一种负载生长因子的高细胞负载量组织工程支架的快速制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架的快速制备方法，该方法采用独特的三束同步微球电喷/细胞电喷/纤维电纺技术，快速制备高细胞负载量电纺组织工程支架。本方法操作简单、方便快捷，仅需简单的注射泵和高压发生装置即可进行；利用该方法制得的含生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架，可广泛用于生物工程和临床医学的研究。
【专利说明】一种负载生长因子的高细胞负载量组织工程支架的快速制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于材料学领域，具体地说是一类负载生长因子的高细胞负载量组织工程支架的快速制备方法。
【背景技术】
[0002]组织、器官的损伤或功能缺失一直是人类健康所面临的主要危害之一。据统计，目前全世界用于组织或器官修复方面的开支约占医疗卫生整体支出的8%。美国每年的组织、器官缺损患者有近800万，治疗费用高达4000亿美元。在我国，每年则有数千万人患有与组织器官缺损相关的疾病。因此，组织、器官的修复与功能重建是关乎人类健康的重大科学技术问题。[0003]组织工程概念的出现，为解决组织、器官的修复与功能重建问题提供了新的思路。组织工程通常将细胞种植在由生物材料制备的组织工程支架上，通过体外培养制备活性的组织替代物，之后植入体内进行受损、病变组织或器官的修复。
[0004]组织工程支架的传统制备方法有相分离法、冷冻干燥法、溶剂浇筑/致孔剂法、乳化/冻干法等，这些方法虽然成型简单，但周期较长、效率较低。粒子/纤维粘接法和新出现的快速成型技术所得产物孔隙率偏低，而飞秒激光加工技术成本高，效率较低。
[0005]静电纺丝技术可以制备由直径为纳米至微米级的高孔隙率、高比表面积的纤维状支架，在组织工程中有着独特的优势。但由于纤维间排列较为紧密，导致细胞难以渗透进入电纺丝支架内部，这极大地限制了电纺丝支架在组织工程中的应用。
[0006]同步电纺方法即在纤维电纺的同时将细胞电喷到电纺纤维上，可快速制备高细胞负载量的电纺组织工程支架，不仅有效地解决了电纺纤维难以快速负载细胞的问题，而且得到的支架结构与天然细胞外基质接近，力学性能也较好。因而同步电纺法是一种很有实用价值的“活性”组织工程支架制备方法。然而该方法制备的载细胞支架因不含有生长因子，无法使细胞在支架表面生长良好。因此制备一种可以负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架对组织工程和再生医学有重要意义。
[0007]本发明公布了一种新颖且操作简单的制作高细胞负载量电纺组织工程支架的生产工艺。本发明采用三束同步微球电喷/细胞电喷/纤维电纺技术，得到负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架，并研究其在生物工程领域的相关应用。
[0008]该方法制备的高细胞负载量电纺组织工程支架具有很高的应用价值。综合以上技术和相关背景，我们所阐述的方法解决了传统的步骤繁琐耗时的缺陷，也不需要昂贵的设备，简化了生产工艺，同时所得的负载生长因子的载细胞电纺组织工程支架性能优异，从而为电纺支架的更为广泛的应用提供了广阔的空间。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是快速制备负载生长因子的高细胞负载量组织工程支架，获得组织替代物，解决组织、器官的修复与功能重建问题。
[0010]本发明采取的技术方案如下:
[0011]一种负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架的快速制备方法，其特征在于，采用三束同步微球电喷/细胞电喷/纤维电纺技术，分别为:
[0012]A.制备纤维状电纺组织工程支架:采用纤维电纺技术，将电纺用高聚物溶于有机溶剂，加入注射泵中，15-20kV直流电压下喷射制得纤维状电纺组织工程支架；
[0013]B.同轴电喷技术制备负载生长因子的电喷微球:配置含生长因子的PBS溶液，加入注射泵并与同轴喷头内轴连接；同时将PLGA的CH2C12溶液与同轴喷头外轴连接，15-20kV直流电压下进行同轴电喷，获得包覆生长因子的PLGA微球；
[0014]C.细胞电喷:将可以贴壁生长的细胞分散制成细胞悬液，加入注射泵，5_6kV直流电压下进行细胞电喷；
[0015]上述 A、B、C三个工艺同时进行，包覆生长因子的PLGA微球和细胞悬液负载于制得的纤维状电纺组织工程支架上，得负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架。
[0016]所述电纺用高聚物包括聚氨酯、聚酰胺、聚己内酯、聚乙醇酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚吡咯烷酮、醋酸纤维、聚羟基丁酸、聚醚、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醋酸乙烯酯、胶原-ΡΕ0、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物等几乎所有可以用来电纺的天然生物材料和人工合成材料。
