用自体同源的成纤维细胞治疗的制作方法

专利名称：用自体同源的成纤维细胞治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及尿失禁，膀胱输尿管逆流和胃食管逆流的治疗。
背景尿失禁在整个美国是非常普遍的病症。美国健康与公共事业服务部在1996年报告说该国家有1300万人遭受尿失禁的困扰。这种症状对于妇女比男子更为常见。在年龄为15至64岁的普通人群中，有10-30％的妇女，相对于1.5-5％的男子受到影响。至少50％的疗养院居住者受此困扰，其中70％为妇女。
尿失禁可由解剖学的、生理的或病理的因素导致。急性和暂时性的失禁通常由分娩、运动性限制、药物副作用，和尿道感染引起。慢性失禁通常由先天性缺陷、膀胱肌无力、尿道闭塞(例如，由于良性前列腺增生或肿瘤)、大脑或脊髓损伤、神经失调(例如，先天性和获得性肌肉神经支配失调，例如肌萎缩性侧索硬化、脊柱裂，或多发性硬化)，以及骨盆肌无力引起。
有几种类型的尿失禁。应力性尿失禁指在增加腹部压力的身体活动(例如，咳嗽，打喷嚏，或大笑)时的尿流失。急迫性尿失禁导致伴随急需排空和无意识的膀胱收缩的尿流失。混合型尿失禁包括应力性和急迫性尿失禁。溢流型尿失禁包括持续的尿滴漏，尽管膀胱从未完全排空。在尿失禁的这些类型中，压力性、急迫性，和混合型尿失禁占病例的90％以上。溢流型尿失禁在由脊髓上部起源的神经供应受影响而失调的人群，以及前列腺增生的老年男性中更为常见。
尿失禁的问题一般在尿道中产生，并且经常是由于在膀胱颈部的尿道括约肌机制的失效而造成的。由于这种失效，尿流出的阻力降低到发生尿无意识流失的程度。
输尿管逆流也是包括阻抗尿流出的阻力不足的相关病症。这种失调包括尿液从膀胱到输尿管的不适当回流，其可伴随肾内的回流，并因此由于逆流肾病而复杂化。
胃食管逆流病(GERD)是包括类似机制的病症，其中胃的内容物倒退回食道中。胃的内容物正常地通过食道下部的括约肌活动而保留在胃里，其除在吞咽期间外保持紧张收缩。当括约肌功能丧失，间歇性的放松或紊乱时，就会发生GERD。有效控制膀胱的不适当尿流出和不适当的食物回流到食道的方法对于治疗患有尿失禁，膀胱输尿管逆流，和GERD的患者将非常有益。
在此将美国专利号5,858,390；5,665,372；5,660,850，和5,591,444，以及共悬而未决的美国申请系列号09/678,047全部引入作为参考。
概述本发明提供通过注射组织学上相容的自体同源的传代成纤维细胞和肌肉细胞的悬浮物来治疗例如尿失禁，膀胱输尿管逆流和食道逆流病症的方法。本发明提供使成纤维细胞和肌肉细胞基本上不含存在于培养基中的免疫原性蛋白质的方法。本发明也提供包含自体同源的成纤维细胞和肌肉细胞的组合物。本发明的组合物也可含有填充剂和/或可生物降解的非细胞基质成分。可将该组合物注射到受试个体内来治疗例如尿失禁，膀胱输尿管逆流和食道逆流的病症。本发明进一步提供注射这种组合物的装置。
通过尿道外或经尿道注射来施用组织学上相容的自体同源的成纤维细胞和肌肉细胞的悬浮液能够增加对尿道的压力，并压缩尿道内腔，从而通过增强尿道对尿流的阻抗来减轻尿失禁。类似的，通过注射到邻近输尿管开口的组织中而施用这些细胞的悬浮液，能够在回流的膀胱内输尿管后增加支持，从而通过提供对尿回流的阻抗而改善膀胱输尿管逆流。可通过将细胞的悬浮液注射到邻近食道下部括约肌的组织内来治疗GERD。注射的成纤维细胞一般是来源于从受试个体取样的活组织样品的培养物的成纤维细胞(例如真皮成纤维细胞)。肌肉细胞(例如来自横纹肌的细胞)也能够从受试个体获得。充分洗涤细胞除去基本上所有的血清来源的蛋白质，其可能在将细胞悬液施用于受试个体时具有免疫原性。
本发明是基于自体同源细胞是用作体积增加剂的理想材料，以治疗例如尿失禁和输尿管逆流的病症，并且可以在治疗前几周培养从受试个体获得的活组织样品而可获得这种细胞的充足供给这一发现的。本发明进一步是基于受试个体内不适当的免疫应答(例如炎症免疫应答)可通过在对受试个体给药前，从自体同源的培养细胞除去抗原性蛋白而避免这一发现的。
一方面，本发明描述了用于修复受试个体中由于受试个体的疾病，失调，或缺陷而变性的组织的组合物。该组合物可包含自体同源的传代成纤维细胞，和自体同源的传代肌肉细胞，并且可基本上不含培养基血清来源的蛋白。疾病，失调，或缺陷可以与尿失禁，膀胱输尿管逆流，或胃食管逆流有关。自体同源的成纤维细胞可以从受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织获得。自体同源的肌肉细胞可以是横纹肌细胞(例如，来自受试个体的舌，舌腭肌，颞肌，比目鱼肌，腓肠肌，或胸锁乳突肌)。自体同源的肌肉细胞也可以是平滑肌细胞。
该组合物可进一步包含可生物降解的非细胞基质，其中成纤维细胞和肌肉细胞整合在基质的内部和表面。基质在与成纤维细胞和肌肉细胞结合之前，可以包含选自胶原、糖胺多糖、白明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿骨、羟基磷灰石、和非有机骨的一种或多种物质。胶原可以是，例如牛胶原，猪胶原I型，或猪胶原III型。成纤维细胞和肌肉细胞整合在基质的内部和表面，基本上填充了基质的内部和表面细胞可占据的空间。
另一方面，本发明描述了用于制备修复组织的组合物的方法，该组织由于受试个体的疾病、失调、或缺陷而在受试个体内变性。该方法可包括(a)提供来自受试个体的含成纤维细胞的组织活检样品；(b)从活组织样品分离自体同源的成纤维细胞；(c)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的自体同源的成纤维细胞的条件下培养自体同源的成纤维细胞；(d)将培养的自体同源成纤维细胞暴露于导致成纤维细胞悬浮的条件下；(e)提供来自受试个体的肌肉组织的活组织样品；(f)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的肌肉细胞的条件下培养分离自肌肉组织的自体同源的肌肉细胞；(g)将培养的自体同源的肌肉细胞暴露于导致肌肉细胞悬浮的条件下；以及(h)将成纤维细胞与肌肉细胞结合。疾病，失调，或缺陷可以与尿失禁，膀胱输尿管逆流，或胃食管逆流相关。
提供包含成纤维细胞组织的活组织样品的步骤可以包括，提供来自受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织的活组织样品。提供肌肉组织的活组织样品的步骤可以包括，提供来自受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌的活组织样品。成纤维细胞和肌肉细胞的培养可包括(1)在含有0.1％-大约20％的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。成纤维细胞或肌肉细胞的培养可以包括在无血清的培养基中培养。成纤维细胞或肌肉细胞的培养可以在含有一种或多种试剂的培养基中进行，该试剂阻止支原体的生长(例如，泰洛星，plasmocin，支原体去除剂，庆大霉素，环丙氟哌酸，阿拉沙星，阿奇霉素，或四环霉素)。产生成纤维细胞或肌肉细胞悬浮液的条件可以包括蛋白水解酶。
另一方面，本发明提供制备用于修复由于受试个体的疾病，失调，或缺陷而导致在受试个体内变性的组织的组合物的方法。该方法可包括(a)提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌肉细胞；(b)提供可生物降解的非细胞基质；以及(c)将成纤维细胞与肌肉细胞和可生物降解的非细胞基质一起培养，使得成纤维细胞和肌肉细胞整合在可生物降解的非细胞基质的内部和表面，其中该培养产生修复组织的组合物，并且其中该培养条件使得组合物基本上不含有培养基血清来源的蛋白。疾病，失调，或缺陷可以与尿失禁，膀胱输尿管逆流或胃食管逆流相关。
可生物降解的非细胞基质，在与成纤维细胞和肌肉细胞结合之前，可以包含选自胶原、糖胺多糖、白明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿骨、羟基磷灰石，和非有机骨的一种或多种物质。胶原可以是牛胶原，猪胶原I型，或猪胶原III型。成纤维细胞和肌肉细胞可以在培养前就组合。可以分别加入成纤维细胞和肌肉细胞进行培养。备选的，培养可包括(1)在含有0.1％-大约20％的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清培养基中培养。培养可包括在无血清的培养基中培养。成纤维细胞和肌肉细胞能够整合在可生物降解的非细胞基制中，直到完全填满可生物降解的非细胞基质中细胞可占据的空间。
提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌肉细胞的步骤可包括(a)提供来自受试个体的含成纤维细胞组织的活组织样品；(b)从活组织样品分离自体同源的成纤维细胞；(c)培养成纤维细胞；(d)悬浮成纤维细胞；(e)提供来自受试个体肌肉组织的活组织样品，(f)从肌肉组织分离肌肉细胞；(g)培养肌肉细胞；以及(h)悬浮肌肉细胞。提供包含成纤维细胞组织的活组织样品的步骤可包括，提供来自受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织的活组织样品。提供包含肌肉细胞组织的活组织样品的步骤可包括，提供来自受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌的活组织样品。成纤维细胞或肌肉细胞的培养可以在包含一种或多种试剂的培养基中进行，该试剂防止支原体的生长(例如，泰洛星，plasmocin，支原体去除剂，庆大霉素，环丙氟哌酸，阿拉沙星，阿奇霉素，或四环霉素)。
