针对人血管生成素2的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及针对人血管生成素2的抗体(抗-ANG-2抗体)，用于制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。
【专利说明】针对人血管生成素2的抗体
[0001]本申请是申请日为2009年12月14日、发明名称为“针对人血管生成素2的抗体”的中国专利申请N0.201210237207.1的分案申请。
[0002]本发明涉及针对人血管生成素2的抗体(抗-ANG-2抗体)，用于制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。
[0003]发明背景
[0004]血管发生参与各种病症的发病机理，所述疾病包括实体瘤、眼内新血管综合征如增殖性视网膜病或年龄相关的黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman，J.，等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)267(1992) 10931-10934;Klagsbrun, M.，等,Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53 (1991) 217-239;和 Garner, A., Vascular diseases (血管疾病)，在:Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach (眼科疾病，即动力学途径的病理学)，Garner, A.，和 Klintworth, G.K，(编辑)第二版 Marcel Dekker,纽约，(1994)，第1625-1710页)。在实体瘤的情形中，与正常细胞相比较，新血管生成允许所述肿瘤细胞获得生长优势和增殖自主性。因此，在乳腺癌以及在一些其它肿瘤中，已经观察到在肿瘤切片中的微脉管密度与患者存活之间的相关性(Weidner，N.,等，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)324 (1991) 1-8; Horak, E.R.,等，Lancet340 (1992) 1120-1124;和 Macchiarini, P.，等，Lancet340 (1992) 145-146)。
[0005]ANG-2 和抗-ANG-2 抗体
[0006]人血管生成素-2(ANG-2)(替代地缩写为 ANGPT2 或 ANG2) (SEQ IDNo: 107)在 Maisonpierre,P.C.，等，Science (科学)277 (1997) 55-60 和 Cheung, A.H.，等，Genomics48 (1998) 389-91 中描述。发现血管生成素-1 和 _2 (ANG-1 (SEQ ID No: 108)和ANG-2 (SEQ ID No: 107))是Ties的配体，Ties是选择性在血管内皮内表达的酪氨酸激酶家族。Yancopoulos, G.D.,等，Nature (自然)407 (2000) 242-48。现在有四种明确的血管生成素家族的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因座的非常不同的对应物。Kim, 1.，等，FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, 1.,等，JBiol Chem (生物化学杂志)274(1999) 26523-28。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂而鉴定(对于 ANG-1，见:Davies，S.，等，Cell (细胞)，87 (1996) 1161-1169;对于 ANG-2，见:Maisonpierre, P.C.,等，Science (科学)277 (1997) 55-60)。所有已知血管生成素基本上都结合Tie2，且Ang-1和-2均以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2。Maisonpierre, P.C.，等，Science (科学)277 (1997) 55-60。显示 Ang-1 支持 EC 存活并促进内皮完整性，Davis, S.，等，Cell (细胞)87(1996) 1161-1169;Kwak, H.J.,等，FEBSLett448(1999)249-53;Suri, C.,等，Science (科学)282(1998) 468-71;Thurston, G.，等，Science(科学)286(1999)2511-14;Thurston, G.,等，Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反 效应，在存活因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子不存在时促进血管去稳定和退化。Maisonpierre, P.C.，等，Science (科学)277 (1997) 55-60。然而，ANG-2功能的许多研究已经表明更复杂的情况。ANG-2可能是血管重塑的复杂调节因子，在血管萌芽和血管退化中均发挥作用。支持ANG-2的这种作用，表达分析揭示在成人血管生成萌芽环境中ANG-2和VEGF—起迅速诱导，而在血管退化环境中在不存在VEGF 时 ANG-2 被诱导。Holash, J.，等，Science (科学)284(1999) 1994-98;Holash, J.，等，0ncogenel8 (1999) 5356-62。与背景-依赖性作用相一致，ANG-2特异性结合相同的内皮-特异性受体Tie-2，Tie-2被Ang-1激活，但一旦激活具有背景-依赖性效应。Maisonpierre, P.C.,等，Science (科学)277 (1997) 55-60。
[0007]角膜血管生成测定已显示ANG-1和ANG-2均具有相似效应，与VEGF协同作用促进新血管的生长。Asahara, T.,等，Circ.Res.，83 (1998) 233-40。体外高浓度 ANG-2 也可促进血管生成，这种观察提出了这样的可能性，即存在剂量-依赖性内皮反应。Kim，1.，等，Oncogene (原癌基因)19(2000) 4549-52。高浓度ANG-2作为内皮细胞在血清饥饿凋亡中的凋亡存活因子起作用，这种凋亡经P1-3激酶和Akt途径激活Tie2。Kim，1.，等，Oncogene (原癌基因)19 (2000) 4549-52。
[0008]其它体外实验表明在持续暴露过程中，ANG-2的效应可从Tie2的拮抗剂进行性转变为其激活剂，且在更晚时间点，ANG-2可直接促进脉管的管形成和新血管稳定。Teichert-Kuliszewska, K.，等，Cardiovasc.Res.(心血管研究)49 (2001) 659-70。另外,如果EC在纤维蛋白胶上培养，也观察到ANG-2激活Tie2，可能暗示ANG-2的作用依赖于EC分化状态。Teichert-Kuliszewska; K.,等,Cardiovasc.Res.(心血管研究)49 (2001) 659-70。在三维胶原蛋白胶中培养的微血管EC中，ANG-2也能诱导Tie2激活并促进毛细血管样结构的形成。Mochizuki，Y.，等，J.Cell.Sc1.(细胞科学杂志)115(2002) 175-83。使用3-D球状共培养作为血管成熟的体外模型证明EC和间充质细胞的直接接触消除了对VEGF的反应性，而 VEGF 和 ANG-2 的存在诱导萌芽。Korff, T.,等，Faseb J.15 (2001) 447-57。Etoh, T.等证明组成型表达Tie2的EC中，在VEGF存在下ANG-2强烈地上调MMP-1，_9和U-PA的表达。Etoh, T.,等，Cancer Res.(癌症研究)61 (2001) 2145-53。通过体内瞳孔膜模型， Lobov, 1.B.，等显示存在内源VEGF时ANG-2促进毛细管直径的迅速增加、促进基底层重塑、内皮细胞的增殖和迁移，并刺激新血管的萌芽。Lobov，1.B.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)99 (2002) 11205-10。相反，没有内源VEGF时ANG-2促进内皮细胞死亡和血管退化。Lobov, 1.B.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美国国家科学院学报)99(2002) 11205-10。相似地，通过体内肿瘤模型，Vajkoczy，P.，等证明多细胞凝集物通过血管原性萌芽起始脉管生长，该萌芽经过宿主和肿瘤内皮同时表达VEGFR-2和ANG-2发生。Vajkoczy, P.,等，J.Clin.1nvest.(临床研究杂志)109 (2002) 777-85。这种模型说明生长中的肿瘤的建立的微血管具有连续重塑的特征,这推测由VEGF和ANG-2的表达介导。Vajkoczy, M.A.,等，J Clin.1nvest.(临床研究杂志)09 (2002) 777-85。
[0009]Tie-2和血管生成素_1敲除小鼠的研究显示相似的表型并表明血管生成素_1刺激的Tie-2磷酸化介导了发育中血管的重塑和稳定，促进血管在血管生成过程中的成熟并维持内皮细胞-支持细胞粘附(Dumont, D.J.，等，Genes&Development (基因和发育),8(1994) 1897-1909;Sato, T.N., Nature(自然),376(1995)70-74;(Thurston, G.,等，Nature Medicine (自然医学)6 (2000) 460-463)。认为血管生成素-1的作用在成人中是保守的，在成人中其广泛且组成型表达(Hanahan，D.，Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D.,等，Exp Neurology, 159 (1999) 391-400)。相比之下，血管生成素 _2 的表达主要局限于血管重塑位点，人们认为在那里血管生成素-2阻断血管生成素-1的组成型稳定或成熟功能，允许血管恢复且保持在可塑状态，该状态对萌芽信号更有反应性(Hanahan, D., 1997;Holash,J.,等,0rzcogerzel8(1999)5356-62;Maisonpierre,P.C.，1997)。在病理性血管生成中血管生成素-2表达的研究已经发现许多肿瘤类型显示血管中血管生成素-2 的表达(Maisonpierre, P.C.,等，Science (科学)277 (1997) 55-60)。功能研究表明血管生成素-2参与肿瘤血管生成并且血管生成素-2过量表达与小鼠异种移植模型中增加的肿瘤生长相关(Ahmad, S.A.，等，Cancer Res.(癌症研究)，61 (2001) 1255-1259)。其它研究已经将血管生成素_2过量表达与肿瘤血管过度形成相关联(Etoh, T.,等，Cancer Res.(癌症研究)61 (2001) 2145-53; Tanaka, F.，等，CancerRes.(癌症研究)62 (2002) 7124-29)。
[0010]近年来已经提出将血管生成素-1，血管生成素-2和/或Tie-2作为可能的抗-癌治疗靶标。例如US6, 166，185，US5, 650，490和US5, 814, 464中每个公开了抗_Tie_2配体和受体抗体。据报道使用可溶性Tie-2的研究降低了啮齿动物中肿瘤的数目和大小(Lin, P, 1997; Lin, P., 1998) ? Siemester, G.,等(1999)产生了表达 Tie_2 胞外域的人黑色素瘤细胞系，将其注射到裸鼠中并报道了可溶性Tie-2导致肿瘤生长和肿瘤血管生成的显著抑制。考虑到血管生成素-1和血管生成素-2均结合Tie-2，从这些研究中尚不清楚血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否将是抗-癌治疗的有吸引力的靶标。然而，认为有效抗-血管生成素-2治疗在治疗疾病(如癌症)中有益，这些疾病中进展依赖于异常血管生成,其中阻断该过程可预防疾病的进展(Folkman, J.，Nature Medicine (自然医学)I, (1995)27-31)。
[0011]此外，一些研究组已经报道结合血管生成素-2的抗体和肽的应用。见例如 US6,166,185 和 US2003/1 0124129, W003/030833, W02006/068953, W003/057134 或US2006/0122370。
[0012]血管生成素-2病灶性(focal)表达效应的研究已经显示拮抗血管生成素-1/Tie-2信号使紧密的脉管结构松弛由此将EC暴露于来自血管生成诱导剂(如VEGF)的激活信号(Hanahan，1997)。这种血管生成素-1的抑制导致的促_血管生成效应表明抗_血管生成素-1治疗将不是有效的抗-癌治疗。
