，用T4DNA接合酶 (NEB)接合，并如上所述选择和测试阳性克隆。
[0322] NSP4基因通过PCR从表达构建体扩增，并通过用SmaI限制酶消化，插入pVAX-荧 光素酶质粒中在SV40启动子控制下和SV40聚腺苷酸化序列的上游，片段如上所述来接合 并选择（图9)。
[0323] 荧光素酶/PRF DNA疫苗的构建
[0324] 经修饰的荧光素酶基因从质粒扩增，并插入pVAX主链（Invitrogen)中在CMV启 动子控制下和BGH聚腺苷酸化序列的上游。pVAX质粒用NheI和EcoRl限制酶消化且经修 饰的荧光素酶2基因用T4DNA接合酶（NEB)接合到消化的pVAX中。DNA转化到电感受态 DH5ci大肠杆菌中并在卡那霉素琼脂板上选择阳性克隆。插入物的存在由再消化和DNA测 序来确认。
[0325] SV40启动子和聚腺苷酸化序列从质粒扩增。此质粒基于pcDNA3。SV40启动子和 SV40聚（A) +位点通过用限制酶PmlI消化来插入pVAX-荧光素酶主链中，用T4DNA接合酶 (NEB)接合，并如上所述选择和测试阳性克隆。
[0326] PRF基因通过PCR从表达构建体扩增，并通过用SmaI限制酶消化，插入pVAX-荧光 素酶质粒中在SV40启动子控制下和SV40聚腺苷酸化序列的上游，片段如上所述来接合并 选择（图10)。
[0327] 免疫接种时程
[0328] 八周龄的C57B1/6小鼠预抽血并在相隔5周的2个时刻，通过皮内途径（耳朵）， 用 50 μ g DNA，用单独 pVAXLUC、pVAXLUC-TK+/-GCV 或 pVAXLUC-NSP4 免疫接种。每 7 天通过 发光来测量荧光素酶表达，直到发光降低。四周以后，挑选小鼠并收集血液以检验体液对荧 光素酶的免疫反应。在分析抗体反应的进一步实验中，小鼠经由皮内途径，在第〇天、第28 天和第 56 天用 50 μ g pVAXLUC、pVAXLUC-TK+/-GCV、pVAXLUC-NSP4 或 LUC-PRF 免疫接种，并 在10天后测量抗体滴度。在分析细胞介导的免疫反应的实验中，pVAXLUC、pVAXLUC-NSP4、 PVAXLUC-TK+/-GCV 或 pVAXLUC-PRF 以及 pVAX、pVAXGagNSP4 或 pVAXGagPRF 免疫接种的小 鼠经由皮内途径以4周时间间隔接受3 X 50 μ g DNA，且10天后还通过ELIspot或细胞内细 胞因子染色检验免疫反应。
[0329] 荧光素酶的暂时表达
[0330] 从第1天起，使用Xenogen IVIS活体成像器检测发光。使小鼠镇静，接着通过腹 膜内途径注射150 μ L D-荧光素。进行10分钟孵育以允许表达DNA疫苗的荧光素酶与荧 光素反应后，小鼠置于Xenogen IVIS中并拍照。通过活体成像软件检测发光，以每秒的光 子数计（图11)。发光是当前荧光素酶表达的直接量度，因为荧光素酶仅仅具有3小时的半 衰期。因此，荧光素酶表达（图12)继续至少4周，且缓慢降低，直到第35天，其比第3天 低 l-21og 倍。
[0331] 初始DNA疫苗初免（第0天）后，在荧光素酶对照（pVAXluc、pVAXluc+GCV、 pVAXluc+TK)或具有佐剂的荧光素酶（pVAXluc+TK+GCV或+NSP4或+PRF)组之间未发现发 光水平的差异。所有群组都展示在第3天与第21天之间高水平的荧光素酶表达，且在第21 天与第35天之间表达缓慢减少,在此时间点其比第3天低l-21og倍。
[0332] DNA疫苗加强免疫后，pVAXluc+NSP4和pVAXluc+PRF群组展示与其它群组相比，荧 光素酶表达随着时间的推移更迅速地减少（图12)。额外的实验展示发光在第35天与第 49天之间完全消失，取决于最初的表达水平。
