成纤维细胞生长因子21变体的制作方法

成纤维细胞生长因子21变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及药理学有效的和稳定的人成纤维细胞生长因子21(FGF21)的变体，含有FGF21变体的药物组合物，以及使用这类变体治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症、和/或代谢综合征的方法。
【专利说明】成纤维细胞生长因子21变体
[0001] 本发明涉及成纤维细胞生长因子21 (FGF21)的变体，含有FGF21变体的药物组合 物，以及用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症、和/或代谢综合征的方法。
[0002] FGF21是一种激素，其作为葡萄糖和脂质内稳态的重要代谢调节物发挥作用。通过 上调GLUTl表达，FGF21促进脂肪细胞中的葡萄糖摄取，其机制不同于胰岛素。在糖尿病啮 齿动物和猴子中，人FGF21降低葡萄糖空腹血清浓度，并降低甘油三酯、胰岛素和胰高血糖 素的空腹血清浓度。此外，在饮食诱导的肥胖的啮齿类动物模型中，施用FGF21导致呈剂量 依赖性方式的累计体重丧失。因此，FGF21具有用于治疗糖尿病、肥胖、异常脂血症、代谢综 合征的潜在效用。
[0003]在TO2010/084169、W02010/065439、W02006/028595 和W02005/061712 中已经描述 了人FGF21的变体。
[0004] 与人野生型FGF21和已知的FGF21变体相关的问题是分子的低的效力和/或低的 药物稳定性。因此，仍然需要一种有效和/或稳定的替代性FGF21变体。
[0005] 本发明提供了替代性的FGF21变体。本发明的FGF21变体具有优于人野生型FGF21 和本领域公开的已知的FGF21变体的优点。这些优点包括具有改善的效力和/或改善的药 物稳定性。除了改善的效力外，本发明的FGF21变体具有一种或多种有利的稳定性特征，这 些特征对作为治疗性蛋白质的有效制备和/或配制是有用的，包括在体内降低的蛋白质水 解降解、降低的对氧化的易感性、减少的在高浓度聚集的倾向、降低的在哺乳动物细胞系统 中生产期间的翻译后修饰和蛋白水解的水平、和/或改善的化学稳定性。另外，本发明的 FGF21变体对2型糖尿病、肥胖、异常脂血症、和/或代谢综合征的治疗具有潜在的作用。
[0006] 本发明提供了FGF21的变体，其中氨基酸序列是
[0007]HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRGPARFLPGLPPALPE PPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQIDN0：1).
[0008] 本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的FGF21变体和至少一种可药用的载 体、稀释剂或赋形剂。
[0009] 本发明还提供了治疗患者中的2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的 方法，包括向所述患者施用本发明的FGF21变体。
[0010] 本发明还提供了治疗患者中的2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的 方法，包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
[0011] 进一步地，本发明提供了本发明的FGF21变体用于治疗。优选地，本发明提供了本 发明的FGF21变体用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征。
[0012] 进一步地，本发明提供了本发明的FGF21变体在制备用于治疗2型糖尿病、肥胖、 异常脂血症和/或代谢综合征的药物中的用途。
[0013] 全长人野生型FGF21是包含27个氨基酸信号肽的208个氨基酸的多肽。成熟人野 生型FGF21包含不具有27个氨基酸信号肽的全长多肽，因而其为181个氨基酸的多肽（SEQ IDN0:2)。本发明FGF21变体中氨基酸位置的改变从成熟人野生型FGF21(SEQIDN0:2) 多肽中的氨基酸位置决定。因此，文中描述的取代"A31C"指在成熟人野生型FGF21变体的 位置31处由氨基酸Cys取代野生型氨基酸Ala。
