细胞疫苗和诱导受试者免疫反应的方法

细胞疫苗和诱导受试者免疫反应的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法。本发明进一步包 括分离的核酸疫苗、细胞疫苗、融合蛋白、表达载体、疫苗和其中使用的免疫原性组合物。
【背景技术】
[0002] 全世界大概有3300万的个体具有人类免疫缺陷病毒（HIV)感染。许多个 体将因为此感染而死亡，据称已经超过2300万例死亡，且每年有270万人被新感染 上(International AIDS vaccine initiative (IAVI), AIDS vaccine blueprint,A challenge to the field, A road map for progress, 2008, ISBN#〇-9792432-8_9)。超过 80%的新HIV-I感染出现在发展中世界中。
[0003] 澳大利亚每年大概有10, 000例新的丙型肝炎病毒（HCV)感染，该国中有220, 000 名 HCV 阳性个体（Razali K 等人，2007, Drug Alcoho I D印end 91:228-235)，世界上大概 有2亿受感染个体且估计每年新增300-400万感染（Bonner, J. E.，Esserman, D.，Evon, D. Μ. , 2012, Reliability and validity of a self-efficacy instrument for hepatitis C antiviral treatment regimens, J Viral Hep 19:316-26)。在发展中国家，许多感染是由 差的医疗实践引起（Hauri, A. Μ, Armstrong, G. L, Hutin Y. J, 2004)。全球的疾病负荷可归因 于在保健设置中给出的被污染的注射（Int. J. STD AIDS, 15(2004)，第7-16页）。
[0004] 需要有效的疫苗来控制这些病原体的蔓延。然而，现有的许可的疫苗常常取决于 诱导保护的中和抗体，但中和抗体可能无法有效地控制HCV和HIV的攻击。这些病毒迅速 地突变并产生逃脱中和抗体（NAb)的突变体。因为常规的疫苗引起NAb，所以需要一种设计 针对这些病毒的疫苗的替代方法。
[0005] 需要HIV和HCV的替代疫苗。本发明设法解决或至少改善如上所述的现有技术的 一个或多个不足，或为消费者提供有用的或商业的选择。
【背景技术】 [0006] 的以上讨论仅仅是意图有助于理解本发明。此讨论并非是承认或认可截 至申请的优先日期止，任何所提及的材料是或属于常识。
[0007] 发明概述
[0008] 根据本发明，提供一种诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法。所述 方法包括以下：
[0009] 使所述免疫原在细胞中表达，以及
[0010] 向所述受试者施用所述细胞，由此诱导促炎性的免疫反应。
[0011] 细胞可以是体细胞。
[0012] 所述方法可以包括在细胞中诱导细胞死亡（坏死）的另一步骤。诱导细胞死亡 (坏死）的步骤可以在向受试者施用细胞的步骤前或后进行。诱导细胞死亡的步骤可以在 免疫接种后使细胞溶解。细胞溶解可以在施用后在受试者中发生，由此在受试者的免疫系 统加工所溶解的细胞时诱导促炎性的免疫反应。典型地，当所述方法包括在细胞中诱导细 胞死亡的另一步骤时，细胞作为非抗原呈递细胞、例如体细胞而提供。细胞可以选自同种异 体细胞、HEK 293T细胞和重组表达人类白细胞抗原（HLA) I和II类分子和Huh7细胞。优 选地，体细胞是同种异体的或者自体的。细胞也可以选自无法表达HLA蛋白质的细胞,例如 (但不限于）CIR细胞、K562和LCL721. 221细胞。
[0013] 或者细胞可以是抗原呈递细胞（APC)。
[0014] 所述方法可以包括使免疫原在细胞中表达的步骤可以进一步包括在细胞表面上 呈递所表达的免疫原的步骤的另一步骤。
[0015] 当细胞是APC时，使免疫原在细胞中表达的步骤可以进一步包括在细胞表面上呈 递所表达的免疫原的步骤。在细胞表面上呈递所表达的免疫原的步骤可以通过受试者的 免疫系统加工所表达的呈递免疫原的APC，由此在受试者中诱导促炎性的免疫反应。APC 可以选自同种异体细胞、树突状细胞（DC)、巨噬细胞、B细胞、郎格罕氏细胞（Langerhans cell)、库柏法细胞（Kupffer cell)。优选地，APC是同种异体的或者自体的。
[0016] 细胞可以共同表达HLA。细胞表达HLA可以是自然过程的结果或者归因于HLA的 重组表达。也就是说，HLA表达可以是细胞通过内源性过程表达HLA的结果。或者，HLA表 达可以因重组工程化和蛋白质产生而发生。
[0017] 免疫原可以来源于HCV。当免疫原来源于HCV时，细胞典型地不共同表达HLA。
[0018] 免疫原可以来源于HIV。当免疫原来源于HIV时，细胞可能或可能不共同表达HLA。
