一种基于自体细胞的人工关节软骨及其制备方法

专利名称：一种基于自体细胞的人工关节软骨及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于自体细胞的人工关节软骨及其制备方法，属于生物医 生技术领域。
背景技术：
关节软骨是关节功能执行的必要成分，由软骨组织及其周围的软骨膜构 成，软骨组织则由软骨细胞、基质及纤维构成。软骨细胞是关节软骨中的唯一 细胞，其不断分泌产生新的软骨基质，最终形成软骨层。软骨细胞位于软骨基 质内的软骨陷窝中，各个细胞均分别围以软骨囊，生活时充满软骨陷窝内，不 能迁移。透明软骨基质非常复杂，有多种生物高分子物质，而且还含有多种适 当的细胞因子等。这些基质通常是可影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增 殖和分化生物活性物质，且有严格的环境条件。透明软骨基质的主要化学组成 主要为羽状分支大分子的软骨粘蛋白，其主要成分是酸性糖胺多糖
(glycosaminoglycan)。这种羽状分支的大分子结合着大量的水，大分子之间又 相互结合构成分子筛，并和胶原原纤维结合在一起形成固态的结构。软骨内无 血管，但由于软骨基质内富含水分(约占软骨基质的75%)，营养物质易于渗透， 故软骨深层的软骨细胞仍能获得必需的营养。透明软骨中无胶原纤维，但有许 多细小的无明显横纹的胶原原纤维，纤维排列不整齐。除关节面的关节软骨外， 软骨的表面均覆有软骨膜。软骨膜是较致密的结缔组织，即分内、外二层，外 层纤维多，细胞少，主要起保护作用，内层纤维少，细胞较多，其中有些梭形 小细胞，称骨原细胞，可增殖分化为软骨细胞。
关节软骨没有神经支配，也没有血管及淋巴组织，其营养成分必须从关节 液中取得，而其代谢废物也必须排至关节液中，关节软骨的这种营养代谢必须 通过关节运动，使关节软骨不断的受到压力刺激才行，所以关节运动对于维持 关节软骨的正常结构起重要的作用。
由于关节软骨自身修复能力低下，病损关节往往表现为不可扼制的逐步恶 化。关节软骨修复能力低下主要源于操作部位缺乏足够的软骨细胞修复，由于软骨细胞几乎没有迁移能力，不能迅速聚集到创伤部位。关节软骨没有血液供 应，且软骨细胞又包埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到操作部位参与修复， 滑液细胞数量太少，无法进行有效修复。而其它可形成软骨细胞的体内细胞， 包括软骨膜骨原细胞，骨髓间充质干细胞，肌肉来源的干细胞等，由于空间时 间及组织阻隔，无法自由移动到关节软骨缺损部位；而且即使在某些情况下这 些干细胞能自由移动到软骨层(比如关节软骨伴随软骨下骨缺损时，形成骨髓 与软骨层之间的通道，因此骨髓间充质干细胞可以自由移动到软骨层)，但由 于干细胞分化为软骨细胞并行使正常的生理功能修复关节软骨有严格的环境 条件，否则易发生退行性变化，极易形成力学强度逊色很多的纤维软骨，以至 于达不到修复的目的。解剖结构上与关节软骨邻近的是软骨膜骨原细胞，但软 骨膜结构是致密结缔组织，细胞不可能自由迁移到关节软骨的损伤部位上，修 复关节软骨层。
对于不严重的关节受损可以用关节镜灌洗术和关节清理术等最基本的传 统治疗手段，但在软骨受损严重时必须用软骨修复。关节软骨修复至今没有比 较理想的技术，目前软骨修复方法主要有剌激关节软骨自身修复的方法、自体 软骨移植、自体软骨膜/骨膜移植、自体软骨细胞移植、异体软骨移植、人工 软骨置换等，但这些技术都有一定缺陷。
剌激关节软骨自身修复包括软骨整形、磨削关节成形术、软骨下骨钻孔、 微骨折术等方法，缺点是这种方法修复的组织易形成纤维软骨，脆性大，不耐 用，最终会发生退变。
自体软骨移植是目前关节软骨修复效果最佳者，但其手术总优良率仅在
70%左右，适应症范围也非常狭窄；由于软骨材料来源有限，自体软骨移植不 适宜于大面积软骨缺损患者，而且供体部位常发生继发性病变；此外需要二次 手术，手术的过程相对复杂；易产生恢复缓慢、疼痛、骨折、流血等并发症和 术后疤痕；在移植软骨和原始组织之间存在裂缝等种种缺陷。
软骨膜的来源仅限于肋骨，取材有限，应用受到限制，且远期效果不佳。 自体骨膜移植技术取材方便，可早期修复损伤的关节软骨缺损，改善症状，但 存在早期退变，再生软骨易钙化，远期效果不稳定等缺点，而且这些组织移植 后生成的软骨样组织的生物学性能、耐磨性、韧性均欠佳。
自体软骨细胞移植是最近才开始采用的一种方法，这种方法需要进行手术
5来获取骨细胞并在外面培养以后移植到损伤的关节软骨区域，因而病人需要进 行二次手术，并且手术过程很复杂和困难，而且软骨细胞易纤维化，脆性大， 状态不佳、扩增能力丧失、寿命不长，即退行性变化。因此据临床统计，自体 软骨细胞移植的总有效率也仅到百分之七十多。
同种异体骨软骨和异种骨软骨移植材料获得相对较易且可预制成任意形 状和大小，因此比自体移植更常用。但是，因新鲜软骨的供应和如何防止细菌 及病毒性疾病的传播等问题限制了异体骨软骨移植的使用；冷冻移植则无法保 证软骨细胞的活性。研究证实，冷冻异体软骨的弹性系数及黏度系数有显著性 改变，软骨进行性退变，软骨表面裂隙明显，因冻存致使移植物出现不可逆的 生物力学改变。异体软骨曾广泛应用，由于可引起免疫排斥反应，导致细胞死 亡及功能丧失，因而未能广泛应用。
人工软骨其实分为两种 一种不含软骨细胞，这是目前研究较多的；另一 种则不仅含软骨细胞，且包含软骨细胞培养支架体系，可称为组织工程化人工 软骨。组织化工程人工软骨至今没有商业化产品。