[0014] 需要注意的是在特定变体中一个氨基酸残基的取代可以影响变体作为整体的特 征，其总体效果可能对药理学效力和/或药物稳定性有益或有害。例如，一个氨基酸取代， Pl15W，增加FGF21变体的效力，但是，也认为Pl15W导致引起聚集的自身缔合。因而，其总体 效果对变体是有害的，所以，P115W取代不包含在本发明的FGF21变体中。另一个例子涉及 氨基酸取代R175L，其增加FGF21变体的效力。但是，发现具有R175L取代的FGF21变体对 蛋白水解易感，因而其总体效果是有害的。为了解决本发明的FGF21变体中观察到的C-末 端蛋白水解，在180和181位的氨基酸（第180位是L，第181位是G)在第180位用氨基 酸E取代，并且在第181位的氨基酸被删除。这些修饰实质性地减少了C-末端蛋白水解， 但也降低了FGF21变体的药理学效力25倍，如在人293细胞-βKlotho-SRE-Iuc测定法中 测量的。令人惊讶的是，通过将第175位的氨基酸残基（R175L)还原为野生型R，可以恢复 效力。因此，该取代的总体效果对变体是有害的，所以，R175L取代不包含在本发明的优选 的FGF21变体中。
[0015] 本发明的FGF21变体是有效的，生物活性的变体，如实施例2中的SEQIDNO: 1所 示。本发明的FGF21变体包含这样的氨基酸取代，这些取代在一起不仅仅改善效力，而且与 其他氨基酸改变是相容的，这反过来提供了改善的稳定性性质，和增加的体内稳定性。在本 发明的FGF21变体中改善效力的氨基酸取代包含D127K、S167R和G174L(参见，实施例2)。
[0016] 人野生型FGF21的浓缩的变体溶液暴露于药物防腐剂、例如间甲酚时，增加变体 形成聚集体的倾向。通过引入额外的二硫键产生的结构稳定化作用改善了人野生型FGF21 的防腐剂相容性和热稳定性。本发明的FGF21变体并入了氨基酸取代A3IC和G43C，其极大 地改善了热稳定性和防腐剂相容性，而不损害生物活性。之前也曾经描述过包含A31C/G43C 取代的高效力FGF21变体。那些报道的变体与野生型FGF21相比，呈现显著改善的防腐剂 相容性，但是其在存在防腐剂时仍然倾向于聚集。此变体聚集增加了免疫原性风险，因而降 低了变体作为治疗性蛋白质的可接受性。
[0017] 令人惊讶的是，本发明优选的FGF21变体包含氨基酸取代L98D和L100K，其导致高 浓度下显著更低的高分子量聚集体形成。有利地，氨基酸取代L98D和LlOOK不降低变体的 效力，并使有害的聚集问题最小化。
[0018] 用于制备本发明FGF21变体的优选的商售表达系统是哺乳动物CHO-Kl细胞系。 然而，哺乳动物细胞系CHO-Kl和HEK293可能通过位置179的酪氨酸侧链硫酸盐化作用引 起成熟的人野生型FGF21翻译后修饰。在位置179和180 (如果存在的话）的酪氨酸残基 的硫酸盐化作用降低了效力，并且是不想要的产品异质性的来源。因此，当在位置179和/ 或180具有Tyr的FGF21变体从CHO-Kl或HEK293细胞系表达时，一定比例的表达变体可 能在位置179被硫酸盐化，另一些可能在位置180被硫酸盐化，而另一些可能在两个位置均 被硫酸盐化，而另一些在任何位置均未被硫酸盐化。这导致了具有降低的效力的异质的且 不可预知的变体群体。
[0019] 本发明的FGF21变体包括解决了该有害的硫酸盐化作用的氨基酸取代。因此，变 体中并入了氨基酸取代Y179F。Y179F消除了在CHO-Kl和HEK293细胞中生产导致的硫酸 盐化作用。而且，氨基酸取代Y179F与本发明其他有利的氨基酸取代是相容的，且确认了其 是关于效力的中性改变。
[0020] 人野生型FGF21易感于体内的蛋白质水解降解。用野生型FGF21静脉内或皮下 注射小鼠或食蟹猴后，从血清回收的主要蛋白质水解片段是中止于位置171的片段。在体 外效力测定法中，确定了跨越残基1至171的FGF21片段效力低?100倍。消除该蛋白质 水解切割位点可通过增加对活性药物的暴露而改善了药效。已经表明氨基酸取代G170E在 小鼠中显著减缓切割，且在食蟹猴中在24小时后测量时，实质上消除了在位置171处的蛋 白质水解。G170E取代不影响效力，且与期望的物理化学稳定性谱相容。因此，氨基酸取代 G170E并入本发明的FGF21变体中。