另一方面，本发明提供在受试个体中修复组织的方法。该方法可包括(a)提供本发明的组合物；(b)确定受试个体中组织缺陷或组织变性的部位；以及(c)在该部位放置组合物，从而修复组织缺陷或变性。组织缺陷或组织变性可导致尿失禁，膀胱输尿管逆流或胃食管逆流。自体同源的成纤维细胞可来自受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织。自体同源的肌肉组织可来自受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌。
另一方面，本发明提供在受试个体中修复组织缺陷的方法。该方法可包括(a)提供药物组合物，其含有(1)自体同源的传代成纤维细胞，(2)自体同源的传代肌肉细胞，和(3)其药物学上可接受的载体，其中药物组合物基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(b)确定受试个体中与选自尿失禁，膀胱输尿管逆流和胃食管逆流等失调相关的组织缺陷或组织变性的部位；(c)在组织缺陷或变性的部位附近注射一定量的药物组合物，其中该注射导致组织缺陷或变性的修复。
注射可包括将一定体积的药物组合物注射到受试个体的尿道，或接近尿道的组织中，从而压缩尿道内腔。注射可以包括注射一定体积的药物组合物到受试个体的输尿管开口的邻近组织中，从而压缩孔口。注射可以包括注射一定体积的药物组合物到受试个体的食道下部括约肌中，从而压缩食道。
提供药物组合物的步骤可以包括(a)提供来自受试个体的包含成纤维细胞的组织的活组织样品；(b)从活组织取样分离成纤维细胞，用来提供基本上不含胞外基质和非成纤维细胞的成纤维细胞；(c)在生产基本上不含培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下培养成纤维细胞；(d)将传代的成纤维细胞暴露于引起成纤维细胞悬浮的条件下；(e)提供来自受试个体的肌肉组织活组织样品；(f)从肌肉组织中分离肌肉细胞；(g)在生产基本上不含培养基血清来源的蛋白质的肌肉细胞的条件下培养肌肉细胞；(g)将传代的肌肉细胞暴露于引起肌肉细胞悬浮的条件下；以及(h)将成纤维细胞的悬浮液与肌肉细胞的悬浮液，以及药物上可接受的载体相组合，形成药物组合物。
包含成纤维细胞组织的活组织取样可从受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织获得。肌肉组织的活组织取样可从受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌获得。成纤维细胞和肌肉细胞的培养可以包括(1)在含有0.1％-大约20％的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清培养基中培养。成纤维细胞或肌肉细胞的培养可包括在无血清培养基中的培养。产生成纤维细胞或肌肉细胞悬浮液的条件可以包括蛋白水解酶。
本发明还描述了一种用于修复由于受试个体的疾病，失调，或缺陷造成的已变性的组织的可注射组合物。可注射的组合物可包括(a)自体同源的传代成纤维细胞，和自体同源的传代肌肉细胞，其中成纤维细胞和肌肉细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；以及(b)可生物降解的非细胞可注射填充物。自体同源的成纤维细胞可以来自受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织。自体同源的肌肉细胞可以来自受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌。可生物降解的非细胞可注射填充物，在与成纤维细胞和肌肉细胞组合之前，可以包含一种或多种选自下列的物质，(a)自体同源胶原纤维的可注射分散物；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；和(f)分散于氯化钠溶液和受试个体等分血清中的猪白明胶粉和氨基己酸。可注射分散系中的自体同源胶原纤维的浓度可至少为24mg/ml。胶原可以是牛胶原(例如，与戊二醛交联的重新构成的牛胶原)。氯化钠溶液和等分血清的比例可以是1∶1的体积比。氯化钠溶液可以包含0.9％体积的氯化钠。
另一方面，本发明也描述了用于修复由于受试个体的疾病，失调，或缺陷造成的已变性的组织的可注射组合物的制备方法。该方法可包括(a)提供自体同源的传代成纤维细胞，和自体同源的传代肌肉细胞，其中成纤维细胞和肌肉细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(b)提供可生物降解的非细胞填充剂；以及(c)组合自体同源的传代成纤维细胞，自体同源的传代肌肉细胞，和生物可降解的非细胞填充剂。疾病，失调或缺陷可与尿失禁、膀胱输尿管逆流、胃食管逆流、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜损伤、牙周疾病、糖尿病、皮肤溃疡、静脉停滞、皮肤疤痕、或皮肤皱纹相关。
提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌肉细胞的步骤可以包括(a)提供来自受试个体的含有成纤维细胞组织的活组织取样；(b)从活组织取样分离自体同源的成纤维细胞；(c)在可以产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下培养自体同源的成纤维细胞；(d)将培养的自体同源的成纤维细胞暴露于导致成纤维细胞悬浮的条件下；(e)提供来自受试个体肌肉组织的活组织取样样品；(f)从肌肉组织的活组织取样中分离肌肉细胞；(g)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的肌肉细胞的条件下培养自体同源的肌肉细胞；以及(h)将自体同源的肌肉细胞暴露于导致肌肉细胞悬浮的条件下。
提供含有成纤维细胞组织的活组织取样的步骤可包括，提供来自受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织的活组织取样。提供肌肉组织的活组织取样的步骤可包括，提供来自受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌的活组织取样。成纤维细胞和肌肉细胞的培养可以包括(1)在含有0.1％-大约20％的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清培养基中培养。成纤维细胞或肌肉细胞的培养可包括在无血清培养基中的培养。成纤维细胞和肌肉细胞的培养可以在含有试剂的培养基中进行，该试剂是防止支原体的生长(例如，泰洛星，plasmocin，支原体去除试剂，庆大霉素，环丙氟哌酸，阿拉沙星，阿奇霉素，或四环霉素)产生成纤维细胞或肌肉细胞悬浮液的条件可以包括蛋白水解酶。
可生物降解的非细胞填充剂，在与成纤维细胞和肌肉细胞组合之前，可以包含一种或多种物质，选自(a)自体同源的胶原纤维的可注射分散物；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的乙醇酸；(e)溶解的肠线；和(f)分散于氯化钠溶液和受试个体的等分血清中的猪明胶粉和氨基己酸。在可注射分散系中的自体同源的胶原纤维的浓度可至少为24mg/ml。胶原可以是牛胶原(例如，与戊二醛交联的重新构成的牛胶原)。氯化钠溶液和等分血清的比例可以是1∶1的体积比。氯化钠溶液可以含有0.9％体积比的氯化钠。
另一方面，本发明描述了用于修复由于受试个体的疾病、失调、或缺陷而变性的组织的方法。该方法可包括在变性的部位注射有效量的本发明的组合物，从而修复该组织。注射可以包括将一定体积的组合物注射到受试个体的尿道或邻近尿道的组织中，从而压缩尿道内腔。注射可以包括注射一定体积的组合物到受试个体的输尿管口的邻近组织中，从而压缩口。注射可以包括注射一定体积的组合物到邻近受试个体的食道下部括约肌的组织，从而压缩食道。
可生物降解的非细胞可注射填充剂，在与成纤维细胞和肌肉细胞组合之前，可以包含一种或多种物质，选自(a)自体同源的胶原纤维的可注射的分散物；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；和(f)分散于氯化钠溶液和受试个体的等分血清中的猪白明胶粉和氨基己酸。胶原可以是牛胶原。
在另一个方面，本发明描述了用于修复由于受试个体的疾病，失调，或缺陷而变性的组织的方法。该方法可包括如下步骤(a)将自体同源的传代成纤维细胞注射到受试个体内组织变性的部位，其中成纤维细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(b)将自体同源的传代肌肉细胞注射到受试个体内组织缺陷，或需要组织增生的部位，其中肌肉细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(c)将可生物降解的，非细胞填充剂注射到该部位，其中填充剂基本上不含培养基血清来源的蛋白质。注射步骤(a)-(c)的每一步可以包括注射到受试个体的尿道，或邻近尿道的组织，其中该方法导致压缩尿道内腔。注射步骤(a)-(c)的每一步可包括注射到受试个体的输尿管口的邻近组织，其中该方法导致压缩口。注射步骤(a)-(c)的每一步可包括注射到邻近受试个体食道下部括约肌的组织，其中该方法导致压缩食道。疾病，失调或缺陷可包括口腔粘膜缺陷，口腔粘膜损伤，牙周疾病，糖尿病，皮肤溃疡、静脉停滞、皮肤疤痕或皮肤皱纹。