前者是目前研究较多的人工软骨类型，这类人工软骨植入材料主要分为两 类，即人工合成的材料和天然生物材料，具体而言，主要有金属-超高分子 量聚乙烯对磨关节假体、硅橡胶、聚氨酯关节软垫材料、聚乙烯醇水凝胶等。 天然生物材料生物相容性好，通常都有利于细胞粘附、增殖、分化，但同时也 具有一些无法弥补的缺点，如孔隙率低，孔隙小；降解速度慢，缺乏一定的机
械强度，难于塑形，因而无法在关节软骨中单独使用。人工材料的软骨假体虽 然在一定程度上能起到替代软骨的作用，但还存在易磨损松动、界面润滑性差、 缺乏生物活性等等不足，其性能有待进一步提高。此外，在对人体软骨进行植 入修复时，以上材料还存在与软骨下骨固定的问题。现在临床上一般采用嵌入 固定、螺丝固定、不锈钢网固定、骨水泥粘结等方法植入缺损部位，但各自均 存在不同问题，.如连接松动、固定效果差、人工软骨与底骨结合不牢固、手术 难度和风险大等，影响了人工软骨的置换和替代效果。
但以上材料最大的缺陷，是它们都没有利用软骨细胞，以至于达到的修复 效果有限。正如上所述，软骨细胞则是软骨层修复的唯一细胞来源。软骨细胞 不断产生新的软骨基质形成软骨层。没有软骨细胞参与的修复，人工软骨的修 复只能起到临时替代及缓解疼痛的作用，无法达到真正意义上的生理修复。为了达到真正意义上的修复，必须利用软骨细胞。然而体外关节软骨细胞 培养有很多难题没有解决。因为关节软骨细胞增殖困难，在体外通常需要长时 间的增殖才能达到所需的数量，难以满足临床要求；而且含活细胞成分的关节 软骨，生产成本昂贵，制备方法工艺复杂，生产周期长，加工过程中难以避免 产品受到污染，贮存运输成本高；由于活细胞多来源于异体细胞，可引起免疫 排斥反应，非目前通用的免疫抑制剂可以控制，无法彻底消除免疫原性，即使 用高效免疫抑制剂，也很难保证不被排斥；异体细胞的引入导致无法完全避免 携带病毒、传播疾病的风险。并且软骨细胞行使正常生理功能，修复软骨层， 需要严格的环境条件。这些严格的环境条件，包括各种适当的细胞因子及剌 激原的剌激作用，关节活动的刺激等，否则易于形成力学性能逊色很多的纤维 软骨，而非在关节透明软骨——纤维软骨和关节软骨两者力学性能上有很大的 不同，纤维软骨难以执行关节软骨的功能。这不仅是体外培养软骨细胞目前尚 未解决的难题，而且在体内进行软骨细胞移植修复时，同样也会遇到的棘手问 题。
因此，诱导关节软骨原位再生是一个理想的做法，目卩使植入人工软骨 的材料有良好的生物相容性，并植入缺损关节软骨，诱导体内干细胞迁移并分 化为软骨细胞，并发挥正常生理功能，原位修复关节软骨；植入的人工软骨在 关节软骨修复后，自动安全降解。这是一个理想的研究方向。
而采用这种方法，需要解决若干问题首先就是体内迁移细胞的来源。细 胞可以来源于关节滑液细胞，也可以来源于软骨下骨细胞。而且，关节滑液中 的软骨细胞尽管数量少，但完全可以自由迁移进入关节软骨缺损部位。
鉴于软骨细胞几乎没有迁移能力，滑液细胞数量太少，而其它可分化为正 常软骨细胞，如骨骼间充质干细胞、软骨膜细胞等，由于组织屏障，正常情 况下都不可能自由的移动到关节软骨的损伤部位上并进行软骨修复。因此，一 般关节软骨缺损是无法自然修复的。
然而，在针对关节软骨缺损的研究中发现，仅软骨层部分缺损时,关节软骨 基本无再生能力,而当伴有软骨下骨缺损时,骨组织中间充质干细胞可以向缺损
区迁移并发生增殖和分化,充填缺损区,但此时缺损区主要由纤维软骨而非透明 软骨充填。也就是说，骨组织和关节软骨在体内空间位置上相互接近，组织阻 隔在软骨下层，因此完全可以通过对软骨下骨打孔形成通道，而介导骨髓间充质干细胞的迁移至软骨受损区。在最近的研究中，有对关节表面进行打孔、将 含有骨形成蛋白(BMP )的胶原蛋白放呈在所希望的部位，可再生关节软骨 的论文发表。而且体外骨髓间充质干细胞培养也证实了，骨髓间充质干细胞确 实可以软化为关节软骨细胞。目前研究己经证实，骨髓间充质干细胞具有较强 的自我更新能力和多向分化潜能，在特定的诱导条件下可分化为软骨细胞，有
多篇文献作了相关报道。例如，用转化生长因子(31、地塞米松诱导的骨髓间
充质干细胞与聚羟基乙酸/聚乳酸共培养1周后移植入猪的非负重区域膝关节
骨软骨缺损处，6个月后膝关节缺损处已完全被工程化透明软骨和松质骨所修 复，蛋白多糖含量与正常关节软骨无差异。Ponticidlo、 Hegewald等都做过先 导性的相关理论研究。
总之，针对细胞的来源问题，完全可以通过人为对软骨下骨打孔形成通道, 而介导骨髓间充质干细胞的迁移至软骨受损区。
因此，采用这处方法，目前真正需要解决的问题是，介导骨髓间充质干细 胞迁移至软骨受损区后，如何有效诱导骨髓间充质干细胞分化为关节软骨细胞 行使正常的生理功能，最终修复软骨层。这就需要严格的拟合关节软骨细胞的 正常环境条件。
这些严格的拟合的环境条件，对植入的人工关节软骨而言，包括关节活 动的刺激，关节软骨支架材料性能，附着在支架上各种适当的细胞因子及刺激 原及其可控释放。由于是关节原位再生，关节活动对之施加了同等的力学刺激。 影响因素主要是后两者。这两者的严格拟合有着相当的难度。
首先是支架及其性能。支架性能有两方面的要求，第一，则是有良好的力 学性能，弹性极佳，滑润性好，在关节软骨没有再生之前，起到临时替代关节 软骨功能的作用；第二，是支架本身基质材料及其结构。因为人工软骨支架影 响表现型软骨细胞的表达。人工合成聚合物的组织工程支架机械性能比一般天 然生物材料更好，但天然材料常有利于软骨修复。例如II型胶原虽有利于软骨 细胞粘附、增殖、分化，可作为良好的材料包埋添加剂，但是缺乏一定的机械 强度，难于塑形，支架材料在体内降解过快，因而无法在关节软骨中单独使用。 因此，目前研究一定都在寻找合适的材料和方法。目前认为单一材料较难适应 要求，而通过共混调整不同材料之间的比例，可以使共混材料具有更适合力学 性能、降解性和生物学性质等。而在关节软骨细胞完成修复后，支架可以自动