[0019] 在一个优选的实施方案中，免疫反应是针对内源性抗原，使得在细胞溶解后，抗原 被免疫系统当做外源性抗原处理，导致抗原交叉呈递。在另一个方面，本发明提供一种诱导 或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法，其包括以下步骤：
[0020] 使所述内源性免疫原在体细胞或APC中表达；
[0021] 在所述细胞中诱导坏死；以及
[0022] 将所述细胞施用所述受试者，由此诱导促炎性的免疫反应。
[0023] 本发明的进一步特征提供向受试者施用细胞，由此诱导促炎性的免疫反应的步 骤，所述步骤通过受试者的APC经由II类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首 次用于实验的CD4+T细胞检测。
[0024] 本发明的更进一步特征提供向受试者施用细胞，由此诱导促炎性的免疫反应的步 骤，所述步骤通过APC经由I类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验 的⑶8+T细胞检测。
[0025] 在另一个方面，本发明提供一种诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方 法，其包括以下步骤：
[0026] 使所述内源性免疫原在细胞中表达，由此呈递内源性免疫原；以及
[0027] 向所述受试者施用内源性免疫原呈递细胞，由此诱导促炎性的免疫反应。
[0028] 在一个实例中，细胞是APC。
[0029] 本发明的进一步特征提供使免疫原在APC中表达，由此呈递免疫原的步骤，所述 步骤通过APC经由II类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的 ⑶4+T细胞检测。
[0030] 本发明的更进一步特征提供使免疫原在APC中表达，由此呈递免疫原的步骤，所 述步骤通过APC经由I类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的 ⑶8+T细胞检测。
[0031] 本发明的方法的细胞可以选自同种异体或自体细胞、树突状细胞（DC)、外周血单 核细胞（PBMC)、巨噬细胞、B细胞、郎格罕氏细胞、库柏法细胞、HEK 293T细胞、重组表达HLA I和II类分子的HEK293T细胞以及Huh7细胞。优选地，APC是同种异体的或者自体的。
[0032] 免疫原可以是病毒来源。如以上所讨论，免疫原可以是HIV来源。HIV来源的免疫 原可以与例如（但不限于）HLA A*0201、HLA B*0702、HLA 0￥7、01?1、01?3、01?4和01?5等 人类白细胞抗原（HLA) -起呈递。免疫原在来源于HIV时，可以选自（但不限于）HIV gag 和/或env蛋白。或者，免疫原可以来源于SIV，例如SIV gag和/或env蛋白。
[0033] 在一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的方法包括 以下步骤：
[0034] 使HIV蛋白质和人类白细胞抗原（HLA)在细胞中表达；
[0035] 在所述细胞中诱导坏死；以及
[0036] 向所述受试者施用表达HIV蛋白质和人类白细胞抗原（HLA)的所述细胞，由此诱 导针对HIV蛋白质和HLA蛋白质的促炎性的免疫反应。
[0037] 优选地，HLA 选自 HLA-A*0101、HLA-A*0301 和 HLA-A*2901 以及 HLA DP、DQ 和 DR。
[0038] HIV抗原可以是任何来源于HIV的蛋白质，例如（但不限于）gpl20或gag。
[0039] 在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的方法包 括以下步骤：
[0040] 使HIV蛋白质在细胞中表达；
[0041] 在所述细胞中诱导坏死；以及
[0042] 向所述受试者施用表达HIV蛋白质的所述细胞，由此诱导针对HIV蛋白质的促炎 性的免疫反应。
[0043] 本发明的进一步特征提供诱导细胞中的细胞死亡的步骤，所述步骤通过诱导坏死 进行。在细胞中诱导坏死的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导条件，例如（但不限于） 将免疫原呈递细胞加热到63°C，保持至少30分钟来进行。
[0044] 或者，诱导细胞中的细胞死亡的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导剂或使坏死 剂在细胞中表达（细胞中的内部表达，而非外部暴露于坏死剂）进行。坏死诱导剂的实例 可以包括（但不限于）胸苷激酶（TK)、穿孔素、颗粒酶、胱天蛋白酶、RIP蛋白质1和3、腺 病毒五邻体纤维、NSP4、链球菌溶血素0、炭疽杆菌溶血素、PB-F2和其功能性片段。