[0017]所述生长因子包括肽激素、胰岛素类生长因子(IGF- 1、IGF-1I)、表皮生长因子(EGF)、成纤细胞生长因子(FGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、生长激素释放抑制因子(SRIH)、骨肉瘤来源生长因子(0DGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素类生长因子(11-1、11^-1、11^-3)、红细胞生长素化?0)、集落刺激因子(05?)等几乎所有对细胞生长和发育有调控作用的生物活性物质。
[0018]所述可以贴壁生长的细胞包括正常的上皮型、成纤维型和神经型细胞等。
[0019]经由上述方法可以制得负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架。
[0020]采用同步细胞电喷/聚合物电纺技术，即上述方法中仅A、C工艺同时进行，可以制得具有高细胞负载量的电纺组织工程支架；采用同步聚合物电纺/微球电喷技术，即上述方法中仅A、B工艺同时进行可以制得负载生长因子的电纺组织工程支架。
[0021]与现有技术相比，本发明的创新性和优势如下:
[0022]1、采用独特的三束同步微球电喷/细胞电喷/纤维电纺技术，快速制备负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架；
[0023]2、将促细胞存活物质/促血管化生长因子与细胞同步包覆在支架内，快速制备适宜于缺氧、缺营养条件下的高柔性载细胞组织工程支架；
[0024]3、电纺工艺可使制备的支架具有与细胞外基质结构接近的纤维状结构；
[0025]4、本方法制备的支架可以同步快速负载大量细胞，同时保持支架的纤维状结构，并使所负载细胞在支架内生长良好；
[0026]5、本方法操作简单、方便快捷，仅需简单的注射泵和高压发生装置即可进行，简化了组织支架的生产工艺。【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为PU电纺纤维支架的显微镜图。
[0028]图2为同步细胞电喷/聚合物电纺技术制备高细胞负载量的纤维状电纺组织工程支架示意图。
[0029]图3(A)为同步细胞电喷/聚合物电纺法制备高细胞负载量组织工程支架的纵剖面图(支架厚度400 μ m), H&E染色；(B)为支架内部结构的SEM图。
[0030]图4为同轴电喷技术制备负载生长因子的电喷微球示意图。
[0031]图5为同轴电喷技术制备的负载IGF-1的PLGA电喷微球的SEM图。
[0032]图6为同轴电喷技术制备的负载IGF-1的PLGA电喷微球的荧光显微镜图，(Α)生长因子IGF-1，用FITC染色；(B)PLGA微球，用罗丹明Β染色；(C)叠加图。
[0033]图7为同步聚合物电纺/微球电喷技术制备负载生长因子的电纺组织工程支架示意图。
[0034]图8为同步聚合物电纺/微球电喷技术制备的包覆VEGF的PLGA微球的电纺组织工程支架的SEM图。
[0035]图9为同步电纺/电喷法制备含双生长因子的载细胞电纺组织工程支架示意图。
[0036]图10 (A)为同步细胞电喷/纤维电纺技术制备包覆生长因子的高细胞负载量电喷组织工程支架的CLSM图，(A1):IGF-1微球(IGF-1用FITC染色)，(A2)细胞(细胞骨架用Rhodamine phalloidin染色)，(A3)叠加图。(B)为支架内部的SEM图，光滑小球为电喷PLGA微球，粗糙球状物为MSC。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明，但仅是对本发明的示例性说明，而非对本发明范围的限制，本领域技术人员可以对下列实施例中的原料及其用量按照
【发明内容】
中的技术方案作出变通，这些都是本领域技术人员可以预见的，故不一一列出，但上述变通均应在本发明的保护范围内。
[0038]实施例1:高聚物纤维状电纺组织工程支架的制备
[0039]干燥的2mL注射器内加入PU的10%六氟异丙醇(HFIP)溶液，注射器固定在微量注射泵的卡槽中，高压直流电源输出端固定在注射器前端金属针头上(针头内径为0.6mm)，外加电压设为15kV，针头和接收装置的距离为15cm。流速设置为0.5mL / h。以固定在接地铜板上的铝箔作为接收屏，获得PU电纺支架(图1)。
[0040]实施例2:高细胞负载量电纺组织工程支架的制备