8降解，避免二次手术问题。
其实则是细胞因子和刺激原作用。不仅骨髓间充质干细胞的迁移需要多种 细胞迁移及归巢因子的作用。更重要的是，软骨细胞正常生理功能的发挥还需 要多种适当的细胞因子的刺激，其它一些刺激原也有相应作用。因此人工软骨 支架通常会添加的各种促进软骨生长的成分，这些成分通常是可影响细胞的形 状、代谢、功能、迁移、增殖和分化生物活性物质，如某些促软骨生长的细胞 因子。细胞因子辅助治疗软骨损伤法中细胞因子本身对软骨生长的促进作用很 好，但要将因子固定于组织工程支架材料并能缓释释放，目前还没有相关专利 和产品。而这对骨髓间充质干细胞定向迁移至关节软骨受损部位，并定向分化 为关节软骨细胞后，行使正常的生理功能原位修复受损关节软骨一系列关节软 骨原位修复过程至关重要。
以上整个人工关节软骨支架体系不仅在关节软骨修复之前起临时替代关 节软骨的作用，而且为细胞的生存及活动提供适宜的场所和支撑，并提供了合 适的生理微环境。
因此，真正理想的人工软骨应该是可以诱导软骨细胞原位再生，形成真 正的透明软骨并与周围正常软骨组织结构一致，再生性修复关节软骨，再生修 复完成后可人工软骨可自动降解。
但目前并无具体的制备方法将纳米仿生人工软骨产品制备出来并应用于 临床，这是目前此技术领域的技术难题，本发明正是针对此未攻克的技术难题 进行改进和确立具体实现方案。
近年来， 一些纳米生物仿生技术，如静电纺丝、细胞打印技术等的兴起为
构建新型人工软骨产品提供了新思路。相比以往的支架制备技术，由静电纺丝 纳米仿生技术制备的软骨生物支架具有以下一些优点①由静电纺丝技术制备 的纳米纤维直径由几十纳米至几微米，能在形态上很好模拟细胞外基质 (ECM)，纵横交错的纤维形成很多孔隙，使材料具有高比表面积，有利于细胞 粘附、增殖和分化；②数量巨大的纳米纤维的排列，使材料具有很好的力学强 度及柔韧性；③静电纺生物支架能够软骨细胞及生长因子有效融合； 静电纺 丝技术适用于超过100种天然或合成生物材料，还可以通过调整工艺参数，获 得不同材料、不同结构的组合，使生物支架具有灵活的可设计性，可满足人体 软骨中对多细胞和多材料组成的要求。生物打印技术是近年来出现的新技术。生物打印能按预定计划精确定位， 这和打印技术的特点是一致的。生物打印与一般打印的不同仅在于其墨水和接 受打印的纸张不一样。生物打印的纸片是在体内可降解的生物纸片；生物打印 的"生物墨水"是特制的细胞溶液或有生物活性的细胞因子溶液。生物打印技术 是将这种特制溶液喷射到可生物降解的生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺 序的堆叠。由于使用了打印技术，可以将细胞或/和细胞因子("生物墨水")精 确的结合到预定部位；而按特定的堆叠方式的生物纸片则会形成三维结构。理 论上如果所用的生物墨水是细胞溶液，则形成三维的组织结构和器官，最后生 物纸片降解，细胞保留下来，形成立体结构，例如，活的三维组织、血管和器 官。但是生物打印技术仍处于基础研究的阶段，还没有出现直接利用细胞通过 生物打印技术制备的人工器官，也没有见到相关报道。但目前并无具体的制备方法将纳米仿生人工软骨产品制备出来并应用于 临床，这是目前此技术领域的技术难题，本发明正是针对此未攻克的技术难题 进行改进和确立具体实现方案。 发明内容本发明的目的是克服己有技术的缺点，提供一种基于自体细胞的人工关节 软骨，所述人工关节软骨是一种能对关节软骨损伤进行原位再生性修复的生物 型关节软骨植入材料，它不仅涉及人工软骨材料，并涉及多种细胞因子、可原 位诱导骨髓间充质干细胞定向迁移到人工关节软骨的纳米仿生支架内，并诱导 骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，促使诱导的软骨细胞发挥正常生理功能、 最后再重生关节软骨，在关节软骨原位再生后，材料可自动安全降解。这种新 型人工软骨克服了目前关节软骨损伤的修复中无合适材料可用的被动局面。本发明的另一个目的是提供上述人工关节软骨的制备方法，所述方法简单 易行、可适应大规模生产、成本低，同时拓宽了生物打印技术应用范围的。本发明提供了一种人工关节软骨，在对关节面进行打孔至软骨下硬骨骨 髓、将含有细胞因子的人工关节软骨放呈在所希望的部位，并诱导关节软骨再 生。它涉及多种细胞因子、可原位诱导骨髓间充质干细胞及滑液细胞定向迁移 到人工关节软骨的纳米仿生支架内，并诱导骨髓间充质干细胞及滑液细胞分化 为软骨细胞，促使诱导的软骨细胞发挥正常生理功能、最后再重生关节软骨； 并在关节软骨再生后自动安全降解。本发明通过以下技术方案实现上述目的本发明提供了一种基于自体细胞的人工关节软骨，包括纳米仿生支架和附 着于其上的水溶胶，所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子。所述纳米仿生支架是采用支架材料通过静电纺丝技术制备得到，所述支架 材料包括聚乳酸、聚已内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸 乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸 酯、聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、 聚对二恶酮、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、 纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、 海藻酸、硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸。将上述材料溶于一定的 溶剂，形成电纺液，就可以通过静电纺丝技术得到纳米仿生支架。这些溶剂可 以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二 甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲垸、三氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、 二噁垸、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们任意比例的混合物。上述的高分子材 料和溶剂用于静电纺丝的相关技术，例如材料与溶剂的重量比例等参照现有技 术。用上面提到的一种或两种以上混合材料通过静电纺丝技术，可以按照具体 需要做出合适孔径和直径的纳米材料。此项工艺在本发明制备方法一节有详细 叙述，操作简单，所得到的纤维是纳米级的，比传统的方法得到的无纺布直径 小几个数量级，其直径分布是几个纳米到几个微米，并可通过工艺参数调整得 到不同直径，做到和人体真皮网状结缔组织高度相似，形成的网状结构的孔径 大小和其分布也可调整，孔径可以调整到数十纳米到数个微米之间，以达到在 允许营养物质进入的同时防止细胞进入；也可以调整为到数十到数百微米，以利于不同类型的细胞迁入，如50+20微米的孔径有利于血管内皮细胞长入，而 神经纤维则需要30 100微米的孔径。静电纺纤维得到的孔隙大小分布很大程 度上依赖于纤维直径，已知纤维直径减小时，孔径也在同时减小。据已发表的 文献，纤维直径在4-10pM时，孔径从20-45pM。采用不同材料不同参数的静 电纺丝可生成的不同直径的纤维。本发明采用上述材料的电纺丝根据软骨修复 过程自动安全降解，避免了结缔组织的异常增生，软骨纤维化现象。由于人工 软骨的特殊要求，静电纺支架同时有很好的耐磨性和韧性，以达到对天然软骨ii的最佳模拟。所述的纳米仿生支架在生物打印中同时起到生物"纸片"的作用。所述水溶胶可以是以下聚合物制成的水溶胶多糖类聚合物，如淀粉、纤 维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖；多肽类聚合物，如胶原、聚L-赖氨酸或聚 L-谷胺酸；合成的亲水高分子聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰 胺或聚N-聚代丙烯酰胺。上述聚合物制备的水溶胶通过改变温度、酸碱度、 经紫外线照射或者加入交联剂(固化液)等方法，可由液态转变为固态。多种细胞因子于软骨细胞的分化都有很重要的影响。软骨细胞的分化和增 殖受到多种因子的调节。本发明所涉及的细胞因子有以下几种调节软骨形成 的生长因子，促使骨髓间充质干细胞及滑液细胞转化为软骨细胞的细胞因子， 骨髓间充质干细胞及其迁移和转化为软骨细胞或其他刺激原。促使骨髓间充质干细胞及滑液细胞转化为软骨细胞的细胞因子包括以下因子转化生长因子f31 (TGF-pi)、骨形态发生蛋白2 (BMP-2)、胰岛素样生 长因子l (IGF-1)等细胞因子。转化生长因子(31是促骨髓间充质干细胞向软 骨分化首选的细胞因子，其具有多重生物学效应①促进软骨前体细胞趋化到 骨软骨损伤部位，并能诱导未分化的骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞。②促 进软骨基质合成。③抑制软骨分解代谢。④关节软骨缺损修复远期疗效不佳的 一个重要原因是在关节软骨损伤的病理过程中多种炎症递质(如白细胞介素、 肿瘤坏死因子、干扰素、基质金属蛋白酶等)参与软骨基质的降解，转化生长 因子pl能抑制这些炎症递质的活性，并能促进基质金属蛋白酶抑制剂的表达。 骨形态发生蛋白2是转化生长因子(3超家族的成员，也能诱导骨髓间充质干细 胞增殖并分化为软骨细胞。骨形态发生蛋白2和转化生长因子pi还具有协同 作用，骨髓间充质干细胞在两者共同作用下II型胶原合成显著提高，同时使I 型胶原表达降至最低。胰岛素样生长因子1是一种强有力的合成代谢刺激因子， 可以促进软骨细胞增殖和成熟，合成软骨基质蛋白多糖。研究表明胰岛素样生 长因子1可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，还可抑制转化生长因子卩l 引起的细胞外焦磷酸盐的积聚，防止焦磷酸钙结晶的形成和进一步成骨，是转 化生长因子(31重要的辅助因子。对干细胞的归巢或趋化或细胞分化起作用的因子，如细胞定向迁移因子(SDF-1)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白介素IL-3、血管生成素结合因子(ECM)、转化生长因子-a (TGF-a)、血小板衍生的生长 因子(PDGF)或细胞定向迁移因子、胰岛素生长因子、骨形态发生蛋白、骨形 态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子、碱性成纤维细胞生长 因子、骨桥蛋白、生长激素类(如促生长素)等细胞吸引及粘附因子调节软骨形成的生长因子软骨形成受到的生长因子调节作用，许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进干细胞分化为软骨细胞，并促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有IGFs， TGF-Ps (如BMPs)， PDGF， FGF， EGF, IGF-I ，而对软骨细胞有抑制作用 的有IL-1、 IL-2、 IL-7、 TNF-a、 IFN-y等。