[0045] 在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的方法包 括以下步骤：
[0046] 使HIV蛋白质和人类白细胞抗原（HLA)在细胞中表达；以及
[0047] 向所述受试者施用表达HIV蛋白质和人类白细胞抗原（HLA)的APC，由此诱导针对 HIV蛋白质的促炎性的免疫反应。
[0048] 优选地，细胞是APC。
[0049] 或者，免疫原可以来源于HCV。当来源于HCV时免疫原可以选自（但不限于）以下 HCV 蛋白质：核心、E1/E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。
[0050] 在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的方法包 括以下步骤：
[0051] 使HCV蛋白质在细胞中表达，由此呈递HCV蛋白质；
[0052] 在所述细胞中诱导坏死；以及
[0053] 向受试者施用表达HCV蛋白质的所述细胞，由此诱导针对HCV的促炎性的免疫反 应。
[0054] 本发明的进一步特征提供诱导细胞中的细胞死亡的步骤，所述步骤通过诱导坏死 进行。在细胞中诱导坏死的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导条件，例如（但不限于） 将免疫原呈递细胞加热到63°C，保持至少30分钟来进行。
[0055] 或者，诱导细胞中的细胞死亡的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导剂或使坏死 剂在细胞中表达（细胞中的内部表达，而非外部暴露于坏死剂）进行。坏死诱导剂的实例 可以包括（但不限于）胸苷激酶（TK)、穿孔素、颗粒酶、胱天蛋白酶、RIP蛋白质1和3、腺 病毒五邻体纤维、NSP4、链球菌溶血素0、炭疽杆菌溶血素、PB-F2和其功能性片段。
[0056] 在向受试者施用细胞的步骤后细胞可能进行溶解。
[0057] 在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的方法包 括以下步骤：
[0058] 使HCV蛋白质在APC或其它体细胞中表达，由此呈递HCV ;以及
[0059] 向受试者施用表达HCV蛋白质的APC，由此诱导针对HCV的促炎性的免疫反应。
[0060] 在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的方法包 括以下步骤：
[0061] 使HCV蛋白质在细胞中表达；以及
[0062] 向所述受试者施用表达HCV蛋白质的细胞，由此诱导针对HCV的促炎性的免疫反 应。
[0063] 本发明还提供一种核酸疫苗，其包含具有以下序列的核酸序列：
[0064] 第一核酸序列，其具有编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的第一核酸序列；以及
[0065] 第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列。
[0066] 核酸疫苗可以是DNA疫苗。
[0067] 第一序列和第二序列可以是双顺反子的。
[0068] 核酸疫苗可以进一步包括一种或多种启动子，例如（但不限于）CMV启动子或SV40 启动子。核酸疫苗还可以包括病毒性内部核糖体进入位点（IRES)，例如（但不限于）脑心 肌炎病毒（EMCV) IRES。
[0069] 在一个实施方案中，核酸疫苗包括：
[0070] 可操作地连接于第一核酸序列的CMV启动子；和
[0071] 可操作地连接于第二核酸序列的SV40启动子。
[0072] 核酸疫苗可以包括可操作地连接以例如通过脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点 (EMCV IRES)进行单顺反子表达的第一核酸序列和第二核酸序列，并在第一核酸序列与第 二核酸序列之间任选地包括插入核酸序列，所述插入核酸序列编码FMDV 2A蛋白酶或其它 自体蛋白酶序列。
[0073] 因此，在另一个实施方案中，核酸疫苗包括：
[0074] 可操作地连接于第一核酸序列的EMCV IRES。
[0075] 或者，具有编码蛋白酶裂解位点的DNA序列的核酸可以插入第一与第二核酸序列 之间，例如（但不限于）口蹄疫病毒2A蛋白酶序列。应了解，载体可以设计成能将口蹄疫 病毒2A蛋白酶核酸序列插入编码免疫原的上游第一核酸序列与编码具有坏死诱导活性的 多肽的下游第二核酸序列之间。所产生的融合蛋白将预期包括与蛋白酶和具有细胞死亡诱 导活性的多肽融合的免疫原。2A蛋白酶具有自我裂解活性，将预期其通过与翻译同时或在 翻译后裂解而产生作为独立蛋白质的上游和下游蛋白质。2A蛋白酶的氨基酸序列在本文中 描述为SEQ ID N0:8,且2A蛋白酶的DNA序列在本文中描述为SEQ ID N0:9。