[0333] 免疫接种的小鼠中的抗荧光素酶抗体滴度
[0334] 重组萤火虫荧光素酶蛋白质用以涂布ELISA板，并在37°C下孵育小鼠血清的连续 稀释液一小时。接着用与辣根过氧化酶（HRP)缀合的抗小鼠 IgG检测抗荧光素酶IgG。与 邻苯二胺（OPD)底物一起孵育后，通过分光光度计测量底物中的变色。在2个时刻用50 μ g DNA免疫接种小鼠的初始实验展示通过Elisa检测的抗LUC的滴度对于LUC是1/256,且对 于LUC+NSP4DNA是1/4096。用TK/GCV处理产生类似的抗LUC抗体滴度，但无后一 GCV施用 的TK的共同表达对抗LUC滴度没有影响。接着在用pVAXLUC、pVAXLUC (后面施用GCV，作为 对照）或pVAXLUC+TK(后面未施用GCV)免疫接种的小鼠中测量抗荧光素酶抗体滴度并且 大概是1/10, 〇〇〇。在用pVAXLUC+TK (加后面施用GCV)或用pVAXLUC+NSP4免疫接种的小鼠 中，抗荧光素酶抗体滴度大概是1/20, 000,而用pVAXLUC+PRF免疫接种产生大概1/40, 000 的抗荧光素酶抗体滴度（图13)。重要的是，抗体滴度在pVAXLUC+NSP4和pVAXLUC+PRF免 疫接种的小鼠中更加迅速地升高（图13)。
[0335] 免疫接种的小鼠中细胞介导的对荧光素酶的反应
[0336] 通过ELIspot测量细胞介导的对荧光素酶的反应。最终免疫接种7天后，从小鼠收 获脾细胞，并用来源于荧光素酶的肽刺激。此实验的结果展示pVAXLuc+NSP4免疫接种使表 达IFN的细胞的频率增加3倍。类似地，用pVAXLuc+PRF免疫接种使IFN阳性细胞的频率 比用单独pVAXLuc免疫接种增加2倍，且多功能T细胞的频率增加2倍（图14、15、18-20)。
[0337] 本文中陈述的结果展示使用自杀基因疗法可以增加针对由DNA疫苗编码的特定 免疫原的免疫反应。此策略可以同等地应用于由复制缺陷型重组疫苗载体编码的免疫原乃 至复制型疫苗载体，两者通常都可以是非细胞溶解的。
[0338] 本文中陈述的结果还展示毒性蛋白质同时与免疫原组成性表达很可能由于交叉 呈递增加而使免疫性的水平增加。因此，不需要随后施用例如可以活化可诱导启动子的前 药或化合物等试剂，使得不再需要例如向患者施用更昔洛韦。虽然使用锌活化金属硫蛋白 启动子在动物中可能有效，但在人类中不可能同等有效，在人类中锌是一直存在的关键元 素。
[0339] 有效疫苗将必然地需要诱导不可能通过诱导细胞凋亡的自杀基因实现的发炎反 应。
[0340] 实施例3
[0341] 以下数据说明本发明的另一实施方案，其中小鼠细胞系DC 2. 4用编码HCV NS3蛋 白质的RNA转染。通过在63°C下热处理30分钟，使转染细胞坏死，从而产生本发明的同基 因疫苗。
[0342] 坏死的病毒抗原阳性细胞是高度免疫原性的
[0343] 进行坏死全细胞疫苗的临床前研究。所述策略的示意图展示于图16中。小 鼠细胞系DC2. 4用编码HCV NS3蛋白质的RNA (此RNA序列由R Trowbridge和EJ Gowans(Trowbridge R 及 Gowans EJ(1998). Molecular cloning of an Australian isolate of hepatitis C virus. Arch. Virol 143:501-511)和寄存在 Genebank 寄存编号 AJ000009下的序列）转染，且48小时后，通过将细胞加热到63°C，保持30分钟来诱导这些 细胞坏死。与用相同的活细胞系免疫接种相比，在6只小鼠的群组中用这些细胞皮下免疫 接种诱导更高的CMI反应（如通过代表免疫原性差的HCV NS3蛋白质的肽刺激的脾细胞的 ELIspot分析确定，在不同的实验中80-100倍）（图17)。在这些实验中，通过比较在蛋白 质印迹法（Western blot)中检测到的亮带的强度与市售纯化NS3的亮带强度，小鼠接受大 概IOOng NS3蛋白质。
