人源化抗c-met 拮抗剂的制作方法
【专利说明】人源化抗C-MET拮抗剂
[0001] 本申请是申请日为2005年08月04日、中国申请号为201210336983. 7(原申请号 200580033792. 1)、发明名称为"人源化抗C-MET拮抗剂"的发明分案申请的再分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 此申请是根据37 CFR 1.53(b) (1)提交的非临时申请，根据35 USC 119(e)要求 2004年8月5日提及的临时申请60/598, 991的优先权，将其完整内容收入本文作为参考。
[0004] 生物材料的保藏
[0005] 以下生物材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA) (ATCC)：
[0006] 保藏物 保藏日期 保藏编号
[0007] 杂交瘤，1A3.3.13 1995-05-23 HB-11894
[0008] 杂交瘤，5D5.11.6 1995-05-23 HB-11895
技术领域
[0009] 一般而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调控领域。更具体的说，本发明涉及 HGF/c-met信号途径的调节物，及所述调节物的用途。
[0010] 背景
[0011] HGF是间充质衍生的多效因子，对许多不同细胞类型具有促有丝分裂、促运动 和促形态发生活性。HGF作用是通过特定的酪氨酸激酶c-met介导的，而且在多种肿 瘤中经常观察到异常HGF和c-met表达。参见例如Maulik et al.，Cytokine&Growth Factor Reviews(2002), 13:41-59 ；Danilkovitch-Miagkova&Zbar, J. Clin. Invest. (2002)，109(7) :863-867。在肿瘤进展和转移中牵涉HGF/c-Met信号途径的调控。参见例 如 Trusolino&Comoglio, Nature Rev. (2002)，2:289_300〇
[0012] HGF结合Met受体酪氨酸激酶（RTK)的胞外域并调控不同生物学过程，诸如细 胞分散、增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发育是至关重要的，尤其是在肌 肉祖细胞迀移及肝和神经系统发育中（Bladt et al·，1995 ;Hamanoue et al·，1996; Maina et al·，1996 ;Schmidt et al·，1995 ;Uehara et al·，1995)。Met 和 HGF 敲除小 鼠的发育表型非常相似，表明HGF是Met受体的关联配体（Schmidt et al.，1995 ;Uehara et al.，1995)。HGF-Met还在肝再生、血管发生和伤口愈合中发挥作用（Bussolino et al.，1992 ;Matsumoto and Nakamura, 1993 ;Nusrat et al.，1994)。Met 受体前体经蛋白水 解切割成由二硫键连接的胞外α亚基和跨膜β亚基（Tempest et al.，1988)。β亚基包 含胞质激酶结构域，而且在C末端包含多底物停靠位点，衔接物蛋白质在此结合并起动信 号传导（Bardelli et al.，1997 ;Nguyen et al.，1997 ;Pelicci et al.，1995 ;Ponzetto et al.，1994 ;Weidner et al.，1996)。HGF 结合后，Met 活化分别经由 Gabl 和 Grb2/Sos 介导的PI3激酶和Ras/MAPK活化而导致酪氨酸磷酸化和下游信号传导，它驱动细胞运动 和增殖（Furge et al.，2000 ;Hartmann et al.，1994 ;Ponzetto et al.，1996 ;Royal and Park, 1995) 〇
[0013] Met据显示在经致癌原处理的骨肉瘤细胞系中正在转化（Cooper et al.，1984 ; Park et al.，1986)。已在多种人癌症中观察到Met过表达或基因扩增。例如，Met蛋白在 结肠直肠癌中过表达至少5倍，且据报道在肝转移中有基因扩增（Di Renzo et al.，1995; Liu et al.，1992)。Met蛋白据报道还在口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、乳癌和肺 癌中过表达（Jin et al.，1997 ;Morello et al.，2001 ;Natali et al.，1996 ;01ivero et al.，1996 ;Suzuki et al.，1994)。此外，已在肝细胞癌、胃癌和结肠直肠癌中观察到mRNA 过表达（Boix et al.，1994 ;Kuniyasu et al.，1993 ;Liu et al.，1992) 〇
