专利名称：一种人角质细胞生长因子-1结构类似物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种人角质细胞生长因子-1结构类似 物，特别涉及一种人角质细胞生长因子-1结构类似物的及其制备方法和应用。
背景技术：
角质细胞生长因子-l(KeratinocyteGrowthFacfor-l. KGF-1)也叫成纤维细胞生
长因子-7 (FGF-7)，因为其具有显著的促进上皮细胞增殖的作用而受到科学家的
关注。现已证明，它对多种上皮细胞包括II型肺泡上皮细胞、肝实质细胞、胃肠
细胞、尿道上皮细胞和各种鳞状上皮的角化细胞等都有作用。由于KGF对许多组
织的上皮细胞都具有促增殖作用，因此对皮肤、角膜、膀胱、肾、肺、肠、肝等
部位上皮组织的损伤具有重要的修复作用。
KGF-1具有刺激胃肠系统的上皮细胞的增殖和分化的功能，对保持胃肠系统牯
膜的完整性和促进损伤修复有很重要的作用。研究表明，KGF-1能够诱导胃上皮
细胞的增殖，同时，KGF-1还能降低胃酸的分泌。因此，KGF-1具有治疗胃肠系
统溃疡的功能。和传统的治疗药物相比，KGF-1在起到传统药物抑制胃酸作用的
同时，还能从根本上促进胃肠系统上皮细胞的增殖和分化，从而使溃疡面重新上
皮化而得到完全的恢复。Farrell等证明，在小鼠的放疗和化疗模型中，给小鼠预
先滴注重组KGF-1，可以降低小鼠的胃肠道损伤，显著改善小鼠的生存状态。放
疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时，使胃肠系统的细胞同样受到损伤，影响患者的
生存状态，在放化疗的同时使用KGF可使胃肠系统的细胞存活率增加55 %或更多。在化疗模型和放化疗结合模型中，应用KGF-1能够加速恢复期的体重增加。其对 胃肠粘膜的保护机制是KGF的预处理增加了小肠绒毛的高度和隐窝的深度，同时， KGF-1对小肠隐窝千细胞也有直接作用，加强隐窝细胞在放化疗中的存活率。因 此，KGF-1在治疗胃肠系统的损伤和降低癌症放化疗的毒副作用方面具有十分重 要的意义。
已有充分证据表明，KGF-1蛋白分子极不稳定，KGF-1的5个半胱氨酸分别位 于l、 15、 40、 102、 106位，其中1位与15位以及102位与106位之间分别形成二对 二石危键，而40位的半胱氨酸以自由的形式存在的，全长的KGF-1由于二硫4泉之间 的错配容易造成蛋白的不稳定和聚集。研究发现，缺失第1位与15位的半胱氨酸， KGF-1的稳定性不但提高，活性也比原来提高了5 10倍。通过对其N端进行改造和 对活性位点(第122 133位氨基酸残基)的点突变则使蛋白活性出现了不同程度的 改变。
目前使用哺乳动物细胞表达KGF-1产量极低且造价昂贵，而使用大肠杆菌进 行表达虽然具有表达量高和成本较低的特点，但是由于KGF-1本身具有的5个半 胱氨酸，造成在表达过程中主要形成包涵体，而且这种包涵体往往难于复性。因 此，使用弱启动子降低其表达的速率，同时使用分子伴侣帮助其正确折叠，从而 获得大量可溶的人KGF-l,有望获得令人满意的KGF-1产量。
到目前为止，还没有报道在将N末端缺失22个氨基酸(即A22KGF-1)的基 础上，将第23位氨基酸残基由精氨酸突变为甘氨酸，第128位氨基酸残基突变由 天冬酰胺突变为非极性氨基酸的报道。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明的第一个目的在于，提供一种人角质细胞生 长因子的类似物，与人角质细胞生长因子的蛋白质结构相比较，该类似物的蛋白序列的N末端缺失22个氨基酸(即A22KGF-1),将第23位氨基酸残基由精氨 酸突变为甘氨酸，第128位氨基酸残基突变由天冬酰胺突变为非极性氨基酸，如 丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，优选为丝氨酸。将此类似物命名 为KGF-1/GLYS。
本发明的结构类似物KGF- 1/GLYS具有序列4所示的氨基S菱序列,其基因具有 序列3所示的核苷S臾序列。
本发明的第二个目的在于公开KGF-1/GLYS蛋白的制备方法通过PCR扩增得 到含突变位点的人角质细胞生长因子-l的cDNA，将所述cDNA片段与表达载体连 接，连接产物转化感受态细胞，筛选阳性克隆，表达纯化。
所述的突变位点包括R23G和N128S。
所述的表达载体具有trp启动子，并与编码具有辅助表达折叠功能的TRX蛋 白的基因可操作的连接。
该方法是使用本实验自己构建的ptrpTRX载体表达目的蛋白。该载体具有启动 能力较弱的trp启动子及帮助折叠的硫氧还蛋白TRX,可以有效地控制蛋白表达的 速率和折叠效果。