[0013]发育过程中ANG-2在发生血管重塑的位点表达。Maisonpierre, P.C.，等，Science (科学)277 (1997) 55-60。在成人个体中，ANG-2表达限制在血管重塑位点以及高度血管化的肿瘤中，包括神经胶质瘤，Osada, H.，等，Int.J.0ncol.18 (2001) 305-09 ;Koga, K.,等,Cancer Res.(癌症研究)61 (2001) 6248-54，肝细胞癌，Tanaka, S.，等，J.Clin.1nvest.(临床研究杂志)103(1999)341-45，胃癌，Etoh, T.,等，Cancer Res?(癌症研究)61 (2001) 2145-53; Lee, J.H.，等，，Int.J.0ncol.18(2001)355-61，甲状腺瘤，Bunone, G.,等,Am JPathol 155 (1999) 1967-76，非 _ 小细胞肺癌，Wong, M.P.,等，Lung Cancer (肺癌)29 (2000) 11-22 和结肠癌,Ahmad, S.A.,等，Cancer (癌症)92 (2001) 1138-43,和前列腺癌 Wurmbach, J.H.，等，Anti CancerRes (抗癌研究).20 (2000) 5217-20。发现一些肿瘤细胞表达ANG-2。例如，Tanaka, S.，等，J.Clin.1nvest.(临床研究杂志)103(1999)341-45在人肝细胞癌(HCC)的12个样品的10个中检测到ANG-2mRNA。Ellis研究组报道ANG-2在肿瘤上皮中广泛表达。Ahmad, S.A.，等，Cancer (癌症)92(2001) 1138-43。其他研究者报道了相似的发现。Chen, L.,等，J.Tongji Med.Univ.21 (2001) 228-30，235 (2001)。通过在存档的人乳腺癌样品中检测 ANG-2mRNA 水平，Sfilogoi, C.，等，Int.J.Cancer (国际癌症杂志)103(2003)466-74 报道ANG-2mRNA与辅助淋巴结侵袭、短的无疾病时间和差的总体生存显著相关。Tanaka，F.，等，Cancer Res.(癌症研究)62 (2002) 7124-29综述了分别具有病理1-期至IIIA期非小细胞肺癌(NSCLC)的总共236个患者。使用免疫组织化学，他们发现16.9%的NSCLC患者是ANG-2阳性的。ANG-2阳性肿瘤的微血管密度比ANG-2阴性的微血管密度显著更高。ANG-2的这种血管生成效应仅在VEGF表达高的时候可见。此外，ANG-2的阳性表达是预测较差手术后生存的显著因子。Tanaka, F.,等，Cancer Res.(癌症研究)62 (2002) 7124-29。然而，他们没有发现Ang-1表达和微血管密度之间有显著相关性。Tanaka, F.，等，Cancer Res.(癌症研究)62 (2002) 7124-29。这些结果表明ANG-2是数种类型癌症预后不良患者的指示剂。
[0014]最近，使用ANG-2敲除小鼠模型，Yancopoulos研究组报道出生后血管生成中需要ANG-2。Gale, N.W.,等，Dev.Cell3 (2002) 411-23。他们显示眼中玻璃样脉管系统的发育编程性退化在ANG-2敲除小鼠中没有发生，并且它们的视网膜血管没有从视网膜中央动脉萌发出来。Gale, N.W.，等，Dev.Cell (细胞)3 (2002)411-23。他们还发现ANG-2缺失导致淋巴脉管系统的模式形成和功能的严重缺陷。Gale, N.W.，等，Dev.Cell (细胞)3 (2002) 411_23。通过Ang-1的遗传拯救纠正了淋巴缺陷，但没有纠正血管生成缺陷。Gale，N.W.，等，Dev.Cell (细胞)3(2002)411-23。
[0015]Peters及其同事报道了可溶性Tie2当作为重组蛋白或在病毒表达载体中递送时，抑制小鼠模型中鼠乳腺癌(mammary carcinoma)和黑素瘤的体内生长。Lin, P.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)95 (1998) 8829-34; Lin, P.,等，J.Clin.1nvest.(临床研究杂志)100(1997)2072-78。如此处理的肿瘤组织中血管密度大大降低。此外，可溶性Tie2阻 断肿瘤细胞条件培养基刺激的大鼠角膜中的血管生成。Lin, P.，等，J.Clin.1nvest.(临床研究杂志)100 (1997) 2072-78。另外，Isner及其小组证明向VEGF添加ANG-2比单独的VEGF显著促进更长且更多周围新血管生成。Asahara, T.，等，Circ.Res.,83(1998)233-40。过量可溶性Tie2受体妨碍VEGF-诱导的新血管生成经ANG-2的调节。Asahara, T.,等，Circ.Res.，83 (1998) 233-40。Siemeister, G.,等，Cancer Res.(癌症研究)59 (1999) 3185-91通过裸鼠异种移植显示在异种移植物中过量表达Flt-1或Tie2的胞外配体-结合结构域导致途径的显著抑制不能被另一种补偿，表明应当认为VEGF受体途径和Tie2途径是两种独立的体内血管生成过程中必需的介质。Siemeister, G.，等，Cancer Res?(癌症研究)59 (1999) 3185-91。这一点被 White, R.R.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美国国家科学院学报)100(2003)5028-33更近的公开所证明。在他们的研究中，证明了特异性结合且抑制ANG-2的核酸酶-抗性RNA适体(aptamer)显著抑制大鼠角膜微袋(micropocket)血管生成模型中bFGF诱导的新血管形成。
[0016]发明概沭
[0017]本发明包括特异性结合人血管生成素-2 (ANG-2)的抗体，其特征在于包含SEQ IDNO:1, SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:41 或 SEQ IDNO:49的⑶R3区作为重链可变结构域⑶R3区。
[0018]优选地，所述抗体特征在于:[0019]a)所述重链可变结构域包含 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID N0:41 或 SEQ ID NO:49 的 CDR3 区，SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 10，SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:42或SEQ ID 勵:50的0?2区，和 SEQ ID NO:3，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:35，SEQ IDNO:43 或 SEQ ID NO:51 的 CDRl 区，和[0020]b)所述轻链可变结构域包含 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:28，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:44 或 SEQ ID NO:52 的 CDR3 区，SEQ ID NO:5，SEQ IDNO: 13，SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37, SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:53 的CDR2区，和 SEQ ID NO:6，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:38，SEQ IDN0:46 或 SEQ ID N0:54 的 CDRl 区。
[0021 ] 优选地，所述抗体特征在于包含:
[0022]a)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:39，SEQID N0:47或SEQ ID NO:55的重链可变结构域；和
[0023]b)SEQ ID NO:8，SEQ ID NO: 16，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:40，SEQID N0:48或SEQ ID NO:56的轻链可变结构域。
[0024]优选地，所述抗体特征在于所述抗体不特异性结合于血管生成素I (ANG-1)。
[0025]本发明的另一个实施方案是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。
[0026]本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。
[0027]本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于预防转移的应用。
[0028]本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于治疗癌症的应用。
[0029]本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于治疗血管疾病的应用。
[0030]本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于治疗视网膜病的应用。
[0031]本发明的另一个实施方案是编码根据本发明所述的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸。
[0032]本发明还提供含有根据本发明所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，和用于重组产生所述抗体的含有这种载体的宿主细胞。
[0033]本发明还包括原核或者真核宿主细胞，其包含根据本发明的载体。
[0034]本发明还包括用于产生根据本发明所述的重组人或人源化的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明所述的核酸，并且从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。本发明还包括可通过所述重组方法获得的抗体。
[0035]根据本发明所述的抗体特别用于预防继发性肿瘤/转移或用于治疗血管疾病如视网膜病。
[0036]发明详沭
[0037]本发明包括特异性结合于人血管生成素-2(ANG_2)的抗体，其特征在于包含SEQID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:25, SEQID NO:33, SEQ ID N0:41 或SEQ IDNO:49的⑶R3区作为重链可变结构域⑶R3区。
[0038]在本发明的一个实施方案中，所述抗体特征在于
[0039]a)所述重链可变结构域包含 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO:25, SEQ ID NO:33, SEQ ID N0:41 或 SEQ ID NO:49 的 CDR3 区，SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 10，SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:42或SEQ ID 恥:50的0?2区，和 SEQ ID NO:3，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:35, SEQ IDNO:43 或 SEQ ID NO:51 的 CDRl 区，和
[0040] b)所述轻链可变结构域包含 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:28，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:44 或 SEQ ID NO:52 的 CDR3 区，SEQ ID NO:5，SEQ IDNO: 13，SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:37, SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:53 的CDR2区，和 SEQ ID NO:6，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:38，SEQ IDNO:46 或 SEQ ID NO:54 的 CDRl 区。
[0041 ] 优选地，所述抗体特征在于包含
[0042]a)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:39，SEQID N0:47或SEQ ID NO:55的重链可变结构域；和
[0043]b)SEQ ID NO:8，SEQ ID NO: 16，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:40，SEQID N0:48或SEQ ID NO:56的轻链可变结构域。
