一种抗b细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途，属于生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 淋巴瘤属原发于淋巴结或淋巴组织的恶性肿瘤，有淋巴细胞和（或）组织细胞的 大量增生，占我国常见恶性肿瘤的第八位，且年轻化趋势明显，近年发病率由2-4/10万升 至6. 91/10万，并以每年5%的速度上升，每年新发患者约5万人，死亡人数超过2万。一般 认为霍奇金淋巴瘤主要来源于B细胞，大多数的非霍奇金淋巴瘤也来源于B细胞，因此通过 清除B细胞治疗淋巴瘤已成为一种新的治疗方案。
[0003] 临床研究发现，淋巴瘤等恶性B细胞可以合成和分泌一种名为B淋巴细胞刺激因 子（B cells-activating fact BAFF)的蛋白，属肿瘤坏死因子超家族成员，其可与表达在B 细胞表面的受体结合，进而激活NF-kB途径，诱导抗细胞凋亡基因：Bcl-2、Bcl-xL的表达， 减少成熟B细胞的凋亡。不同亚型B-细胞淋巴瘤患者血清可溶性BAFF含量较正常对照者 是明显升高的，且BAFF血浆水平与基因变异及疾病的进展、严重程度及治疗敏感性呈正相 关关系。
[0004] 纳米抗体是由羊驼血液中发现的缺失轻链的重链抗体，经比利时科学家应用分子 生物学技术结合纳米粒子科学的方法，而研发出来的最新及分子量最小的抗体分子。其具 有结构简单，穿透力强，易于纯化和表达，亲和力及稳定性高，无毒副反应等一系列优点。
[0005] 目前尚未有针对BAFF的纳米抗体的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种抗BAFF的纳米抗体及其编码基因序列。
[0007] 本发明要解决的另一个技术问题是提供抗BAFF的纳米抗体的用途。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO. 1 所示。该序列包括框架区和互补决定区；互补决定区为CDRl-CDR3 ;框架区为分别为 FR1-FR4 ;互补决定区具有选自下组的氨基酸序列，具体为：
[0010] CDRl的氨基酸序列：NYHMG
[0011] CDR2 的氨基酸序列：VAAINGRGSRTKYADSVKG
[0012] CDR3 的氨基酸序列：AAGGPEFYRGRLEDYA
[0013] 框架区的FR1-FR4的氨基酸序列，具体为：
[0014] FRl 的氨基酸序列：QVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFK
[0015] FR2 的氨基酸序列：WFRQAPGKEREF
[0016] FR3 的氨基酸序列：RFTISRDNAERTVRLEMNSLKPEDTAVYYC
[0017] FR4 的氨基酸序列：YWGPGTQVTVSS
[0018] 所述抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体其氨基酸组成顺序：FR1，⑶Rl，FR2,⑶R2， FR3, CDR3, FR4。（序列表SEQ ID NO. 1)命名为抗BAFF纳米抗体52。
[0019] 所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体，其氨基酸序列与序列表SEQ ID NO. 1 所不的氨基酸序列的同源性大于80%，优选大于90%，最优选大于95%。
[0020] -种多肽，选自上述纳米抗体，或称单域抗体片段，或称结构域抗体片段，或"dAb， VHJHH'
[0021] 编码上述抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的基因序列。
[0022] 所述基因序列为序列表SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0023] 根据本发明的抗BAFF纳米抗体可变区中特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外 人工合成与此相同的抗体轻重链基因的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而 获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗BAFF纳米抗体或相关蛋白或多肽 产物。
[0024] 包含所述基因序列的表达载体。载体可以为原核细胞表达载体、真核细胞表达载 体或昆虫细胞表达载体。
[0025] 包含所述表达载体的宿主细胞。所述的宿主细胞可以为原核表达细胞、真核表达 细胞或昆虫细胞，所述原核表达细胞优选大肠杆菌。
[0026] 通过所述宿主细胞制备抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体的方法。
[0027] 药用组合物，其包含一种或多种所述的抗BAFF纳米抗体分子作为活性成份，并包 含可药用载剂。
[0028] 所述药物载剂选自细胞毒素、放射性同位素、免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖 剂、促凋亡剂、化学治疗剂或治疗性核酸的治疗剂。
[0029] 所述药物组合物也可以采用包含包装的药物试剂盒的形式提供，所述包装包含在 分开容器内的或在单一容器内的一种或多种拮抗剂。
[0030] 所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体用于制备检测BAFF的试剂的用途。包 括但不限于用于双抗体夹心酶标免疫检测BAFF ELISA试剂中的捕获抗原用纳米抗体包被 ELISA板和检测抗原用的生物素标记纳米抗体。
[0031] 所述的抗B细胞生长刺激因子的纳米抗体用于制备治疗BAFF表达异常相关疾病 的药物的用途；所述BAFF表达异常相关疾病为B细胞非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma)、B细胞慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、涉及B细胞的自身免疫病或炎性疾 病。
[0032] 本发明构建了 BAFF胞外区多肽重组基因克隆的pET30a表达载体，获得带有His 标签的BAFF胞外区（BAFFE⑶）高纯化蛋白，与能高亲和力结合带有His标签蛋白的Ni+磁 珠结合，展示多肽的正确空间结构，以此形式的抗原免疫羊驼，构建特异性的纳米抗体基因 库(纳米抗体噬菌体展示基因库)，筛选免疫纳米抗体基因库，而获得了 B细胞刺激因子的 特异性的纳米抗体(或称单域抗体片段，single domain antibody fragment),将此基因与 表达载体连接重组，构建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株anti-BAFF52。在实验 室进行摇瓶小规模生产，经Ni+树脂凝胶亲和层析纯化，可得到SDS-PAGE电泳纯达95%，约 100mg/L细菌培养物的纳米抗体。
[0033] 本发明涉及了针对BAFF的不同形式纳米抗体(单体、双体或五聚体)、制备B细胞 生长刺激因子（BAFF)的纳米抗体的所有技术(技术参考：Tanha J, Dubuc G, Selection by phage display of llama conventional V(H) fragments with heavy chain antibody V(H)H properties. J Immunol Methods. 2002, 263(1-2):97-109) (Gueorguieva D, Li S. Identification