本发明的第三个目的在于，特别提出一种重组表达载体，所述重组表达载体 含有上述人角质细胞生长因子-1结构类似物的基因序列。
所述的重组表达载体具有trp启动子，并与编码具有辅助表达折叠功能的TRX 蛋白的基因可操作的连接。
本发明的目的还在于提供人角质细胞生长因子-1结构类似物在制备放、化疗 损伤预防药物、长效药物、促进创伤愈合药物或溃疡治疗药物中的应用，同时也 可应用于化妆品中。
本发明的人角质细胞生长因子-l结构类似物能促进创口的愈合，修复各种皮肤损伤，减少疤痕形成，对临床上治疗烧伤及其他皮肤损伤有重要价值；能促进 正常上皮细胞增殖，具有辐射防护作用，能预防和治疗放、化疗造成的损伤；而 对肺瘤细胞既不促进其增殖，也不降低其对辐射的敏感性，同时还有增加癌症治 疗中放疗指标的潜力。可用于溃疡和胃肠炎的治疗，因此该类似物可以作为潜在 的新型多功能药物制剂。另外，由于它能促进角质细胞的增殖，加速皮肤角质层 和基底层的修复，所以具有延缓皮肤细胞衰老，促进皮肤细胞修复，使皮肤光滑 丰润的作用，因此可用于美容和化妆品行业。因此，具有非常重要的商业价值和 十分广阔的市场开发和应用前景。
图l为表达载体ptrpTRX的质粒图2为BL21的超声破碎和肝素亲和层析纯化结果；
图3为凝血酶切割目的蛋白的电泳结果图4为SP阳离子亲和层析纯化结果；
图5为KGF-1/GLYS蛋白对IEC-6细胞促增殖实验结果；
图6为使用两种不同载体表达KGF-1/GLYS的产量比较图。
具体实施例方式
实施例一人KGF-l的cDNA^列的获得
根据GENBANK和文献报道的人KGF氨基醋列(由163个氨基酸组成)，设 计合成针对KGF-1基因的特异引物(见序列表中序列5和6),利用PCR方法从人 胎肝cDNA文库中扩增出KGF-lcDNA。酶切后与测序载体连接，制备重组质粒， 转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序。测序结果与序列表中序列l完全一致，其编码的序列见序列表中序列2。
实施例二 KGF-l/GLYScDNA^列的获得
以上面制备的含有KGF-1基因序列的重组质粒为模板，分别用两对引物(见序 列表中序列7和9，序列8和10)扩增，引入N128S的突变点，获得含KGF-1/GLYS N128S全长基因的两个重叠片段。然后，将两个片段混合作为模板，利用两端引 物(见序列表中序列7和8)进行PCR^应(此时引物已将第23位R突变为G),这时 获得R23G和N128S同时突变成功的cDNA片段。将该cDNA片段回收酶切后与相 同酶切的载体连接，连接产物转化感受态细胞，筛选阳性克隆并送测序。
实施例三ptrpTRX/KGF-l/GLYS重组质粒的构建
以KGF-1/GLYS基因为模板，设计合成针对KGF-1/GLYS的特异引物(见序列 表中序列5和6)，通过PCR扩增出长度约为435bp,两端分别含有5aw/71 (GGATCC )和五coi I酶切位点的KGF-1/GLYSPCR产物，将该PCR产物用5am/f I和五coi I双酶切，然后连接到用这两种酶相同处理过的表达载体ptrpTRX中，构 建表达质粒ptrpTRX/KGF-l/GLYS。图l为表达载体ptrpTRX的质粒图。将该质粒转 化至感受态细胞topolO中。培养增殖后从转化抹中抽提重组质粒，按已知的方法 并使用通用引物(T7promoter)测序。经测序，证明获得正确的KGF-1/GLYS cDNA 序列，见序列表中序列3，其编码的氨基S交序列见序列表中序列4，该质粒记为 ptrpTRX/KGF- 1/GLYS。将质粒转化大肠杆菌BL21中。 实施例四发酵培养
分别从ptrpTRXZKGF- 1/GLYS转化大肠杆菌BL21的平板上挑取单克隆菌落，接 入50ml的氨千抗性LB培养基中，30°。培养至00600=0.6 ~ 1.0。收菌，并转接入氨 千抗性的18升LB培养基中，30。C培养至OD6。cr0.6-1.0，添加0.5mM诱导剂IPTG， 继续培养8小时，发酵结束。从含有KGF-1/GLYS转化的大肠杆菌的平板上挑取单克隆菌落，接入培养基中培养，并诱导表达，离心收M。菌体沉淀进行超声破碎，
离心取上清分别过肝素亲和层析柱和SP阳离子柱，图2为BL21超声破和肝素亲和 层析纯化结果，其中栏1-IO分別表示低分子量标准、ptrpTRX转化的BL21、 ptrpTRX/KGF-l/GLYS转化的BL21、全菌上清、全菌沉淀、肝素亲和层析流穿、 O.lMNaCl洗脱峰、1MNaCl洗脱峰l、 1MNaCl洗脱峰2和lMNaCl洗脱峰3。由 图2的结果可知，融合蛋白表达分子量正确，而且其表达产物以可溶表达为主。而 且其能与肝素亲和层析填料上肝素基团特异结合，是FGF家族蛋白的共同特点。 实施例五KGF-1突变体蛋白的分离纯化