[0044]本发明的另一个实施方案是特异性结合于人ANG-2的抗体，特征在于所述抗体不特异性结合于人血管生成素I (ANG-1)。特异性结合于人ANG-2，而不特异性结合人ANG-1的典型抗体例如是 Ang2s_R3_LC03，Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07,或这样的抗体，其结合于与 Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10 相同的表位，优选地结合于与Ang2i_LC06相同的表位。因此，在本发明的一个实施方案中，特异性结合于人血管生成素-2 (ANG-2 )，但不特异性结合于人ANG-1的抗体结合于与Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10 相同的表位，优选地结合于与Ang2i_LC06相同的表位。特异性结合于ANG-2，但是不特异性结合于ANG-1的这些抗体与ANG-2和ANG-1特异性抗体相比，可以具有改善的性质如功效，较少的毒性，药物代谢动力学性质。
[0045]因此，在本发明的一个实施方案中，特异性结合于人血管生成素-2(ANG_2)但是不特异性结合于人ANG-1的抗体特征在于
[0046]a)所述重链可变结构域包含 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:25, SEQ IDNO:33或SEQ ID NO:49 的CDR3 区，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 34或 SEQ ID N0:50 的 CDR2 区，和 SEQ ID NO:3，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:35或 SEQ ID NO:51 的 CDRl 区，和
[0047]b)所述轻链可变结构域包含 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO:28, SEQ IDN0:36 或 SEQ ID NO:52 的 CDR3 区，SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:29, SEQ IDNO:37 或 SEQ ID NO:53 的 CDR2 区，和 SEQ ID NO:6，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO:30，SEQ IDNO:38 或 SEQ ID NO:54 的 CDRl 区。
[0048]优选地，特异性结合于人血管生成素-2 (ANG-2)但是不特异性结合于人ANG-1的所述抗体特征在于包含:
[0049]a)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:39 或 SEQ ID NO:55 的
重链可变结构域；和
[0050]b)SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:40 或 SEQ ID NO:56 的
轻链可变结构域。[0051]在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于:
[0052]a)所述重链可变结构域包含SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:9的CDR3区，SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 10 的 CDR2 区，和 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO: 11 的 CDRl 区，和
[0053]b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 12的CDR3区，SEQ IDN0:5 或 SEQ ID NO: 13 的 CDR2 区，和 SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO: 14 的 CDRl 区。
[0054]在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于包含
[0055]a) SEQ ID N0:7或SEQ ID NO: 15的重链可变结构域；和
[0056]b)SEQ ID N0:8 或 SEQ ID NO: 16 的轻链可变结构域。
[0057]在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于:
[0058]a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1的CDR3区，SEQ ID NO: 2的CDR2区，和 SEQ ID NO:3 的 CDRl 区，和
[0059]b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的CDR3区，SEQ ID NO:5的CDR2区，和 SEQ ID NO:6 的 CDRl 区。
[0060]在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于包含:[0061]a) SEQ ID NO: 7的重链可变结构域；和
[0062]b)SEQ ID N0:8的轻链可变结构域。
[0063]在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于:
[0064]a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO: 17的CDR3区，SEQ ID NO: 18的CDR2区，和 SEQ ID NO: 19 的 CDRl 区，和
[0065]b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO: 20的CDR3区，SEQ ID NO: 21的CDR2区，和 SEQ ID NO:22 的 CDRl 区。
[0066]在一个实施方案中,根据本发明所述的抗体特征在于包含:
[0067]a) SEQ ID NO: 23的重链可变结构域；和
[0068]b)SEQ ID NO:24的轻链可变结构域。
[0069]优选地，根据本发明所述的抗体特征在于所述抗体是人IgGl亚类或人IgG4亚类的。
[0070]术语“抗体”涵盖抗体结构的多种形式，包括但不限于完整的抗体和抗体片段。根据本发明所述的抗体优选地是人源化的抗体、嵌合抗体或其它遗传改造的抗体，只要根据本发明的特征性质仍旧保留。
[0071]“抗体片段”包含完整长度抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括形成自抗体片段的双抗体、单链抗体分子(scFv或scFab)和多特异性抗体(例如双特异性)。ScFv抗体在例如Houston, J.S.，Methods in Enzymol (酶学方法).203(1991)46-88)中进行描述。此外，抗体片段包含这样的单链多肽，其具有Vh结构域的特征，
[0072]即能够与'结构域一起组装以形成功能性抗原结合位点并由此提供性质，或具有结合于ANG-2的\结构域的特征，即能够与Vh结构域一起组装形成功能性抗原结合位点并由此提供性质。可以使用例如下列来稳定ScFvs:a) 二硫化物稳定(见例如在W094/029350, Rajagopal, V.,等，Prot.Engin.(1997) 1453-59;Kobayashi, H.,等，NuclearMedicine & Biology (核医学和生物学)，卷 25，(1998)387-393;或 Schmidt, M.,等，Oncogene (原癌基因)(1999) 18 1711-1721中)或b)稳定的构架(例如通过特异性突变，见例如 W02007/109254,具体的稳定构架，见例如 US7, 258，985，Furrer, F.，等，Invest.0phthalmol.Vis.Sc1.50 (2009), % 771 - 778 页或 Ottiger, M.，等，Invest.0phthalmol.Vis.Sc1.50 (2009)，第 779 - 786 页。
[0073]术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。
[0074]术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fe受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sc1.USA)81(1984)6851-6855;US5, 202，238 和 5，204，244。
[0075]术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(OTR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在优选实施方案中，将鼠⑶R移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger，M.S.，等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fe受体(FcR)结合。
[0076]用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk, M.A.,和van de ffinkel, J.G.,当前化学生物学观点(Curr.0pin.Chem.Biol).5 (2001) 368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits，A.，等?，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)90 (1993) 2551-2555; Jakobovits,A.,等?，Nature (自然)362 (1993) 255-258; Brueggemann, M.，等?，Year Tmmuno1.(免疫学年度)7(1993) 33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter, G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227 (1992) 381-388; Marks, J.D.,等?，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole, S.P.C.,等和 Boerner,等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole, S.P.C.，等?，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Liss A.R., (1985) 77-96;和 Boerner, P.，等?，J.1mmunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fe部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突变。)[0077]用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NSO或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。 [0078]“可变结构域”(轻链(')的可变结构域，重链(Vh)的可变结构域)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补决定区，⑶Rs)相连接。构架区采用(6-折叠构象且⑶R可以形成连接折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR—起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。
[0079]用于本文时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域并且限定抗体的性质。按照Kabat，E.A.，等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service,National Institutes of Health),Bethesda,MD.(1991))的标准定义确定⑶R和FR区域，和/或来自“高变环”的那些残基。
[0080]术语“核酸”或“核酸分子”，用于本文时，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链DNA。
[0081]术语”氨基酸”在本申请中使用时指天然存在的羧基a氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母编码:ala, —字母编码:A),精氨酸(arg，R),天冬酰胺(asn, N)，天冬氨酸(asp, D),半胱氨酸(cys，C),谷氨酰胺(gin, Q)，谷氨酸(glu, E)，甘氨酸(gly，G),组氨酸(his, H)，异亮氨酸(ile，I),亮氨酸(leu，L),赖氨酸(lys，K),甲硫氨酸(met, M)，苯丙氨酸(phe, F),脯氨酸(pro, P)，丝氨酸(ser, S),苏氨酸(thr, T),色氨酸(trp, W),酪氨酸(tyr, Y)，和纟颜氨酸(val, V)。
