段。每个部分通过各自的特异引物获得相应的目的片段，再通过叠 加 PCR的方式将人VEGF受体片段和人IgGlFc片段拼接，最终获得全长基因序列。第一、二 两个部分扩增PCR反应体系均为（总体积50 μ I) :5X缓冲液10 μ l、dNTP2 μ 1、特异上下游 引物各1 μ I、模板（上述合成片段1或合成片段2) 1 μ I、Phusion酶（PCR保真酶）0. 5 μ I， 最后用双蒸水补至50μ1 ;反应条件：98°C预变性30s，98°C 10s、68°C 2min，10个循环， 98°C 10s、55°C 30s、72°C 50s，30 个循环，最后 72°C 5min。【具体实施方式】为：kh02 :第一部 分引物对为Pl和P6,模板为合成基因1 ;第二部分引物对为P5和P2,模板为合成基因2。 kh03 :第一部分引物对为Pl和P8,模板为合成基因1 ;第二部分引物对为P7和P2,模板为 合成基因2。kh04 :第一部分引物对为Pl和P10,模板为合成基因1 ;第二部分引物对为P9 和P2,模板合成基因2。蛋白KHOl的编码序列（khOl):第一部分引物对为Pl和P4,模板为 合成基因1 ;第二部分引物对为P3和P2,模板合成基因2。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检 测。共获得 8 种相关片段，分别为 kh01-Q、kh01-H、kh02-Q、kh02-H、kh03-Q、kh03-H、kh04-Q 和kh04-H。重叠 PCR反应体系为（总体积50 μ I) :5X缓冲液10 μ 1、dNTP 2 μ 1、模板为 上述分别扩增的对应的第一和第二片段各1 μ 1 (如：扩增khOl全长，使用对应的kh01-Q和 khOl-Η回收PCR产物各1 μ 1)、上下游引物各1 μ I (Pl，P2)、Phusion酶0. 5 μ 1，最后用双 蒸水补至5(^1;反应条件：98°〇预变性308,98°〇108、55°〇308、72°〇508,30个循环，最后 72°C 5min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳（IQ300, GE公司产品）检测。共获得4种基因片 段，分别命名为khOl-Ι (对应SEQ ID NO: 11 (PCR扩增产物同SEQ IND NO: 11相比多了信号 肽编码序列）、kh02-l(对应序列为SEQ ID N0:13(多了信号肽编码序列））、kh03-l(对应 序列为SEQ ID N0:15(多了信号肽编码序列））、kh04-l(对应序列为SEQ ID N0:17(多了 信号肽编码序列））。通过电泳检测，获得扩增片段大小与预期一致。
[0062] 1. 3载体和基因片段的酶切处理
[0063] 对pCHOL 0质粒（购买自 life technologies，货号：A13696-01)、kh01-l、kh02-l、 kh03-l、kh04-l扩增片段分别进行双酶切处理，酶切体系为：在I. 5ml EP管中分别加入 如下成分：pCHOL 0质粒或kh01-l、kh02-l、kh03-l、kh04-l扩增片段40 μ 1，IOX缓冲液 4(ΝΕΒ)10μ1，Avr II (R0174L，NEB)和 BstZl7I(R〇594L，NEB 公司产品）各 5μ1，灭菌水 45 μ 1，混匀后在37°C下反应5h，利用PCR产物纯化试剂盒（CAT:28106, QIAGEN)回收。
[0064] 1.4重组质粒的连接转化
[0065] 在T4DNA连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的pCHOL 0片段（Avr II和 88七2171酶切大片段，约13吐）和吐01-1、吐02-1、吐03-1、吐04-1仏￥1'11和88七2171酶切） 片段连接。连接反应体系如下：在I. 5ml EP管中分别加入如下成分pCHOL 0片段（Avr II 和 BstZ17I)2yl，kh01-l、kh02-l、kh03-l、kh04-l(Avr II 和 BstZ17I 酶切）片段 6μ1， 10ΧΤ4 缓冲液（B0202S，NEB) 1 μ 1，T4DNA 连接酶（M0202L，NEB) 1 μ 1，混匀后在室温（20°C 左右）下反应4h以上，连接产物转化至ToplO大肠杆菌（CB104, TIANGEN)感受态细胞中， 涂布于2YT (AMP)平板培养基（上海锐聪实验室设备有限公司产品）上37°C静止过夜，平板 编号分别为 khO I、kh02、kh03、kh04。
[0066] I. 5重组质粒的菌落PCR筛选
[0067] 从khOl、kh02、kh03、kh04平板中各挑取数个重组单菌落经过37°C，静止培养 3-5h。培养后作为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定。菌液PCR扩增反应体系（总体 积 20yL):2XTaq HS(R013A，TAKATA)10yL、菌液模板 2yL、上下游引物（Pl 和 P2)各 IuU终浓度0·3μπιο1/υ，最后用双蒸水补至20yL;反应条件：94°C 3min，94°C 60s、 53°〇6〇8、72°0 12〇8,30个循环，最后72°0 51^11。结果显示，所有菌落均能扩增出1.610^左 右的目的条带，表明均为阳性克隆。
[0068] 1. 6重组质粒的酶切鉴定
[0069] 将通过菌落PCR鉴定正确的菌落接种后提取质粒再进行酶切鉴定。首先进行重组 菌的质粒提取，然后进行酶切分析，酶切体系：在I. 5ml EP管中加入如下成分：质粒2 μ 1， 10Χ缓冲液41 μ l，Avr II和BstZ17I各1 μ 1，补灭菌水至10 μ 1，混匀后在37°C下反应4h。 通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示均能酶切出I. 6Kb左右目的条带，所挑取的克隆均为 阳性克隆。
[0070] 1. 7重组质粒的测序鉴定
[0071] 将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落送至苏州金唯智生物科技有限公司进行 测序鉴定。测序结果与预期一致。表达质粒保存备用，将测序成功克隆进行如下编号： khoi-l 编号为 610, kh02-l 编号为 711，kh03-l 编号为 812, kh04-l 编号为 915。
[0072] 2、质粒转染及细胞筛选
[0073] 采用 Freedom?CH〇-STMKit 试剂盒（A13696-01，LIFE TECHNOLOGIES)中宿主细胞 CHO-S，按说明书进行质粒转染。本实验分别转染4种质粒：610、915、812、711，转入质粒的 细胞分别置于摇瓶培养，培养基为⑶FortiCHO培养基（购买自life technologies)，培养 条件为37°C、8% C02、110rpm/min，培养48h，以细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。