[0014] 已在肾乳头状癌中发现Met激酶结构域中的许多突变，它们导致组成性受体活 化（Olivero et al.，1999 ;Schmidt et al.，1997 ;Schmidt et al.，1999)。这些活化突 变造成组成性Met酪氨酸磷酸化，并导致MAPK激活、病灶形成和肿瘤发生（Jeffers et al·，1997)。此外，这些突变增强细胞运动和侵入（Giordano et al·，2000 ;Lorenzato et al.，2002)。转化细胞中HGF依赖性Met活化介导运动、分散和迀移增加，最终导致侵入性 肿瘤生长和转移（Jeffers et al.，1996 ;Meiners et al.，1998) 〇
[0015] Met已显示与驱动受体活化、转化和侵入的其它蛋白质相互作用。在肿瘤细胞中， Met据报道与κ 6 κ 4整联蛋白相互作用以促进HGF依赖性侵入性生长，κ 6 κ 4整联蛋白是 胞外基质（ECM)组分诸如层粘连蛋白的受体（Trusolino et al.，2001)。此外，Met胞外 域已显示与脑信号蛋白家族的成员丛蛋白Bl相互作用，且增强侵入性生长（Giordano et al.，2002)。而且，已知牵涉肿瘤发生和转移的⑶44v6据报道也与Met和HGF形成复合物 并导致 Met 受体活化（Orian-Rousseau et al.，2002) 〇
[0016] Met是包括Ron和Sea在内的RTK亚家族的成员（Maulik et al·，2002)。Met胞 外域的结构预测表明它与脑信号蛋白和丛蛋白共享同源性。Met的N末端包含约500个 氨基酸的Sema结构域，它在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白 属于首先因其在神经发育中的作用而描述的一个分泌和膜结合蛋白质大家族（Van Vactor and Lorenz, 1999)。不过，新近将脑信号蛋白过表达与肿瘤侵入和转移关联起来。在丛蛋 白、脑信号蛋白和整联蛋白中发现的富含半胱氨酸PSI结构域（也称为Met相关序列结构 域）邻近Sema结构域，随后是4个IPT重复片段，它们是在丛蛋白和转录因子中发现的免 疫球蛋白样区。最近的研宄表明Met Sema结构域足以使HGF和肝素结合（Gherardi et al·，2003)。此外，Kong-Beltran 等人（Cancer Cell (2004)，6:61-73)报道了 Met 的 Sema 结构域是受体二聚化和活化所必需的。
[0017] 已报道了靶向HGF/c-met途径的许多分子。这些分子包括抗体，诸如那些美国专 利5, 686, 292中所描述的。c-met胞外域的一部分据显示还具有针对HGF/c-met途径的拮 抗作用。不过，考虑到该途径在各种病理状态的病因学中所发挥的重要作用，显然继续需要 具有最适于开发成治疗剂的临床特性的药剂。本文描述的发明满足这一需求并提供了其它 好处。
[0018] 完整收入本文引用的所有文献，包括专利申请和出版物，作为参考。
[0019] 发明公开
[0020] 本发明部分基于HGF/c-met生物学途径的多种拮抗剂的鉴定，该途径是呈现为重 要且有利治疗靶的生物学/细胞过程。本发明提供了以干扰HGF/c-met活化为基础的组合 物和方法，包括但不限于干扰HGF与c-met胞外部分结合及受体多聚化。如本文所述，本发 明的拮抗剂为靶向与异常或不想要的HGF/c-met途径信号传导有关的病理状况提供了重 要的治疗剂和诊断剂。因此，本发明提供了与调节HGF/c-met途径有关的方法、组合物、试 剂盒和制品，包括调节c-met配体结合、c-met二聚化、活化及其它与HGF/c-met信号传导 有关的生物学/生理学活动。
[0021] 一方面，本发明提供了适于治疗用途且能实现HGF/c-met信号途径不同程度破坏 的抗HGF/c-met治疗剂。例如，在一个实施方案中，本发明提供了人源化抗c-met抗体，其 中所述抗体对人c-met的单价亲和力（例如Fab片段形式的抗体对人c-met的亲和力）与 包含图7中所示轻链和重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10)、由其组成或基本上由其组成 的鼠抗体的单价亲和力（例如Fab片段形式的鼠抗体对人c-met的亲和力）基本上相同。 在另一个实施方案中，本发明提供了人源化抗c-met抗体，其中所述抗体对人c-met的单 价亲和力（例如Fab片段形式的抗体对人c-met的亲和力）低于包含图7中所示轻链和 重链可变区序列（SEQ ID NO:9和10)、由其组成或基本上由其组成的鼠抗体的单价亲和力 (例如Fab片段形式的鼠抗体对人c-met的亲和力），例如至少低3、5、7或10倍。在另一 个实施方案中，本发明提供了抗c-met人源化抗体，其中所述抗体对人c-met的单价亲和力 (例如Fab片段形式的抗体对人c-met的亲和力）高于包含图7中所示轻链和重链可变区 序列（SEQ ID NO:9和10)、由其组成或基本上由其组成的鼠抗体的单价亲和力（例如Fab 片段形式的鼠抗体对人c-met的亲和力），例如至少高3、5、7、10或13倍。