[0082]当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是共线性的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。
[0083]用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。
[0084]用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用纯化的野生型ANG-2抗原的等离子共振测定(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)(实施例3)中，抗体与抗原(ANG-2)的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD (解离常数)和KD(kD/ka)定义。结合或特异性结合意为10_8mol/l以下，优选地IO-9M到10_13mol/l的结合亲和力(Kd)。
[0085]抗体与FcyRIII的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare, Uppsala, Sweden)进行研究。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。
[0086]用于本文时，术语“不结合ANG-1 ”或“不特异性结合ANG-1 ”表示在体外ANG-1结合ELISA测定法中抗体具有高于8000ng/ml的EC50值(根据实施例2)。
[0087]术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面定群(groupings),诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。
[0088]抗体的“Fe部分”不直接涉及抗体与抗原的结合，而是显示不同的效应子功能。“抗体的Fe部分”是技术人员公知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶裂解定义。根据它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分类为下列类别:IgA, IgD, IgE, IgG和IgM,并且其中一些可进一步被分类为亚类(同种型)，例如IgGl，IgG2, IgG3,和IgG4，IgAl,和IgA2。
[0089]根据重链恒定区，将不同类别的免疫球蛋白分别称为a、S、e、Y和ii。抗体的Fe部分直接涉及ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和基于补体激活、Clq结合和Fe受体结合的CDC (补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的Fe部分结合而起始。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，与Clq的结合由在Fe部分中限定的结合位点所导致。这样的结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由 Boakle, R.J.,等 Nature (自然)282 (1975) 742-743，Lukas, T.J.,等，免疫学杂志(J.Tmmun01.) 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R.,和 Cebra, J.J.,分子免疫学(Mol.1mmunol.) 16 (1979) 907-917; Burton, D.R.,等，自然(Nature) 288 (1980) 338-344; Thommesen,J.E.,等，分子免疫学(Mol.Tmmun01.) 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E.,等，免疫学杂志(J.1mmunol.) 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M.，等，病毒学杂志(J.Virology.) 75 (200I) 12161-12168; Morgan, A.，等，免疫学(Immunology) 86 (1995) 319-324;和 EP0307434 所描述。所述结合位点例如是 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331,和 P329 (根据Kabat的EU索引编号，见下)。亚类IgGl，IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活，和Clq和C3结合，而IgG4不激活补体系统并且不结合Clq和C3。
[0090]根据本发明所述的抗体优选地包含来自人起源的Fe部分，其是亚类IgGl的人抗体的Fe部分。 [0091]根据本发明所述的抗体特征在于人起源的恒定链。所述恒定链是现有技术中众所周知的，并且例如由 Kabat, E.A.(见，例如 Johnson, G.和 Wu, T.T.，Nucleic Acids Res.(核酸研究)28 (2000) 214-218)描述。例如，有用的人重链恒定区包含SEQ ID N0:57的氨基酸序列或SEQ ID N0:58的氨基酸序列。例如有用的人轻链恒定区包含SEQ ID N0:59的K-轻链恒定区的氨基酸序列，或SEQ ID NO:60的入-轻链恒定区的氨基酸序列。
[0092]术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别:IgA, IgD, IgE, IgG和IgM,并且这些中的一些可以被进一步分为亚类如IgGl，IgG2, IgG3,和IgG4，IgAl和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为a、S、e、Y和ii。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为K (kappa)和入(lambda)。
[0093]术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgGl，IgG2, IgG3,或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链K区。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由 Kabat, E.A.，描述(见，例如 Johnson, G.和 Wu, T.T.，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)28 (2000) 214-218; Kabat, E.A.，等?，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)72(1975)2785-2788)。
[0094]当IgG4亚类的抗体显示减少的Fe受体(Fe YRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体显示强烈的结合。然而，Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (失去 Fe 糖)，Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434,和 His435 是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fe受体结合(Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 276 (2001) 6591-6604; Lund, J.，等，FASEB J.9(1995) 115-119; Morgan, A.，等，免疫学(Immunology) 86 (1995) 319-324; EP0307434)。
[0095]在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体与IgGl抗体比较具有减少的FcR结合，并且所述单特异性二价母体抗体涉及具有S228，L234，L235和/或D265中突变的IgG4亚类的或IgGl或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在单特异性二价母体抗体中的突变是S228P，L234A, L235A, L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，在单特异性二价母体抗体中的突变在IgG4中是S228P，在IgGl中是L234A和L235A。恒定重链区在SEQ ID N0:57和58中显示。在一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定重链区是具有突变L234A和L235A的SEQ ID N0:57的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定重链区是具有突变S228P的SEQ ID N0:58的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定轻链区是SEQ ID N0:59的K轻链区或SEQ ID N0:60的\轻链恒定区。在本发明的一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定重链区是SEQ ID勵:57或具有突变3228?的3￡0 ID NO: 58的恒定重链区。
[0096]抗体的恒定区直接涉及ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和CDC (补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas, T.J.，等，免疫学杂志(J? Tmmun01.) 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R.,和 Cebra, J.J.,分子免疫学(Mol.1mmuno
1.) 16(1979) 907-917; Burton, D.R.,等，自然(Nature) 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E.，等，分子免疫学(Mol.Tmmun01.) 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E.,等，免疫学杂志(J.1mmunol.) 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M.，等，病毒学杂志(J.Virol.) 75 (2001) 12161-12168;Morgan, A.,等，免疫学(Immunology) 86 (1995) 319-324;和 EP0307434 所描述。所述恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331,和P329(根据Kabat的EU索引编号)。
[0097]术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC) ”指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达CCR5的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。
[0098]术语“补体依赖的细胞毒性(⑶C) ”指由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的Fe部分结合而起始的过程。Clq与抗体的结合由在所谓结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fe部分结合位点是现有技术已知的(见上)。这些Fe部分结合位点例如特征在于氨基酸 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331,和 P329 (根据 Kabat 的 EU索引编号)。亚类IgGl，IgG2,和IgG3的抗体通常显示包括Clq和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合Clq和/或C3。
[0099]根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明抗体的所述核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母，或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides, S.C., Protei n Expr.Purif.17(1999) 183-202;Geisse, S.,等,Protein Expr.Purif.8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.) 16(2000) 151-161; Werner, R.G.，J.Drug Res (药物研究杂志)? 48 (1998) 870-880 的综述文章中描述。
