人残耳软骨干细胞及其构建组织工程软骨的方法

专利名称：人残耳软骨干细胞及其构建组织工程软骨的方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及利用人残耳软骨干细胞构建的组织工程化软骨及其制备方法和用途。
背景技术：
小耳畸形(microtia)是一种发病率较高(约1/3000)的先天性疾病，表现为耳廓标志形态缺失，耳区被挛缩、畸形的软骨团块(残耳软骨)所取代。目前临床上对小耳畸形的治疗主要是取患者自体肋软骨雕刻成耳廓形态后植入耳区皮下为主。该方法的主要缺点是对正常肋软骨造成很大创伤，而且容易导致气胸、胸廓塌陷、畸形和瘢痕等供区并发症。组织工程技术的兴起及迅速发展为解决这一难题带来了希望。目前应用动物的软骨细胞复合耳廓形态可降解支架已能在体外构建出精确的人耳廓形态软骨。因此，只要有足够的病人自体来源的软骨构建种子细胞，这一技术完全有希望转化为实际的临床应用， 为小耳畸形患者的外耳重建带来福音。然而，种子细胞来源问题一直是制约这一技术向临床转化的瓶颈。目前用于构建软骨的种子细胞主要有两种1)软骨细胞；2)具有软骨分化潜能的干细胞。由于软骨细胞本身已经具有很强的自发成软骨能力，因此直接用其构建组织工程软骨最稳定也最能保证成功率；但正常人体内的软骨细胞来源非常有限，取材创伤大，且正常软骨细胞体外扩增能力很低，扩增后又极易老化、去分化，从而丧失软骨形成能力，因此，取病人自体正常软骨细胞进行外耳软骨重建缺乏临床应用可行性。具有成软骨分化潜能的干细胞(如脂肪干细胞或骨髓基质干细胞)虽然来源广泛，扩增能力强，但这些细胞体外构建具有特定形态(如人耳廓)软骨的成功率不高，且体外构建的软骨植入皮下环境后很不稳定，极易发生骨化或纤维化，也不适于构建耳廓等异位软骨。小耳畸形患者的残耳在外耳再造手术中属于废弃组织，切取残耳不会对正常组织造成任何损伤，并且已有研究证实早期传代的残耳软骨细胞能够再生组织工程软骨。那么，能否利用小耳畸形病人自体的残耳软骨细胞构建耳廓形态软骨来进行耳再造呢？要实现这一梦想，首先要解决三个关键问题1.细胞数量问题一个病人的残耳软骨中仅能分离获得1-3 X IO6个细胞，能否将这些细胞扩增到构建正常大小人耳廓形态软骨所需的细胞数量(1. 5-3 X IO8个细胞)？ 2.细胞功能问题扩增后的残耳软骨细胞是否还具有良好的软骨形成能力？ 3.构建技术问题如何利用这些细胞在体外构建具有精确人耳廓形态的软骨？综上所述，本领域迫切需要寻找取材创伤小，具有较强增殖能力和软骨形成能力，且在皮下环境中软骨形成稳定的种子细胞，并建立相应的软骨构建核心技术。

发明内容
本发明旨在提供一种增殖能力强、软骨定向分化潜能强、且在体外及皮下环境中软骨形成稳定的软骨再生种子细胞(残耳软骨干细胞)，以及利用该细胞构建组织工程三维软骨移植物的方法。在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化软骨移植物，所述的移植物含有在三维结构下生长的人残耳软骨细胞；所述的人残耳软骨细胞是第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的；较佳地，是第1、2、3、4、或5代的。在另一优选例中，所述三维结构是由所述的人残耳软骨细胞聚集形成的团块(pellet)、或高密度所述人残耳软骨细胞接种于培养皿所形成的细胞膜片、或是由所述人残耳软骨细胞接种于固体的医学上可接受的生物可降解材料形成；所述高密度是指O. 5 X IO6个细胞/cm2-5 X IO6个细胞/cm2 ;所述医学上可接受的生物可降解材料选自聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及其共聚物或混合物。
在本发明提供的软骨移植物中，所述的人残耳软骨细胞来自自体或同种异体；优选小耳畸形(microtia)患者自体的残耳软骨。本发明提供的软骨移植物，以所述移植物的总体积计，其中的人残耳软骨细胞浓度为2 X IO7个细胞/cm3-10 X IO7个细胞/cm3 ;较佳地，为2 X IO7个细胞/cm3_7 X IO7个细胞 /cm3。在另一优选例中，所述移植物的形状同人体需要移植软骨的缺损部位形状相符；较佳地，本发明提供的软骨移植物的形状为人耳廓、鼻背、鼻翼、下颏、颧弓、眉弓、管状、菱形、片状、圆柱等多种形状但不仅限于此。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程化软骨移植物的制备方法，所述的方法包括步骤(I)将人残耳软骨细胞进行平面扩增，并传代至第1、2、3、4、5、6、7、或8代；(2)将第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的人残耳软骨细胞通过离心形成团块(pellet)、或将第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的人残耳软骨细胞高密度接种形成细胞膜片、或将第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的人残耳软骨细胞与固体的医学上可接受的生物可降解材料混合形成细胞-生物材料复合物；和(3)将团块、细胞膜片或复合物进行体外软骨诱导；以总体积计，所述体外软骨诱导液中含有 5-50ng/ml TGF- β ! (Transforming Growth Factor-β p 转化生长因子-β J 和10-100ng/ml 的地塞米松(dexamethasone)。上述体外软骨诱导液，含血清诱导体系在CN 200510112068. X和CN200610024205. 9)中都有述及，相关内容并入本发明中。本发明优选的体外成软骨诱导液为无血清诱导体系，以总体积计，含有常规含量的血清替代物(如ITS premix,其中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐)及常规细胞培养添加物(如脯氨酸、维生素C等)，同时含有5_20ng/ml 的 TGF- β 丨(Transforming Growth Factor- β 丨，转化生长因子-β )，IO-1OOng/ml 的 IGF-1 (Insulin-Like Growth Factor-1,膜岛素样生长因子-1),和 10-100ng/ml 的地塞米松(dexamethasone);更佳地，所述成软骨诱导液中含有8_12ng/ml的TGF-^1,90-100ng/ml 的 IGF-UP 30_50ng/ml 的地塞米松。