一种抑制血管新生或生长的融合蛋白及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制血管新生或生长的融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 在正常生理条件下，血管的生成是一个受多个环节严密调节的过程，对修复和维 持机体的正常功能具有重要的作用。然而，如果肿瘤内部血管快速生长，则是临床常见的现 象之一。大量的动物模型和人体临床试验表明，阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻 止肿瘤的生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗作用。因此，抑制血管新生是 目前抗肿瘤新药研宄的重要方向之一。大分子抗新生血管药物如Avastin已经过美国FDA 的上市批准，同时还有更多的药物处于不同的临床前和临床研宄阶段。另外，对于老年性视 网膜血管病变（Age-related macular degeneration，简称为AMD)、糖尿病视网膜病变、关 节炎等多种与血管新生相关的疾病，抑制血管新生的治疗新药也有广泛和重要的作用。
[0003] 血管新生是一个由多种活性生物因子进行调控的复杂过程，其中一个关键环节是 内皮细胞表面受体与多种生长因子相结合从而被激活，然后经细胞内酪氨酸磷酸化的信号 传递系统控制内皮细胞活动，从而促使血管新生。在多种生长因子中，血管内皮细胞生长因 子（Vascular endothelial cell growth factor，简称为VEGF)是控制血管新生最重要的 因子，是诱导和促进血管形成作用最强、最专一的血管生长因子，在几乎所有的人体肿瘤中 都过量表达，是抗癌研宄的一个重要分子靶标。VEGF在血管内皮细胞表面上有多种受体，其 中包括VEGFR-I (又称为Flt-I)和VEGFR-2 (又称为KDR或Flk-I)，它们的细胞外部分均由 七个可与VEGF相结合的免疫球蛋白样区域（D1-D7)组成，细胞内部分均包括酪氨酸激酶基 团。当受体被VEGF激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团发生磷酸化，并导致一系列的信号传 递，最终引发血管新生。由于VEGF信号传递对血管新生的重要性，阻断VEGF或VEGF受体 从而达到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同时也对其他包括视网膜血管病变等与血管 新生相关的疾病有着重要的治疗作用。
[0004] 融合蛋白药物的稳定性对于生物技术应用具有重要影响，也是提高药物质量以及 药物能够工业化生产的关键。蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改 变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。变性作用是 蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。蛋白热稳定检测能 够有效的确定蛋白的变性，从而用于蛋白质药物研发过程中蛋白质稳定性的检测，其主要 是采用紫外激发光照射蛋白质样品使其发射出荧光，由于蛋白质所发射荧光的波长和光强 度与其结构的变化是一一对应的，所以据此可以精确地检测出蛋白质样品的变性温度Tm。 另外，同时采用紫外激发光应用静态光散射（Static Light Scattering)技术检测蛋白质 的聚集状况，蛋白质样品聚集和非聚集状态下其光强度有非常显著的变化，所以据此可以 精确的检测出蛋白质样品的聚集温度Tagg(aggregation onset temperature);蛋白的变 性温度Tm和聚集温度Tagg能够有效的反映生物蛋白分子的稳定性。
[0005] 生物大分子药物开发过程中制约因素包括药物疗效、药物的稳定性、药物是否能 够工业化生产等等，寻求一种疗效确切、稳定性高的抑制血管新生或生长的药物是十分必 要的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种疗效确切、稳定性高的抑制血管新生或生长的融合蛋 白，该融合蛋白通过阻断VEGF信号传递，从而抑制血管新生或生长。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明一方面提供一种抑制血管新生或生长的融合蛋白，该融合蛋白由人VEGF 受体片段与人免疫球蛋白Fc片段连接而形成，其中所述VEGF受体片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5 所示。
[0009] 在进一步的实施方式中，所述融合蛋白的人免疫球蛋白Fc片段选自如下序列之 一 ：IgGlFc(氨基酸序列为SEQ ID N0:7)、IgG2Fc(氨基酸序列为SEQ ID N0:8)、IgG3Fc(氨 基酸序列为SEQ ID NO:9)和IgG4Fc(氨基酸序列为SEQ ID NO: 10)。
[0010] 在更进一步的实施方式中，本发明的融合蛋白为：
[0011] KH02,其氨基酸如 SEQ ID NO: 14 所示；
[0012] KH03,其氨基酸如SEQ ID NO: 16所示；或
[0013] KH04,其氨基酸如 SEQ ID NO: 18 所示。
[0014] 在另一方面，本发明提供编码所述融合蛋白的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序 列为：
[0015] kh02,编码融合蛋白KH02,其核苷酸如SEQ ID NO: 13所示；
[0016] kh03,编码融合蛋白KH03,其核苷酸如SEQ ID NO: 15所示；或
[0017] kh04,编码融合蛋白KH04,其核苷酸如SEQ ID N0:17所示。
[0018] 在另一方面，本发明提供一种表达所述融合蛋白的表达载体或宿主细胞，所述表 达载体包含上述融合蛋白的核苷酸序列。所述表达载体可以是重组真核表达载体，优选哺 乳动物细胞表达载体；也可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。所述表 达载体能在转化的宿主细胞中复制表达，优选地，所述宿主细胞为CHO细胞及其亚系或293 细胞及其亚系。
[0019] 在另一方面，本发明提供一种制备所述融合蛋白的方法，包括将上述表达载体引 入合适的宿主细胞中，进行融合蛋白的表达。
