一药剂显著更大的活性。以下肿瘤抑制数值也证明这一点3.19.3(10mg/kg2xwk)=480/0;(p<0.03)DC101(15mg/kg2xwk)=66%;(p<0.01)3.19.3+0(3101组合=93%抑制(组合对单一药剂的卩<0.001)。通过体重变化进行测定，没有观察到该组合与单独的单一药剂处理相比较有另外的毒性(图5b)。这些结果证明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3和抗VEGFR-2抗体DC101的组合处理在临床前模型中导致功效显著改进而又没有增添毒性。这个数据为对抗促血管生成素-2mAb3.19.3与其它抗血管生成抗体(包括阿瓦斯汀"^)的处理组合作进一步的临床研究提供了基础。mAb3.19.3与阿瓦斯汀的组合在人肺瘤异种移植中的治疗功效的测定单克隆抗体3.19.3与阿瓦斯汀頂的组合的抗肺瘤活性可在人肿瘤的异种移植模型中进行评估。可将A431、Colo205、LoVo或其它细胞按常规在烧瓶中培养，直到细胞达到亚铺满。可采用免疫缺陷的7-10周龄雄性或雌性NCR棵鼠进行模型开发。可将细胞收获，悬浮在基质凝胶中，然后皮下注射到每只小鼠中。然后可将小鼠随机分组，每组8-10只小鼠。阿瓦斯汀TM和mAb3.19.3可通过腹膜内或静脉内注射来给予。每周可测量每个肿瘤的大小两次。肿瘤的体积可如下计算体积=长x(宽fx0.5cm3，或者通过双边游标卡尺测量来计算，长度M紳瘤的最长直径，宽度取相应的垂线，计算公式(Ti/6)x(长度x宽度)x々(长度x宽度)。从处理的开始算起的生长抑制，可通过比较对照组和处理组之间的肺瘤体积差异来评估。mAb3.19.3与阿瓦斯汀，处理的组合预期产生出比单独的单一药剂显著更高的肿瘤生长抑制作用(组合对单一药剂的p<0.01:P值得自假设等方差的单尾两样品f检验)。mAb3.19.3与SU11248(Sutent)或BAY43-9006(Sorafinib)的组合在人肿瘤异种移植中的治疗功效的测定单克隆抗体3.19.3与Sutent或Somfinib的组合的抗肿瘤活性可在人肿瘤的异种移植模型中进行评估。可将HT29、A431、Colo205、LoVo或其它人胂瘤细胞按常规在烧瓶中培养，直到细胞达到亚铺满。可采用免疫缺陷的7-10周龄雄性或雌性NCR棵鼠进行模型开发。可将细胞收获，悬浮在基质凝胶中，然后皮下注射到每只小鼠中。然后可将小鼠随机分组，每组8-10只小鼠。Sutent和mAb3.19.3可按照下表通过腹膜内或静脉内注射来给予。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>每周可测量每个肿瘤的大小两次。胂瘤的体积可如下计算长x(宽/x0.5cm3，或者通过双边游标卡尺测量来计算，长度取跨肿瘤的最长直径，宽度取相应的垂线，计算公式(7c/6)x(长度x宽度)x々(长度x宽度)。从处理的开始算起的生长抑制，可通过比较对照组和处理组之间的肿瘤体积差异来评估。mAb3.19.3与Sutent或Sorafmib的组合预期产生出比单独的单一药剂显著更高的肿瘤生长抑制作用(组合对单一药剂的p<0.01:P值得自假设等方差(assumingequalvariance)的单尾两样品t-检验)。表1中所列单克隆抗体的可变区的核苷酸和多肽序列如下所示。抗促血管生成素-2单克隆抗体3.3.2重链可变区的核苷酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAAGGTATAGCAGTGGCTGGGCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC丁CAGCC(SEQIDNO:1)重链可变区的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSY窗SWVRQ(SEQIDNO:2)轻链可变区的核苦酸序列:GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGACTGTTAGCAGCGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCATTAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTCCTGTCAGCAGTATTATAACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA(SEQIDNO:3)轻链可变区的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQTVSSDLAWYQQKPGQAPRLLIYGASIRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYSCQQYYNWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:4)抗促血管生成素-2单克隆抗体3.19.3重链可变区的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCACTAACTATGGCATGCACTGGGGCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCACATGATGGAAATAATAAGTATTATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAATCGATTTTTGGAGTGGCCTCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCC(SEQIDNO:5)重链可变区的氨基酸序列QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTNYG固WGRQAPGKGLEWVAVISHDGNNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLA(SEQIDNO:6)轻链可变区的核苦酸序列GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTACCGGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTGTGGTGCATCCAGCTGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGTAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGTTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGA(SEQIDNO:7)轻链可变区的氨基酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSITGSYLAWYQQKPYYCQQYSSSPITFGQGTRLEIKR(SEQIDNO:8)抗血管生成素-2单克隆抗体3.31.2重链可变区的核苷酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGACAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCTGTGCGAGAGATATGGGCAGTGGCTGGTTTGACTACTGGGG重链可变区的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQRMNSLRAEDTAVFYCARDMGSGWFDYWGQGTLVTVSSA(SEQIDNO:10)轻链可变区的核香酸序列GAAGTAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGCTGTCAGCAGTATAATCACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA(SEQIDNO:轻链可变区的^J^^列EWMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPCCQQYNHWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:12)抗血管生成素-2单克隆抗体5.16.3重链可变区的核香*列CAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTTCTATATGTACTGGGTGCGACAGGCCCCGTAGTGGCACAAACCATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGATATAGCAACAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC(SEQIDNO:13)重链可变区的M酸序列:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGFYMYWVR(SEQIDNO:14)轻链可变区的核苷酸序列:GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCACCCGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGTGGACGTTCGGCCGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA(SEQIDNO:15)轻链可变区的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWWTFGRGTKVEIKR(SEQIDNO:16)抗血管生成素-2单克隆抗体5.28.1重链可变区的核苷酸序列GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAATCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATACCATGCACTGGGTCCGTCAAACTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTATTAGTTGGGATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAGGACACCGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATATAGATATAGCAGTGGCTGGTACAGGATTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:17)重链可变区的M酸序列EVQLVESGGIWQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQTNSLRTEDTALYYCAKDIDIAVAGTGFD鼎GQGTLVTVSSA(SEQIDNO:18)轻链可变区的核普酸序列GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGCAACCTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATTAATTAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATAATAACTGGCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGA(SEQIDNO:19)轻链可变区的氨基酸序列EI程TQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVTSNLAWYQQKPYCQQYNNWPFTFGPGTKVDIKR(SEQIDNO:20)抗血管生成素-2单克隆抗体5.78.3重链可变区的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGCTGGAACTACGCAGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:21)重链可变区的氨基餅列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRMELSRLRSDDTAVYYCARDRGWNYADYYYYGMDVWGQGTTVTVSSA(SEQIDNO:22)轻链可变区的核苷酸序列GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGTTCCAACAATCAGAACTTCTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAACTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAATAGATTAAACGA(SEQIDNO:23)轻链可变区的氨基酸序列EDVAVYYCHQYYSTPITFGQGTRLEIKR(SEQIDNO:24)抗血管生成素-2单克隆抗体5.86.1重链可变区的核苦酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACCATATGTACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGCTGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGTGAGAGATCAGGGTATAGCAGCAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGTGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:25)重链可变区的M酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMYWVR(SEQIDNO:26)轻链可变区的核苷酸序列:GACATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCTAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACACTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGA(SEQIDNO:27)轻链可变区的M酸序列DI腹TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISTYLNWYQQKPGYCQQSYTTPFTFGPGTKVDIKR(SEQIDNO:28)抗血管生成素-2单克隆抗体5.88.3重链可变区的核苦酸序列GAGGTGCAGATGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTAAGAAGCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGGAAGACGGAAGTGAGAAATACCATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCGAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATATGGAAGCATCAGCTGGCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:29)重链可变区的氨基酸序列MSSLRAEDTAVYYCARDMEASAGLFDYWGQGTLVTVSSA(SEQIDNO:30)轻链可变区的核苦酸序列GAAATAGTGATGACGCAGTCCCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCATCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATTACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA(SEQIDNO:31)轻