在另一优选例中，所述人残耳软骨细胞来自自体或同种异体；优选小耳畸形(microtia)患者自体的残耳软骨。在本发明提供的上述制备方法中，体外成软骨诱导的时间为3-20周；较佳地为6-12 周。在本发明提供的上述制备方法中，以复合物的总体积计，残耳软骨细胞在复合物中的浓度为2 X IO7-1O X IO7个细胞/cm3。在另一优选例中，所述用于体外成软骨诱导的无血清成软骨诱导液的应用时间为软骨细胞与固体的医学上可接受的生物可降解材料混合之后24-168小时，优选24-48小时。对于无需支架材料做载体、仅通过细胞聚集形成的三维团块(如pellet)或细胞膜片，成软骨诱导液的应用时间为细胞聚集物形成之后72小时内，优选24小时内。在另一优选例中，所述用于成软骨诱导的无血清培养液的应用方法为直接滴加在复合物、pellet或细胞膜片上，换液间隔时间为24-96小时。 在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组织工程化软骨移植物在构建组织工程化耳廓移植物中的应用。在本发明的第四方面，提供了一种人残耳软骨细胞在体外构建组织工程化软骨中的应用。在本发明的第五方面，提供了一种人残耳软骨细胞在体外构建组织工程化耳廓移植物中的应用。在另一优选例中，所述的人残耳软骨细胞来自自体或同种异体；更佳地，小耳畸形(microtia)患者自体的残耳软骨。据此，本发明提供了取材创伤小，具有较强增殖能力和软骨形成能力，且在皮下环境中软骨形成稳定的种子细胞，并建立了相应的软骨构建核心技术。


图1显示了残耳软骨细胞诱导骨髓基质干细胞(BMSC)在裸鼠皮下成软骨的情况。其中A、D分别为残耳软骨细胞与BMSC共培养组的大体外观及II型胶原染色；B、E分别为单纯残耳软骨细胞组的大体外观及II型胶原染色；C、F分别为单纯骨髓基质干细胞组的大体外观及II型胶原染色。图2显示了不同代次残耳软骨细胞体外平面扩增时的细胞形态(100X)及增殖情况；其中Pld4代表第I代扩增到第4天的残耳软骨细胞，以此类推。细胞形态下方为相同代次对应的增殖曲线。图3显示了不同代次残耳软骨细胞软骨形成情况。P0d5代表原代扩增到第5天的残耳软骨细胞以及用其制备的pellet情况，以此类推。图4显示了第8代残耳软骨细胞的三向分化潜能。从左到右依次为第8代残耳软骨细胞经成骨诱导3周后的茜素红染色、形成pellet经成软骨诱导3周后的II型胶原免疫组化染色以及经成脂诱导3周后的油红染色(200X)。图5显示了第8代残耳软骨细胞经诱导形成软骨的情况。A :为pellet大体外观(η = 3), B 为各组 pellet 湿重(n = 5), C 为各组 pellet 直径(η = 5)。图6显示了第8代残耳软骨细胞pellet经诱导形成软骨的大体及组织学(HE、Safrani n_0及II型胶原染色)。
图7显示了第3代残耳软骨细胞-PGA/PLA复合物体外成软骨诱导8周的大体及II型胶原染色结果；其中A为大体观，B为II型胶原免疫组化染色，(100X)。图8显示了第5代残耳软骨细胞，以及骨髓基质干细胞(BMSC)复合PGA支架，在体外成软骨诱导6周后植于裸鼠皮下12周后的大体及HE(200X)。图9显示了第3代残耳软骨细胞-耳支架复合物体外成软骨诱导8周的大体及组织学染色结果；其中A为大体观，B为HE染色，(100X)。
具体实施例方式针对现有技术中存在的问题和困难，发明人首先考察了残耳软骨细胞体外扩增后的软骨形成能力，结果不幸地发现，残耳软骨细胞的软骨形成能力随着体外传代急剧下降，甚至较正常软骨细胞下降更快，传到第3代时已基本不能形成均质的典型软骨(图3)，无法满足组织工程软骨构建对种子细胞功能的要求，这一现象通常被认为是一种软骨表型去分·化的表现，给予本领域技术人员的提示是通过扩增残耳软骨细胞来进行耳再造似乎不具备临床应用可行性。然而，研究过程中发明人意外地发现，残耳软骨细胞虽然很容易丧失软骨形成能力，但其却具有超强的增殖能力，也就是说，虽然发生了去分化，却未出现明显的老化现象，这一点与正常来源的软骨细胞明显不同正常软骨细胞从第I代开始增殖能力就迅速下降，传到第5代时已明显老化、很难增殖(而且每次传代增殖的比例也很有限)；而残耳软骨细胞则具有很强的增殖能力，即使(按1: 3比例)扩增到第8代仍能保持很高的增殖活性(图2)( —般传到第3-4代已基本能够满足构建正常大小的耳廓形态软骨对种子细胞的数量要求)。那么，扩增后的残耳软骨细胞是否仍具有软骨形成潜能呢？鉴于残耳软骨细胞体外增殖能力强、不易老化等特性完全不同于分化成熟的软骨细胞，而与以往报道的干细胞特性类似，因此发明人大胆假设，残耳软骨来源的细胞很可能是一种发育过程中残留下来的干细胞。基于这一假设，发明人对残耳软骨细胞进行了多向诱导分化实验，并惊喜地发现，即使扩增到第8代的细胞仍然具有成骨、成软骨、成脂肪等多向分化潜能(图4)。这些结果提示，残耳软骨来源的细胞的确是一种增殖能力强且具有多向分化潜能的类似干细胞特性的细胞，这一重大发现以往未见报道，发明人暂且将其称为残耳软骨干细胞。为充分证实这一重大发现，发明人对多例残耳软骨来源的细胞进行了增殖潜能及多分化潜能验证，结果证实，所有残耳软骨来源的细胞均具有很强的增殖潜能和骨、软骨、脂肪等多向分化潜能，表明残耳软骨来源细胞的干细胞特性并非偶然现象，而是一种客观存在并可重复的特性，这些结果提示残耳软骨细胞在数量及功能方面均有望满足构建耳廓形态软骨的要求。尽管上述诸多重要发现，如何应用残耳软骨干细胞来构建临床可应用的耳廓形态软骨仍然是一个巨大挑战。在充分证实其干细胞特性的基础上，发明人结合以往诱导干细胞(如骨髓基质干细胞等)构建三维软骨的经验，通过反复尝试和多种方案的对比及优化整合，建立了稳定的残耳软骨干细胞软骨定向诱导体系(图5、图6)，并结合三维可降解支架，应用残耳软骨干细胞在体外构建出均质成熟的三维软骨样组织(图7)。体内植入结果显示，残耳软骨干细胞再生的软骨在皮下环境中能够维持稳定的软骨表型(图