[0344] 此外，坏死细胞引起的反应比用例如DNA免疫接种等其它（规范）免疫接种方案 检测高得多，所述免疫接种方案典型地产生约100个点形成单位/IO 6个细胞。
[0345] 实施例4
[0346] 按图3和4中描述的类似方式，来自HIV基因组的gag序列分别插入pVAX中 NSP4和PRF顺反子的上游，产生DNA疫苗pVAXgag+NSP4和pVAXgag+PRF。C57B1/6小鼠 用50 μ g这些DNA疫苗通过上述皮内途径，在相隔4周的3个时刻免疫接种。这些结果展 示在ELIspot分析中当脾细胞用所识别的gag免疫显性肽刺激时，与单独pVAXgag相比， pVAXgag+NSP4诱导分泌IFN的T脾细胞增加大概1. 5倍，而pVAXgag+PRF诱导增加 1. 3倍 (图 18)。
[0347] 为了更详细地分析这些反应，CD8+和CD8 _记忆细胞（CD44 +)用免疫显性gag肽 离体刺激并先后通过细胞内细胞因子染色与流动式细胞测量术检验IFN、TNF和IL-2 的表达。提出个别细胞中多种细胞因子的表达代表了能够防止攻击的成功疫苗的一种 先决条件（R Seder, PA Darrah 及 M Roederer(2008)T_cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev 8:247-258)。这些实验的结果 展示pVAXgag+NSP4使能够在个别细胞中合成所有三种细胞因子的CD8 +记忆细胞的频率增 加1. 7倍，而pVAXgag+PRF使其增加2. 7倍（图19)。
[0348] 同样地，虽然CD8+T细胞常常被识别成杀死病毒感染细胞的细胞，但表达多种细胞 因子的CD4+细胞是T细胞帮助所必需的。因此，还通过多色流动式细胞测量术检验来自免 疫接种小鼠的CD8'CD44 +记忆T细胞以分析个别细胞中IFN、TNF和IL-2的合成。结果展示， 虽然PVAX+NSP4展示在肽刺激后这些多功能T细胞的频率没有增加，但来自用pVAXgag+PRF 免疫接种的小鼠的T细胞展示此细胞群体增加3倍（图20)。
[0349] 实施例5
[0350] 材料与方法
[0351] 表达密码子优化的NS3glB的稳定的DC2. 4细胞系的制备
[0352] 所有实验都使用含有人类乙型肝炎病毒转译后调控元件（PRE)和HIV中央聚嘌 呤区（cPPT)元件的第三代慢病毒载体（Barry等人2001和Brown等人2010中描述）。为 使NS3glb过度表达，主链经重新工程化以含有延伸因子（EF)-I启动子（plvEIG)、Gateway 克隆位点（att，CAT ccdB att)和内部核糖体进入位点（IRES)，以推动编码绿色荧光蛋白 质的标记物基因（GFP)。为了产生HCV NS3递送载体，此主链经工程化，以在其中NS3盒进 行重组的Rev反应元件的上游含有Gate way盒（att, CAT ccdB att)。HCV NS3glb插入 在EF-I α启动子的控制下，且从IRES表达标记物基因（GFP)。为了产生NS3慢病毒原液， HEK293T细胞以6X IO6个细胞的密度接种于75cm2组织培养瓶中的18ml培养基中。根据 标准方案，使用 Lipofectamine LTX 试剂（Invitrogen)和 Opti-MEM(Invitrogen)减血清 培养基，细胞用 12. 5g NS3 转移载体（plvEIG)、7. 5g Gag/Pol (8. 2)、6. 25g Rev(pRSV-Rev) 和3. 75g Env (pCMV-VSV-G)转染。第二天，培养基换成IOml新鲜RPMI，且48小时后，收集 上清液，过滤（孔径，0. 45m)，且立刻使用或冷冻储存（_70°C )。