发酵结束后，6000rpm离心收集菌体，加入20mMTris-CL重悬菌体，利用超 声波破碎仪破碎细胞，12000rpm离心20分钟，收集上清。将该上清首先通过已用 20mMTris-CL平衡过的肝素凝胶柱.用含O. lmol/L NaCl的Tris-CL(pH7.0)溶液洗柱 后，加入含lmol/LNaCl的Tris-CL(pH7.0)溶液洗脱目的蛋白。将目的蛋白使用凝 血酶切割，圓3为凝血酶切割目的蛋白的电泳结果图，其中1 _ 3栏分别为肝素亲和 层析洗脱峰、凝血酶切割后蛋白、低分子量标准。由图3结果可知，经过凝血酶切 割后原来的蛋白消失，产生新的条带(由于TRX和KGF/GLYS大小都约为16KD， 因此电泳没有分开)。再通过已用含0.5mol/LNaCl的PB平衡过的SP阳离子交换 柱，用lmol/LNaCl的PB(PH7.4)洗脱目的蛋白。将收集的洗脱峰超滤浓缩后，通 过分子篩S-200凝胶柱进行分离。纯化后的蛋白经12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 后，考马斯亮蓝染色显示分子量为约16kD的单一条带，通过氨基酸N端测序以及 氨基酸组成分析证实按本发明方法制备的蛋白的真实性(图4)。图4为SP阳离子 亲和层析纯化结果，其中l - 3栏分别为低分子量标准、1MNaCl洗脱峰l、 1MNaCl 洗脱峰2。经15。/。的SDS-PAGE电泳鉴定纯化产物仅为一条目的条带，大小约为 16kD。实施例六MTT法测定KGF-1/GLYS的活性
正C-6细胞为正常小鼠空肠上皮细胞，用含10。/。胎牛血清的DMEM培养液培 养至80%融合时，收集细胞，以3xl()S个/孔接种于96孔板细月包培养板中，lOOpL/ 孔；然后分别在每孔加入10pL按倍比稀释的KGF-l/GLYS突变体蛋白样品，终浓 度分别为3.75 , 6.25 , 12.5 , 25和50ng/mL,设不加因子的阴性对照即Ong/mL, 每个浓度重复做3个复孔，培养24h后每孔加入5mg/ml的MTT20pL，继续培养5h 后，每孔加入100pL 10% SDS(溶于0.01NNaCl中)，待紫色结晶溶解后，测定570nm 的吸光值。对重组人的KGF-l/GLYS和商品化的rhKGF-l的增殖作用的测定结果进 行比较，表明KGF-l/GLYS的促上皮细胞增殖活性较rhKGF-l明显增强，而且差异 显著，结果见图5，图5为KGF-l/GLYS蛋白对正C-6细胞促增殖实验结果。本发明 通过实验证明了KGF-l/GLYS促细胞增殖活性较rhKGF-l显著增强，因此具有 rhKGF-l的各种功能和用途。
实施例七不同载体蛋白收率的比较
使用两种不同载体pET22b和ptrp-TRX构建KGF-l/GLYS的表达菌抹，构建成 功后，同时使用1L的培养基进行放大培养、收菌和纯化，使用lowey检测蛋白浓度， 做三次重复后计算均数和标准差，比较两者差别。图6为使用两种不同载体表达 KGF-1/GLYS的产量比较图。由图6可知，使用pET22b载体表达从l升培养基获得 0.83mg蛋白，而使用ptrp-TRX载体表达可以获得16.1mg蛋白。两种方法收率相差 将近20倍，差别具有统计学差异。序列表
<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120>—种人角质细胞生长因子-1结构类似物及其制备方法和应用
<160>10
<210>1
<211>498
<212>DNA
<400>1
tcgcatatgt gcaacgatat gactccagaa cagatggcaa ctaacgtgaa ctgcagcagc 60 ccagaacgtc atactcgtag ctatgattac atggaaggtg gtgatattcg tgtgcgtcgt 120 ctgttctgtc gtacccagtg gtatctgcgt atcgataaac gtggcaaagt aaaaggcacc 180 caagaaatga agaataatta caatatcatg gaaatccgta ccgtggcagt tggtattgtg 240 gcaatcaaag gcgtggaaag cgagttctat ctggcaatga acaaggaagg taaactgtat 300 gcaaagaaag aatgcaatga agattgtaac ttcaaagaac tgattctgga aaaccattac 360 aacacctacg catctgctaa atggacccac aacggtggcg aaatgtttgt tgccctgaat 420 caaaagggca ttccggtgcg tggtaaaaaa accaagaaag aacaaaaaac cgcccacttt 480 ctgcctatgg caatcact