8)。在此基础上，进一步结合先前已建立的基于动物成熟分化软骨细胞的精确人耳廓形态软骨构建技术(如计算机辅助设计支架成型等)，相关文献包括Liu Y, Zhang L, ZhouG，Li Q，Liu W，Yu Z，Luo X，Jiang T，Zhang W，Cao Y.1n vitro engineering of humanear-shaped cartilage assisted with CAD/CAM technology. Biomaterials. 2010. 03.，31 (8) :176-183,相关专利包括CN200710044711. 9，将人残耳软骨干细胞与精确人耳廓形态的PGA/PLA支架材料复合，并以上述优化的条件进行诱导，最终在体外构建出了具有精确人耳廓形态的组织工程软骨(图9)。综上所述，发明人针对软骨构建种子细胞来源不足的瓶颈问题，基于残耳软骨细胞体外培养过程中具有很强增殖潜能的意外发现，大胆假设并首次证实残耳软骨来源的细胞是一种增殖能力强且具有多向分化潜能的类似干细胞特性的细胞，并进一步结合发明人以往干细胞软骨定向诱导及三维软骨构建技术与经验，以及精确人耳廓形态软骨构建核心 技术，通过对一系列关键技术参数的反复尝试与优化整合，最终建立了基于残耳软骨干细胞的体外三维软骨构建体系。在此基础上，完成了本发明。人残耳软骨细胞本发明中人残耳软骨细胞来源于小耳畸形患者自体或异体的残耳软骨组织。患者年龄及性别无特别限制。分离获得残耳软骨细胞的方法有多种，在本发明一实施方式中，所述的方法是全麻下或局麻下切取小耳畸形患者残耳软骨，彻底剥离剔除残耳软骨周围的结缔组织及软骨膜，将软骨切碎至l_2mm3小块，以O. 25%氯霉素溶液浸泡30_40min，PBS冲洗后以O. 25%胰蛋白酶+0. 02% EDTA于37°C恒温摇床中振荡消化30min，再以O.1 %的胶原酶于37°C恒温摇床中振荡消化12h。用200目滤网过滤消化液，收集滤液于50mL离心管内，1800rpm离心8min，弃上清后以合适的培养液(如含有10%胎牛血清，bFGF 10ng/ml, L-谷氨酰胺30(^8/1111，维生素05(^8/1111，青、链霉素各10(^/1111的DMEM培养液)重悬细胞沉淀，每IOcm培养皿中接种约2X IO6个活细胞，于37°C、5% C02、100%饱和湿度的条件下培养，隔日换液。待细胞生长近汇合后，以0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，按1: 3比例进行细胞传代。在本发明中，优选第1、2、3、4、5、6、7、或8代细胞制备组织工程软骨。虽然残耳软骨来源的细胞是一种增殖能力强且具有多向分化潜能的类似干细胞特性的细胞，但是人残耳软骨细胞同时也具备正常成熟软骨细胞诱导BMSC成软骨的这一能力，在证实这一能力的试验中需要使用的共培养技术在CN200610024205. 9中也已详细描述过,相关内容并入本发明。生物可降解材料可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚轻基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烧(polye sterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan, GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；(c)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原等。本发明中的材料可预制成各种精确的大小与形状，以适应不同大小和形状的软骨组织构建。当材料为固体型材料时，可以直接将材料预制成需要的大小与形状，也可以通过计算机辅助及快速成型技术定制的模型对材料进行精确的塑性。组织工程化软骨移植物
本发明提供的组织工程化软骨移植物含有在三维结构下生长的人残耳软骨细胞；所述的人残耳软骨细胞是第1、2、3、4、5、6、7、或8代；较佳地为第1、2、3、4、或5代的；更佳地为第1、2、或3代的。所述三维结构是由所述的人残耳软骨细胞聚集成团(pellet)或高密度(一般为I X IO6个细胞/cm2-5 X IO6个细胞/cm2)接种于培养皿所形成的细胞膜片；或是由所述的人残耳软骨细胞接种于固体的医学上可接受的生物可降解材料形成。以所述移植物的总体积计，其中的人残耳软骨细胞浓度为2X107个细胞/Cm3-1OXlO7个细胞/cm3 ;较佳地为2 X IO7个细胞/cm3_7X IO7个细胞/cm3。发明人在实验中发现，残耳软骨细胞的软骨形成能力随传代扩增迅速下降，第2代以上的细胞已经丧失软骨形成能力。但研究中意外地发现，这些细胞具有强大的增殖能力，即使(按1: 3比例)扩增到第8代仍能保持很高的增殖活性，而传到第3-4代已基本能够满足构建正常大小的耳廓形态软骨对种子细胞的数量要求(具体数目视所构建的特定组织及三维培养环境而定，一般在PGA支架上构建耳廓形态约需2 X IO8细胞)。进一步研究证实，残耳软骨细胞具有干细胞特征性的多向分化潜能，定向诱导实验证实，不同代次的残耳软骨细胞均能表现出较强的成骨、成软骨能力以及一定程度的成脂能力，基于这些结果本发明提出了残耳软骨干细胞的概念，并由此提出了通过软骨定向诱导构建组织工程软骨移植物的理念。基于这一理念，通过一系列关键技术参数的优化及整合，建立了稳定的残耳软骨干细胞体外软骨构建培养体系。基于这些原创性发现，结合发明人已有的干细胞体外三维软骨构建技术经验，以及先前已建立的基于动物成熟分化软骨细胞的精确人耳廓形态软骨构建技术(如计算机辅助设计支架成型等)，将人残耳软骨干细胞与精确人耳廓形态的PGA/PLA支架材料复合，利用上述优化的培养体系，体外构建精确人耳廓形态的组织工程软骨获得了成功。发明人还在此基础上进一步进行了更加严谨的大规模实验论证，最终完成了本发明。人残耳软骨细胞-生物材料复合物本发明中人残耳软骨细胞-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为2X IOVml至7X 107/ml或更高。材料为固体性材料或者固、液体复合材料，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。当支架材料为特殊三维形状时，如耳廓或鼻背形，按实际体积的大小来进行计算。
制备方法本发明的组织工程化软骨的制备方法简便，将一定数量的所述人残耳软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，再经体外成软骨诱导即可。所述的方法包括步骤第一步，将人残耳软骨来源的细胞进行平面培养扩增，并传代至1-8代；第二步，将上述传代扩增的细胞通过离心形成团块(pellet)或高密度接种形成细胞膜片；或将这些细胞与固体的医学上可接受的生物可降解材料混合形成细胞-生物材料复合物；第三步，将团块、膜片或复合物置于成软骨诱导液中进行体外培养。·