TGF-|3可以诱导间充质细胞车、化为 软骨细胞。现己实验证明TGF-(3s具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外 基质合成的能力。骨形态发生蛋白(BMP)家族属于TGF-(3s超家庭，可加速功 能性关节软骨的再生，被证实为具有骨发生、软骨发生和其它生长和分化类型 的活性。这些BMP包括BMP画2 、 BMP-3 、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP - 7 ( OP陽1 )、 BMP - 8、 BMP - 9、 BMP - 12、 BMP-13、 BMP-15、 BMP-16、 BMP-17、 BMP-18、 GDF-1、 GDF-3、 GDF-5、 GDF-6、 GDF画7、 GDF-8、 GDF-9、 GDF-IO、 GDF-ll、 GDF-12、 GDF-14、 Vgr-2和任何生长分化因子(GDF )。 例如，BMP-7(OP-l)是BMP家族中的一员，可增加其碱性磷酸酶活性和提高 mRNA和II型胶原的合成能力，rhBMP(OP-l)能有效促进胚胎和成人关节软骨 细胞合成蛋白多糖和II型胶原。IGF- I能强烈剌激软骨细胞合成II型胶原和蛋 白多糖，还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，而IGF-II能刺激软骨细胞 DNA和RNA的合成且比IGF-I更有效的剌激胚胎细胞的生长。而IGF结合 蛋白(IGFlBPs)它通过特异性结合IGFs而起作用。成纤维细胞生长因子(FGFs) 体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成，而bFGF是 一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨细胞蛋白多糖的合 成。促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的其它刺激原地塞米松常被认为是一 种非特异性的分化刺激原，能提高软骨细胞外基质基因的表达，使II型胶原和蛋白多糖合成增多。此外，n型胶原是透明软骨的主要成分之一，对于软骨细 胞功能的维持起着重要作用。单独使用n型胶原也能诱导并维持间充质干细胞 向软骨细胞分化，还能与转化生长因子pi相互作用增强骨髓间充质干细胞的分化能力。从以上论述中可以得知，多种因子尽管都对关节软骨的再生有不可或缺的 作用，但其作用方式，其局部浓度及其梯度浓度分配、不同因子的组合和在损 伤部位深浅层次上浓度分配及其不同的比例，都对关节软骨的修复效果有重要 关系。比如说，促进软骨细胞迁移的因子在人工软骨支架材料上的分布应该是 内层浓度高于外层浓度，以利其迁移。反之，分化因子则应该有计划的成簇分 布为佳。因此，为满足此点要求，必须将多种细胞因子精确的与纳米仿生支架 结合。但目前的混纺技术等都不能做到此点，但生物打印技术却可以将不同的 细胞因子准确的结合到计划部位。本发明还提供了上述纳米仿生人工关节软骨的制备方法，包括以下步骤 (1)制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液； (2 )用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架； (3)用喷墨打印机将含有细胞因子或软骨细胞的水溶胶溶液打印到所述 纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。含有细胞因子的水溶胶溶液的制备也可以在步骤(3)实施之前再进行。在本发明中，步骤(2)和(3)可重复一次或者更多次，以得到不同厚度的关节软骨。所述电纺溶液是将所述支架材料溶于一定的溶剂，形成电纺液；支架材料 包括聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙二 酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙垸、聚 对二恶酮、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤 维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海 藻酸、硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸的一种或两种以上混合溶液；可用的溶剂为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、 四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、 乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙烷、三氟乙酸或水的任意一种或者它们任意比例 的混合物。上述的高分子材料和溶剂用于静电纺丝的相关技术，例如材料与溶 剂的重量比例等参照现有技术。所述电纺溶液优选数均分子量为26000的聚-DL-乳酸和聚己内酯的二氯甲14垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己内酯所占的重量百分比分别为50 %和50%， 溶液总的质量百分比浓度为4 11 % 。步骤(1)所述含有细胞因子的水溶胶溶液是含有细胞因子的水溶胶缓冲 液；所述细胞因子所占质量百分比总数不高于10%。