自体同源的成纤维细胞可以来自受试个体的齿龈，上颚，皮肤，固有层，结缔组织，骨髓，或脂肪组织。自体同源的肌肉细胞可以来自受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌、或胸锁乳突肌。成纤维细胞和肌肉细胞可以同时注射。成纤维细胞，肌肉细胞，和可生物降解的非细胞填充物可以同时注射。成纤维细胞和肌肉细胞也可以分开注射。成纤维细胞和肌肉细胞也可以与可生物降解的非细胞填充物分开注射。将成纤维细胞和肌肉细胞注射到受试个体中与将可生物降解的非细胞填充物注射到受试个体中的期间大约2周。
可生物降解的非细胞填充剂，在与成纤维细胞和肌肉细胞结合之前，可以包含一种或多种物质，选自(a)自体同源的胶原纤维的可注射分散物；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；和(f)分散于氯化钠溶液和受试个体的等分血清中的猪白明胶粉和氨基己酸。自体同源的胶原纤维在可注射的分散系中的浓度可至少为24mg/ml。胶原可以是牛胶原(例如，与戊二醛交联的重新构成的牛胶原)。氯化钠溶液和等分血清的比例可以是1∶1的体积比。氯化钠溶液可以含有0.9％体积的氯化钠。自体同源的的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌肉细胞，与生物可降解的非细胞填充剂可以是大约1∶1的体积比。
另一方面，本发明描述了用于修复由于受试个体的疾病，失调，或缺陷而变性的组织的装置。该装置可包括(a)具有注射腔，配置其中的活塞并且孔口与腔相通的皮下注射器；和(b)包含自体同源的传代成纤维细胞，自体同源的肌肉细胞，和药物学可接受载体的悬浮液，其中该悬浮液基本上不含培养基血清来源的蛋白质，并且其中悬浮液配置在注射腔中。
除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的具有相同的意义。尽管可使用与在此所描述的相似或相当的方法和材料实施本发明，但是适合的方法和材料如下描述。在此提及的所有出版物，专利申请，专利，和其他参考文献，都全部引入作为参考。在有冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例只是为了例证而不是为了限制。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容在附图
和下文的说明中阐明。本发明的其他特性、目的和优势在说明书和权利要求书中是显而易见的。
发明详述本发明提供了用于治疗例如尿失禁，膀胱输尿管逆流和食道逆流的病症的方法。这些方法包括将包含组织学上相容的自体同源的传代成纤维细胞的组合物施用于受试个体。该组合物也可包含肌肉细胞(例如，组织学相容或自体同源的肌肉细胞)，以及可以进一步包含可生物降解的非细胞基质成分和/或填充剂(例如可生物降解的非细胞填充剂)。本发明提供了使注射细胞基本上不含可能存在于培养基中的免疫原性蛋白质的方法。本发明也提供了包含有或没有肌肉细胞的自体同源的传代成纤维细胞、可生物降解的非细胞基质，和/或填充剂的组合物，将该组合物施用于患有诸如尿失禁，膀胱输尿管逆流和食道逆流的病症的受试个体。本发明进一步提供了制备该组合物的方法和用于注射该组合物的装置。
1.包含自体同源的成纤维细胞的组合物本发明提供了可用于治疗例如尿失禁、膀胱输尿管逆流和食道逆流的病症的组合物。本发明的组合物包含基本上不含免疫原性蛋白质的自体同源的传代成纤维细胞(例如培养基血清来源的蛋白质)。如在此所使用的，术语″自体同源″指从供体取出并且施用于受体的细胞，其中供体和受体是相同个体。如在此所使用的，“基本上不含培养基血清来源的蛋白质”的细胞(例如自体同源的传代成纤维细胞)指细胞整合于其中的包围细胞的液体含有少于0.1％(例如，少于0.05％，少于0.01％，少于0.005％，或少于0.001％)的在培养细胞时组织培养基含有的异种或异源血清的细胞。同样的，“基本上不含培养基血清来源的蛋白质”的组合物指，其中包围细胞的液体含有少于0.1％(例如，少于0.05％，少于0.01％，少于0.005％，或少于0.001％)的在培养细胞时组织培养基含有的异种或异源的血清的组合物。
成纤维细胞可以来自提供自体同源细胞的任何哺乳动物种属(例如，人，非人的灵长类，狗，牛，马，猪，羊，猫，兔，小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，或沙鼠)。自体同源的人成纤维细胞是特别有用的。注意如果动物是近亲繁殖并因此是同源基因的(例如，动物，如小鼠和大鼠的相同实验室品系)，“自体同源”可以意味着来自相同种属的另一个体。
组合物可以包含可在培养物中扩增的任何未分化的间质细胞。从真皮组织分离的成纤维细胞是特别有用的，因为它们可以轻易地获得并扩展，并且因为它们是通常存在于尿道括约肌、尿道口和食道下部括约肌的邻近组织的细胞类型。自体同源的真皮成纤维细胞可以从例如受试个体的齿龈，上颚或皮肤的活组织样品中获得。真皮定位在表皮下，并且一般具有大约0.5-3mm的厚度。真皮的主要细胞组成是成纤维细胞和巨噬细胞，但也存在脂肪细胞和肌肉纤维。除了真皮，成纤维细胞可无限制地从筋膜、固有层、毛囊的球根部位、骨髓，或结缔组织的任何来源获得。此外，成纤维细胞可来源于未分化的间质细胞。可使用培养和分化未分化的间质细胞的任何合适方法，包括本领域公知的那些方法。
由于移植外科医生和免疫学家公知的同种异体移植排斥的现象，培养的成纤维细胞与受体组织相容是非常重要的。可以通过从待治疗的受试个体获得活组织样品来确保组织相容性。然而可以理解的是，这种细胞也可以从受试个体的同卵双生子，或从与受试个体的主要组织相容性复合体(MHC)相同的个体获得。可培养来自活组织样品的成纤维细胞，使所得到的细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质，也降低细胞激活受试个体中不适当免疫应答的能力。为了产生本发明的组合物，成纤维细胞培养物可起源于例如，患有组织变性(例如小便失禁、膀胱输尿管逆流或GERD)的受试个体的齿龈、上颚或皮肤的完全厚度(例如1-5mm，或如果可得到足够的组织，可以超过5mm)的真皮活组织样品。这种活组织样品可以通过利用，例如活组织穿孔取样的方法来获得。真皮或固有层的活组织也经常用于获得自体同源的成纤维细胞。皮肤活组织样品可取自皮肤，例如耳后的皮肤。
在开始培养前，活组织样品可以用抗生素和抗真菌剂重复洗涤。适宜的“洗涤培养基”可包含，例如组织培养基，诸如Dulbecco′sModified Eagle′s Medium(DMEM)，和部分或全部的下列试剂庆大霉素、两性霉素B(Fungizone)、支原体去除剂(MRA；Dianippon制药公司，日本)、plasmocin和泰洛星(可从例如，Serva，海德堡，德国购得)。庆大霉素的使用浓度可以是10-100μg/ml(例如，从25-75μg/ml，或大约50μg/ml)。两性霉素B的浓度是0.5-12.5ug/ml(例如1.0-10.0μg/ml，或大约2.5μg/ml)。MRA使用浓度是0.1-1.5μg/ml(例如0.25-1.0μg/ml，或大约0.5μg/ml)。Plasmocin的使用浓度是1-50μg/ml(例如10-40μg/ml，或大约25μg/ml)。泰洛星的使用浓度是0.012-1.2mg/ml(例如0.06-0.6mg/ml，或大约0.12mg/ml)。
如果需要，可以使用无菌的显微解剖从含有角质化组织的上皮，和含有皮下脂肪的皮下组织的活组织取样中分离真皮组织。然后活组织取样可以用例如，镊子或剪刀分离为小块并仔细剪碎组织。在一些实施方案中，组织小块用蛋白酶消化(例如胶原酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、或木瓜凝乳蛋白酶)。使用200-1000U/ml的胶原酶II型消化30分钟到24小时尤为有效。如果采用酶消化，可通过离心收集细胞，并且接种到组织培养瓶中。
如果组织不受到酶消化，剪碎的组织块可以分别置于组织培养瓶的干燥表面上，然后使其贴壁大约2-大约10分钟。缓慢加入少量培养基，使其不能移走贴壁的组织。在消化细胞的情况下，可以将细胞悬浮于培养基并接种到一个或多个培养瓶中。培养大约48-72小时后，可向培养瓶加入另外的培养基。当使用T-25培养瓶开始培养时，初始培养基的体积一般应为大约1.5-2ml。从活组织取样到建立细胞系大约花费2-3周，这段时间细胞可以从初始培养器皿中移出而用于扩增。
在培养的早期阶段，最好使组织碎片保持附着于培养器皿的底部。移除的碎片可以再接种到新的器皿中。可以根据标准技术通过将成纤维细胞短暂的暴露于EDTA-胰蛋白酶来刺激其生长。这样暴露于胰蛋白酶是非常短暂的，不会使成纤维细胞从其附着的培养器皿壁上释放下来。一旦建立培养并且接近汇合后，可立即处理成纤维细胞的样品，冷冻储存在例如液氮中。可使用任何冷冻细胞的合适方法，包括很多本领域众所周知的成功冷冻细胞备用的方法。优选冷冻和储存传代数较早的细胞，因为正常人成纤维细胞的细胞培养物的传代次数是有限的。