[0100]根据本发明所述的抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如J1EK293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
[0101]根据本发明所述抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。
[0102]术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生根据本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将J1EK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。[0103]在NSO细胞中的表达记述在，例如，Barnes, L.M.，等.，细胞技术学(Cytotechnology) 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M.,等?，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.) 73 (2001) 261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher, Y.，等?，核酸研究(Nucl.Acids.Res.) 30 (2002) E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi, R.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 86 (1989) 3833-3837; Carter, P.,等?，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 89 (1992) 4285-4289;和 Norderhaug, L.，等?，免疫学方法杂志(J.1mmunol.Methods) 204 (1997) 77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK293)记述在 Schlaeger, E.-J.,和 Christensen, K.,在细胞技术学(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83中和 Schlaeger, E.-J.,在免疫学方法杂志(J.1mmunol.Methods) 194 (1996) 191-199 中。
[0104]适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。
[0105]当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。
[0106]通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding),柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见AUSUbel，F.，等，编辑，现代分子生物学中的方法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 和 WileyInterscience, New York(1987)。 不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用(6-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和力材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vi jayalakshmi, M., A.应用生物化学生物技术(App1.Biochem.Biotech).75(1998)93-102)。
[0107]本发明包括用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据本发明所述的抗体。
[0108]本发明包括根据本发明所述的抗体用于治疗的应用。
[0109]本发明包括根据本发明所述的抗体用于制备预防转移的药物的应用。
[0110]本发明包括根据本发明所述的抗体用于制备用于治疗癌症的药物的应用。
[0111]本发明的一个方面是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是将根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是用于制备包含根据本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包含与药用载体一起配制的根据本发明所述的抗体的组合物，例如药物组合物。[0112]本发明的另一个方面是用于预防转移的所述药物组合物。
[0113]本发明的另一个方面是用于预防转移的根据本发明所述的抗体。
[0114]本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备用于预防转移的药物的应用。
[0115]本发明的另一个方面是在遭受原发癌的患者中预防转移的方法，所述方法通过向需要所述预防性治疗的患者施用根据本发明所述的抗体进行。
[0116]我们可以显示在原位和皮下癌症模型中对自发转移/继发性肿瘤的体内高度有效的预防(见实施例9)(与其中静脉内注射肿瘤细胞的实验模型对比)。这与细胞从原发肿瘤播散并转移到继发器官如肺或肝(其中继发肿瘤)的临床情形相似。
[0117]根据本发明的术语“转移”指癌细胞从原发性肿瘤传播到患者中的一个或多个其他位点，然后在那里发展继发性肿瘤。确定癌症是否转移的转移方式(MetastasMeans)是本领域已知的，并包括骨扫描、胸部X线检查、CAT扫描、MRI扫描和肿瘤标记检测。
[0118]术语“预防转移”或“预防继发肿瘤”用于本文时具有相同的含义并且指以抑制或减少癌细胞自原发肿瘤向患者中一个或多个其它位点进一步传播的这种方式，在遭受复发性HER2阳性癌症的患者中针对转移的预防剂。这意味着原发性肿瘤或癌症的转移被预防、延缓或减少，并由此预防、延缓或减少继发肿瘤的发展。优选地，肺的转移，即肺的继发肿瘤被预防或减少，这意味着癌细胞从原发肿瘤向肺的转移性传播被预防或减少。
[0119] 本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
[0120]本发明的另一个方面是用于治疗癌症的根据本发明所述的抗体。
[0121]本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。
[0122]本发明的另一个方面是通过向需要所述治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗遭受癌症的患者的方法。
[0123]用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附延缓试剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊或表皮施用(例如通过注射或输注)。
[0124]本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员所理解地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。
[0125]术语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、目艮内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
[0126]术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemias),肺癌(lung cancer),非小细胞肺(NSCL)癌(non small celllung (NSCL) cancer),支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer),骨癌(bone cancer)，膜腺癌(pancreaticcancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancerof the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancerof the analregion)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(coloncancer),乳腺癌(breast cancer),子宫癌(uterine cancer),输卵管癌(carcinomaof thefallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宫颈癌(carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma ofthe vulva)，霍奇金病(Hodgkin’s Disease)，食管癌(cancer of theesophagus)，小肠癌(cancer of the small intestine)，内分泌系统癌(cancer ofthe endocrine system),甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroidgland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of softtissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，阴莖癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of thebladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of thekidney or ureter)，肾细胞癌(renal cellcarcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renalpelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliarycancer)，中枢神经系统(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axistumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，和尤因瘤(Ewing，ssarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
[0127]本发明的另一方面是作为抗-血管生成剂的所述药物组合物。这种抗-血管生成剂可用于治疗癌症(特别是实体瘤)和其它血管疾病。[0128]本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗血管疾病的药物的应用。
[0129]本发明的另一个方面是用于治疗血管疾病的根据本发明所述的抗体。
[0130]优选的实施方案是用于治疗视网膜病的根据本发明所述的抗体。
[0131]优选的实施方案是根据本发明所述的抗体用于制备治疗视网膜病的药物的应用。
[0132]本发明的另一方面是通过向需要这种治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗患有血管疾病的患者的方法。
[0133]术语“血管疾病(vascular diseases) ”包括癌症(Cancer)，炎性疾病(Inflammatory diseases)，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)，缺血(Ischemia)，