[0041]采用同步细胞电喷/聚合物电纺技术制备高细胞负载量的纤维状电纺组织工程支架。将平滑肌细胞以1百万个每毫升(IMillion/mL)浓度分散在含0.1%明胶和10%胎牛血清的DMEM溶液中制成细胞悬液，加入注射器，加5KV电压，以lmL/h的流速进行细胞电喷。同时另一束将10%PU以0.5mL/h进行聚合物电纺(同实施例1)。将电喷的细胞悬液与电纺的PU纤维同时收集在收集装置上，从而得到高细胞负载量的纤维状电纺组织工程支架(图2)。H&E染色和活细胞CLSM研究表明大量细胞可较均匀的分布在电纺组织工程支架内，且生长良好，如图3所示，表明加工过程中的高电压和残存的电纺用溶剂对细胞的影响较小。[0042]实施例3:负载生长因子的电喷微球的制备
[0043]采用同轴电喷技术制备负载生长因子的电喷微球。配置含0.P/oIGF-l的PBS溶液，加入注射器并与同轴喷头内轴连接；同时将10%的PLGACH2C12溶液与同轴喷头外轴连接。加20KV电压，以内轴0.lmL/h、外轴lmL/h的速度进行同轴电喷，获得包覆IGF-1的PLGA微球，实验装置如图4所示。制备的PLGA电喷微球的SEM图如图5所示，可知接收屛上包覆IGF-1的PLGA微球直径约5 μ m。荧光显微镜图像证实IGF-1被包覆在PLGA微球内(图6)。
[0044]实施例4:负载生长因子的电纺组织工程支架的制备
[0045]米用同步聚合物电纺/微球电喷技术，一束进行PU电纺(见实施例1);一束将含
.0.P/oVEGF的PBS溶液与PLGA溶液进行同轴电喷(见实施例3)获得包覆生长因子质的PLGA微球，从而得到负载生长因子的电纺组织工程支架，如图7所示。生长因子VEGF在电纺组织工程支架。采用同步聚合物电纺/微球电喷技术制备的包覆生长因子VEGF的PLGA微球的电纺组织工程支架的SEM图见图8，表明包覆生长因子的PLGA微球被成功包覆在纤维状的组织工程支架内。
[0046]实施例5:负载生长因子的载细胞电纺组织工程支架的制备
[0047]采用同步三束电纺/电喷技术，一束进行PCL电纺(见实施例1);一束采用同轴电喷技术用PLGA包覆IGF-1，获得负载IGF-1的PLGA微球(见实施例3);另一束进行骨髓间质干细胞细胞电喷(见实施例2)，得到负载生长因子的载细胞电纺组织工程支架，实验装置如图9所示。采用三束同步微球电喷/细胞电喷/纤维电纺技术制备的包覆载IGF-1微球和干细胞的组织工程支架的CLSM图见图10，表明载IGF-1微球和细胞被成功包覆在纤维状的组织工程支架内。
[0048]上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架的快速制备方法，其特征在于，采用三束同步微球电喷/细胞电喷/纤维电纺技术，分别为:A.制备纤维状电纺组织工程支架:采用纤维电纺技术，将电纺用高聚物溶于有机溶剂，加入注射泵中，15_20kV直流电压下喷射制得纤维状电纺组织工程支架；B.同轴电喷技术制备负载生长因子的电喷微球:配置含生长因子的PBS溶液，加入注射泵并与同轴喷头内轴连接；同时将PLGA的CH2C12溶液与同轴喷头外轴连接，15-20kV直流电压下进行同轴电喷，获得包覆生长因子的PLGA微球；C.细胞电喷:将可以贴壁生长的细胞分散制成细胞悬液，加入注射泵，5-6kV直流电压下进行细胞电喷；上述A、B、C三个工艺同时进行，包覆生长因子的PLGA微球和细胞悬液负载于制得的纤维状电纺组织工程支架上，得负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架。
2.权利要求1所述的负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架的快速制备方法，其特征在于，所述电纺用高聚物包括聚氨酯、聚酰胺、聚己内酯、聚乙醇酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚吡咯烷酮、醋酸纤维、聚羟基丁酸、聚醚、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醋酸乙烯酯、胶原-PEO、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物。
3.权利要求1所述的负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架的快速制备方法，其特征在于，所述生长因子包括肽激素、胰岛素类生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、生长激素释放抑制因子、骨肉瘤来源生长因子、转化生长因子、神经生长因子、白细胞介素类生长因子、红细胞生长素、集落刺激因子。`
4.权利要求1所述的负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架的快速制备方法，其特征在于，所述可以贴壁生长的细胞包括正常的上皮型、成纤维型和神经型细胞。
5.一种负载生长因子的高细胞负载量电纺组织工程支架，其特征在于，由权利要求1-4任意一项所述方法制备。
【文档编号】A61L27/24GK103705981SQ201310471717
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】王丰, 杨艳, 赵晓梅, 余波, 张晓敏 申请人:上海师范大学