成纤维细胞可以冷冻在任何适用于保存成纤维细胞的冷冻培养基中(例如任何商业化提供的冷冻培养基)。由大约70％(v/v)的生长培养基、大约20％(v/v)的胎牛血清和大约10％(v/v)的二甲亚砜(DMSO)组成的培养基是特别有用的。DMSO也可以用例如甘油来代替。解冻的细胞可以用于开始次级培养，用于制备稍后用于相同受试个体的附加悬浮液，从而避免为获得次级活组织样品而带来的不便。
适用于从活组织样品中增殖真皮成纤维细胞的任何组织培养技术都可以用来扩增该细胞。适用的技术可在，例如，，R.I.Freshney，编辑.动物细胞培养实用方法Animal Cell CultureA PracticalApproach，(IRL出版社，牛津，英格兰，1986)和R.I.Freshney，编辑，动物细胞培养基本技术手册Culture of Animal CellsAManual of Basic Techniques，(Alan R.Liss & Co.，纽约，1987)。
细胞培养基可以是适于原代成纤维细胞培养物生长的任何培养基。培养基可以补充有人或非人的血清(例如，自体同源的人血清、非自体同源的人A/B血清、马血清、或胎牛血清(FBS))以促进成纤维细胞的生长。当包括在培养基中，血清的量一般在大约0.1％-大约20％v/v之间(例如0.5％-19％之间，1％-15％之间，或5％-12％之间)。也可以使用更高浓度的血清以促进成纤维细胞的更快生长。尤其有用的培养基包含补充有大约2mM的谷氨酸盐，大约10mg/L丙酮酸钠，大约10％(v/v)FBS，和抗生素的葡萄糖DMEM(经常称为“完全培养基”)，其中葡萄糖的浓度范围为大约1,000mg/L-大约4,500mg/L。成纤维细胞也可在不含血清的培养基中扩增。这种方法中，成纤维细胞不再暴露于异种或异源的血清蛋白质，并且也不需要在不含血清培养基中的额外培养，当成纤维细胞在含有非自体同源血清的培养基中扩增时进行这样的额外培养。
用于培养成纤维细胞的生长培养基可以补充抗生素来防止培养物受到例如细菌、真菌、酵母和支原体的污染。支原体污染是组织培养中常见且非常棘手的问题。为了防止或最小化支原体污染，可以向生长培养基中加入例如泰乐菌等的试剂。培养基可以进一步补充加入一种或更多种抗生素/抗真菌素(例如庆大霉素、环丙氟哌酸、阿拉沙星、阿奇霉素、MRA、plasmocin，和四环素)。泰洛星的使用浓度可以为0.006-0.6mg/ml(例如0.01-0.1mg/ml，或大约0.06mg/ml).庆大霉素的使用浓度可以为0.01-0.1mg/ml(例如0.03-0.08mg/ml，或大约0.05mg/ml)。环丙氟哌酸的使用浓度可以为0.002-0.05mg/ml(例如0.005-0.03mg/ml，或大约0.01mg/ml)。阿拉沙星的使用浓度可以为0.2-5.0μg/ml(例如0.5-3.0μg/ml，或大约1.0μg/ml)。阿奇霉素的使用浓度可以为0.002-0.05mg/ml(例如0.005-0.03mg/ml，或大约0.01mg/ml)。MRA的使用浓度可以为0.1-1.5μg/ml(例如0.2到1.0μg/ml，或大约0.75μg/ml)。plasmocin的使用浓度可以为1-50μg/ml(例如10-40μg/ml，或大约25μg/ml)。四环素的使用浓度可以为0.004-0.1mg/ml(例如0.008-0.05mg/ml，或大约0.02mg/ml)。抗生素可以在整个培养期或在部分的培养期存在。
支原体污染可以通过利用例如购自bioMérieux(Marcy l’Btiole，法国)或自制的支原体琼脂板系统的琼脂培养方法和PCR来分析。美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)出售PCR“检测支原体试剂盒”。包含泰洛星(0.06mg/ml)、庆大霉素(0.1mg/ml)、环丙氟哌酸(0.01mg/ml)，阿拉沙星(1.0μg/ml)，阿奇霉素(0.01mg/ml)和四环素(0.02mg/ml)的培养基对防止支原体污染是特别有用的。可用于防止支原体污染的另外试剂是4-氧代-喹啉-3-羧酸(OQCA)的衍生物，这种试剂是从例如ICN Pharmaceuticals，Inc.(CostaMesa，CA)商业可获得的“支原体去除试剂”。一般这种试剂的使用浓度大约是0.1-2.5mg/ml(例如0.2-2.0mg/ml，或0.5mg/ml)。在开始培养后的第一个二周内，抗生素的混合液或其他试剂可以存在于成纤维细胞的培养基中。培养2周以后，包含抗生素的培养基一般被不含抗生素的培养基所取代。一旦在培养基中存在足够数量的细胞(例如，当细胞为70％-90％汇合)，就可以检测支原体，细菌，和真菌的污染。只有没有检测到污染的细胞才能用于本发明的方法。
成纤维细胞可以通过胰蛋白酶消化而传代到新的细胞瓶中。为了扩增，单个细胞瓶可以按一定比例，例如1∶3-1∶5，进行分传。具有总共450cm2培养面积的三重底的T-150细胞培养瓶，适合于扩增成纤维细胞。例如，一个三重底的T-150细胞培养瓶根据细胞大小可以接种例如，大约1×106-3×106个细胞。当需要大约5-7天培养，达到培养瓶的容量时，生长培养基可以换成无血清培养基。一般细胞在30℃-大约37.5℃培养至少4小时(例如过夜或大约18小时)。细胞在不含血清的培养基中培养可基本上除去来源于培养基中加入的非自体同源的血清(例如FBS)的蛋白质，如果这些蛋白存在于注射到受试个体内的组合物中，会激发不需要的免疫应答。无血清培养基可包含，例如，补充有大约2mM谷氨酰胺，含有或没有110mg/L丙酮酸钠的葡萄糖DMEM，其中葡萄糖的浓度范围在1,000mg/L-4,500mg/L之间。葡萄糖浓度为大约4,500mg/L是特别合适的。无血清培养基也可包含一种或多种上述的抗生素。
无血清培养结束时，可以使用例如，胰蛋白酶-EDTA将细胞从组织培养瓶中移出。在对受试个体给药前，一般将成纤维细胞在不含血清和不含酚红的培养基或盐溶液中洗涤2-4次。通过离心和重悬来洗涤细胞，然后用等体积的可注射的等渗溶液悬浮并用于注射，该等渗溶液具有适当的生理渗透压并且基本上不含热源和外来蛋白质。等渗盐溶液是特有用的注射溶液。5个三重底的T-150培养瓶汇合后可以产生大约3.5×107-大约7×107的细胞，这些细胞足够制备大约1.2ml-大约1.4ml的悬液。然后将药物学上可接受的载体加入传代的自体同源的成纤维细胞中以形成药物组合物。“药物学上可接受”指当，对细胞无毒害的分子实体和组合物施用于人类时，是生理上耐受的，并且一般不会产生过敏或类似的不适当反应，例如胃不适、眩晕等。这种组合物包括多种缓冲容量(例如，Tris-HCI、醋酸、磷酸)的生理学上可接受的稀释剂，pH值和离子强度。
在施用前，可以将成纤维细胞与活化的化合物共培养，例如，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、亚油酸，C-Med 100(Optigene-XLLC，Shrewsbury，NJ)、辅酶Q-10、乙醇酸、L-羟酸，L-硫辛酸，一磷酸钙，或其他刺激性添加物，例如生长因子。与这些化合物共培养可以刺激成纤维细胞并增强其胶原的产生。也可将一种或多种活化的化合物与包含自体同源的传代成纤维细胞的组合物一起施用于受试个体。备选地，在缺乏传代的成纤维细胞时施用活化的化合物可以体内刺激成纤维细胞。
如果不立即施用成纤维细胞，可以将其在大约4℃于冰上培养多达24-48小时。细胞可悬浮于具有适宜的渗透压浓度并且已经检测过致热原和内毒素水平的生理学溶液中。一般这种溶液不包含酚红pH指示剂，并且优选地任何血清为受试个体的血清而不是FBS或另外的异种血清。成纤维细胞可以悬浮在例如，含5％葡萄糖的Krebs-Ringer溶液，或任何其他的生理溶液中(例如，生理盐水)。可以在培养基中抽吸细胞并施用给受试个体。悬浮细胞的盐水或培养基的体积一般与例如待注射的成纤维细胞的数目和由于组织变性或缺陷造成的损伤程度等因素相关。
任何其他适合的方法也可以用于制备包含自体同源的传代成纤维细胞的组合物，参见例如，美国专利号5,858,390；5,665,372；5,660,850；和5,591,444；以及WO 99/60951，所有这些都全部引入作为参考。
2.含有成纤维细胞和肌肉细胞的组合物本发明的组合物可以包含自体同源的传代成纤维细胞和传代的肌肉细胞。肌肉细胞可以是自体同源或非自体同源的(例如，来自另一个受试个体或细胞系)，尽管自体同源的肌肉细胞是特别有效的。肌肉细胞可以是横纹肌细胞或平滑肌细胞。自体同源的横纹肌细胞可以从例如，来自头部(例如，舌、舌腭肌或颞肌)、颈、躯干(例如，胸锁乳突肌)，或四肢(例如比目鱼肌或腓肠肌)的活组织取样的肌肉组织分离。自体同源的肌肉活组织取样一般从容易接触到的部位获得，但是从美容学的观点出发，不能取自高度可见的部位。平滑肌细胞一般是非自体同源的，并且可以从例如来自器官(例如，心脏)移植供体的大动脉活组织取样分离。非自体同源的肌肉细胞也可以来自肌肉细胞系。这些细胞是可从例如，ATCC和Clonetics公司(San Diego，CA)商业获得的。备选地，肌肉细胞也可来源于例如从真皮的活组织取样分离的干细胞。可以使用培养和分化干细胞的任何适宜的方法，包括本领域众所周知的方法。