[0134]创伤(Trauma),脓毒症(Sepsis)，COPD,哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD，视网膜病(Retinopathy)，中风(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺损伤(Acutelung injury)，出血(Hemorrhage)，血管渗漏(Vascular leak)例如细胞因子诱导的血管渗漏，变态反应(Allergy)，格雷夫斯病((Graves’Disease)，桥本自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto^ s Autoimmune Thyroiditis)，特发性血小板减少性紫癒(IdiopathicThrombocytopenic Purpura)，巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis)，类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus (SLE))，狼疮性肾炎(Lupus Nephritis),局限性回肠炎(Crohn’ s Disease),多发性硬化(MultipleSclerosis),溃瘍性结肠炎(Ulcerative Colitis),特别是实体瘤，眼内新血管综合征(intraocular neovascular syndromes)(诸如增殖性视网膜病(proliferativeretinopathies)或年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration (AMD)),类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)。(Folkman, J.,等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M.，等，Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53 (1991) 217-239;和 Garner, A., Vasculardiseases (血管疾病)，在:Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach (眼科疾病，即动力学途径的病理学)，Garner, A.，和 Klintworth, G.K.(eds.)第二版 Marcel Dekker,纽约，(1994),第 1625-1710 页)。
[0135]这些组合物还可以包含辅药如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法，见上文和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等也可能是理想的。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。
[0136]不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。
[0137]在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、 施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性另IJ、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。
[0138]所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。
[0139]适当的流动性可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。
[0140]用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。
[0141]术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham, F.L.，和van derEb.Virology (病毒学)52 (1973) 456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen, F.N，等，PNAS (美国科学院院报)? 69 (1972) 71 IOff所述。[0142]用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
[0143]“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。
[0144]“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。
[0145]提供下列实施例，序列表和图来辅助理解本发明，其真实范围在后附的权利要求中提出。需要理解可以在不背离本发明精神的情况下，对提出的方法进行修饰。
[0146]氨基酸序列描述
[0147]SEQ ID NO:1 重链 CDR3,〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0148]SEQ ID NO: 2 重链 CDR2,〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0149]SEQ ID NO: 3 重链 CDRl,〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0150]SEQ ID NO:4 轻链 CDR3,〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0151]SEQ ID NO: 5 轻链 CDR2,〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0152]SEQ ID NO:6 轻链 CDRl,〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0153]SEQ ID NO:7 重链可变结构域，〈ANG_2>Ang2i_LC06
[0154]SEQ ID NO:8 轻链可变结构域，〈ANG_2>Ang2i_LC06
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[0170]SEQ ID NO:24 轻链可变结构域，〈ANG_2>Ang2k_LC08
[0171]SEQ ID NO: 25 重链 CDR3,〈ANG_2>Ang2s_LC09
[0172]SEQ ID NO: 26 重链 CDR2,〈ANG_2>Ang2s_LC09[0173]SEQ ID NO:27重链 CDRl,〈ANG_2>Ang2s_LC09
[0174]SEQ ID NO:28轻链 CDR3,〈ANG_2>Ang2s_LC09
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[0178]SEQ ID NO:32轻链可变结构域，〈ANG_2>Ang2s_LC09
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[0185]SEQ ID NO:39重链可变结构域，〈ANG_2>Ang2i_LC10
[0186]SEQ ID NO:40轻链可变结构域，〈ANG_2>Ang2i_LC10
[0187]SEQ ID NO:41 重链 CDR3, <ANG_2>Ang2k_LCll
[0188]SEQ ID NO:42重链 CDR2, <ANG_2>Ang2k_LCll
[0189]SEQ ID NO:43重链 CDRl, <ANG_2>Ang2k_LCll
[0190]SEQ ID NO:44轻链 CDR3, <ANG_2>Ang2k_LCll
[0191]SEQ ID NO:45轻链 CDR2, <ANG_2>Ang2k_LCll
[0192]SEQ ID NO:46轻链 CDRl, <ANG_2>Ang2k_LCll
[0193]SEQ ID NO:47重链可变结构域，<ANG_2>Ang2k_LCll
[0194]SEQ ID NO:48轻链可变结构域，<ANG_2>Ang2k_LCll
[0195]SEQ ID NO:49重链 CDR3,〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0196]SEQ ID NO:50重链 CDR2,〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0197]SEQ ID NO: 51重链 CDRl,〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0198]SEQ ID NO:52轻链 CDR3,〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0199]SEQ ID NO:53轻链 CDR2,〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0200]SEQ ID NO:54轻链 CDRl,〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0201]SEQ ID NO:55重链可变结构域，〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0202]SEQ ID NO:56轻链可变结构域，〈ANG_2>Ang2s_R3_LC03
[0203]SEQ ID NO:57来自IgGl的人重链恒定区
[0204]SEQ ID NO:58来自IgG4的人重链恒定区
[0205]SEQ ID NO:59k 轻链恒定区
[0206]SEQ ID NO:60A 轻链恒定区
[0207]SEQ ID NO:61人 Tie_2 受体
[0208]SEQ ID NO: 62具有前导序列和His标记的人血管生成素_2 (ANG-2)
[0209]SEQ ID NO:63具有前导序列和His标记的人血管生成素-1 (ANG-1)
[0210]附图描述
[0211]图1克隆IgGs用于在表达载体中瞬时表达，瞬时表达A)Ang21-LC06(图1A)B.)Ang21-LC06(图1B)
[0212]图 2 纯化的抗 ANG-2 抗体 Ang2i_LC06, Ang2i_LC07 和 Ang2k_LC08 的 SDS-PAGE凝胶
[0213]图3血管生成素_Tie2相互作用ELISA
[0214]图4 通过 Ang21-LC06 和 Ang2k_LC08 抑制 ANG-2 与 Tie2 的结合
[0215]图5 通过 Ang21-LC06 和 Ang2k_LC08 抑制 ANG-1 与 Tie2 的结合
[0216]图6用于测试抗ANG-2抗体的体内功效的Colo205异种移植模型
[0217]图7用于测试抗ANG-2抗体的体内功效的KPL-4异种移植模型
[0218]图8通过Biacore传感图的ANG-1结合
[0219]图9在原发性结肠肿瘤异种移植(9A)和原发性乳腺癌异种移植(9B)中由根据本发明所述的抗体预防肺转移/继发肿瘤
[0220]图10由根据本发明所述的抗体抑制视网膜病。
[0221]实验方法I
[0222]材料与一般方法[0223]在Kabat, E.A.,等，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第 5版，公众健康服务(Public Health Service),国家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman，G.M.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A.,等，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5版，公众健康服务(Public Health Service),国家健康研究所(National Institutes ofHealth)，Bethesda, MD (1991)对抗体链的氨基酸进行编号和参考。
[0224]重组DNA技术
[0225]将标准方法用于操作DNA，如在Sambixx)k，J.，等，分子克隆:实验室手册(Molecular cloning:A laboratory manual);冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),冷泉港,纽约，1989中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。
[0226]基因合成
[0227]需要的基因片段制备自通过化学合成制备的寡核苷酸。侧邻单限制性内切酶切割位点的基因片段通过包括PCR扩增的退火和寡核苷酸连接进行组装，并且将其随后通过指定的限制性酶切位点，例如KpnI/Sac I或Asc I/Pac I克隆到基于pGA4克隆载体的pPCRScript (Stratagene)中。通过DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。根据在Geneart (Regensburg, Germany)的指定说明对基因合成片段进行排序。
[0228]DNA序列确定
[0229]DNA 序列通过在 MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)或 SequiserveGmbH(Vaterstetten, Germany)进行的双链测序来确定。
[0230]DNA和蛋白序列分析和序列数据处理