[0353] 为转导鼠类DC2. 4细胞系，细胞以每孔2 X IO5个细胞的密度接种在6孔板中。培 养基换成3ml含有8g/ml的最终浓度的聚凝胺的病毒上清液（未浓缩）。NS3-GFP阳性细 胞通过流动式细胞测量术（FACSAria;BD Biosciences，San Jose, CA)分选，直到纯度到达 96%。
[0354] 表达密码子优化的NS3glB的坏死稳定的DC2. 4细胞系的刺激
[0355] NS3DC2. 4细胞在PBS中再悬浮。细胞加热到63°C，保持30分钟，以诱导坏死。通 过锥虫蓝染色和流动式细胞测量术确认坏死。
[0356] 坏死细胞的流动式细胞测量术检测
[0357] 坏死NS3DC 2. 4细胞通过流动式细胞测量术（FACSCanto, BD Biosciences, San Jose, CA)分析。通过检查DC2. 4的FFC和SSC特征确认坏死。
[0358] 结果
[0359] 坏死细胞的流动式细胞测量术检测
[0360] 制备稳定的DC2. 4细胞系，其表达密码子优化的NS3glb。收集表达密码子优化的 NS3glB的稳定DC2. 4细胞的97. 56%样品（图21A)。在转导7-8天后，使用标准流动式细 胞测量术分选技术，收集GFP阳性转导细胞的此群体。第四次分选后，GFP阳性细胞的纯度 提高到 93-95% (图 21B-F)。
[0361] 制备七个稳定的DC2. 4细胞系克隆。如使用上述流动式细胞测量技术检测，每一 克隆细胞系的GFP阳性细胞的百分比在52. 1 %到82. 8%之间变化（图22A-G)，门控参数在 图22H中说明。
[0362] 单剂坏死或活免疫接种后的细胞活化动力学
[0363] 代表所制备的表达NS3glb的稳定DC2. 4细胞系的活或坏死细胞的单剂IO6个细 胞施用小鼠，并在第〇、2、3、5和7天取样。从引流LN(局部）和脾（全身性）取样，并针对 以下进行分析：i)T细胞活化（⑶3/⑶4/⑶8/⑶25/⑶69) ;ii)DC活化（⑶Ilc/⑶8/MHCII/ CD80/CD86) ;iii)Clec9A DCs(Clec9A/CDllc/CD8/MHCII/CD4) ;iv)免疫接种后引流 LN 中 GFP表达；和V)引流LN中细胞数。
[0364] 图23展示在免疫接种后第2、3、5和7天GFP阳性细胞的频率。图24A-D展示第 2、3、5和7天DLN中的GFP表达。发现2、3和5天后DLN中坏死GFP阳性细胞的频率显著 增加。7天后，活GFP阳性细胞的频率显著增加。
[0365] 单剂坏死或活疫苗后DLN中⑶Ilcs细胞
[0366] 如图25中所示，免疫接种5天后，LN中坏死细胞的数目相对于活细胞的数目显著 增加。然而，DLN中坏死0011(^细胞的数目在免疫接种7天后最高（图26)。关于频率和 总细胞数，坏死CDlIcs细胞相对于活细胞的频率在免疫接种5天后显著增加（图27)。
[0367] DLN中坏死⑶Ilcs 细胞的频率不随时间显著变化（图28)。然而，DLN中坏死 ⑶Ilcs CD8细胞的数目在免疫接种7天后最高（图29)。
[0368] DLN中坏死⑶Ilcs ra8+Clec9A+细胞的频率不随时间显著变化（图30)。然而， 免疫接种5天和7天后，DLN中坏死⑶Ilcs ro8+Clec9A+细胞的数目比活细胞显著高（图 31)。