第一步中的平面培养扩增的方法例如但不限于，将分离得到的人残耳软骨细胞重悬于高糖DMEM培养液中，然后取细胞悬液接种于培养皿上，在适宜条件下培养，待细胞生长近汇合后，消化、按比例(例如但不限于，I 2-1 10;优选1: 3-1 7;更佳地为1:3-1: 5)进行细胞传代至新的培养皿，在相同条件下继续传代培养。以所述高糖DMEM培养液的总体积计，优选其中含有10-20% FBS, l-10ng/ml bFGF ;接种量优选每10厘米培养皿中接种约O. 5-2 X IO6个活细胞。第二步在单层培养的人残耳软骨细胞达到近90%汇合时，进行消化，细胞计数当显示活细胞数多于90%,离心使细胞沉淀、弃去上清，分散细胞；重悬收集的细胞，离心使细胞聚集形成pellet或是将细胞高密度接种形成细胞膜片；也可以将细胞按照2X IO7-1OX IO7个细胞/cm3的密度接种到固体的医学上可接受的生物可降解材料上形成复合物。第三步中将获得的细胞膜片、pellet或是复合物在常规培养条件(例如但不限于，37°C、5% C02、100%饱和湿度、含10%血清的常规高糖DMEM培养液)下培养24-48小时后，更换为成软骨诱导液，一般采用常规成软骨诱导液即可，优选无血清成软骨诱导液。在本发明的一个实施方式中所采用的含血清成软骨诱导液在CN200510112068. X和CN200610024205. 9)中已有述及，相关内容并入本发明中。在本发明的另一实施方式中，采用无血清诱导体系，以总体积计，含有常规含量的血清替代物(如ITS premix,含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐)及常规细胞培养添加物(如脯氨酸、维生素C等)，同时含有5-20ng/ml 的 TGF-β i (Transforming Growth Factor-β 转化生长因子-β J , 10-100ng/ml 的IGF-1 (Insulin-Like Growth Factor-1,膜岛素样生长因子-1),和 10-100ng/ml 的地塞米松(dexamethasone);更佳地,所述成软骨诱导液中含有8_12ng/ml的TGF-β 1; 90_100ng/ml的IGF-1,和30_50ng/ml的地塞米松。本发明采用的成软骨诱导液中可优选添加或复合其它各种促进软骨分化的细胞因子或生长因子，如BMP、CDMP等，以加强软骨诱导效率并提高细胞外基质合成能力等。本发明采用的成软骨诱导液每2-4天换液一次，体外诱导的时间为3-20周，优选6-12 周。本发明的组织工程化软骨移植物构建软骨过程中，主要为静态培养，或者以离心或振荡的方式加入力学刺激，也可以通过软骨生物反应器模拟体内软骨的力学环境，对体外构建的软骨施加类似的力学刺激，促进软骨的成熟与力学性质的改进。用本发明方法形成的组织工程化软骨，即人残耳软骨干细胞与固体性生物材料构成的复合物，该复合物经体外成软骨诱导后可植入体内皮下或软骨缺损部位。在本发明的一个实施例中，用人残耳软骨干细胞与培养液制成浓度为5XlOVml的细胞悬液(不仅限于此浓度)，然后与聚羟基乙酸(PGA)为主的生物支架材料形成复合物(复合物大小、形状依照软骨缺损的大小及形状确定)。该复合物经体外软骨定向诱导6周至8周(不仅限于此时间，期间每2至4天换液一次，以保证细胞营养及诱导效率)，当体外组织工程化软骨初步形成时植入体内皮下或相应的软骨缺损部位。亦可将材料制作成具有精细结构外形的三维支架(如人耳廓形态)，再接种人残耳软骨干细胞进行体外诱导，经6-8周(不仅限于此时间)后植入体内软骨缺损部位。应用方法人残耳软骨细胞与可降解固态生物材料形成复合物后，在体外进行成软骨诱导，形成适合软骨缺损大小和形状的组织工程化软骨后，再植入体内软骨缺损部位。术语 术语“人残耳软骨细胞”、“残耳软骨来源的细胞”、或“人残耳软骨干细胞”可以互换使用，都是指使用本领域的常规分离细胞技术，从小耳畸形患者自体或异体的残耳软骨组织中获得的能够分泌II型胶原(collagen II),糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)等软骨特异性基质的多角形贴壁细胞。术语“人残耳软骨细胞的分离”指将残耳软骨细胞从小耳畸形患者残耳组织中分离出来的过程。术语“人残耳软骨细胞的扩增”指为了获取大量残耳软骨细胞而在体外环境中大量增殖的过程。术语“成软骨诱导”指提供特殊的生化环境，使具有软骨分化潜能的细胞表达软骨表型及具备成软骨能力的过程。术语“接种”指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如残耳软骨细胞)从某个体中取出并再施用于同一个体的过程。术语“三维结构”就是立体结构，是指占据了三维空间的结构，三维既是坐标轴的三个轴，即X轴、y轴、Z轴，其中X表示左右空间，y表示上下空间，Z表示前后空间。所谓的三维空间是指我们所处的空间，可以理解为有前后-上下-左右。本发明中在三维结构生长的种子细胞可以是通过将种子细胞接种于固体的医学上可接受的生物可降解材料上而形成的复合物；也可以是将种子细胞离心形成的细胞团块；或是将种子细胞进行高密度接种形成细胞膜片。所述的种子细胞是人残耳软骨细胞。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明对于本领域的重要贡献在于首次证实或建立了(一)、在二维培养条件下，残耳软骨来源的细胞具有很强的扩增能力，即使(按1: 3比例)扩增到第8代仍能保持很高的增殖活性；(二)、残耳软骨来源的细胞具有干细胞特有的多向分化潜能，即使扩增到第8代仍保持了很好的骨、软骨、脂肪等多向分化潜能；(三)、建立了稳定的残耳软骨干细胞软骨定向诱导体系；(四)、建立了残耳软骨干细胞体外构建三维软骨的核心技术，并证实其在体内皮下环境中的软骨表型稳定性；(五)、建立了基于人残耳软骨干细胞体外构建精确人耳廓形态软骨的核心技术。本发明的主要优点在于(I)可应用自体细胞，且一次取材既可获得足够的细胞量；(2)取材过程完全不损伤正常组织；(3)体外培养方法简单易学，便于推广应用；(4)体外成软骨诱导方法操作简便，成软骨效果确切可靠； (5)可按软骨缺损大小和形状预制移植物的大小和形状，以达到精确的修复；(6)与其它干细胞相比，残耳软骨干细胞体外构建的软骨形态更容易精确维持，植入皮下环境后软骨表型维持相对稳定。