[0021] 人野生型FGF21也对CHO-Kl制备中产生的羧肽酶易感，并且氨基酸取代A180E和 第181位的氨基酸删除减缓了该过程，因而降低了所表达的变体长度的异质性（S卩，在由细 胞系表达的成熟变体中氨基酸残基数目的异质性）。尽管氨基酸取代A180E和第181位的 氨基酸删除并不消除哺乳动物细胞表达中的C末端蛋白质水解，其非常有效地减缓蛋白质 水解，同时维持本发明FGF21变体中存在其它所需氨基酸取代的条件下的效力。鉴于该有 利的特征，氨基酸取代A180E和第181位的氨基酸删除并入本发明的优选的FGF21变体。
[0022] 本发明还包含涵盖编码上述变体的多核苷酸，其可以是RNA形式，或DNA形式，其 中DNA包括cDNA和合成的DNA。DNA可以是双链或单链。由于遗传密码子的冗余或简并， 编码本发明变体的编码序列可以不同。
[0023] 编码本发明变体的多核苷酸可以包含如下：仅仅变体的编码序列，变体的编码序 列和其他的编码序列，如引导序列或分泌序列或前变体序列；变体的编码序列和非编码序 列，如内含子或变体的编码序列的5'和/或3'非编码序列。因此，术语"编码变体的多核 苷酸"涵盖这样的多核苷酸，所述多核苷酸可不仅仅包括变体的编码序列，还包括包括其他 的编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。
[0024] 序列被有效地连接至表达调控序列后，本发明的多核苷酸在宿主细胞中表达。表 达载体通常作为附加体或作为宿主染色体DNA的整体部分在宿主生物体中复制。一般地， 表达载体含有选择标记物，例如，四环素、新霉素、和二氢叶酸还原酶，以允许检测被期望的 DNA序列转化的那些细胞。
[0025] 本发明的FGF21变体可以容易地在如下细胞中生产：在哺乳动物细胞中如CH0、 NS0、HEK293或COS细胞；在细菌细胞中如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)、 突光假单胞菌（Pseudomonasfluorescence);或在真菌或酵母细胞中。使用本领域已知 的技术培养宿主细胞。优选的哺乳动物宿主细胞是含有谷氨酰胺合成酶（GS)表达系统的 CH0K1SV细胞系（参见US5, 122, 464)。
[0026] 可以通过熟知的方法将含有目的多核苷酸序列（例如FGF21变体和表达调控序 列）的载体转移至宿主细胞中，这样的方法取决于宿主细胞的类型而不同。例如，氯化钙转 化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他宿主细胞。
[0027] 可采用多种蛋白质纯化的方法，这些方法是本领域公知的，例如， 在Deutscher，MethodsinEnzymology182:83-89(1990)和Scopes,Protein Purification:PrinciplesandPractice,第 3 版，Springer，NY(1994)中描述的。
[0028] 可通过本领域已知的任何方法施用本发明的FGF21变体药物组合物，实现通常预 期的治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症和/或代谢综合征的目的。优选的给药途径是胃肠 外途径。给药剂量取决于接收者的年龄、健康状态和体重，如果有，还取决于同时治疗的种 类，治疗的频率，以及期望效果的性质。典型的剂量水平可使用标准临床技术优化，其取决 于给药模式和患者状态，可由具有本领域常规技术的人员确定。
[0029] 根据已知的方法配制本发明的FGF21变体，以制备可药用的组合物。期望的制 剂是稳定的冻干产品，其与合适的高纯度稀释剂或水性溶液重建，所述高纯度稀释剂或水 性溶液任选带有可药用的载体、防腐剂、赋形剂或稳定剂[Remington,TheScienceand PracticeofPharmacy,第 19版，Gennaro,ed.，MackPublishingCo.，Easton,PA1995]。
[0030] 本发明的FGF21变体可以与可药用的缓冲液配制，调节pH以提供可接受的稳定 性，以及给药可接受的pH。另外，本发明的FGF21组合物可放置于容器内，如药瓶、药筒、笔 递送装置、注射器、静脉内给药管或静脉内给药袋。
[0031] 术语"异常脂血症"指脂蛋白质代谢病症，包括脂蛋白质过量产生或不足。异常脂 血症可表现为血液中总胆固醇、低密度脂蛋白质（LDL)胆固醇和甘油三酯浓度的升高和/ 或高密度脂蛋白质（HDL)胆固醇浓度的降低。
[0032] 术语"代谢综合征"的特征在于一个人中的一组代谢风险因子。它们包括：腹部肥 胖-在大多数男人中，有40英寸或更大的腰围；高血糖-禁食后至少110毫克每分升（mg/ dl);高甘油三酯-血流中至少150mg/dL;低HDL-少于40mg/dl;和/或血压130/85或更 商。