[0369] 免疫接种2天后，DLN中坏死⑶Ilcs ra8+MHCII+Clec9A+细胞的频率比活细胞显 著高（图32)。
[0370] 加强剂量的坏死或活疫苗后DLN中NS3细胞
[0371] 小鼠用IO6个细胞初始剂量免疫接种，接着7天后类似地施用加强剂量。施用加 强剂量14天后取样并收集3池的NS3细胞。
[0372] 如图33A-D和图34中所示，所有三个池中，与用活NS3细胞免疫接种的小鼠比较， 在用坏死NS3细胞免疫接种的小鼠中分泌干扰素-γ的细胞的数目显著更大，表明在用坏 死细胞免疫接种的小鼠中所有池的IFNg反应更大。
[0373] 与NS3阳性活细胞比较，在用NS3阳性坏死细胞免疫接种的小鼠中NS3刺激的细 胞分泌的IL-2、TNF和IFNg的量显著增加（图36-38)。
[0374] 实施例6
[0375] 材料与方法
[0376] 为了检验用HCV抗原阳性的坏死树突状细胞免疫接种对HCV感染结果的潜能，对 许多先前用常规的基于干扰素的疗法失败的HCV阳性人类个体免疫接种。获取基线血液 样品。在用HCV抗原阳性的坏死树突状细胞免疫接种前四周，每个患者用干扰素-处理总 共4周。在用细胞免疫接种前一周，从患者获取血液样品并从每个患者制备单核细胞衍生 的树突状细胞（Mo-DC)，如先前所述（Gowans EJ, Roberts S, Jones K, Dinatale I, Latour PA, Chua B, Eriksson EMY, Chin R, Li S, Wall DM, Sparrow RL, Moloney J, Loudovaris M, Ffrench R, Prince HM, Hart D,Zeng ff, Torresi J, Brown LE, Jackson DC(2010) · A phase I clinical trial of dendritic cell immunotherapy in HCV-infected individuals. J H印atology. 53 (4) : 599-607)，此过程耗费5天。基本上，外周血标本收集在9ml肝素锂 vacutainer 管（Becton Dickinson)中。对于每 15ml 血液，等体积的 RPMI (R-) (Invitrogen) 通过在50ml Falcon离心管中旋动来混合。接着使用注射器和套管将Ficoll-paque溶液 铺在30ml稀血液下面。管置于气溶胶密封的离心机中，并在22°C下在400g下离心30分 钟。
[0377] 使用注射器/套管吸出浑浊的单核细胞界面。接着将细胞转移到另一个新制的无 菌50ml管（Falcon)中并使用RPMI洗涤细胞来补足到45ml体积。接着细胞在室温下在 400g下离心8分钟。弃去上清液并将来自每个管的细胞汇集到50ml离心管中，并再悬浮于 MACS缓冲液（PBS、2mM EDTA、1% BSA)中，浓度为2. 5X IO8个细胞/毫升。接着CD14微珠 粒（Miltenyi Biotec)以每IX IO7个细胞20ul添加到细胞中。此混合物在4°C下孵育15 分钟，并接着用MACS缓冲液洗涤。接着细胞施加于由MACS磁铁供应的磁场中的LS+MACS 柱（Miltenyi)。使⑶14阴性细胞通过柱以废弃。接着从磁铁去除柱，且通过使用试剂盒中 供应的柱塞，施加 IOml MACS缓冲液，从柱洗脱CD14阳性细胞。接着CD14阳性单核细胞用 MACS 缓冲液洗涤，并在具有 1000U/ml GM-CSF(Berlex)和 IL-4(R&D Systems)的 Aim-V 培 养基（Inv