步骤(1)所述水溶胶缓冲溶液为藻酸盐或藻酸盐与其它物质的混合溶液， 交联剂溶液为氯化钙溶液；或所述水溶胶缓冲溶液为纤维蛋白原溶液，交联剂 溶液为凝血酶溶液；或所述水溶胶缓冲溶液为透明质酸碳酸氢钠溶液，交联剂 溶液为酰肼或碳化二亚胺；或所述水溶胶缓冲溶液为胶原-聚阴离子溶液，交 联剂为碳化二亚胺。步骤(2)所述静电纺丝的优选参数为注射泵推进速度为0.1 3.0ml/h， 纺丝针头为IO、 12、 14、 16、 18或20号针头，施加电压为10 30KV， 接收 喷丝的细胞培养皿中装有交联剂溶液，生物打印的纸片为电纺制得的纳米仿生 支架。所述喷墨打印机优选改装的惠普550C喷墨打印机，改装方法参考美国专 利US 7051654。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明是对现有技术的进一步发展，比已有技术中人工合成聚合物的组织 工程支架机械性能更好，细胞因子辅助治疗软骨损伤法中细胞因子本身对软骨 生长的促进作用很好，但要将因子固定于组织工程支架材料并能缓释释放，这 一构想目前还没有得到实际实施，本发明实现了该构想。本发明采用了原位自体细胞工程技术，采用干细胞趋化因子吸引自体干细 胞定向迁移进入创面并按设计要求进行分化,采用细胞趋化因子和细胞分化因 子，前者吸引关节滑液和/或关节软骨下骨中合适的自体细胞定向迁移进入关 节软骨损伤部位，后者促使吸引迁移到损伤部位的自体细胞按设计要求分化为 软骨细胞并进一步行使正常软骨细胞功能、修复关节软骨，既避免了使用活细 胞带来的不便，又能达到使用与其同等或者更佳的修复效果，有广阔和应用前學本发明利用生物打印技术，将生长因子等生物物质按设计要求与纳米支架 精确结合，形成诱导软骨下骨干细胞和关节滑液细胞迁移、聚集、分化的微环 境，吸引干细胞进入损伤部位。本发明采用的三维支架具有理想的降解速度，在关节软骨层再生后降解， 能够满足临床实际应用的需要。可完全降解，而且三维支架有一定的耐磨性， 润滑性，在关节软骨层再生之前可以代替软骨的功能，可植入固定，与关节面 糸5口 口 o本发明的人工关节软骨生物安全性、相容性好，没有免疫排斥作用或排斥作用极低；原料无毒性及致瘤性，产品有良好的耐磨性，润滑性和机械强度， 有一定的可塑性，有临时性代替软骨功能的作用，能与关节面紧密结合。本发明结合了静电纺丝和生物打印技术，分布了适当的细胞因子和刺激 原，并可控释放，提供了合适的微环境，以利于间充质干细胞的归巢、粘附、 分化为软骨细胞并生长增殖和行使正常生理功能，诱导软骨组织再生，形成新 的正常透明关节软骨层。本发明原料来源丰富，易于获得；材料是目前巳经证实对人体无毒无害的 安全生物材料；本发明制备的人工软骨本身不含活细胞成分，不使用外源细胞 和蛋白，免除了因此而带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险；本发明制备的人工软骨贮存运输简单；制备方法工艺步骤简化，生产时间 短，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，产品标准容易 实现，产品可实现低成本、高效率的产业化生产。


图1为本发明人工关节软骨的结构示意图，图中1为静电纺丝形成的生物 纸片，2为细胞分化因子、3为细胞迁移因子。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。 实施例l(1)制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液； -电纺溶液优选数均分子量为26000的聚-DL-乳酸和聚己内酯的二氯甲垸溶 液；所述聚-DL-乳酸和聚己内酯所占的重量百分比分别为50 %和50%，溶液 总的质量百分比浓度为7%。交联剂溶液选用O.IM氯化钙溶液。含有细胞因子的水溶胶溶液采用藻酸盐溶液，所述细胞因子藻酸盐溶液中 细胞因子TGF-(31、 IGF-1、 BMP-2的质量百分比浓度各为100ppm。将配置好的O.IM氯化钙溶液放入直径150mm的细胞培养皿中，置于静电 纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专 利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在电纺 丝装置箱内电纺针头正下方，用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子藻酸 盐溶液装入喷墨打印墨盒中。本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。(2) 用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架； 将电纺溶液装入注射泵开始纺丝，设定注射泵推进速度为0.5ml/h， 选用10号针头，施加电压为20KV，用装有氯化钙溶液的细胞培养皿接收喷丝。 喷丝30分钟后，停止静电纺丝；(3) 用喷墨打印机将含有细胞因子的藻酸盐溶液打印到纳米仿生支架上， 水溶胶固化后即得。开启喷墨打印机，按照设定的位置，将细胞因子藻酸盐溶液打印在培养皿 的电纺层上，藻酸盐溶液接触电纺层上的氯化钙溶液后迅速固化，形成藻酸盐 水溶胶，将细胞因子包裹并固定。重复打印15遍后，关闭打印机。重新静电纺丝30分钟，然后再关闭静电 纺丝，打印；静电纺丝和打印循环重复。最后形成厚度约1.5mm的人工关节 软骨，制得的人工关节软骨结构如图l所示，图中l为静电纺丝形成的生物纸 片，2为细胞分化因子、3为细胞迁移因子。