为了制备自体同源的肌肉细胞的悬浮液，可以从肌肉活组织取样获得自体同源或非自体同源的肌肉组织。一般样品大小为大约0.5-1.0cm3，质量为大约0.5-1g。这些组织可以在含有例如，与用于从活组织取样到产生自体同源的成纤维细胞培养物过程中所描述的相同抗生素的培养基中温和搅动进行分离。可用镊子除去任何明显的结缔或脂肪组织。剩下的组织样品可切碎为更小的块(例如，不大于1mm3的块)。用刀片在胰蛋白酶中剪碎是特别有用的。剪碎的悬浮液可以在胰蛋白酶/EDTA中温和搅动来分离细胞，然后将其轻轻倒入新培养瓶，使剩余的组织块留在后面。可加入FBS来中和胰蛋白酶。胰蛋白酶步骤可以最多重复3次，或直到没有粉色组织块残留，并且可以离心收集肌肉细胞。肌肉细胞和/或肌肉组织(例如活组织取样样品)可以用如上文用于培养成纤维细胞所描述的，含有抗生素和抗真菌剂的培养基充分洗涤。
肌肉细胞可以在任何适宜的培养基中培养。人肌肉生长培养基条件培养基(HuGM/CM)为1∶1的混合物是特别有用的。HuGM一般含有Ham′s F10，10％FBS，5％FBS(成分明确并且补充铁；Hyclone，Logan，UT)，0.5％鸡胚浸液(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)，100U/ml青霉素，和100μg/ml链霉素。CM是已经与MRC-5成纤维细胞(可提供自，例如ATCC)培养处理后的HuGM培养基。不含外源血清蛋白质的(例如，不含血清的培养基)其它有用的培养基是上述用于自体同源成纤维细胞所描述的。该培养基也包含与上述用于自体同源的成纤维细胞相同的抗生素。
当肌肉细胞达到大约40％汇合时，可将细胞接种到任何合适大小的组织培养皿或培养瓶(例如96孔板、24孔板、12孔板，或35mm、60mm或100mm的培养皿，或T-25、T-75、T-150，或T-500培养瓶)中并且用新鲜培养基培养(例如，1∶1的HuGM/CM)。然后每2-3天用生长培养基培养细胞(比如HuGM)。当肌肉细胞达到大约70％--80％汇合时，可以用胰蛋白酶消化，并以每皿5×105-10×105个细胞，接种到新鲜的组织培养皿中(例如，100mm培养皿)。分传后一般培养皿中为大约20％汇合。可以扩增和传代细胞直到获得合适的数目。如上所述，监测细胞的细菌、真菌、酵母或支原体的污染。一旦达到合适的肌肉细胞数目，其可以在无血清的培养基中培养2-18小时，以除去免疫源性的蛋白质(即，使细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质)。在施用于受试个体前，肌肉细胞一般在无血清培养基或PBS中洗涤2-4次。不含Ca2+、Mg2+的PBS是特别有用的。一般细胞经过离心和重悬而洗涤，然后在等体积的等渗溶液中悬浮用于注射，该溶液具有合适的生理渗透压，并且基本上不含热原和外来蛋白质。等渗生理盐水是特别有用的等渗溶液。
在施用于受试个体前，可将药物学上可接受的载体加入肌肉细胞。备选地，如果不立即施用细胞，可以将其在大约4℃于冰上培养多达24-48小时。对于这种培养，细胞可以悬浮在具有合适渗透压并且已经检测过致热原和外来蛋白质的生理溶液中。这种溶液一般不含酚红pH指示剂，和任何血清，即使有，优选是受试个体的血清而不是FBS或异种血清。肌肉细胞可以悬浮在例如含有5％葡萄糖的Krebs-Ringer溶液或其它任何生理溶液中。细胞可在培养基中抽吸并施用给受试个体。其中悬浮肌肉细胞的盐溶液或培养基的体积一般与例如待注射的细胞数目和由组织变性或缺陷所造成的损伤程度相关。
可以冷冻肌肉细胞以备日后使用。细胞可以被胰蛋白酶处理并重悬于任何适宜的冷冻培养基中(见上文；例如含有90％小牛血清和10％DMSO的培养基)。然后将肌肉细胞悬浮液等份分入低温冰冻的小瓶中，在转移入液氮前于大约-70℃到大约-86℃冷冻，或可以将其冷冻在液氮深低温保藏单位中。可解冻细胞并用于开始次级培养以制备日后用于相同受试个体的附加悬浮液，从而避免获得次级样品的不便。
本发明提供了制备用于修复或改善受试个体中组织缺陷的组合物的方法。这些方法一般包括获得真皮活组织取样并制备基本上不含免疫原性蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)的自体同源的传代成纤维细胞的悬浮液，获得肌肉活组织取样，并且制备基本上不含免疫原性蛋白质的自体同源的传代肌肉细胞，以及将成纤维细胞和肌肉细胞组合产生可用于治疗例如尿失禁、膀胱输尿管逆流、或食道逆流的组合物。备选地，可以制备非自体同源的肌肉细胞的悬浮液并与成纤维细胞组合。
3.含有可生物降解的非细胞基质成分的组合物包含自体同源的传代成纤维细胞，有或没有传代的肌肉细胞的本发明组合物也可包括可生物降解的非细胞基质成分。这种组合物适用于注射或植入受试个体以修复已经变性的组织。如在此所使用的术语“可生物降解的”表示生物学上无害，并可通过自然的效应因素(例如天气、土壤细菌、植物、动物)化学降解或分解的组合物。本发明中可以使用的基质的实例包括但不限于，包括自体同源和非自体同源的蛋白质的非细胞基质，和包括生物可降解的聚合物的非细胞基质。
许多包含非自体同源蛋白质的，生物可降解的非细胞基质都可用于在此所提供的组合物。生物可降解的非细胞基质的实例包括包含任何类型胶原，或具有与例如戊二醛交联的糖胺多糖(GAG)的任何类型胶原的基质。可以从其中制备有用的生物可降解的非细胞基质的其它物质包括透明质、透明质酸、Restalyn和Parleane。含有胶原的基质，包括但不限于，可吸收的胶原海绵、胶原膜、和骨松质。胶原的有用类型包括，例如，牛胶原(例如，可从McGhan Medical公司，SantaBarbara，CA商业化购得的Zyderm和Zyplast，)、猪胶原、人尸胶原(例如，FascianTM(Fascia Biosystems，LLC，Beverly Hills，CA)，Cymetra(LifeCell公司，Branchburg，NJ)，或DennalogenTM，以前由Collagenesis公司生产)，和自体同源的人胶原(Autologeni，见下)。FascianTM是特别有用的。这种产品有5种不同的大小，任何一种都可以用于在此所描述的组合物和方法。大小为0.25mm的颗粒是特别有用的。
可吸收的胶原海绵体可以从例如Sulzer Calcitek公司(Carlsbad，CA)购买获得。这些胶原海绵状的敷料剂，商业名称为CollaTape，CollaCote，和CollaPlug)，是用从牛深屈肌(Achilles)键提取的胶原和GAG交联制成的。这些产品柔软、易变形、不易碎并且无致热原。超过90％的胶原海绵体通常由开放的小孔组成。
可生物降解的非细胞基质可以含有形成例如薄膜的胶原(例如，牛或猪胶原I型)。一种这样的膜是由Sulzer Calcitek公司制造的，商品名称是BioMendTM。另一种膜状的基质是由Geistlich Shne AG(Wolhusen，Switzerland)销售的Bio-Gide，其由猪I型和III型胶原制成。Bio-Gide具有双层结构，一面是多孔的并容许细胞在内生长，而另一面比较紧密并阻止纤维组织在内生长。
可生物降解的非细胞基质也可从形成颗粒状或块状的骨松质制备。该材料由动物(例如，人、非人灵长类、牛、绵羊、猪、或山羊)骨组成，其中基本上已经除去所有的有机物质(例如蛋白、脂类、核酸、碳水化合物、和有机小分子，如维生素和非蛋白质的激素)。这种类型的基质在此称为“非有机基质”。以Bio-Oss生产的海绵状颗粒和Bio-Oss块销售的一种这样的基质，是由Geistlich Shne AG制造的。该公司也生产包含非有机质骨和另外包含大约10％重量的胶原纤维的块型基质(Bio-Oss胶原)。
其他有用的可生物降解的非细胞基质可以包含明胶、多聚乙醇酸、肠线、脱矿骨、非有机骨、或羟基磷灰石，或这些物质的混合物。由脱矿人骨制成的基质例如是形成小块的，并且以DynaGraft由GenSci Regeneration Laboratories公司(Toronto，Ontario)销售。脱矿骨可以与例如胶原组合以生产海绵状、块状或膜状形式的基质。从一种或多种单体合成的聚合体也可以用来制备在此可用的可生物降解的非细胞基质。可从一种或多种这样合成的聚合物制备基质。合成的聚合物可以与上述任何一种物质组合来形成基质。形成单独基质的不同聚合体可以是独立的单元或片层。例如，W.L.Gore和Associates，Inc.(Flagstaff，AZ)生产多孔的可生物降解的非细胞基质(GORE RESOLUT XT Regenerative Material)。该基质是由生物可吸收的乙交酯和三甲烯碳酸酯的共聚物纤维组成的，其中细胞可以迁移，附着于由合成的生物可吸收的乙交酯和丙交酯共聚物组成的闭合膜，其可阻止细胞在内生长。
选择可生物降解的非细胞基质后，有或没有传代肌肉细胞的，自体同源的传代成纤维细胞的浓缩悬浮液可以均匀分布于基质表面。一般使用浓缩的悬浮液是为了避免超过基质对液体悬浮液的吸附能力。例如，应用于GORE RESOLUT XT基质的细胞悬浮液一般体积为约94μl到125μl，并且每平方厘米的基质包含大约2.0×106-大约4.0×106个细胞。可容许细胞附着于基质而无需进一步加入培养基。细胞与基质的培养可以在例如大约37℃下进行大约1-2小时。在培养60分钟后，一般细胞会附着并均匀分布于整个基质材料。这时，含有负载细胞的基质的培养器皿可以补充附加的生长培养基，并且细胞在基质中培养大约3-4天。由于细胞以高密度加入基质，以基本上充满基质内部的空间，在3-4天的培养期内，极少或根本没有发生细胞增殖。实际上，该期间内显著的细胞增殖一般是不需要的，因为分开的成纤维细胞会分泌酶(例如，胶原酶)，而降解或部分降解基质。