(7)本发明建立并优化的软骨诱导体系不含血清，成分明确，临床应用安全性高，便于标准化，易于形成产业化产品。应用本发明确定的方法，可获得大量具备软骨形成能力的残耳软骨细胞，用于构建耳廓形态组织工程软骨。该组织工程软骨不仅具有良好组织学结构、生物化学组成和力学强度，并且体外构建过程中不易收缩，可维持原有耳廓形态不变，而且植入皮下后成软骨稳定，不易发生骨化、纤维化现象。下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下述实施例中，高糖DMEM 培养基(Dulbecco’ s Modification of Eagle’ sMedium, high glucose)购自美国 HyClone 公司，货号SH0495 ;胎牛血清(Fetal BovineSerum, FBS)购自美国HyClone公司，货号SV30087. 02 ;维生素C(Vitamin C)购自美国Sigma公司，货号A8960-5G ;胰蛋白酶(Trypsin)购自美国Amresco公司，货号:0458 ；胶原酶NB4粉剂(Collagenase NB4)购自德国Serva公司，货号17454 ;碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)购自美国 R&D 公司，货号233_FB/CF;ITS通用型培养混合剂(ITS premix)购自美国S i gma公司，货号12521 ;转化生长因子-β I (Transformi ng Growth Factor- β I, TGF- β I)购自美国 R&D 公司，货号240-B-010 ;胰岛素样生长因子-1 (Insulin-Like Growth Factor-1，IGF-1)购自美国R&D公司，货号291-G1_010 ;地塞米松(dexamethasone)购自美国Sigma公司，货号D4902-1G;胰岛素(insulin)购自美国Sigma公司，货号:15500 ;吲哚美辛(indomethaein)购自美国Sigma公司，货号1-8280 ;β-磷酸甘油购自美国Sigma公司，货号G9422 ；1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)购自美国Sigma公司，货号15879。实施例1人残耳软骨干细胞的获取和培养细胞取小耳畸形患者自体残耳软骨组织，供体年龄8-30岁，身体健康，无恶性肿瘤、传染性疾病及自身免疫性疾病。(I)取材手术室无菌条件下，麻醉满意后，常规消毒铺巾，切取患者残耳组织，置于50mL无菌离心管内，以40mL无菌生理盐水浸泡保存及运输。(2)分离残耳软骨细胞超净台内无菌条件下，彻底剥离剔除残耳软骨周围的结缔组织及软骨膜，将软骨切碎至l_2mm3小块，以O. 25%氯霉素溶液浸泡30_40min，PBS冲洗后以O. 25%胰蛋白酶+0. 02% EDTA(Amresco, USA)于37°C恒温摇床中振荡消化30min，再以O. 1%胶原酶(Collagenase NB4, Serva, Germany)溶液于37°C恒温摇床中振荡消化12h。用200目滤网过滤消化液,收集滤液于50mL离心管内，1800rpm离心8min。(3)接种弃上清后以含有10%胎牛血清，10ng/ml bFGF, 300 μ g/ml L-谷氨酰胺，50 μ g/ml维生素C，青、链霉素各100U/ml的高糖DMEM培养液重悬细胞沉淀。取少量细胞悬液以台盼蓝常规计数活细胞，每IOcm培养皿中接种约2X IO6个活细胞。置于37°C、5%C02、100%饱和湿度的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液液。(4)培养与传代一般原代细胞在上述条件下培养7-8天后可达到融合状态，可继续传代培养。传代时吸除培养液，以少量PBS洗涤一次，加入1. 5-2. Oml的消化液(O. 25%胰蛋白酶+0. 02% EDTA(Amresco, USA))，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的DM EM条件培养液中止消化，收集细胞悬液、按1: 3比例传代至新的培养皿内，继续在相同的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液。一般4-5天后又可达到融合状态，可继续传代培养。以第1、2、3、4或5代细胞用于实验效果较佳。
倒置显微镜下观察，结果见图2。结果表明，人残耳软骨细胞呈长梭形或多角形。增殖曲线显示原代至第8代中各代次细胞均保持旺盛的增殖活性，未见明显老化迹象。实施例2以残耳软骨干细胞制备pellet(I)收集细胞单层培养的人残耳软骨细胞达到90%汇合时，应用0.25%胰酶+0. 02% EDTA消化。细胞收集后用细胞计数仪计数，台盼蓝染色显示活细胞数多于90%，1800rpm离心8min使细胞沉淀,弃去上清液,振荡分散细胞。(2)制备pellet :收集细胞后，以普通培养液重悬制备成0.4X 106/ml的细胞悬液。取Iml该悬液于15ml离心管内，IOOOrpm离心5min,制成细胞pellet。略微旋松瓶盖，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，之后隔天换液(普通培养液或成软骨诱导液)。3周后对各组pellet分别取材进行大体外观及组织学(HE，Safranin-0, II型胶原等)检测。实施例3PGA/PLA可降解三维支架的制作聚羟基乙酸(PGA)无纺棉由上海国睿生命科技有限公司生产，低温干燥保存。聚乳酸(PLA)购自美国Sigma公司，溶于二氯甲烷制成0.3%的PLA溶液。
