包含双重血管生成素-2/Dll4结合物和抗VEGF-R药剂的药物组合的制作方法
【专利说明】包含双重血管生成素-2/DI 14结合物和抗VEGF-R药剂的药 物组合 发明领域
[0001] 本发明涉及包含双重血管生成素-2/D114结合物和抗VEGF-R药剂的药物组合，所 述药物组合用于治疗像癌症、眼病等的疾病。
[0002] 发明背景
[0003] 当肿瘤达到大约Imm3的临界尺寸时，肿瘤变得依赖于血管生成，用于维持以氧和 营养物进行的血液供应以允许进一步生长。如US 2008/0014196中所概述，血管生成牵涉 于包括实体肿瘤和转移的许多病症的发病机理中。
[0004] 在肿瘤生长的情况下，血管生成似乎对从增生转变到瘤形成来说至关重要，并且 对提供营养用于肿瘤的生长和转移来说至关重要（Folkman等，Nature339-58, 1989)，这 允许肿瘤细胞获得相较于正常细胞的生长优势。因此，抗血管生成疗法已变成对于一些类 型肿瘤的重要治疗选择。这些疗法已集中于通过中和VEGF(阿瓦斯丁（Avastin))或它 的受体（Sutent和索拉非尼（Sorafinib))来阻断VEGF途径（Ferrara等，Nat Rev Drug Discov. 2004 年 5 月；3 (5) : 391-400.)。
[0005] 如例如US2008/0014196和W02008/101985中所述，血管生成牵涉于包括实体肿瘤 和转移以及眼部疾病的许多病症的发病机理中。最重要的促血管生成因子之一是血管内皮 生长因子（VEGF)，也称为VEGF-A或血管通透性因子（VPF)。VEGF属于包括胎盘生长因子 (PIGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 以及 VEGF-F 的基因家族。人 VEGF 的单个基因的 mRNA的选择性剪接产生至少六种亚型（VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189以及 VEGF206)，VEGF165是最丰富的亚型。
[0006] 已鉴定出与VEGF相互作用的两种VEGF酪氨酸激酶受体（VEGFR)，即VEGFR-I (也 称为FIt-I)和VEGFR-2 (也称为KDR或FIK-1)。VEGFR-I对VEGF的亲和力最高，而VEGFR-2 对 VEGF 的亲和力稍微较低。Ferrara (Endocrine Rev. 2004, 25:581-611)提供 VEGF 的详 细描述，正常过程和病理过程中VEGF与它的受体的相互作用和它的功能可见于Hoeben等 Pharmacol. Rev. 2004, 56:549-580 中。
[0007] VEGF已被报道是正常血管生成和异常血管生成的关键调节物（Ferrara和 Davis-Smyth，Endocrine Rev. 1997, 18:4-25 ;Ferrara J. Mol. Med. 1999,77:527-543)。相 较于促进血管形成的过程的其它生长因子，VEGF在它对血管系统内的内皮细胞具有高特异 性方面是独特的。
[0008] VEGF mRNA由大多数人肿瘤过度表达。在肿瘤生长的情况下，血管生成似乎对从 增生转变到瘤形成来说至关重要，并且对提供营养用于肿瘤的生长和转移来说至关重要 (Folkman等，1989, Nature 339-58)，这允许肿瘤细胞获得相较于正常细胞的生长优势。因 此，抗血管生成疗法已变成对于一些类型肿瘤的重要治疗选择。这些疗法已集中于阻断 VEGF 途径（Ferrara 等，Nat Rev Drug Discov. 2004 年 5 月；3 (5) :391-400)。
[0009] 对VEGF和它在血管生成和不同过程中的作用的解释已提供治疗性干预的潜在新 目标。VEGF的功能受到小分子的抑制，这些小分子阻断或防止VEGF受体酪氨酸激酶的活化 (Schlaeppi 和 Wood, 1999, Cancer Metastasis Rev.，18:473-481)，并且因此干扰 VEGF 受 体信号转导途径。含有细菌或植物毒素的细胞毒性缀合物可抑制VEGF对肿瘤血管生成的 刺激作用。VEGF-DT385毒素缀合物（融合或化学缀合到VEGF165的白喉毒素结构域）例如 有效地抑制体内肿瘤生长。肿瘤生长抑制还可通过由逆转录病毒递送Flk-I突变体或可溶 性VEGF受体来实现。
[0010] VEGF中和抗体，如A4. 6. 1和MV833已被开发以阻断VEGF与它的受体结合， 并且已显示临床前抗肿瘤活性（Kim等Nature 1993, 362:841-844 ;Folkman Nat. Med. 1995, 1:27-31 ;Presta 等 Cancer Res. 1997, 57:4593-4599 ;Kanai 等 Int. J. Cancer 1998,77:933-936 ;Ferrara和 Alitalo Nat. Med. 1999,5:1359-1364 ;320, 340。对于治疗性 抗 VEGF 方法试验的综述，参见 Campochiaro 和 Hackett, Oncogene 2003, 22:6537-6548)。
[0011] 大多数临床经验已利用A4. 6. 1获得，A4. 6. 1也称为贝伐单抗（bevacizumab) (Avastillli ; Genentech, San Francisco, CA) 〇
[0012] 在小鼠中的近期研宄已显示，作为Tie2受体的配体的血管生成素2 (Ang2)通过实 现如VEGF的其它血管生成因子的功能来控制血管重塑。Ang2主要由内皮细胞表达，受缺 氧和其它血管生成因子强烈诱导，并且已被证明调节肿瘤血管可塑性，允许血管对VEGF和 FGF2作出反应（Augustin 等，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009年 3 月；10(3): 165-77)。与这 种作用一致，Ang2的缺失或抑制导致血管生成减少（Falc0n等，Am J Pathol. 2009年11月； 175 (5) : 2159-70.)。已报道患有结肠直肠癌、NSCLC和黑素瘤的患者具有升高的Ang2血清 浓度（Goede 等，Br J Cancer. 2010 年 10 月 26 日；103 (9) :1407-14 ;Park 等，Chest. 2007 年 7 月；132 (1):200-6 ;Helfrich 等，Clin Cancer Res. 2009 年 2 月 15 日；15 (4) :1384-92)。 在CRC癌症中，Ang2血清水平与对抗VEGF疗法的治疗反应相关。