具有细胞的基质一般用如下溶液洗涤(例如至少洗3次，每次10分钟)，例如盐水或不含血清和酚红的培养基，以便基本上除去免疫原性的蛋白质(例如，基质接种步骤使用的含有非自体同源的血清的培养基中的培养基血清来源的蛋白)，该蛋白在施用于受试个体时会激发免疫应答。每次洗涤可使用新鲜的PBS。然后可以在使用前将基质孵育在新鲜的PBS中(例如，孵育2小时)。孵育后，可以将包含自体同源的传代成纤维细胞，有或没有传代的肌肉细胞的基质置于组织变性或缺陷的区域上。
至于胶原海绵基质(例如CollaCote)，将大约1.5ml生长培养基中的大约1.5×107-2.0×107个细胞接种到2cm×4cm的薄(大约2.5-3.0mm厚度)海绵上。然后将海绵在37℃培养大约1-2小时，不进一步加入培养基以容许基本上所有的成纤维细胞附着于基质材料。细胞附着后，可将另外的生长培养基加入基质和细胞组合物，然后可在37℃用每日更换的培养基培养3-4天。如果使用包含非自体同源的血清的培养基用于细胞接种步骤，可从包含这种血清的生长培养基移出该组合物并且用PBS重复洗涤(例如，3次或更多)。每次加入PBS后，基质可在丢弃PBS前孵育10-20分钟。最后洗涤后，组合物可立即施用于受试个体，或可转入包含生理溶液(例如，Kreb′s Ringer溶液)的运送小瓶中并且在大约4℃孵育达到大约24-48小时。
至于膜状基质(例如，BioMendTM)，将大约100μl生长培养基中的大约3×106-8×106个成纤维细胞接种到15mm×20mm的薄膜(大约0.5-1.0mm厚度)上。然后将膜在37℃培养大约30-60分钟，不进一步加入培养基以容许基本上所有的细胞附着于基质材料。细胞附着后，可将另外的生长培养基加入基质和细胞组合物，然后其可在37℃用每日更换的培养基培养2-3天。一般细胞以高密度加入基质(参见上面)使得基本上充满基质内细胞可占据的空间。组合物的洗涤和立即的利用或孵育可以如上段用于海绵基质所描述的进行。
至于例如上述所描述的非有机基质(例如，Bio-Oss块)或脱矿骨基质(例如，DynagraftTM)的块状基质，可将大约100-150μl生长培养基中的大约1.2×107-2.0×107个细胞接种到1cm×1cm×2cm的基质材料立方块中。一般，将细胞缓慢地接种到块表面的一个层面上。一旦块已经吸收培养基和细胞，块的另一表面可以类似方式接种。可重复该过程直到块的所有表面都已经接种并且完全用培养基饱和。应该注意避免加入过量的培养基并由此导致培养基和细胞从块渗漏。然后将组合物在37℃培养大约60-120分钟，不进一步加入培养基以容许基本上所有的细胞附着于基质材料。细胞附着后，可将另外的生长培养基加入基质和细胞组合物，然后其可在37℃用每日更换的培养基培养2-3天。一般细胞以高密度加入基质(参见上面)使得基本上充满基质内细胞可占据的空间而具有如上所述相同的结果。组合物的洗涤和立即的利用或孵育可以如上用于海绵基质所描述的进行。
包含自体同源的传代成纤维细胞和小颗粒的可生物降解基质(例如，FascianTM、CymetraTM、或DermalogenTM)的组合物可通过将成分，例如在2个经luer塞衔接的注射器之间往复混合而制备。例如FascianTM，一般是在注射器(例如，3cc注射器)中以80mg/注射器得到的。使用前FascianTM颗粒可在注射器中，通过将小体积(例如，1.5ml)的洗涤缓冲液(例如，等渗盐水或包含葡萄糖的Kreb′sRingers溶液)吸入注射器而直接洗涤，将第一注射器经luer塞连接第二注射器，并且使颗粒和洗液在2个注射器之间往复流通若干次。为了从洗液分离颗粒，可将该混合物转入无菌的试管并且使FascianTM颗粒沉淀。可移出溶液(例如，轻轻倒出或吸出)，并且可根据需要通过将颗粒吸入新鲜的注射器(例如，通过18号或20号的针)而重复洗涤过程。
适当洗涤填充剂颗粒后，可将它们与成纤维细胞和任选地肌细胞，利用如用于洗涤的相同方法混合。可将细胞(例如，1×107-3×107个细胞)悬浮在溶液(例如，1.5ml的含5％葡萄糖的Kreb′s Ringers溶液)中并且吸入注射器。可将包含细胞的注射器与包含填充剂颗粒的注射器借助luer塞而连接，并且2种组分可通过将其在注射器之间往复而混合。然后可将混合物转入T-25组织培养瓶或组织培养皿或试管中，使得该细胞附着于填充剂颗粒。备选地，当附着发生时混合物可保持在注射器中，尽管这可能对细胞更有害。将混合物孵育过夜然后转入容器(例如，小瓶或试管)以运送给临床医师，或转入注射器而施用于受试个体。运送给临床医师的容器可在运送期间保存在冰上。当使用这种小颗粒的非细胞的可生物降解基质时，包含细胞的颗粒的悬浮液可任选地注射，而不是植入组织变性或缺陷的区域内。
当培养的肌细胞包括在包含成纤维细胞和可生物降解的非细胞基质的组合物内时，它们可与成纤维细胞在接种到基质内部前混合。备选地，它们可在成纤维细胞接种前或接种后接种到基质中。当肌细胞是在成纤维细胞前或后接种的，第二接种可在第一接种后立即进行或在第一接种的细胞已经基本上附着于基质后进行。
本发明也提供用于制备包含自体同源的传代成纤维细胞和基质成分的组合物的方法。这些方法一般包括，提供基本上不含免疫原性的蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)的自体同源的传代成纤维细胞的悬浮液，提供可生物降解的非细胞基质，将可生物降解的非细胞基质与成纤维细胞悬浮液一起培养，以使得成纤维细胞结合在基质上和基质内，从而形成用于修复或增加组织的组合物。这些方法也可包括将传代肌细胞(例如，自体同源的传代肌细胞)的悬浮液与成纤维细胞同时或分别加入基质。
4.包含填充剂的组合物本发明的组合物可包含一种或多种可生物降解的非细胞的可注射填充剂物质(即，填充剂)以及自体同源的传代成纤维细胞。组合物适于注射到受试个体中以便修复已经变性的组织。除成纤维细胞和填充剂外，组合物也可包含传代的肌细胞(一般为自体同源的肌细胞；参见上面)。在包含自体同源的传代成纤维细胞，有或没有肌细胞的，与可生物降解的非细胞填充剂的可注射组合物中，细胞一般与填充剂以大约1∶1的体积比率混合。
可将许多类型的可生物降解的非细胞的可注射填充剂加入本发明的组合物。填充剂可由自体同源的蛋白质，包括来自受试个体的任何类型的胶原组成。这种填充剂的实例是Autologen，其原先由Collagenesis公司(Beverly，MA)生产。Autologen是来自受试个体的自体同源的皮肤胶原纤维的分散体系，因此当与肌细胞和/或成纤维细胞再施用给受试个体时不会引发免疫应答。为了获得Autologen，从受试个体获得组织样品(例如，真皮、胎盘或脐带)并提供给Collagenesis公司，其中将它加工到富含胶原的分散体系中。大约一又二分之一平方英寸的皮组织可产生一个立方厘米(cc)的Autologen。Autologen的浓度可根据受试个体内修正缺陷或增加组织所需要的数量而调节。分散体系中的Autologen的浓度可以是，例如至少大约25mg/L(例如，至少30mg/L，至少40mg/L，至少50mg/L，或至少100mg/L)。
非细胞的可注射填充剂物质也可包含非自体同源的蛋白质，包括任何类型的胶原。许多的胶原产品是可商业购买的，并且可用于本发明的组合物。人胶原产品也是可商业购买的。可商业购买的胶原的实例包括但不限于，重新构成的牛胶原产品，例如Zyderm和Zyplast，其包含与戊二醛交联，并且悬浮在含0.3％利多卡因的磷酸盐缓冲的生理盐水中的重新构成的牛胶原纤维。这些产品由Santa Barbara，CA的McGhan Medical公司生产。猪胶原产品也是可商业购买的。
有效的填充剂物质的其他实例包括但不限于，溶解的白明胶、聚乙醇酸、或缝合肠线。例如特别的白明胶基质植入物是以Fibril出售的。该填充剂包含等体积的(1)分散在0.9％(按体积)氯化钠溶液中的猪白明胶粉和o-氨基己酸的混合物，和(2)来自受试个体的等分血浆。其他作为填充剂的有用物质包括透明质酸酶；透明质酸、restalyn和parleane。
本发明也提供制备包含自体同源的传代成纤维细胞和可生物降解的非细胞填充剂，有或没有传代肌细胞的组合物的方法。这些方法一般包括，提供基本上不含免疫原性的蛋白质(例如，培养基血清来源的蛋白质)的自体同源的传代成纤维细胞和任选地肌细胞的悬浮液，提供一种或多种可生物降解的非细胞填充剂物质，以及将填充剂与成纤维细胞和肌细胞悬浮液组合。备选地，单独的2种细胞类型的悬浮液可与填充剂组合。
5.用于施用本发明组合物的装置本发明也提供用于将包含自体同源的传代细胞的组合物递送到组织变性或缺陷部位(例如，尿道、尿道口或食道下部的括约肌)的接近点的装置。这种装置可由具有注射腔、其中配置的活塞、与腔互通的孔口，以及包含自体同源的传代成纤维细胞的药物组合物，以使得药物组合物配置在腔内的无菌皮下注射器组成。该药物组合物可包含自体同源的传代成纤维细胞和一种或多种下列传代肌细胞(例如，自体同源的传代肌细胞)、药物学上可接受的载体、可生物降解的非细胞填充剂和可生物降解的非细胞基质成分。皮下注射器可具有任何合适的大小(例如，1cc、3cc、10cc或大于10cc)的容积。注射器也可连接合适大小(例如，14号、16号、18号、20号、23号、25号、27号、或30号)和长度(例如，小于20cm、20cm、25cm、30cm、35cm、或40cm、或大于40cm)的针头。