(I)圆柱形PGA/PLA支架将PGA无纺棉精确称量为4mg/块，用模具压制成直径5_、厚Imm的圆柱体小块,待形状固定后,滴加PLA溶液至饱和,风干。使用前，将支架材料完全浸入到75%乙醇中消毒30分钟。PBS冲洗3次，再用含10%胎牛血清的DMEM培养基浸泡10分钟，吸干后准备接种细胞。(2)人耳廓形态PGA/PLA支架称取PGA无纺棉约800mg/块，用特制的(例如文献Liu Y, Zhang L, Zhou G, Li Q, Liu ff, Yu Z, Luo X, Jiang T, Zhang ff, Cao Y.1n vitroengineering of human ear-shaped cartilage assisted with CAD/CAM technology.Biomaterials. 2010. 03. ,31(8) :176-183 公开的，专利 CN200710044711. 9 中所公开的)病人个性化耳廓模具压制病人个性化耳廓形态，待形状稳定后，滴加PLA溶液并于模具内继续塑形，待形态固定后，将耳廓支架完全浸入到75%乙醇中消毒30分钟。PBS冲洗3次，再用含10%胎牛血清的DMEM培养基浸泡10分钟，吸干后准备接种细胞。实施例4
人残耳软骨细胞诱导骨髓基质干细胞构建三维软骨(I)人残耳软骨细胞的获取和培养参见实施例1 ;(2)骨髓基质干细胞的获取和培养(a)取材及原代培养无菌条件下，抽取羊骨髓10_20ml于50ml离心管内。补PBS至45ml，1800rpm离心lOmin，弃上清，如此重复清洗2次后，再以BMSC培养液(含10% FBS的低糖DMEM培养液)清洗I次，最后以BMSC培养液重悬并接种于IOcm培养皿内(每2ml骨髓接种I皿)。5天后首次换液,换液时先以PBS洗去不贴壁的血细胞。之后2-4天换液一次。(b)传代培养待细胞长至80%融合状态时进行传代培养。传代时，吸除培养液，以少量PBS洗涤一次，加入1. 5-2. Oml的消化液(0. 25%胰蛋白酶+0. 02% EDTA(Amresco,USA))，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的DMEM条件培养液中止消化，收集细胞悬液、按1: 3比例传代至新的培养皿内，继续在相同的条件下培养。隔日更换三分之二量的培养液，一般2-5天后又可达到融合状态，可继续传代培养。以第1-4代细胞用于实验效果较佳。(3)接种细胞-材料复合物收集骨髓基质干细胞(BMSC)和残耳软骨干细胞，共培养组(η = 3)中BMSC与残耳软骨细胞以3 I比例混合均匀后按照5X IO7个细胞/cm3的密度接种到圆柱形PGA支架上；单纯软骨细胞组(η = 3)中按照5 X IO7个细胞/cm3的密度接种单纯残耳软骨干细胞；单纯BMSC组(η = 3)中按照5 X IO7个细胞/cm3的密度接种单纯BMSC ;将接种好的细胞-材料复合物于37°C、5% C02、100%湿度的环境中静态培养5小时。缓慢加入已预温的含10% FBS的普通高糖DMEM培养液，继续培养，每3_4天换液一次，I周后进行裸鼠皮下回植。(4)裸鼠皮下埋植将体外培养I周的各组细胞-材料复合物植于裸鼠背部皮下，10周后取材进行大体外观及II型胶原免疫组化检测。(a)大体观裸鼠皮下埋植10周后，共培养组及单纯软骨细胞组样本呈典型软骨样瓷白色外观，原有体积维持不变，质地柔韧并有一定弹性；而单纯BMSC组呈暗黄色外观，体积有明显收缩，质地较柔软(图1)。
(b) II型胶原免疫组化裸鼠皮下埋植10周后，共培养组及单纯软骨细胞组II型胶原表达呈强阳性，且具有典型软骨陷窝结构；而单纯BMSC组II型胶原呈阴性且无典型软骨陷窝样结构(图1)。上述结果表明残耳软骨细胞具有诱导BMSC软骨形成的能力。实施例5人残耳软骨干细胞体外自发成软骨(I)人残耳软骨细胞的获 取和培养取材、原代培养及传代培养的方法参见实施例I ;(2)平面扩增过程中的残耳软骨干细胞II型胶原表达将各代次培养至第5天的残耳软骨干细胞进行II型胶原免疫荧光染色，荧光显微镜下观察，结果显示平面扩增过程中的残耳软骨干细胞其II型胶原表达随传代次数增加而急剧下调，至第2代仅极少量细胞呈II型胶原阳性，第3代已无明显阳性细胞(图3)。(3)pellet制备及体外培养收集各代次培养至第5天的细胞，以普通培养液(含10% FBS的高糖DMEM培养液)重悬制备成O. 4X 106/ml的细胞悬液。取Iml该悬液于15ml离心管内，IOOOrpm离心5min，制成细胞pellet。略微旋松瓶盖，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，之后隔天换液(普通培养液)，3周后对各组pellet分别取材进行检测。(a)大体观各代次(原代至第3代)残耳软骨干细胞均能形成直径约2_左右的球状瓷白色软骨样团块(pellet)，其中第2代之前(含第2代)的残耳软骨干细胞所成pellet质地柔韧并有一定弹性，而第2代之后的pellet质地较柔软(图3)。(b) II型胶原免疫组化第2代之前(含第2代)的残耳软骨干细胞所成pellet，其II型胶原呈阳性表达，且具有典型软骨陷窝结构；而第2代之后的pellet，其II型胶原呈弱表达，且软骨陷窝样结构不明显(图3)。结果表明，人残耳软骨干细胞仅在早期(较低代次)表现一定的自发成软骨能力。实施例6人残耳软骨干细胞多向分化诱导实验(I)人残耳软骨干细胞的获取和培养取材、原代培养及传代培养的方法参见实施例I ;(2)人残耳软骨干细胞成骨诱导以成骨诱导液培养第8代的残耳软骨干细胞，每
2-3天换液一次，诱导3周后进行茜素红染色。成骨诱导液具体成分包括低糖DMEM培养基，10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS), IOmM 地塞米松，IOmM β-憐酸甘油，50mM 维生素C。诱导结果镜下可见明显钙结节，茜素红染色呈阳性(图4)，表明第8代残耳软骨干细胞仍具有成骨潜能。(3)人残耳软骨干细胞成软骨诱导将第8代残耳软骨干细胞制备成pellet，并以成软骨诱导液培养，每2天换液一次，诱导3周后进行组织切片及II型胶原免疫组化染色。Pellet制备及体外培养参照实施例4。成软骨诱导液具体成分包括以总体积计，含有高糖DMEM 培养基、10ng/ml 的 TGF-β 1; 100ng/ml 的 IGF-1，，40ng/ml 的地塞米松、一倍含量 ITSpremix (ITS通用型培养混合剂,含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐)、脯氨酸、和维生素C。诱导结果11型胶原染色呈阳性，可见典型软骨陷窝样结构(图4)，表明第8代残耳软骨干细胞仍具有成软骨潜能。(4)人残耳软骨干细胞成脂诱导以成脂诱导液培养第8代的残耳软骨干细胞，每