[0013] Ang-Tie系统由2种受体（Tiel和Tie2)和3种配体（Angl、Ang2和Ang4)组成 (Augustin 等，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 年 3 月；10 (3) :165-77. hTie2、Angl 和 Ang2 是这个家族中研宄最详尽的成员，Tiel是孤儿受体，并且Ang4对血管重塑的作用仍需要确 定。Ang2和Angl对Tie2结合和活化介导相反的功能。Ang2介导的Tie2活化导致内皮细 胞活化、周皮细胞解离、血管渗漏以及诱导血管萌芽。与Ang2相反，Angl信号传导通过周 皮细胞的募集维持血管完整性，从而维持内皮细胞静止。
[0014] Ang2是Tie2受体酪氨酸激酶的分泌的66kDa配体（Augustin等，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009年3月；10 (3) : 165-77)。Ang2由N-末端卷曲-螺旋结构域和C-末端纤 维蛋白原样结构域组成，后者是Tie2相互作用所需的。Ang2主要由内皮细胞表达，并且受 缺氧和包括VEGF的其它血管生成因子强烈诱导。Tie2见于内皮细胞、造血干细胞和肿瘤细 胞上。已证明Ang2-Tie2调节肿瘤血管可塑性，允许血管对VEGF和FGF2作出反应。
[0015] 在体外已显示Ang2在人脐静脉内皮细胞（HUVEC)中充当温和的有丝分裂原 (mitogen)、化学趋化物（chemo-attractant)以及管形成的诱导物。Ang2诱导成纤维细胞 中异位表达的Tie2的酪氨酸磷酸化，并且促进下游信号传导事件，如HUVEC中ERK-MAPK、 AKT和FAK的磷酸化。已描述了 Ang2在Angl诱导的内皮细胞反应中的拮抗作用。
[0016] 已显示Ang2缺乏导致小鼠中严重的淋巴模式化缺陷（lymphatic patterning defect)。尽管Ang2的丧失对于胚胎血管发育来说不是必要的，但是Ang2缺陷型小鼠在视 网膜和肾中具有持久的血管缺陷。结合血管生成部位（例如卵巢）处的Ang2表达的动态 模式，这些发现表明Ang2通过实现如VEGF的其它血管生成因子的功能来控制血管重塑。
[0017] Ang2_Tie2系统在血管生成转换和肿瘤血管生成后期阶段期间发挥至关重要的作 用。Ang2表达在肿瘤相关的内皮中强烈上调。已观察到当植入到Ang2缺陷型小鼠中，特别 是在肿瘤生长的早期阶段期间植入时，肿瘤生长降低。以Ang2mAb治疗性阻断Ang2已在多 种肿瘤异种移植物模型中显示出广泛的功效。
[0018] Notch信号传导途径对于细胞-细胞通信是重要的，所述途径涉及在胚胎发育期 间和在成年生物体中控制多种细胞分化过程的基因调节机制。Notch信号传导在许多癌症 中失调，例如在T细胞急性淋巴细胞白血病中和在实体肿瘤中（Sharma等2007, Cell Cycle 6 (8) : 927 - 30 ;Shih 等，Cancer Res. 2007 年 3 月 1 日；67 (5) : 1879-82) 〇
[0019] D114 (或Delta样4或delta样配体4)是Notch配体的Delta家族的一个成员。 D114的细胞外结构域由N-末端结构域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)结构域以及一串八个 表皮生长因子（EGF)样重复构成。总体上，认为EGF结构域包含氨基酸残基218-251 (EGF-1 ; 结构域 1)、252-282 (EGF-2 ;结构域 2)、284-322 (EGF-3 ;结构域 3)、324-360 (EGF-4 ;结构域 4)以及362-400 (EGF-5 ;结构域5)，其中DSL结构域在大致氨基酸残基173-217处，并且 N-末端结构域在hDl 14的大致氨基酸残基27-172处（W0 2008/076379)。
[0020] 已报道，D114通过血管内皮，尤其在动脉内皮中展现高选择性表达（Shutter等 (2000)Genes Develop. 14:1313-1318)。在小鼠中的近期研宄已显示，D114受VEGF诱导并 且是限制血管萌芽和分枝的负反馈调节物。与这种作用一致，D114的缺失或抑制导致过 度血管生成（Scehnet等，Blood. 2007年6月1日；109 (11) :4753-60)。这种不受限制的 血管生成由于非生产性血管系统的形成而反常地减缓肿瘤生长，即使在对抗VEGF疗法具 有抗性的肿瘤中也是如此（Thurston 等，Nat Rev Cancer. 2007 年 5 月；7 (5) :327-31 ;W0 2007/070671 ;Noguera-Troise 等，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122))。此外，在多种 肿瘤类型的异种移植物模型中，相较于单独的抗VEGF，VEGF和D114的组合抑制显示提供 较优的抗肿瘤活性（Noguera-Troise 等，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1032-7 ; Ridgway 等，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1083-7)。
[0021] 由于这些结果，D114被认为是癌症疗法的有希望的靶标，并且已描述处 于临床（前）开发中的一些靶向D114的生物化合物：REGN-421 ( = SAR153192 ; Regeneron，