6.修复或增加组织的方法本发明的方法可用于将有效量的本发明组合物施用给受试个体从而修复或增加受试个体内的组织。如在此所使用的，术语″有效量″指药物组合物的数量可提供修正受试个体中组织缺陷，或可在受试个体已经变性的组织中促进组织再生的合适容积。本发明的方法对于施用药物组合物以治疗与失调，例如尿失禁、膀胱输尿管逆流或GERD相关的组织变性或缺陷是特别有用的。
本发明的方法一般包括通过例如注射或植入来对受试个体施用一种或多种本发明的组合物。当将自体同源的传代成纤维细胞、传代肌细胞(例如，自体同源的传代肌细胞)和填充剂的组合施用于受试个体时，可同时或分别地施用其组分。例如，自体同源的传代成纤维细胞可作为一次注射施用于受试个体，自体同源的传代肌细胞可作为单独的注射施用，以及填充剂物质可作为另一次注射施用。注射可以任何合适长的时间分开(例如，5分钟、30分钟、1天、3天、1周、2周或超过2周)。备选地，这些成分可在注射前组合。例如，包含自体同源的传代成纤维细胞、传代肌细胞和填充剂的组合物可通过单次注射施用。备选地，包含自体同源的传代成纤维细胞和传代肌细胞的混合物可作为一次注射剂施用，而填充剂可以单独地注射。
本发明的方法可用于治疗任何哺乳动物种属(例如，人、非人、灵长类、狗、牛、猪、马、羊、猫、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或沙鼠)。本发明的方法对治疗人是特别有用的。
本发明的方法可通过重新形成或修复尿道、输尿管和食道周围的组织(例如，括约肌结构)，因而减小异常宽松的内腔的大小而治疗尿失禁和/或膀胱输尿管逆流。这些方法包括将本发明的组合物放置(例如，注射或植入)入尿道、输尿管或食道周围的区域，或直接置入在待修复或增加的区域中建产的腔袋中。
男性尿道分为前列腺、膜状和阴茎区域。膜状区域是尿道最厚的部分，并且穿过泌尿生殖器的横隔。膜状尿道的骨骼肌层包含外部的(或随意的)泌尿括约肌，其几乎形成包围尿道的完全的环。本发明的方法可用于将包含自体同源的成纤维细胞的组合物施用于(例如，通过注射或植入尿道壁)患有尿失禁的受试个体以改善损伤或有缺陷的膜状尿道的功能。
女性尿道是很短的并且是测量为大约4cm长度的可膨胀管状结构。尿道从膀胱出口开始并且贯穿会阴膜、经过耻骨联合的后面并且终止于会阴部中的尿道外口。女性尿道表现了膀胱的整个括约肌机制。其内部由粘膜层覆盖并且其核心是由3个主要的肌肉层组成的强肌肉壁。中间层包含形成环的缩合的横纹肌纤维；如果这些肌纤维部分有缺陷可导致失禁。尿道的功能可由于尿道内或邻近器官例如，阴道和膀胱内的构造问题而改变或损伤。损伤或有缺陷的膜状尿道的功能可利用本发明的方法，施用(例如，通过注射或植入尿道壁)包含自体同源的成纤维细胞和任选地肌细胞(例如，自体同源的肌细胞)而改善。这种组合物可包含在稀释剂(例如，盐水)中、在包含可生物降解的填充剂物质的悬浮液中、或接种在可生物降解的非细胞基质中的细胞。
输尿管是在从肾运输尿到膀胱期间负责应答牵张反射的肌肉导管。远端输尿管进入膀胱的孔口被称为输尿管口，并且位于下层肌肉和称为膀胱三角的三角形结构侧面的膀胱壁的后侧平面。输尿管和膀胱三角的肌肉系统是连续的，因为输尿管的肌层穿过该导管并且在膀胱底面上扇形散开。膀胱内输尿管和插入表层三角的粘膜下层输尿管的内部纵向肌层的长度对于远端输尿管的正常功能是至关重要的。这些因素对于尿道口的形状是重要的，并且当孔口具有改变的形状时，就因此会增加孔口位置异常、膀胱内输尿管部分缩短和逆流的趋势。
改善尿道括约肌或输尿管肌肉系统的功能的方法可任选地，在局部或全身麻醉下进行。对于注射入输尿管结构，一般可在门诊患者基础上或甚至在办公室就诊期间进行膀胱镜检。可将膀胱镜导入尿道，以使得其头部位于离异常扩张的尿道/输尿管内腔适当的可视距离内。可在尿道周围或透过尿道进行注射。
为了治疗患有尿失禁的男性，可将任何合适规格和长度的针(例如，20号×35cm的针)导入膀胱镜的工作通道，从膨胀内腔到外部进入围绕尿道的组织。可将包含自体同源的成纤维细胞，有或没有肌细胞(例如，自体同源的肌细胞)的，和任选地，可生物降解的非细胞填充剂或基质的本发明组合物注射到尿道的环绕组织中直到实现所需要的内腔变窄。
为了治疗患有尿失禁的女性，可将任何合适规格和长度的针(例如，20号×30cm的针)插入尿道周围，以使得该针斜面向下对准并且根据膀胱镜的轴线以针放置的方向进入膀胱颈。在注射装入连接针的注射器中的细胞制剂前，可通过从膀胱镜视野观察对针进行温和运动而使针进入周围粘膜组织的理想针位。可在“3点钟和/或9点钟的位置”进行注射。内腔的变窄可通过膀胱镜连续监测直到完成注射。
为了治疗膀胱输尿管逆流，受试个体可处于背侧或改进的膀胱切石的体位，并且可将膀胱镜插入并进入直到可以看见输尿管。长度为大约25-40cm(例如，25cm、30cm、35cm、或40cm长)的针(例如，18号针、20号针，23号针、25号针，或27号针)可通过工作通道进入。将针尖插入膀胱粘膜，在直视为″6点钟的位置″下进入输尿管下的空间，离尿道口大约4-6mm远。通过将法式导管置入输尿管而便于适当地放置针。然后可邻近地插入针。缓慢地注射包含自体同源的成纤维细胞，有或没有肌细胞(例如，自体同源的肌细胞)的和任选地具有可生物降解的非细胞填充剂或基质的组合物，直到膨胀得几乎使尿道口闭塞。为了防止外渗，一般进行单个的精确注射，并且在退针前可保持针在原位2-3分钟。
食道是大约8英寸长的肌肉管道并且从咽延伸到胃。食道的上下末端都具有除吞咽期间外保持关闭的括约肌结构。食道下部括约肌(LES)的缺损可能容许胃含物返流入食道从而导致GERD。
为了改善LES的功能并且减轻GERD的症状，可将本发明的组合物置入(例如，注射或植入)LES或其附近的食道。使用内窥镜观察LES，并且将任何合适大小和长度的针(例如，附着于导管的23号×25cm的针，或23号×1.5cm的针)插入内窥镜的工作通道。以倾斜面朝内面向食道内腔，然后将针插入略接近LES的食道粘膜。将本发明的组合物以几个位置(例如，3点钟、6点钟、9点钟和12点钟的位置)注射到食道壁中，直到达到所要求的粘膜膨胀。
本发明也提供施用本发明的组合物，增加和/或修复表皮的、皮下的和筋膜组织的方法。将包含自体同源的传代成纤维细胞，有或没有传代肌细胞、基质成分、和/或填充剂的组合物注射或植入受试个体以治疗，例如疤痕、皮下脂肪丰富、皮肤松弛或皮肤变薄、皱纹、伤口(例如，急性的、慢性的、部分或完全的变厚伤口、灼伤、褥疮和溃疡)、乳房缺损、牙周病症、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜损伤、糖尿病、静脉停滞、疝气、关节的韧带、腱和肌肉的损伤以及allopecia。治疗这些病症的方法可包括，例如，将包含自体同源的传代成纤维细胞和传代肌细胞(例如；自体同源的传代肌细胞)的组合物注射到缺损或缺陷的部位，其中该细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质。
进一步在下面的实施例中描述本发明，该实施例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实施例实施例1-获得可注射的成纤维细胞悬浮液的方法皮成纤维细胞的培养是从皮肤的1-5mm完全厚度的活检标本开始的，如果可得到组织，也可用更厚的样品由于同种异体移植排斥现象，培养的成纤维细胞必须是与宿主组织相容的。通过从待治疗的受试个体获得活组织样品并且由此样品培养成纤维细胞而确保组织相容性。
在培养开始前，用抗生素和抗真菌剂(参见上面)重复洗涤活组织样品。除去表皮和皮下的含脂肪细胞的组织以便所得到的培养物基本上不含非成纤维细胞。用解剖刀或剪仔细粉碎剩余的皮肤样品。用钳子将组织的单独片块置于T-25组织培养瓶的干燥表面上并且容许附着2-5分钟，或根据组织和实验室和培养通风柜的温度附着所需要的时间。缓慢并小心地加入少量培养基(通常为1.5-2ml)，以免移动附着的组织碎片。培养48-72小时后，向培养瓶补充包含标准抗生素的附加培养基。细胞在具有抗生素的培养基中维持细胞14天，然后从此点开始在含有庆大霉素的无抗生素培养基中孵育。
早期培养期间，需要保持组织碎片附着于培养瓶的底部；将移除的碎片再置入新的培养瓶中。通过短暂的暴露于胰蛋白酶/EDTA刺激成纤维细胞生长。该暴露很短暂不至于细胞从其附着物上释放下来。该过程容许细胞更均匀的分布在培养瓶表面，并且促进更快速的增殖汇合。建立培养物并且接近汇合后，立即将成纤维细胞的样品移出冷藏。由于人成纤维细胞的传代数目一般是有限的，早期传代成纤维细胞的贮存是优选的。冷冻培养基一般包含7-10％的DMSO和20％的自体同源的血清或FBS，尽管细胞也可在甘油或90％血清中冷冻。
一旦细胞汇合，通过胰酶消化将其传代入新的培养瓶。对于扩增，单独的培养瓶以1∶3分入总的培养面积为450cm2的三重底的T-150培养瓶。这些培养瓶接种大约6×106个细胞并产生大约1.8×107个细胞。当达到培养瓶的容积(一般在培养7-10天后)，用无血清的完全培养基替换生长培养基。其后细胞于37℃，在无蛋白质的培养基中培养至少2小时(一般超过12小时)。无血清培养基中的培养本上从细胞除去了来源于胎牛血清的蛋白质，该蛋白质如果存在，可能在受试个体中是免疫原性的并且将引起变态反应。
无血清培养基中的培养结束时，通过胰蛋白酶/EDTA从组织培养瓶移出细胞，经离心和重悬浮充分洗涤，并且悬浮在等体积的可注射等渗盐水中用于注射。5-10个生长到容积的三重底T-150培养瓶，产生大约3×107-1×108个细胞，足够制成大约1-3ml的悬浮液。