<210>2 <211>163 <212>PRT <400>2
Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser
5 10 15
Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp
20 25 30
lie Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Tip Tyr Leu Arg lie
35 40 45
Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr50 55 60
Asn lie Met Glu lie Arg Thr Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys 65 70 75 80
Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu
85 90 95
Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie
100 105 110
Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Tip Thr His Asn
115 120 125
Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg
130 135 140
Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met 145 150 155 160
Ala lie Thr
<210>3 <211>423 <212>DNA <400>3
ggtagctatg attacatgga aggtggtgat attcgtgtgc gtcgtctgtt ctgtcgtacc 60
cagtggtatc tgcgtatcga taaacgtggc aaagtaaaag gcacccgtga aatgaagaat 120
aattacaata tcatggaaat ccgtaccgtg gcagttggta ttgtggcaat caaaggcgtg 180
gaaagcgagt tctatctggc aatgaacaag gaaggtaaac tgtatgcaaa gaaagaatgc 240
aatgaagatt gtaacttcaa agaactgatt ctggaaaacc attacaacac ctacgcatct 300
gctaaatgga cccactctgg tggcgaaatg tttgttgccc tgaatcaaaa gggcattccg 360
gtgcgtggta aaaaaaccaa gaaagaacaa aaaaccgccc actttctgcc tatggcaatc 420 acttaagaattcctg
<210〉4 <211>141<212>PRT <400>4
Gly Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Val Arg Arg Leu Phe
5 10 15
Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg lie Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys
20 25 30
Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn lie Met Glu lie Arg Thr
35 40 45
Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr
50 55 60 65
Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn
70 75 80
Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr
85 90 95
Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Ser Gly Gly Glu Met Phe Val Ala
100 105 110
Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu
115 120 125
Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala lie Thr 130 135 140
<210>5 <211>23 <212>DNA <400>5
tcgcatatgtgcaacgatatg 21
<210>6
<211>23
<212>DNA<400>6
agtgattgccataggcagaaa 21
<210>7 <211>23 <212>DNA <400>7
gatgatggatccggtagctatgattacatggaaggtg 3 7
<210>8 <211>23 <212>DNA <400>8
gatgatgaattcttaagtgattgccataggcaga 3 4
<210>9 <211>23 <212>DNA <400>9
caccagagtgggtccatttagc 22
<210>10 <211>23 <212>DNA <400>10
gctaaatggacccactctggtg 2权利要求
1、一种人角质细胞生长因子-1结构类似物，其特征在于，与人角质细胞生长因子-1的蛋白质结构相比较，所述结构类似物的蛋白序列的N末端缺失22个氨基酸，将第23位氨基酸残基由精氨酸突变为甘氨酸，第128位氨基酸残基突变由天冬酰胺突变为非极性氨基酸。
2、 如权利要求1所述的人角质细胞生长因子-1结构类似物，其特征在于， 所述的非极性氨基酸为丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
3、 如权利要求1所述的人角质细胞生长因子-1结构类似物，其特征在于， 所述的非极性氨基酸为丝氨酸。
4、 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求1 - 3 之一所述的人角质细胞生长因子-1结构类似物的基因序列。
5、 如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体 具有trp启动子，并与编码具有辅助表达折叠功能的TRX蛋白的基因可操作的 连接。
6、 一种如权利要求l - 3之一所述的人角质细胞生长因子-l结构类似物的制 备方法，其特征在于，通过PCR扩增得到含突变位点的人角质细胞生长因子-1的 cDNA，将所述cDNA片段与表达载体连接，连接产物转化感受态细胞，筛选阳 性克隆，表达纯化。
7、 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的突变位点包括R23G 和N128S。
8、 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的表达载体具有trp 启动子，并与编码具有辅助表达折叠功能的TRX蛋白的基因可操作的连接。
9、 权利要求1 - 3之一所述的人角质细胞生长因子-1结构类似物在制备放、 化疗损伤预防药物、长效药物、促进创伤愈合药物或溃疡治疗药物中的应用。
10、 权利要求1 - 3之一所述的人角质细胞生长因子-1结构类似物在化妆品 中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人角质细胞生长因子的类似物，与人角质细胞生长因子的蛋白质结构相比较，该类似物的蛋白序列的N末端缺失22个氨基酸，将第23位氨基酸残基由精氨酸突变为甘氨酸，第128位氨基酸残基突变由天冬酰胺突变为非极性氨基酸。制备该蛋白时，通过PCR扩增得到含突变位点的人角质细胞生长因子-1的cDNA，将所述cDNA片段与表达载体连接，连接产物转化感受态细胞，筛选阳性克隆，表达纯化。特别提出一种重组表达载体，其含有上述人角质细胞生长因子-1结构类似物的基因序列。本发明的人角质细胞生长因子-1结构类似物可制备放、化疗损伤预防药物、长效药物、促进创伤愈合药物或溃疡治疗药物，同时也可应用于化妆品中。
文档编号A61P17/16GK101575372SQ20091004010
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者佘妙琴, 盛国庆, 蔡祥胜 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院