将制得的纳米纤维水溶胶薄膜从培养皿中取出，用蒸馏水漂洗5遍，经冻 干后真空包装，经25kGy钴-60灭菌后负20摄氏度低温保存。 实施例2实施步骤同实施例1。所述电纺溶液优选数均分子量为26000的聚-DL-乳酸和聚己内酯的二氯甲 烷溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己内酯所占的重量百分比分别为50 %和50%， 溶液总的质量百分比浓度为5 %。交联剂溶液选用100IU/ml凝血酶溶液； 含有细胞因子水溶胶溶液采用细胞因子纤维蛋白原溶液，BMP-2浓度为 10mg/ml。具体操作是将配置好的凝血酶溶液放入直径90mm的细胞培养皿中，置于 静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固定在 电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作细胞因子定位打印。将配好的细胞因子 纤维蛋白原溶液装入喷墨打印墨盒中，本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。将电纺溶液装入注射泵开始纺丝，设定注射泵推进速度为1.5ml/h，选用 16号针头，施加电压为25KV，用装有凝血酶溶液的细胞培养皿接收喷丝。喷 丝25分钟后，停止静电纺丝，开启喷墨打印机，按照设定的位置，将打印在 培养皿的电纺层上，纤维蛋白原溶液接触电纺层上的凝血酶溶液后迅速固化， 形成水溶胶，将细胞因子包裹并固定。重复打印15遍后，关闭打印机，重新 静电纺丝30分钟，然后再关闭静电纺丝，打印15遍.反复若干次，形成厚度 约3.0mm的纳米仿生人工关节。保存方法同实施例1。 实施例3所述电纺溶液优选数均分子量为26000的聚-DL-乳酸和聚己内酯的二氯甲 垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己内酯所占的重量百分比分别为50 %和50%， 溶液总的质量百分比浓度为10%。交联剂溶液选用100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子的胶原与聚阴离子溶液，其中胶 原浓度为1%，聚阴离子采用聚谷氨酸，浓度50mg/ml，所述细胞因子包括细 胞定向迁移因子SDF-1、表皮生长因子、转化生长因子(3、 BMP-2、地塞米松， 总的质量百分比浓度为0.5%。具体操作是将配置好的碳化二亚胺溶液放入直径150mm的细胞培养皿中， 至于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按 照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固 定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作细胞因子定位打印。将配好的细胞 因子溶液装入喷墨打印墨盒中，本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。将电纺溶液装入注射泵开始纺丝，设定注射泵推进速度为0.2ml/h，选用 12号针头，施加电压为20KV，用装有碳化二亚胺溶液的细胞培养皿接收喷 丝。喷丝30分钟后，停止静电纺丝，开启喷墨打印机，按照设定的位置，将 细胞因子的透明质酸碳酸氢钠溶液(细胞因子质量百分比浓度0.1%)打印在 培养皿的电纺层上，透明质酸溶液接触电纺层上的碳化二亚胺后迅速固化，形18成透明质酸水溶胶，将细胞因子包裹并固定。重复打印15遍后，关闭打印机，重新静电纺丝35分钟，然后再关闭静电纺丝，打印15遍，重新静电纺丝35分钟，然后再关闭静电纺丝。反复若干次， 形成厚度约4.0mm的纳米人工关节软骨。保存方法同实施例1。 实施例4所述电纺溶液优选数均分子量为26000的聚-DL-乳酸和聚己内酯的二氯甲 垸溶液；所述聚-DL-乳酸和聚己内酯所占的重量百分比分别为50 %和50%， 溶液总的质量百分比浓度为6%。交联剂溶液选用100mg/ml水溶性碳化二亚胺溶液；含有细胞因子的水溶胶溶液采用细胞因子的胶原与聚阴离子溶液，其中胶 原浓度为1%，聚阴离子采用聚谷氨酸，浓度50mg/ml，所述细胞因子包括细 胞定向迁移因子SDF-1、表皮生长因子、转化生长因子-a、 BMP，总的质量百 分比浓度为0.5%。具体操作是将配置好的碳化二亚胺溶液放入直径150mm的细胞培养皿中， 至于静电纺丝装置及打印机共用的平板接收器上。将惠普550C喷墨打印机按 照现有专利报道进行改装，例如可参照美国专利US 7051654公开的方法，固 定在电纺丝装置箱内电纺针头正下方，用作细胞因子定位打印。将配好的细胞 因子溶液装入喷墨打印墨盒中，本实施例采用的墨盒型号为HP51626A。将电纺溶液装入注射泵开始纺丝，设定注射泵推进速度为0.4ml/h，选用 12号针头，施加电压为25KV，用装有碳化二亚胺溶液的细胞培养皿接收喷 丝。喷丝35分钟后，停止静电纺丝，开启喷墨打印机，按照设定的位置，将 细胞因子的透明质酸碳酸氢钠溶液(细胞因子质量百分比浓度0.1%)打印在 培养皿的电紡层上，透明质酸溶液接触电纺层上的碳化二亚胺后迅速固化，形 成透明质酸水溶胶，将细胞因子包裹并固定。重复打印15遍后，关闭打印机，重新静电纺丝35分钟，然后再关闭静电 纺丝，打印15遍，重新静电纺丝35分钟，然后再关闭静电纺丝。反复若干次， 形成厚度约5.0mm的纳米人工关节软骨。保存方法同实施例1。 实施例5用实施例1制得的人工关节软骨进行动物实验选择新西兰兔并进行肌肉注射麻醉。