[0076] 本发明还提供一种核酸疫苗，其包含：
[0077] 第一核酸序列，其具有编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列；
[0078] 第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列和
[0079] 在第一与第二核酸序列之间的插入核酸分子，其具有编码蛋白酶的核酸序列。
[0080] 本发明的进一步特征提供插入核酸分子具有口蹄疫病毒2A蛋白酶的核酸序列或 其功能性片段。
[0081] 本发明的更进一步特征提供具有坏死诱导活性的多肽，所述多肽选自（但不限 于）胸苷激酶（TK)、穿孔素、颗粒酶、胱天蛋白酶、RIP蛋白质1和3、腺病毒五邻体纤维、 NSP4、链球菌溶血素0、炭疽杆菌溶血素、PB-F2和其功能性片段。NSP4蛋白质可以来自轮 状病毒。或者，诱导细胞死亡的蛋白质可以选自（但不限于）：炭疽杆菌溶血素〇;人类或小 鼠穿孔素，包括野生型和突变形式（例如（但不限于）SEQ ID NO 7);腺病毒五邻体纤维； 颗粒酶A或B ;胱天蛋白酶1 ;链球菌溶血素0 ;甲型流感病毒蛋白质PB-F2和霍乱毒素。
[0082] 本发明进一步提供一种用于本发明的方法的核酸疫苗，其中：
[0083] 第一核酸序列包含编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的核酸序列；以及
[0084] 第二核酸序列包含编码免疫原性多肽的核酸序列。
[0085] 在本发明的另一个实施方案中，核酸疫苗进一步包含：
[0086] 编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列；和
[0087] 编码免疫原性多肽的第二核酸序列；
[0088] 其中第一核酸序列和第二核酸序列同框可操作地用于将具有坏死诱导活性的多 肽和免疫原性肽以融合蛋白形式表达。
[0089] 在本发明的另一个实施方案中，核酸疫苗进一步包含：
[0090] 第一核酸序列，其具有编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列；
[0091] 第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列；和
[0092] 在第一与第二核酸分子之间的插入核酸序列，其具有编码蛋白酶的核酸分子。
[0093] 归因于DNA密码的简并性，本领域技术人员非常了解在不改变所编码的多肽的氨 基酸序列下可以进行核苷酸取代。因此，本发明包括用于具有坏死诱导活性的多肽的任何 核酸序列，其包含编码毒性蛋白质（其能够诱导细胞坏死）的核酸序列和编码根据本发明 的免疫原性多肽的核酸序列。此外，本领域应了解，对于给出的蛋白质的氨基酸序列，在对 肽的功能无显著影响下可以进行序列中某些氨基酸的取代。此类取代在本领域中称为"保 守取代"。本发明涵盖根据本发明的核酸序列，其包含编码具有坏死诱导活性的多肽的第一 核酸序列和编码根据本发明的免疫原性多肽的第二核酸序列，其含有保守取代，其中细胞 坏死诱导多肽和根据本发明的免疫原性多肽的功能不改变。
[0094] 本发明延伸到融合蛋白，其包含：
[0095] 具有细胞坏死诱导活性的多肽；和
[0096] 免疫原性多肽。
[0097] 本发明还提供一种融合蛋白，其包含：
[0098] 具有细胞坏死诱导活性的多肽；
[0099] 免疫原性多肽和
[0100] 蛋白酶。
[0101] 本发明的进一步特征提供蛋白酶，所述蛋白酶为口蹄疫病毒2A蛋白酶或其功能 性片段。
[0102] 本发明还提供一种重组病毒疫苗，其包含
[0103] 根据本发明的核酸疫苗；和
[0104] 可操作地连接于用于在宿主细胞中表达具有细胞坏死诱导活性的多肽和免疫原 性多肽的核酸疫苗的核酸序列的调控表达元件。
[0105] 本发明的进一步特征提供重组病毒疫苗，所述重组病毒疫苗选自（但不限于）复 制型载体和复制缺陷型载体，其中载体不诱导细胞坏死。
[0106] 重组病毒疫苗可以选自杆状病毒载体；复制缺陷型病毒，包括选自来源于人类和 动物腺病毒、慢病毒、recVV、MVA、AAV、PAV的复制缺陷型病毒的病毒；复制型病毒，其包括 选自来源于人类和动物腺病毒、慢病毒、1^(："、1^4、44￥、？4￥的复制型病毒的病毒 ；和脂质 体/脂质体复合物（Iipoplex)和从流感病毒或类似的病毒产生的病毒体。
[0107] 本发明还提供一种表达载体，其包含
[0108] 根据本发明的核酸疫苗；和
[0109] 可操作地连接于用于在宿主细胞中表达具有细胞坏死诱导活性的多肽和免疫原 性多肽的核酸疫苗的核酸序列的调控表达元件。
[0110] 本发明的进一步特征提供表达载体，所述表达载体选自（但不限于）复制型载体 和复制缺陷型载体，其中载体不诱导细胞死亡。
[0111] 表达载体可以选自杆状病毒载体；复制缺陷型病毒，包括选自来源于人