[0074] 转染48h后进行两步加压筛选：10P/100M，20P/200M(P= lOyg/mL嘌呤霉素，M = nM甲氨蝶呤（MTX)) ;30P/500M，50P/1000M，培养基为CD-FortiCHO培养基，获得初筛细胞， 即610、915、812、711(即分别包含上述对应的质粒）。继续进行单克隆细胞筛选，接种活细 胞密度500个/mL，每个转染48h后获得的初筛细胞群体接种8个6孔板，细胞培养箱内培 养一周。焚光显微镜下观察各孔板细胞克隆生长情况，采用Clone Pix FL(Genetix)挑取 单克隆细胞，通过检测蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。
[0075] 3、蛋白表达、纯化和鉴定
[0076] 选取高产克隆细胞，从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至 50mL摇瓶生长。
[0077] 收集培养4-6天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0. 45 μπι滤膜过 滤，调节pH至7. 4,用HiTrap蛋白A亲和层析柱（HiTrap蛋白A HP，5X Iml ;GE)纯化融合 蛋白；用5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积的PBS缓冲液（20mM磷酸盐， pH 7. 4) (SD117-500ml，上海生物工程有限公司）平衡柱子，上样，收集流出液检测，用10倍 体积PBS缓冲液稀释液（0. 02mol/L磷酸盐，pH 7. 4)洗涤除去杂蛋白，然后使用0.1 M甘氨 酸缓冲液（PH3)将目的蛋白从柱上洗脱，以SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳）检测几种蛋 白纯度都在90%以上。
[0078] 实施例2蛋白纯度及表达产量分析
[0079] 采用SEC-HPLC技术，分析检测发酵液蛋白纯度，另采用ForteBio生物分子相互作 用仪（Octet QKe，Pall公司）检测实施例1中各蛋白表达量，结果如表1显示：融合蛋白 KH02-KH04的表达量和纯度均优于KHOl蛋白，其中融合蛋白KH02在纯度及产量上最具优 势，即使在培养第9天，无营养物添加的条件下，蛋白纯度仍能维持在80%以上。
[0080] 表1 :蛋白的细胞培养上清纯度分析比较
[0081]
【主权项】
1. 一种抑制血管新生或生长的融合蛋白，所述融合蛋白由人VEGF受体片段与人免疫 球蛋白Fc片段连接而形成，其中所述VEGF受体片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5 所示。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc片段选自如下 片段之一 ：IgGlFc、IgG2Fc、IgG3Fc和 IgG4Fc ;优选地，IgGlFc 的氨基酸序列如 SEQ ID N0:7 所示，IgG2Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，IgG3Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所 示，IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
3. 根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为： KH02,其氨基酸如SEQ ID NO: 14所示； KH03,其氨基酸如SEQ ID NO: 16所示；或 KH04,其氨基酸如SEQ ID NO: 18所示。
4. 一种编码如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列；优选地，所述核苷 酸序列为 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 17 所示序列。
5. -种表达如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的表达载体或宿主细胞，其包含如 权利要求4所述的核苷酸序列；优选地，所述表达载体是真核表达载体或病毒表达载体；更 优选地，所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体，所述病毒表达载体为腺相关病毒或 腺病毒载体；优选地，所述宿主细胞为CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系。
6. -种制备如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的方法，包括将权利要求5所述的 表达载体引入合适的宿主细胞中，进行融合蛋白的表达。
7. -种药物组合物，包括如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载 体或赋形剂；优选地，所述药物组合物的制剂形式为注射剂、注射用冻干粉针或眼用凝胶。
8. 根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白在制备治疗由血管新生或生长引起的疾 病的药物中的用途；优选地，所述由血管新生或生长引起的疾病为肿瘤或眼部新生血管引 起的疾病；更优选地，所述眼部新生血管引起的疾病为年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜 病变或脉络膜视网膜病变。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制血管新生或生长的融合蛋白、其编码序列、包含该编码序列的载体、宿主细胞、药物组合物以及所述融合蛋白的制药用途。本发明融合蛋白的热稳定性高，其在发酵过程中的蛋白聚合体形成率明显下降，显著提高了蛋白纯度和产量，并且本发明的融合蛋白具有较优的生物学活性。
【IPC分类】A61P27-02, C07K19-00, A61K38-17, A61K47-48, A61P35-00, A61P9-10, C12N15-62
【公开号】CN104804097
【申请号】CN201510036141
【发明人】柯潇
【申请人】成都康弘生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年1月23日
【公告号】WO2015110067A1