[0033] 术语"肥胖"定义为其中具有相对于瘦体重的比例过量的皮下脂肪的状态 (Stedman,sMedicalDictionary第 28 版，2006,LippincottWilliams&Wilkins)〇
[0034]"患者"是哺乳动物，优选人。
[0035] 术语"治疗"指减缓、降低或逆转症状、病症、状态或疾病的进展或严重性。
[0036] 术语"治疗有效量"指如本文所述的本发明的变体的量或剂量，其通过单次或多次 剂量施用于患者，提供期望的治疗。
[0037] 术语"2型糖尿病"特征在于尽管有可利用的胰岛素，仍然产生过量的葡萄糖，且由 于葡萄糖清除不足导致循环的葡萄糖水平持续过高。
[0038] 可以参考下列实施例实施本发明。但是，这些实施例不应理解为限制本发明的范 围。
[0039] 实施例1
[0040]CH0K1SV细朐中FGF21夺体的表汰
[0041] 使用CH0K1SV细胞在哺乳动物细胞表达系统中产生本发明的FGF21变体。将编码 FGF21变体的基因亚克隆至含有谷氨酰胺合成酶（GS)的表达质粒骨架中（基于pEE12. 4的 质粒）。编码FGF21变体的cDNA序列与优选的信号肽序列的编码序列符合读框融合，以增 加期望的产品分泌到组织培养基中。优选的信号肽序列是如氨基酸序列SEQIDNO:3、SEQ IDNO:4、SEQIDNO: 5 或SEQIDNO:6 所示的多肽。
[0042] 由病毒巨细胞病毒（CMV)启动子驱动表达。使用电穿孔以及适当量的重组表达质 粒稳定转染CH0K1SV细胞，转染的细胞以足够的细胞密度维持在悬浮培养中。通过在含有 甲硫氨酸砜亚胺（methioninesulfoximine，MSX)、不含血清的培养基中生长完成转染细胞 的选择，并将其孵育在35-37 °C和5-7%CO2中。
[0043] 使用流式细胞仪测量和确定克隆来源的细胞系。在哺乳动物细胞中表达的FGF21 变体通常产生天然的N末端序列，HPIP，S卩，在N末端没有甲硫氨酸残基，如氨基酸序列SEQ IDNO: 1所示的FGF21变体。
[0044] 使用如下方法纯化从CHO细胞分泌至培养基的FGF21变体，其中在该方法中将澄 清的细胞培养基加热至50-60°C，维持至多2小时，冷却，用洗涤剂（TritonX-100)处理用 于失活病毒，并加载至CaptoMMC(GEHealthcare)混合模式层析柱。使用pH8的缓冲液从 柱中洗脱FGF变体，使用50mM柠檬酸、150mMNaCl溶液将洗脱后汇集的产品调节至3. 2至 3. 5的pH范围，持续1小时使病毒失活。通过加入Tris缓冲液调节溶液pH至6. 7到7. 3 之间，使用苯基琼脂糖高性能树脂（GEHealthcare)通过疏水性交换层析进一步纯化FGF 变体。在PH7下，用递减梯度的硫酸钠洗脱该疏水性相互作用柱。将HIC纯化的FGF变体 的缓冲液交换为pH8的含NaCl的Tris缓冲液，并由Source30Q树脂（GEHealthcare)上 的阴离子交换层析进一步纯化。用PH8的递增浓度的氯化钠洗脱阴离子交换柱。使纯化的 FGF变体通过Planova20N(AsahiKaseiMedical)病毒滞留过滤器，而后在再生纤维素膜 (Millipore)上通过切向流超滤浓缩/渗滤至pH为7的IOmM朽1檬酸、150mMNaCl中。
[0045] 实施例2
[0046]3T3-L1-βKlotho成纤维细朐的葡萄糖摄取测定法
[0047] 3T3-Ll-0Klotho成纤维细胞由3T3-L1成纤维细胞通过CMV驱动的哺乳动物表达 载体的逆转录病毒转导产生，所述CMV驱动的哺乳动物表达载体含有野生型小鼠βKlotho 和杀稻瘟菌素抗性标记物的编码序列。在15μM杀稻瘟菌素存在下，生长14天后选择杀 稻瘟菌素抗性细胞，应用抗βKlotho抗体通过免疫印迹证实βKlotho变体表达。在含有 10%小牛血清和15μM杀稻瘟菌素的Dulbecco'sModifiedEagle培养基（DMEM)中维持 3T3-L1-βKlotho成纤维细胞，直至铺板用于实验用途。