[0020] 在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包括本发明的融合蛋白和药学上可 接受的载体或赋形剂；所述载体或赋形剂为本领域常规使用的载体或赋形剂。优选地，所述 药物组合物的制剂形式为注射剂、注射用冻干粉针或眼用凝胶；可以用本领域已知的方法 制备所述制剂。
[0021] 在另一方面，本发明提供了上述融合蛋白在制备治疗由血管新生或生长引起的疾 病的药物中的用途；其中所述由血管新生或生长引起的疾病优选为肿瘤或眼部新生血管引 起的疾病，所述眼部新生血管引起的疾病优选为年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、 脉络膜视网膜病变等。
[0022] 本发明融合蛋白的热稳定性高，使得其在发酵过程中的蛋白聚合体形成率明显下 降，显著提高了蛋白纯度和产量，同时本发明的融合蛋白具有较优的生物学活性。
【附图说明】
[0023] 图1为VEGF受体融合蛋白的热变性倾向性检测结果图；图中曲线反映蛋白分子内 在荧光峰值随温度升高情况，其中，纵坐标BCM(nm)为内在荧光峰值，横坐标为温度。
[0024] 图2为VEGF受体融合蛋白的热聚合倾向性检测结果图；图中曲线反映蛋白分子的 静态光散射强度随温度变化情况，其中，纵坐标SLS at 266nm为静态光散射强度，横坐标为 温度。
[0025] 图3为VEGF受体融合蛋白抑制VEGF诱导HUVEC细胞增殖作用结果图；其中，横坐 标为融合蛋白浓度，纵坐标为CCK-8法检测细胞活力的吸光值。
[0026] 图4为VEGF受体融合蛋白抑制VEGF诱导HUVEC细胞迀移作用结果图；其中，横 坐标为融合蛋白与VEGF的摩尔浓度比，纵坐标为占总迀移的百分比总迀移率=(F fusim _in-Fbasal) AF t(rtal-Fbasal)，U培养基组的荧光均值，F total指VEGF组的荧光均值， Ffusim _ein指不同摩尔比的融合蛋白与VEGF组的荧光均值。
【具体实施方式】
[0027] 现通过以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本 发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作 的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
[0028] 序列说明：
[0029] 人VEGF受体片段1 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，核苷酸序列为SEQ ID NO: 2 ;
[0030] 人VEGF受体片段2 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 3,核苷酸序列为SEQ ID NO: 4;
[0031] 人VEGF受体片段3 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 5,核苷酸序列为SEQ ID NO: 6 ;
[0032] 融合蛋白KHOl :氨基酸序列为SEQ ID NO: 12,核苷酸序列为SEQ ID NO: 11 ;
[0033] 融合蛋白KH02 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 14,核苷酸序列为SEQ ID NO: 13 ;
[0034] 融合蛋白KH03 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 16,核苷酸序列为SEQ ID NO: 15 ;
[0035] 融合蛋白KH04 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 18,核苷酸序列为SEQ ID NO: 17。
[0036] 融合蛋白KH05 :氨基酸序列为SEQ ID NO: 20,核苷酸序列为SEQ ID NO: 19。
[0037] 实施例1:融合蛋白的制备
[0038] 材料或试剂
[0039] PCR 试剂盒（含 5 X 缓冲液、dNTP 和 Phusion 酶）：M0530L，NEB 公司
[0040] 琼脂糖凝胶电泳：IQ300, GE公司
[0041] 缓冲液 4 (lot :0101201) :NEB 公司
[0042] Avr II : ROl 74L，NEB 公司
[0043] BstZ17I :R0594L，NEB 公司
[0044] PCR产物纯化试剂盒：QIAGEN公司，CAT: 28106
[0045] 10 X T4 缓冲液：B0202S，NEB 公司
[0046] T4DNA 连接酶：M0202L，NEB 公司
[0047] ToplO 大肠杆菌：CB104, TIANGEN 公司
[0048] 2YT (AMP)平板培养基：上海锐聪实验室设备有限公司
[0049] Freedom?CH〇-STMKit 试剂盒：A13696-01，LIFE TECHNOLOGIES 公司
[0050] Clone Pix FL :Genetix 公司
[0051] HiTrap蛋白A琼脂糖亲和层析柱：HiTrap蛋白A HP，5x Iml ;GE公司
[0052] PBS缓冲液（20mM磷酸盐，pH 7. 4) :SD117-500ml，上海生物工程有限公司
[0053] ForteBio生物分子相互作用仪：0ctet QKe, Pall公司
[0054] 蛋白质热稳定性分析仪：0ptim2, Avacta公司
[0055] VEGF :R&D 公司
[0056] NHS-LCLC-Biotin :Thermo 公司
[0057] 1、包含融合蛋白编码序列的质粒的构建
[0058] 1.1基因和引物合成
[0059] 由北京金唯智公司合成合成片段1(SEQ ID NO: 21)和2 (SEQ ID NO: 22)以及引 物Pl-PlO(序列分别如SEQ ID N0:23-32所示），并将合成片段1和2重组至质粒载体 pUC19(北京金唯智公司）中。合成片段1包括编码人VEGF受体片段的核苷酸序列和信号 肽序列，合成片段2包含人IgGlFc的编码序列。合成片段1和2作为构建各融合蛋白的模 板，利用下述引物通过PCR方法构建出本发明的融合蛋白的编码序列。
[0060] 1. 2融合蛋白编码序列的获得
[0061] 每种融合蛋白的编码序列分为两个部分进行扩增，第一部分为人VEGF受体片段， 第二部分为人IgGlFc片