[0231]使用GCG’ s (Genetics Computer 组，Madison, Wisconsin)软件包 10.2 版本和Infomax's Vector NTl Advance suite版本8.0来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。
[0232]表达载体
[0233]为了表达所述抗体，应用基于具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造(organization)或基于具有CMV启动子的基因组构造的用于瞬时表达(例如在HEK293EBNA或HEK293-F中)或稳定表达(例如在CHO细胞中)的表达质粒的变体(例如图1)。
[0234]除抗体表达盒以外，所述载体包括:
[0235]-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌中复制，和
[0236]-(6-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。
[0237]抗体基因的转录单元由以下元件组成:
[0238]-5’末端处的独特限制位点
[0239]-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
[0240]-在cDNA组构的情形中，随后是内含子A序列，
[0241]-人抗体基因的5’-非翻译区，
[0242]-免疫球蛋白重链信号序列，
[0243]-人抗体链(重链、修饰的重链或轻链)作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组构
[0244]-具有聚腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和
[0245]-3’末端处的独特限制位点。
[0246]如下所述的包括选定抗体重链序列的融合基因通过PCR和/或基因合成产生并使用已知的重组方法和技术，通过在基因组重链载体中例如利用独特NsiI和EcoRI位点来连接相应的核酸区段来装配。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时且稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制剂来制备更大量的质粒(NucleobondAX, Macherey-Nagel)。
[0247]细胞培养技术
[0248]如在细胞生物学中的当前方法(Current Protocols in Cell Biology)(2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.和Yamada, K.M.(编辑)，John Wiley & Sons, Inc中所述使用标准细胞培养技术。
[0249]HEK293-F系统中的瞬时转染
[0250]通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照制造商的说明瞬时转染两种质粒(分别编码重链或修饰的重链和相应的轻链)来生成抗体。简言之，用两种各自的表达质粒和293fectin或fectin (Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyle293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于例如2L摇瓶(Corning)，以1.0E*6细胞/mL的密度接种6OOmLHEK293-F细胞并以120rpm，8%C02温育。第二天，用约42mL的混合物，以约1.5E*6细胞/mL的细胞密度来转染细胞，所述混合物为A)具有600 u g分别编码等摩尔比的重链或修饰的重链，和相应轻链的总质粒DNA(1 u g/mL)白勺2OmL Opt1-MEM(Invitrogen)和B) 20ml0pt1-MEM+l.2mL293fectin或fectin(2 ii 1/mL)的混合物。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获包含分泌的抗体的上清液，并且直接由上清液纯化抗体或冷冻并保存上清液。[0251]蛋白确定
[0252]使用基于根据Pace, C.N.，等，蛋白科学(Protein Science)，4 (1995)，2411-1423的氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过确定280nm的光密度(OD)，来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度。
[0253]在上清液中的抗体浓度确定
[0254]抗体和衍生物在细胞培养物上清液中的浓度通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(FS))的免疫沉淀法来评估。60iiL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mMTris, pH7.5，150mM NaCl, l%Nonidet-P40)洗涤三次。随后，将 l_15mL 细胞培养物上清液加样于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育Ih后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗漆I次,用0.5mL2x磷酸盐缓冲液(2xPBS, Roche (罗氏))洗涤2次并用0.5mL100mM柠檬酸钠pH5.0简单洗涤4次。通过添加35ii I NuPAGE? LDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与NllPAGE?样品还原剂混合或保持未还原，并在70° C加热lOmin。因此，将20 yl应用于 4-12% NllPAGE? Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有 MOPS 缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE，和具有NuPAGE?抗氧化运行缓冲液添加剂的MES缓冲液(Invitrogen)，以用于还原的SDS-PAGE)并用考马斯蓝染色。
[0255]通过蛋白A-HPLC层析法测量细胞培养物上清液中的抗体和衍生物的浓度。简言之，将包含结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加到HiTrap蛋白A柱(GEHealthcare)上，所述柱在 50mM K2HP04, 300mM NaCl, pH7.3 中，并在 Dionex HPLC 系统上，用50mM乙酸，pH2.5从基质中洗脱。通过UV吸光度和峰面积的积分(integration)来量化洗脱的蛋白。将纯化的标准IgGl抗体用作标准。
[0256]备选地，抗体和衍生物在细胞培养物上清液中的浓度通过夹心式-1gG-ELISA来测量。简言之，StreptaWell 高结合链霉亲和素(StreptaWell High Bind Strepatavidin)A-96孔微滴定板(Roche(罗氏))用100 y L/孔生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab，)2〈h-Fc Y >BI (Dianova)，以0.1 U g/mL在室温下包被Ih或备选地在4° C包被过夜，并随后用200 u L/孔PBS, 0.05%吐温(PBST, Sigma (西格玛))洗涤3次。将100 u L/孔包含各种抗体的细胞培养物上清液在PBS (Sigma (西格玛))中的稀释物系列加入到孔中并在微滴定板摇动器上，以室温温育l_2h。孔用200 u L/孔的PBST洗涤三次并且用100 U I浓度为0.1 ii g/mL的F(ab’)2〈hFc y >P0D (Dianova)作为检测抗体，在微滴定板摇动器上，以室温检测结合的抗体l_2h。未结合的检测抗体用200 u L/孔的PBST以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100 u LABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的测定。
[0257]蛋白质纯化
[0258]参考标准流程，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，将抗体加样于蛋白质A琼脂糖柱(GE Healthcare (GE健康护理))并用PBS洗涤。在酸性pH进行抗体洗脱，并随后立即中和样品。在20mM组氨酸，140mM NaCl pH6.0中，通过大小排阻层析法(Superdex200, GE healthcare (GE健康护理))将聚集的蛋白质与单体抗体分开。将单体抗体级分合并，如果需要，利用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWC0)离心浓缩器浓缩，在-80° C保存。提供部分样品进行随后的例如通过SDS-PAGE、大小排阻层析法、质谱法和内毒素测量(见图2)进行的蛋白质分析和分析表征。
[0259]SDS-PAGE
[0260]NllPAGE?预制凝胶系统(Invitrogen)按照制造商的说明来使用。具体地，使用 4-20% NuPAGE? Novex? TRIS-甘氨酸预制(Pre-Cast)凝胶和 Novex? TRIS-甘氨酸SDS运行缓冲液。(见例如图1)。样品的还原通过在运行凝胶前添加NuPAGE?样品还原剂完成。
[0261]分析大小排阻层析法[0262]用于确定抗体聚集和低聚状态的大小排阻层析法是通过HPLC层析法来进行。简言之，将蛋白质A纯化抗体加样于Dionex HPLC系统上的300mM NaCl, 50mM KH2P04/K2HP04, pH7.5 中的 Tosoh TSKgel G3000SW 柱或 Dionex HPLC-系统上的 2x PBS 中的Superdex200柱(GE Healthcare (GE健康护理))。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积的积分(integration)来量化。BioRad凝胶过滤标准151 - 1901起标准物的作用。
[0263]质谱法
[0264]抗体的总去糖基化质量通过电喷雾离子化质谱法(ES1-MS)来确定和验证。简言之，用处于 IOOmM KH2P04/K2HP04, pH7 中的 50mU N-糖苷酶 F (PNGaseF, ProZyme)在37° C，以蛋白质浓度至多为2mg/ml来将100 u g纯化的抗体去糖基化达12_24h，并随后通过S印hadex G25柱(GEHealthcare (GE健康护理))上的HPLC来脱盐。各种重链和轻链的质量在去糖基化和还原后通过ES1-MS来确定。简言之，处于115 ill中的50iig抗体用60 u IlM TCEP和50 U18M盐酸胍来温育并随后脱盐。总质量和还原的重链和轻链的质量通过在装配了 NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上进行ES1-MS来确定。
[0265]ANG-1 和 ANG-2 结合 ELISA
[0266]抗体针对ANGPTs (血管生成素I或血管生成素2)的结合性质在使用全长血管生成素-2-His蛋白(R&D Systems#623-AN/CF或内部生产的材料)或血管生成素-1-His (R&Dsystems#923-AN)的ELISA测定中评估。因此，96孔板(Falcon聚苯乙烯增透微量滴定板或Nunc Maxisorb)用100 u 11 u g/mL重组人血管生成素_1或血管生成素_2 (无载体)在PBS(Sigma)中室温包被2h或在4。C包被过夜。用300 yl PBST (0.2%Tween20)洗涤孔三次并用200 u 12%BSA0.l%Tween20室温封闭30min并且随后用300 u I PBST洗涤三次。将100 u L/孔稀释系列(40pM-0.01pM)的处于PBS中的针对<ANG_2>的纯化测试抗体和作为参照的Mab536(01iner，J.，等，CancerCell (癌细胞).11月6日(2004)507-16, US2006/0122370)加入到孔中并在微量滴定板摇动器上在室温下温育lh。该孔用300 u I PBST (0.2%Tween20)洗涤三次，并且结合的抗体用 100 u L/ 孔在 2%BSA0.l%Tween20中的0.1 ii g/ml F(ab’)〈hk>P0D(Biozol Cat.N0.206005)作为检测抗体在微量滴定板摇动器上室温Ih进行检测。未结合的检测抗体使用300 u L/孔的PBST，以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100 u L ABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的确定。
[0267]ANG-2 结合 BIACORE