2-3天换液一次，诱导3周后进行油红染色。成脂诱导液具体成分包括低糖DMEM培养基，10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS), I μ M地塞米松,O. 5mM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)，IOM胰岛素，200 μ M吲哚美辛(indomethaein)。诱导结果镜下可见明显脂滴，油红染色呈阳性(图4)，表明第8代残耳软骨干细胞仍具有成脂潜能。实施例7 不同成软骨体系诱导残耳软骨干细胞(I)收集细胞参照实施例2 ；(2)制备pellet及实验分组pellet制备参照实施例2，共制备15个pellet，其中无血清组(η = 5)以无血清成软骨诱导液(高糖DMEM培养基，1% IX ITSpremix, 40g/ml脯氨酸，10ng/ml TGF-β 100ng/ml IGF-1,40ng/ml 地塞米松和 50 μ g/ml 维生素 C)培养。含血清组(η = 5)以含血清成软骨诱导液(高糖DMEM培养基，10% FBS, 10ng/ml TGF- β 1；100ng/ml IGF-1, 40ng/ml地塞米松和50 μ g/ml维生素C)培养。普通培养组(η = 5)以含10% FBS的普通高糖DMEM培养液培养。3周后对各组pellet分别取材，进行大体外观及组织学检测。(a)、Pellet 大体观体外成软骨诱导3周后，无血清组pe11et呈瓷白色球形外观，直径达5mm左右，质地柔韧并有一定弹性，湿重达14mg左右；含血清组pellet成瓷白色球形外观,直径达2mm左右，湿重约3mg左右，质地较柔软；普通培养组pellet形状较不规则，直径仅l_2mm，湿重仅2mg左右，质地柔软无弹性(图5)。(b)、Pellet 组织学检查HE染色第8代人残耳软骨干细胞形成的pellet体外培养3周后，无血清诱导组可见大量典型软骨陷窝样结构，含血清诱导组仅边缘可见极少量软骨陷窝样结构，普通培养组无明显陷窝结构(图6)。Safranin-O染色第8代人残耳软骨细胞形成的pellet体外培养3周后,无血清诱导组可见典型软骨陷窝结构及明显Safranin-O阳性着色，含血清诱导组及普通培养组均无明显陷窝结构及Safranin-O着色(图6)。II型胶原免疫组化第8代人残耳软骨细胞形成的pellet体外培养3周后，无血清诱导组大部分区域II型胶原呈阳性且具有典型软骨陷窝结构，含血清诱导组仅边缘可见II型胶原阳性区域；普通培养组无明显陷窝结构，仅有少量散在的点状II型胶原表达(图 6)。上述结果表明无血清成软骨诱导体系更有利于残耳软骨干细胞在体外形成软骨。实施例8人残耳软骨干细胞裸鼠皮下成软骨(I)人残耳软骨干细胞的获取和培养参见实施例1 ;(2)残耳软骨干细胞-PGA复合物成软骨诱导收集残耳软骨干细胞，按照5X107个细胞/cm3的密度接种到圆柱形PGA支架上(残耳软骨干细胞组，η = 3);同理，收集骨髓基质干细胞(BMSC)并接种于圆柱形PGA支架上(BMSC^ln = 3)。将接种好的细胞-材料复合物于37°C、5% C02、100%湿度的环境中静态培养5小时。缓慢加入事先温浴的含10%FBS的普通高糖DMEM培养液，继续培养。48小时后，换无血清成软骨诱导液(高糖DMEM培养基，I % I X ITS premix, 40 μ g/ml 脑氨酸，10ng/ml TGF- β 100ng/ml IGF-1,40ng/ml 地塞米松和50 μ g/ml维生素C)，每3-4天换液一次，培养6周后，进行裸鼠皮下埋植。(3)裸鼠皮下埋植将体外成软骨诱导6周的细胞-材料复合物植于裸鼠背部皮下，12周后取材进行大体外观及HE染色。(a)大体观
裸鼠皮下埋植12周后，残耳软骨干细胞组样本呈典型软骨样瓷白色外观，原有体积维持不变，质地柔韧，有弹性；而BMSC组样本质地坚硬、表面粗糙，成骨现象明显(图8)；(b)HE染色裸鼠皮下埋植12周后，残耳软骨干细胞组样本可见大量典型软骨陷窝结构，而BMSC组骨化明显(图8)。结果表明，残耳软骨干细胞获得的软骨移植物在皮下环境中软骨表型更稳定。实施例9残耳软骨干细胞复合支架材料体外诱导构建组织工程软骨(I)收集细胞参照实施例2，收集第3代残耳软骨干细胞。(2)接种细胞-材料复合物按5X IO7个细胞/cm3的密度将细胞悬液接种到圆柱形PGA支架或耳廓形PGA/PLA支架上，于37°C、5% CO2、100%湿度的环境中静态培养5小时。缓慢加入已预温的含10% FBS的普通高糖DMEM培养液，继续培养48小时后更换为成软骨诱导液。本实例所采用的成软骨诱导液具体成分包括高糖DMEM培养基，I % IXITSpremix, 40 μ g/ml 脑氨酸，10ng/mlTGF- β 100ng/ml IGF-1, 40ng/ml 地塞米松和 50 μ g/ml维生素C。每3-4天换液一次，8周后取材进行检测。(a)、体外构建的软骨移植物及其II型胶原免疫组化染色检查第3代人残耳软骨干细胞-PGA材料复合物体外经成软骨诱导8周后，PGA纤维已经被大量软骨基质包裹，表现出典型软骨样外观，呈瓷白色，大小及形状维持良好，质地柔韧并有一定弹性，II型胶原表达呈强阳性，进一步证明大量软骨特异性基质分泌(图7)。(b)、体外构建的正常大小人耳廓形态软骨及其组织学检查第3代人残耳软骨细胞-耳廓形态PGA/PLA材料复合物体外经成软骨诱导8周后，表现出软骨样外观，大小及耳廓形态维持良好，质地柔韧并有一定弹性。组织学显示大量成熟的软骨陷窝结构，支架材料已经被大量胞外基质包裹(图9)。讨论本发明残耳软骨干细胞理念的提出是在残耳软骨来源细胞生物学特性探索过程中意外发现的基础上，结合发明人以往积累的大量经验所提出的大胆假设。基于这一假设，发明人经过多病例大量实验反复验证，证实了残耳软骨来源细胞的干细胞特性，并以此为基础，通过一系列关键技术参数的优化、整合，最终建立了基于残耳软骨干细胞的体外三维软骨构建技术体系。这一技术体系的建立为利用小耳畸形病人自体残耳软骨来源细胞构建组织工程软骨进行耳再造等软骨缺损修复与重建提供了可行的临床治疗方案。一般认为，残耳软骨来源的细胞属于软骨细胞，应具有成软骨能力强、体外扩增易老化、去分化等分化成熟软骨细胞的特征，国内外大多数学者也基本认同这一观点。发明人通过系统的研究发现，残耳软骨来源的细胞较正常软骨细胞更容易去分化，扩增至第2代以上已基本丧失软骨形成能力，这显然限制了其临床应用可行性。