[0048] 对于葡萄糖摄取，3T3-Ll_i3Klotho成纤维细胞以20, 000个细胞/孔铺板于96 孔平板，在含有10%小牛血清的DMEM中孵育48小时。在含有或不含有目的FGF21变体、 含有0.1 %牛血清白蛋白质（BSA)的DMEM中孵育细胞3小时，而后在含有或不含有FGF21 变体、含有100μM2-脱氧-D-(14C)葡萄糖的Krebs-Ringer磷酸盐（KRP)缓冲液（15mM Hepes,pH7. 4, 118mMNaCl, 4. 8mMKC1,I. 2mMMgSO4,I. 3mMCaCl2,I. 2mMKH2PO4, 0. 1%BSA) 中孵育I小时。通过在含有ImM2-脱氧-D-(14C)葡萄糖的Krebs-Ringer重碳酸盐/ Hepes(KRBH)缓冲液中孵育选择的孔确定非特异结合。通过向细胞加入20μM细胞松弛素 B中止反应，使用液体闪烁计数器测量葡萄糖摄取。
[0049] 在3T3-Ll-0Klotho成纤维细胞的葡萄糖摄取测定中SEQIDNO: 1的FGF21变体 的体外效力（EC5tl)是0.05InM。
[0050] 实施例3
[0051] 物理稳定件
[0052] 如下测定FGF21变体的物理稳定性。在有或无150mMNaCl的IOmM组氨酸pH7中 透析和制备l_2mg/mL变体，并通过SEC分析确定％HMW(表1 :"初始"）。
[0053]在尺寸为 30cmX0.78cm的TosohBioscience3000SWXL, 5 微米柱上实施SEC分 离方法。移动相为〇.OlM柠檬酸盐，150mMNaCl，pH7,流速为0.5mL/分钟。初始的低浓度 样品以IOmcL注射应用，并在214nm的吸收波长下监控，而以ImcL注射应用30mg/mL样品， 在280nm监控。
[0054] 之后，将变体浓缩至30mg/mL，并再次分析（t=0)。在存在盐的组氨酸缓冲液中 浓缩后，SEQIDN0:7的FGF21变体的％HMW从0. 15%增加至0.9%。在含有盐的组氨酸缓 冲液中浓缩后，SEQIDNO: 1的FGF21变体的％HMW从0. 15%增加至0. 7%。在缺少盐的 条件下，SEQIDN0:7的FGF21变体的％HMW在浓缩后从0.2%增加至3.2%，SEQIDN0:1 的FGF21变体的％HMW从0.13%增加至1.0%。因此，SEQIDN0:7的FGF21变体和SEQ IDNO: 1的FGF21变体都具有较低的初始％HMW，和在存在150mMNaCl的条件下配制30mg/ mL变体时较低的％HMW。这些数据证实了存在于SEQIDN0:1的FGF21变体中、而不存在 于SEQIDNO: 7的FGF21变体中的L100K突变的重要性。
[0055] 将30mg/mL的制剂在4°C、25°C和40°C下孵育4周，以评估其在胁迫条件下的较 长期稳定性。如表1所示，在4周时间（t= 4周）时再次测定％HMW。在40°C和缺少盐 的条件下，SEQIDN0:7的FGF21变体的％HMW从3.2%增加至6.6%。在4(rC下，SEQID N0:l的FGF21变体的％HMW从l%增加至5.3%。在4(rC和存在盐的条件下，SEQIDN0:7 的FGF21变体的％HMW从0.9%增加至2. 3%，并且SEQIDNO: 1的FGF21变体的％HMW从 0. 7%增加至1.7%。在缺少盐的条件下，在25°C下4周后，SEQIDN0:1的FGF21变体的％ HMW的水平仅为1.1%，而SEQIDNO: 7的FGF21变体为2. 9%。这些数据证实了在SEQID NO: 1的FGF21变体中存在的L100K突变的有益影响。
[0056] 表1:物理稳定性
[0057]
【权利要求】
1. 成纤维细胞生长因子21 (FGF21)变体，其氨基酸序列是 HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSR FLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEP PGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQ ID N0：1).
2. 包含权利要求1的变体和至少一种可药用的载体、稀释剂和赋形剂的药物组合物。
3. 治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症，和/或代谢综合征的方法，包括向有需要的患者 施用权利要求1的变体。
4. 权利要求1的变体，其用于疗法。
5. 权利要求1的变体，其用于治疗2型糖尿病、肥胖、异常脂血症，和/或代谢综合征。
【文档编号】A61K38/18GK104364261SQ201380030829
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年6月5日 优先权日:2012年6月11日
【发明者】R·J·达林, C·D·迪金森, D·A·德赖弗, M·D·贡西亚茨 申请人:伊莱利利公司