确定兔子完全麻醉以后，剃光两条腿 的膝关节，用橡皮膏固定，并保持仰卧姿势。确认膝关节没有病变现象以后， 用锐利的手钻在大股骨关节面的位置处打一个中心螺旋状的凹孔，然后用钻子在其中心位置打一个直径4mm的洞，深度达到3mm，人为建立了一个全厚的 软骨缺陷。按照上述方法建立软骨损伤以后，继续观察损伤区域4个月。确 定关节软骨损伤区域没有自己愈合。再次进行肌肉注射麻醉，打开上次手术部位。用钻子在上次人为建立的关 节软骨损伤区之下的硬骨上打洞，移植本发明制备的人工关节软骨。将本发明 制备的人工关节软骨的一端植入到硬骨骨洞上。进行软骨修复12周后进行核磁共振检测。从核磁共振图上可见，修复处 表面平滑，表明修复处未有塌陷。未见明显免疫炎症反应。进行软骨修复8个月后，.处死实验动物，取手术部位组织观察。肉眼观察 可见，在移植物处形成新生的透明软骨，新生软骨与关节表面融合良好。组织 切片检测，可见人工关节软骨己被新生的透明软骨所替代，修复处未出现塌陷， 与正常软骨的交界处紧密接合，界线模糊。未见巨噬细胞等炎症细胞浸润，未 见明显免疫炎症反应。上述结果表明，在关节软骨缺损中，本发明制备的人工关节软骨可促进软 骨的愈合。
权利要求
1.一种基于自体细胞的人工关节软骨，包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子。
2. 如权利要求1所述的人工关节软骨，其特征在于所述细胞因子包括细胞的归巢或趋化起作用的细胞因子、促使间充质干细胞转化为软骨细胞的细胞 因子或调节软骨形成的生长因子中的任意一种或几种。
3. 如权利要求1所述的人工关节软骨，其特征在于所述纳米仿生支架是 采用支架材料溶于溶剂形成电纺液通过静电纺丝技术制备得到；所述支架材料 包括聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨酯、聚乙二醇、聚对苯二甲酸乙 二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚磷酸酯、 聚氨基甲酸酣、聚L-乳酸、聚酯酰胺、聚乙烯醇、聚丙交酯、聚氧乙烷、聚 对二恶酮、聚氨酯类、聚碳酸酯、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤 维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、海 藻酸、硫酸软骨素，肝素，琼脂，葡聚糖、褐藻酸。
4. 如权利要求3所述人工关节软骨，其特征在于所述溶剂为甲酸、乙酸、 乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、六氟异 丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲垸、甲醇、乙醇、氯仿、二噁垸、三氟乙 垸、三氟乙酸、水或它们任意比例的混合物。
5. 如权利要求1所述的人工关节软骨，其特征在于所述水溶胶是以多糖 类聚合物、多肽类聚合物或多肽类聚合物制成的水溶胶；所述多糖类聚合物为 淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸或壳聚糖；所述多肽类聚合物为胶原、聚 L-赖氨酸或聚L-谷胺酸；所述合成的亲水高分子聚合物为聚丙烯酸、聚甲基丙 烯酸、聚丙烯酰胺或聚N-聚代丙烯酰胺。
6. —种权利要求1所述的人工关节软骨的制备方法，其特征在于包括以 下步骤(1) 制备电纺溶液、含有细胞因子的水溶胶溶液和交联剂溶液；(2) 用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；(3) 用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支 架上，水溶胶固化后即得。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述含有细胞因子的水溶胶溶液的制备在步骤(2)和步骤(3)之间进行。
8. 如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)和(3) 重复若干次。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述静电纺丝的 参数为注射泵推进速度为0.1~3.0ml/h，纺丝针头为10、 12、 14、 16、 18或 20号针头，施加电压为10-30KV,接收喷丝的细胞培养皿中装有交联剂溶液， 生物打印的纸片为电纺制得的纳米仿生支架。
全文摘要
本发明提供了一种基于自体细胞的人工关节软骨及其制备方法。所述人工关节软骨包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，所述水溶胶内包覆有一种或几种细胞因子。本发明还提供了所述人工关节软骨的制备方法，包括以下步骤制备电纺溶液、含有细胞因子水溶胶溶液和交联剂溶液；用所述交联剂溶液接收静电纺丝制得纳米仿生支架；用喷墨打印机将含有细胞因子的水溶胶溶液打印到所述纳米仿生支架上，水溶胶固化后即得。本发明采用的三维支架具有理想的降解速度，在关节软骨层再生后降解，能够满足临床实际应用的需要，可完全降解，而且三维支架有良好的耐磨性，润滑性，在关节软骨层再生之前可以代替软骨的功能。
文档编号A61L27/54GK101574543SQ20091004011
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月9日 优先权日2009年6月9日
发明者弢 徐, 袁玉宇 申请人:广州迈普再生医学科技有限公司