在一个实施方 案中，鼠抗体对人c-met的单价亲和力与下述Fab片段的结合亲和力基本上相同，所述Fab 片段包含于1995年5月23日以美国典型培养物保藏中心登记号ATCC HB-11894(杂交瘤 1A3. 3. 13)或HB-11895(杂交瘤OT5. 11.6)保藏的杂交瘤细胞系所生成的抗体的可变区序 列。正如本领域完全确立的，配体对其受体的结合亲和力可使用多种测定法中的任一种来 测定，并以各种定量数值形式表示。因此，在一个实施方案中，结合亲和力以Kd值表示，反 映内在结合亲和力（例如具有最小化的亲合力效应）。普遍且优选的是，结合亲和力在体外 测量，无论是无细胞设置或细胞相关设置。正如本文更为详细描述的，结合亲和力的倍数差 异可量化成人源化抗体的单价结合亲和力数值（例如Fab形式）与参照/比照抗体（例如 具有供体高变区序列的鼠抗体）的单价结合亲和力数值（例如Fab形式）的比率，其中结 合亲和力数值是在相似测定条件下测定的。因此，在一个实施方案中，结合亲和力的倍数差 异确定为Fab形式的人源化抗体与所述参照/比照Fab抗体的Kd值比率。例如，在一个实 施方案中，如果本发明的抗体（A)具有比参照抗体（M) "低3倍"的亲和力，那么若A的Kd 值是3x，则M的Kd值将是lx，且A的Kd与M的Kd的比率将是3:1。相反，在一个实施方 案中，如果本发明的抗体（C)具有比参照抗体（R) "高3倍"的亲和力，那么若C的Kd值是 lx，则R的Kd值将是3x，且C的Kd与R的Kd的比率将是1: 3。本领域已知的许多测定法中 的任一种，包括那些本文所描述的，都可用于获取结合亲和力的测量值，包括例如Biacore、 放射免疫测定法（RIA)和ELISA。
[0022] -方面，本发明的HGF/c-met诘抗剂包含抗c-met抗体，它包含：
[0023] (a)至少一种、两种、三种、四种或五种选自下组的高变区（HVR)序列：
[0024] (i)包含序列 A1-A17 的HVR-L1，其中 A1-A17 是KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID N0:1)
[0025] (ii)包含序列 B1-B7 的 HVR-L2,其中 B1-B7 是 WASTRES(SEQ ID N0:2)
[0026] (iii)包含序列 C1-C9 的 HVR-L3,其中 C1-C9 是 QQYYAYPWT(SEQ ID N0:3)
[0027] (iv)包含序列 Dl-DlO 的 HVR-H1，其中 Dl-DlO 是 GYTFTSYWLH(SEQ ID N0:4)
[0028] (V)包含序列 E1-E18 的 HVR-H2,其中 E1-E18 是 GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO: 5)，及
[0029] (vi)包含序列 Fl-Fll 的 HVR-H3,其中 Fl-Fll 是 XYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:6)且 X不是R ;
[0030] 及（b)至少一种变体HVR，其中所述变体HVR序列包含SEQ ID N0:l、2、3、4、5或 6中所示序列的至少一个残基的修饰。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-Ll包含SEQ ID NO: 1的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L2包含SEQ ID NO:2的序列。在 一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L3包含SEQ ID NO:3的序列。在一个实施方案中，本 发明抗体的HVR-Hl包含SEQ ID NO:4的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H2 包含SEQ ID NO: 5的序列。在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-H3包含SEQ ID NO:6的 序列。在一个实施方案中，HVR-H3包含TYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:7)。在一个实施方案中， HVR-H3包含SYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:8)。在一个实施方案中，包含这些序列（本文所述组 合）的本发明抗体是人源化的或人源的。
[0031] -方面，本发明提供了包含一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR的抗体，其中 各个HVR包含选自下组的序列、由其组成或基本上由其组成：SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7 和 8,其中 SEQ ID NO: 1 对应于 HVR-