链可变区的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERAILSCRASQSISSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:32)抗血管生成素-2单克隆抗体5.101.1重链可变区的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCTTACATGGAGCTGAGGAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAGTATACCAGTGTCTGGTCACTTTGACTACTGGGGGCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:33)重链可变区的氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVPA(SEQIDNO:34)轻链可变区的核苷酸序列:GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTATCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCATCAGTATAATAACTGGTGGACG35)轻链可变区的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLISNLAWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHQYNNWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:36)抗血管生成素-2单克隆抗体5.103.1重链可变区的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCCTCAGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATTTGTACTGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGTGCGAGAGATCAGGTCATAGCAGTAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGGCCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:37)重链可变区的M酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLYWVPQ(SEQIDNO:38)轻链可变区的核苦酸序列GAAACAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGTCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATCAGCAGCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAATTGGTGGACG39)轻链可变区的氨基酸序列ETVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSVISSLAWYQQKPGCQQYNNWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:40)本文引述的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等及其中引述的参考文献，通过引用整体结合到本文中。前面的书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。前面的说明内容和实施例详述了本发明的某些优选实施方案，描述了本发明人所构思的最佳方式。但是应认识到，前述内容无论在文本上可能显得如何详尽，本发明都还可用多种方式进行实施，本发明应按照所附权利要求或其任何等同权利要求进行解释。权利要求1.促血管生成素-2生物活性的拮抗剂和以下物质的生物活性的拮抗剂的组合i.VEGF-A，和/或ii.KDR，和/或iii.Flt1。2.权利要求1的组合,其中促血管生成素-2的拮抗剂是抗体。3.权利要求2的组合，其中促血管生成素-2的拮抗剂是完全人单克隆抗体。4.权利要求2或3中任一项的组合，其中所述抗体结合的表位与以下任何一个完全人单克隆抗体相同i.3.31.2，或ii.5.16.3,或iii.5.86.1，或iv.5.88.3,或V.3.3.2,或vi.5.103.1，或vii.5.101.1，或viii.3.19.3,或ix.5.28.1，或X.5.78.3。5.权利要求4的组合，其中所述抗体是选自以下任何一个的完全人单克隆抗体i.3.31.2，或ii.5.16.3,或iii.5.86.1，或iv.5.88.3,或v.3.3.2,或vi.5.103.1，或vii.5.101.1，或viii.3.19.3，或ix.5,28.1，或x,5.78.3。6.权利要求1的组合,其中KDR或FItl的生物活性的拮抗剂是抗体。7.权利要求1的组合,其中VEGF-A的生物活性的拮抗剂是抗体。8.权利要求7的组合,其中VEGF-A的生物活性的拮抗剂是阿瓦斯汀或DC101。9.权利要求1的组合，其中KDR或FItl的生物活性的拮抗剂是化合物。10.权利要求9的组合,其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗剂是酪氨酸激酶抑制剂。11.权利要求10的组合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗剂选自ZactimaTM、AZD2171、SU11248、SU148B、Vatalanib、BAY43隱9006、XL-647、XL-999、AG曙013736、AMG706、BIBF1120、TS函、GW786034、AEE788、CP-547632、KRN951、CHIR258、CEP-7055、OSI-930、ABT-869、E7080、ZK-304709、BAY57-9352、L-21649、BMS582664、XL-880、XL-184或XL-820。12.权利要求11的组合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗剂选自ZactimaTM、AZD2171、SU11248或BAY43-卯06。13.权利要求11的组合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗剂是Zactima1^。14.权利要求11的组合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗剂是AZD2171。15.包含权利要求1-14中任一项的组合的药物组合物。16.—种拮抗促血管生成素-2和以下任何.-种物质的生物活性的方法i.VEGF誦A,和/或ii.KDR，和/或iii.Fltl，所述方法包括给予权利要求1-15中任一项的组合。17.—种治疗哺乳动物中的疾病相关性血管发生的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-15中任一项的组合。18.—种治疗哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1-15中任一项的组合。全文摘要本发明涉及具有抗血管生成活性并因此可用于治疗与动物或人体中的血管发生有关的疾病状态的方法的活性物质。更具体地说，本发明涉及促血管生成素-2生物活性的拮抗剂和VEGF-A和/或KDR和/或FIt1生物活性的拮抗剂的组合，以及这种拮抗剂的用途。文档编号A61P35/00GK101370519SQ200680052740公开日2009年2月18日申请日期2006年12月12日优先权日2005年12月15日发明者D·C·布莱基,J·L·布朗,S·C·埃梅里申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司