[0268]抗体与抗原(例如人ANG-2)的结合通过利用BIACORE T100仪器(GEHealthcareBiosciences AB, Uppsala,瑞典)的表面等离子共振来研究。简言之，为了亲和力测量，山羊〈hlgG-Fc y >多克隆抗体通过胺偶联固定在CM4芯片上用于呈递针对人ANG-2的抗体。结合在 HBS 缓冲液(HBS-P(1 OmMHEPES, 150mM NaCl, 0.05%Tween20, ph7.4)中，25° C 测量。将纯化的ANG-2-His (R&D系统或内部纯化的)以0.4InM和200nM之间的不同浓度加入到溶液中。缔合通过ANG-2-注射3分钟来测量；解离通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面5分钟来测量且KD值利用1:1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)来评估。由于ANG-2制剂的异质性，不能观察到1:1的结合；因此KD值仅是相对评估。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore TlOO评估软件版本1.1.1来分析传感图(sensorgrams)和用于计算亲和力数据。备选地，Ang-2以捕获水平2000-1700RU通过经胺偶联(无BSA)固定在CM5芯片上的五组氨酸抗体(无BSA的5-His-Ab, Qiagen N0.34660)捕获(见下文)。
[0269]抑制huANG-2 与 Tie_2 的结合(ELISA)
[0270]相互作用ELISA 在 384 孔微量滴定板(MicroCoat，DE, Cat.N0.464718)上，在 RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。用0.5μ g/ml Tie-2蛋白(R&D Systems,英国，Cat.N0.313-TI)包被ELISA板至少2小时(h)。其后，用增补了 0.2%吐温-20和2%BSA (Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE)的PBS封闭孔I小时。纯化的抗体在 PBS 中的稀释物与 0.2 μ g/ml 人血管生成素-2 (huAngiopoietin-2) (R&D Systems (R&D系统)，UK, Cat.N0.623-AN) 一起在RT下温育I小时。洗涤后，添加0.5 μ g/ml生物素化的抗-血管生成素-2克隆BAM0981(R&D Systems (R&D系统)，UK)和1:3000稀释的链霉抗生物素蛋白 HRP (Roche Diagnostics GmbH (罗氏诊断 GmbH)，DE, Cat.N0.11089153001)的混合物I小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(RocheDiagnostics GmbH (罗氏诊断 GmbH)，DE,缓冲液 #204530001，片剂 #11112422001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。
[0271]抑制huANG-Ι 与 Tie_2 的结合(ELISA)
[0272]相互作用ELISA在384孔微量滴定板(MaxiSorb Nunc#442768)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗漆板3次。用0.5 μ g/ml Tie_2蛋白(R&D Systems,英国，Cat.N0.313-TI或内部生产的材料)包被ELISA板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2% 吐温-20 和 2%BSA (Roche DiagnosticsGmbH (罗氏诊断 GmbH)，DE)的 PBS 封闭孔 I小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.2 μ g/ml人血管生成素-1 (huAngiopoietin-l)(R&DSyStemS#923-AN/CF或内部生产的材料))一起在RT下温育I小时。洗涤后，添加0.5 μ g/ml生物素化的抗-血管生成素-1克隆(R&D Systems#BAF923)和1:3000稀释的链霉抗生物素蛋白 HRP (Roche Diagnostics GmbH (罗氏诊断GmbH)，DE, Cat.N0.11089153001)的混合物I小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(RocheDiagnostics GmbH (罗氏诊断 GmbH)，DE,缓冲液 #204 530 001，片剂 #11 112 422 001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。
[0273]HEK293_Tie2细胞系的产生 [0274]为确定血管生成素-2抗体干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化和ANGPT2与Tie2在细胞上的结合，产生了重组HEK293-Tie细胞系。简言之，基于pcDNA3的质粒(RB22-pcDNA3Topo hTie2)，其编码在CMV启动子控制下的全长人Tie2 (SEQ ID61)和新霉素抗性标记，该质粒使用Fugene (Roche Applied Science)作为转染试剂转染到HEK293细胞(ATCC)中，并在DMEM10%FCS，500yg/ml G418中选择抗性细胞。单个克隆通过克隆柱(cloning cylinder)分离，并随后通过FACS分析Tie2的表达。克隆22被鉴定为具有高且稳定Tie2表达的克隆(即使在没有G418时)(HEK293_Tie2克隆22)。HEK293_Tie2克隆22随后用于细胞测定:ANGPT2诱导的Tie2磷酸化和ANGPT2细胞配体结合测定。
[0275]ANGPT2诱导Tie2磷酸化测定
[0276]根据下述测定原则测量ANGPT2抗体对ANGPT2诱导的Tie2磷酸化的抑制。HEK293-Tie2克隆22在不存在或存在ANGPT2抗体时用ANGPT2刺激5分钟并且P_Tie2通过夹心ELISA定量。简言之，每孔2xl05HEK293-Tie2克隆22细胞在聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上于100 μ I DMEM, 10%FCS, 500 μ g/ml遗传霉素(Geneticin)中培养过夜。第二天在微量滴定板中制备一排滴定ANGPT2抗体(4-倍浓缩，75 μ I终体积/孔，两份)并与 75 μ I 的 ANGPT2 (R&D systems#623-AN]稀释物(3.2 μ g/ml 作为 4-倍浓缩液)混合。抗体和ANGPT2在室温预温育15分钟。添加100 μ I混合物到HEK293_Tie2克隆22细胞(与ImM NaV304, Sigma#S6508预温育5分钟)中并在37° C温育5分钟。随后，用每孔200 μ I冰冷PBS+lmMNaV304洗涤细胞，并通过在冰上每孔添加120 μ I裂解缓冲液(20mMTris, ρΗ8.0, 137mM NaCl, 1%NP_40, 10% 丙三醇，2mM EDTA, ImM NaV304, ImM PMSF 和 10 μ g/ml抑酶肽)裂解细胞。细胞在微量滴定板摇动器上4° C裂解30分钟，并且100 μ I裂解物直接转移到P_Tie2ELISA微量滴定板(R&D Systems, R&D#DY990)中，不进行在先离心和不进行总蛋白测量。P_Tie2的量根据制造商说明书定量，且抑制的IC50值使用用于Excel的 XLfit4 分析插件(plug-1n)(剂量-反应单点(dose-response one site),模式 205)测量。IC50值可在实 验内比较但可以在实验与实验之间变化。
[0277]ANGPTl诱导Tie2磷酸化测定
[0278]根据下述测定原则测量ANGPTl抗体对ANGPTl诱导的Tie2磷酸化的抑制。HEK293-Tie2克隆22在不存在或存在ANGPTl抗体时用ANGPTl刺激5分钟并且P_Tie2通过夹心ELISA定量。简言之，每孔2xl05HEK293-Tie2克隆22细胞在聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上于100 μ I DMEM, 10%FCS, 500 μ g/ml遗传霉素(Geneticin)中培养过夜。第二天在微量滴定板中制备一排滴定ANGPTl抗体(4-倍浓缩，75 μ I终体积/孔，两份)并与 75 μ I 的 ANGPTl (R&D systems#923-AN)稀释物(0.8 μ g/ml 作为 4-倍浓缩液)混合。抗体和ANGPTl在室温预温育15分钟。添加100 μ I混合物到HEK293_Tie2克隆22细胞(与ImM NaV304, Sigma#S6508预温育5分钟)中并在37° C温育5分钟。随后，用每孔200 μ I冰冷PBS+lmMNaV304洗涤细胞，并通过在冰上每孔添加120 μ I裂解缓冲液(20mMTris, ρΗ8.0, 137mM NaCl, 1%NP_40, 10% 甘油，2mM EDTA, ImM NaV304, ImM PMSF 和 10 μ g/ml抑酶肽)裂解细胞。细胞在微量滴定板摇动器上4° C裂解30分钟，并且100 μ I裂解物直接转移到P_Tie2ELISA微量滴定板(R&D Systems, R&D#DY990)中，不进行在先离心和不进行总蛋白测量。P_Tie2的量根据制造商说明书定量，且抑制的IC50值使用用于Excel的XLfit4分析插件(剂量-反应单点，模式205)测量。IC50值可在实验内比较但可以在实验与实验之间变化。
[0279]实施例1
[0280]单克隆〈ANG-2〉抗体Ang2i_LC06, Ang2i_LC07 和 Ang2k_LC08 的表达和纯化
[0281]将相应的抗体Ang21-LC06，Ang2i_LC07和Ang2k_LC08的轻链和重链如上所述构建在表达载体中。将重链和K轻链克隆在基因组表达盒中，而将λ轻链作为含有内含子A的cDNA进行克隆(图1B)。将质粒在大肠杆菌中扩增，纯化并随后转染用于在HEK293-F细胞中瞬时表达重组蛋白(使用Invitrogen’s FreeStyle293系统)。7天后，收集HEK293-F细胞上清液，过滤并通过蛋白A和大小排阻层析法纯化抗体。所有的抗体的均质性通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE以及分析大小排阻层析法证实。在还原条件(图1)下，〈ANG-2〉抗体的多肽重链在SDS-PAGE上显示约50kDa的表观分子大小，类似于计算的分子量，多肽轻链显示根据他们预期大小的25kDa的表观分子量。质谱证实纯化的抗体的相同性。所有构建体的表达水平通过蛋白A HPLC进行分析。
[0282]纯化的抗体的大小排阻层析法分析。制备所有的抗体，并且类似于上述方法进行分析表征。将相应的抗体的SEC数据总结在下面的表中。
[0283]
【权利要求】
1.特异性结合于人血管生成素-2(ANG-2)的抗体或抗体片段，其中 a)重链可变结构域包含SEQID NO:33的CDR3区、SEQ ID NO:34的CDR2区和SEQ IDNO:35的CDRl区，并且 b)轻链可变结构域包含SEQID NO:36的CDR3区、SEQ ID NO:37的CDR2区和SEQ IDNO:38 的 CDRl 区。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于包含 a)SEQ ID NO: 39的重链可变结构域；和 b)SEQID N0:40的轻链可变结构域。
3.根据权利要求1-2中任一项的抗体或抗体片段，其中所述抗体不结合于人血管生成素 I (ANG-1)。
4.根据权利要求1-3的抗体或抗体片段，其中所述抗体是人IgG4亚类或人IgGl亚类的抗体。
5.药物组合物，其特征在于包含根据权利要求1-3的抗体或片段。
6.根据权利要求1-3的抗体或抗体片段用于制备预防转移的药物的应用。
7.根据权利要求1-3的抗体或抗体片段用于制备治疗癌症的药物的应用。
8.根据权利要求1-3的抗体或抗体片段用于制备治疗血管疾病的药物的应用。
9.核酸，其编码特异性结合于人血管生成素-2(ANG-2)的抗体的重链，其特征在于所述抗体包含根据权利要求1所述的重`链可变结构域和轻链可变结构域。
10.表达载体，其特征在于包含根据权利要求9所述的核酸，所述表达载体用于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达特异性结合于人血管生成素_2(ANG-2)的抗体。
11.原核宿主细胞或真核宿主细胞，其包含根据权利要求10所述的载体。
【文档编号】A61K39/395GK103739709SQ201410024638
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2009年12月14日 优先权日:2008年12月16日
【发明者】乌尔里希·布林克曼, 雷姆科·阿尔伯特·格里普, 克拉斯·卡努扎, 阿妮塔·卡夫利, 克里斯蒂安·克莱因, 约尔格·托马斯·雷古拉, 维尔纳·朔伊尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司