所幸的是，发明人在研究中意外地发现，残耳软骨细胞虽然很容易丧失软骨形成能力，但其却具有超强的增殖能力，也就是说，虽然发生了去分化，却未出现明显的老化现象，即使扩增到第8代仍能保持很高的增殖活性，从这一特性来看，残耳软骨来源的细胞与正常分化成熟的软骨细胞显然不同。基于这一发现，发明人大胆提出了残耳软骨来源的细胞是一种发育过程中残留下来的干细胞的假设，并在此基础上，利用多个病例开展了大量重复性的实验，结果显示，即使传至第8代的残耳软骨来源细胞仍然具有较强的骨、软骨、脂肪等多向分化潜能，表明残耳软骨来源细胞的确是一种扩增能力强且具有多向分化潜能的类似干细胞特性的细胞，因此发明人首次提出了残耳软骨干细胞这一理念。基于残耳软骨干细胞的理念，发明人确定了通过定向诱导构建软骨的主攻研究方向。由于发明人长期从事干细胞软骨构建相关研究，已经具备丰富的诱导干细胞构建三维·软骨的经验，以这些经验为指导，通过反复尝试和多种方案的对比及优化整合，建立了稳定的残耳软骨干细胞软骨定向诱导体系，并结合三维可降解支架，应用残耳软骨干细胞在体外构建出均质成熟的三维软骨样组织。在此基础上，进一步结合先前已建立的基于动物成熟分化软骨细胞的精确人耳廓形态软骨构建技术，将人残耳软骨干细胞与精确人耳廓形态的PGA/PLA支架材料复合，并以上述优化的条件进行诱导，最终在体外构建出了具有精确人耳廓形态的组织工程软骨。综上所述，本发明所公开的残耳软骨干细胞是一种特殊类型的细胞，其与以往报道的分化成熟软骨细胞以及其他具有软骨分化潜能的干细胞均有所不同。应用残耳软骨干细胞构建软骨有其独特的优势首先，与正常软骨细胞相比，残耳软骨干细胞具有很强的增殖能力，完全能够满足构建较大体积软骨(如人耳廓形态软骨)所需的细胞量，而且对残耳软骨的取材不会对正常组织造成任何损伤。因此，应用病人自体的残耳软骨干细胞构建软骨移植物较正常软骨细胞具有更强的临床应用可行性。其次，与其他具有软骨分化潜能的干细胞相比，其优势更为显著1).成软骨潜能更强较低代次(2代以内)的残耳软骨干细胞不经诱导即可形成软骨，而且还能诱导其它具有软骨形成潜能的干细胞成软骨(图1);较高代次(2代以上)的残耳软骨干细胞经诱导后也较其他干细胞更易形成均质软骨；这些特征可能与残耳软骨干细胞中具有成软骨能力的细胞群体所占比例较高有关。2).三维软骨构建过程中形态维持较好其他来源干细胞(如骨髓基质干细胞)诱导过程中很容易出现收缩变形，而残耳软骨干细胞体外构建三维软骨过程中不易收缩，形态能够精确维持。这可能与残耳软骨干细胞在软骨诱导过程中基质产生更为迅速、软骨形成更快有关。3).体内异位环境中软骨稳定性更好其他来源干细胞(如骨髓基质干细胞)体外构建的软骨在体内皮下环境中很容易骨化，而残耳软骨干细胞体外构建的三维软骨植入皮下后软骨表型维持较为稳定(图8)。这可能与残耳软骨干细胞本身来自于软骨组织、体外诱导后更易形成分化成熟的稳定的软骨有关。此外，本发明建立并优化的体外构建技术以及不含血清的软骨诱导体系还便于标准化，易于形成产业化
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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
权利要求
1.一种组织工程化软骨移植物，其特征在于，它含有在三维结构下生长的人残耳软骨细胞；所述的人残耳软骨细胞是第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的；优选第1、2、3、4、或5代的。
2.如权利要求1所述的软骨移植物，其特征在于，所述三维结构是由所述的人残耳软骨细胞聚集形成的团块、或高密度所述人残耳软骨细胞接种于培养皿所形成的细胞膜片、 或是由所述人残耳软骨细胞接种于固体的医学上可接受的生物可降解材料形成。
3.如权利要求1所述的软骨移植物，其特征在于，所述的人残耳软骨细胞来自自体或同种异体；优选小耳畸形患者自体的残耳软骨。
4.如权利要求1-3任一所述的软骨移植物，其特征在于，以所述移植物的总体积计，其中的人残耳软骨细胞浓度为2 X IO7个细胞/Cm3-1O X IO7个细胞/cm3 ;优选2 X IO7个细胞/ cm3-7X107 个细胞/cm3。
5.如权利要求4所述的软骨移植物，其特征在于，所述移植物的形状同人体需要移植软骨的缺损部位形状相符。
6.一种如权利要求1-5任一所述的软骨移植物的制备方法，所述的方法包括步骤(1)将人残耳软骨细胞进行平面扩增，并传代至第1、2、3、4、5、6、7、或8代；(2)将第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的人残耳软骨细胞通过离心形成团块、或将第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的人残耳软骨细胞高密度接种形成细胞膜片、或将第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的人残耳软骨细胞与固体的医学上可接受的生物可降解材料混合形成细胞-生物材料复合物；(3)将团块、细胞膜片或复合物进行体外软骨诱导；以总体积计，所述体外软骨诱导液中含有 5_50ng/ml TGF-β i (Transforming Growth Factor-β ρ 转化生长因子-β J 和 10-100ng/ml 的地塞米松(dexamethasone)。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，体外成软骨诱导的时间为3-20周；优选6-12周。
8.一种如权利要求1-5任一所述的软骨移植物在构建组织工程化耳廓移植物中的应用。
9.一种人残耳软骨细胞在体外构建组织工程化软骨中的应用。
10.一种人残耳软骨细胞在体外构建组织工程化耳廓移植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种组织工程化软骨移植物，所述组织工程化软骨移植物含有在三维结构下生长的人残耳软骨细胞；所述的人残耳软骨细胞是第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的。本发明还公开了人残耳软骨细胞在体外构建软骨移植物中的应用。
文档编号A61L27/38GK102989040SQ201110268830
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者周广东, 刘豫, 曹谊林, 刘伟 申请人:上海国睿生命科技有限公司