备选地，细胞可在4℃运输，只要在悬浮液制得时间的18小时内注射。细胞悬浮在缺乏酚红pH指示剂并且用受试个体血清置换FBS的等体积的完全培养基中。吸出细胞并且在运送培养基中注射。其中细胞悬浮的盐水或运送培养基的体积是不重要的。
实施例2-获得可注射细胞群的粘稠悬浮液的方法当需要大量的增加容积的物质时，使用制备可注射的细胞悬浮液的备选方法。该方法与实施例1中所描述的方法相同，直到获得大约106个细胞的群体。然后通过加入1ml的受试个体的血浆和50-100μl的300mM CaCl2，在60mm或100mm的组织培养皿的底部形成血浆凝块。将培养的皮成纤维细胞(2-10ml中的106个细胞)接种到凝块的表面上并且进一步在完全培养基中培养7天。7天后，将完全培养基换成无血清培养基。开始培养基置换1小时后，再次除去培养基，用新鲜的无血清培养基替换。另外培养细胞14-18小时。然后将凝块吸入注射器并且按照需要注射。
实施例3获得肌细胞的可注射悬浮液的方法进行肌肉活组织检查以收集大约0.5-1.0cm3大小的样品，如此获得大约0.5-1g的组织。通过在Ham’s F10培养基中温和搅拌分离组织，用钳子除去任何明显结缔或脂肪组织。剩余的组织样品转入100mm皿中的5ml胰蛋白酶中，并且使用无菌刀片将组织切碎成不大于1mm3的块。然后将切碎的悬浮液转入包含搅动棒的无菌培养瓶，并且加入胰蛋白酶/EDTA至终体积为20-25ml。在37℃温和搅拌悬浮液20分钟。一旦组织块沉淀到培养瓶底部，轻轻倒出上清液到置于冰上的50ml塑料离心管中。为了中和胰蛋白酶，加入FBS至终浓度为10％。重复胰酶消化步骤最多3次，或直到没有粉色组织块残留。上清液在800-900g离心5分钟。
在10ml 1∶1的人肌肉生长培养基/条件培养基(HuGM/CM)中混合细胞沉淀。HuGM包含Ham’s F10、10％FBS、5％小牛血清(成分明确并且补充有铁；Hyclone，Logan，UT)、0.5％鸡胚浸液(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。CM是以与MRC-5(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)成纤维细胞培养过夜，然后用0.45μgl滤器过滤而条件化的HuGM。每0.1g的组织一般产生5×103个细胞。
细胞接种在任何合适大小的组织培养平板(例如，35mm、60mm、或100mm)中，并且如果细胞是30-40％汇合的，在第1或2天用1∶1的HuGM/CM培养。否则，当细胞达到40％汇合时或在第4或5天(无论哪个更快)用1∶1的HuGM/CM培养细胞。然后每隔2-3天细胞用HuGM培养，除非它们是小于40％汇合的，在这种情况下，用1∶1的HuGM/CM培养。当细胞达到70-80％汇合时，它们受到胰酶消化，分散在HuGM中，并且以每皿10ml HuGM中5-10×105个细胞接种到新鲜的100mm皿中。传代培养后一般皿是大约20％汇合的。扩增细胞并且传代培养直到获得合适的数目。
冷冻肌细胞备用。胰蛋白酶消化细胞并且收集入15ml的试管。细胞数目利用血细胞计数器确定，并且在800-900g离心细胞2分钟。吸出培养基并将细胞重悬于冷冻培养基中(90％小牛血清，10％二甲亚砜)达到大约2×106个细胞/ml。细胞悬液等分为每2ml的低温冷冻小瓶中0.5ml，并且在转入液氮前小瓶在泡沫填充箱中于-70℃冷冻。
其他的实施方案可以理解已经结合其发明详述描述本发明，上述说明书是用于说明而非限制本发明范围的，其由所附的权利要求定义范围。其他的方面、优势和改变是在下列权利要求的范围之内的。
权利要求
1.用于修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调、或缺陷而变性的组织的组合物，其中所述的组合物包括自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞，其中所述的组合物基本上不含培养基血清来源的蛋白质。
2.权利要求1的组合物，其中所述的疾病、失调或缺陷与尿失禁、膀胱输尿管逆流、或胃食管逆流相关。
3.权利要求1的组合物，其中所述的自体同源的成纤维细胞来源于所述受试个体的齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓，或脂肪组织。
4.权利要求1的组合物，其中所述的自体同源的肌细胞是横纹肌细胞。
5.权利要求4的组合物，其中所述的横纹肌细胞来自于所述受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌或胸锁乳突肌。
6.权利要求1的组合物，其中所述的自体同源的肌细胞是平滑肌细胞。
7.权利要求1的组合物，其中所述的组合物进一步包括可生物降解的非细胞基质，其中所述的成纤维细胞和肌细胞整合在所述的基质内和基质上。
8.权利要求7的组合物，其中所述的基质在与所述的成纤维细胞和肌细胞组合前，包括一种或多种选自胶原、糖胺多糖、白明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿骨、羟基磷灰石和非有机骨的物质。
9.权利要求8的组合物，其中所述的一种或多种物质包括与戊二醛交联的胶原和糖胺多糖。
10.权利要求8的组合物，其中所述的一种或多种物质是胶原。
11.权利要求10的组合物，其中所述的胶原是牛胶原。
12.权利要求10的组合物，其中所述的胶原是猪胶原I型或猪胶原III型。
13.权利要求8的组合物，其中所述的一种或多种物质选自白明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿骨和羟基磷灰石。
14.权利要求13的组合物，其中所述的一种或多种物质选自白明胶、聚乙醇酸和肠线。
15.权利要求7的组合物，其中足够的成纤维细胞和肌细胞结合在所述的基质上和基质内，以基本上充满所述基质上和基质内细胞可占据的空间。
16.制备用于修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调或缺陷而变性的组织的组合物的方法，所述方法包括(a)提供来自所述受试个体的包含成纤维细胞的组织的活组织样品；(b)从所述的活组织样品分离自体同源的成纤维细胞；(c)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的自体同源的成纤维细胞的条件下培养所述的自体同源的成纤维细胞；(d)将所述培养的自体同源的成纤维细胞暴露于导致所述成纤维细胞悬浮的条件；(e)提供来自所述受试个体的肌肉组织的活组织样品；(f)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的肌细胞的条件下，培养从所述的肌肉组织分离的自体同源的肌细胞；(g)将所述培养的自体同源的肌细胞暴露于导致所述肌细胞悬浮的条件；以及(h)将所述的成纤维细胞与所述的肌细胞组合。
17.权利要求16的方法，其中所述的疾病、失调或缺陷与尿失禁、膀胱输尿管逆流、或胃食管逆流相关。
18.权利要求16的方法，其中包含成纤维细胞的组织选自齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓和脂肪组织。
19.权利要求16的方法，其中所述的肌肉组织选自舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌和胸锁乳突肌。
20.权利要求16的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养包括(1)在含有0.1％-大约20％之间的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。
21.权利要求16的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养包括在无血清的培养基中培养。
22.权利要求16的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养是在包括一种或多种防止支原体生长的试剂的培养基中。
23.权利要求22的方法，其中所述的一种或多种试剂包括泰洛星。
24.权利要求23的方法，其中所述的一种或多种试剂进一步包括一种或多种选自庆大霉素、环丙氟哌酸、阿拉沙星、阿奇霉素和四环素的化合物。
25.权利要求16的方法，其中所述导致所述成纤维细胞或肌细胞悬浮的条件包括蛋白水解酶。
26.制备用于修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调或缺陷而变性的组织的组合物的方法，其中所述方法包括(a)提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞(b)提供可生物降解的非细胞基质；以及(c)将所述的可生物降解的非细胞基质和所述的成纤维细胞和肌细胞一起培养，以使得所述的成纤维细胞和肌细胞结合在所述的可生物降解的非细胞基质上和基质内，其中所述的培养产生用于修复组织的组合物，并且其中所述培养的条件使得所述组合物基本上不含培养基血清来源的蛋白质。
27.权利要求26的方法，其中所述的疾病、失调或缺陷与尿失禁、膀胱输尿管逆流、或胃食管逆流相关。
28.权利要求26的方法，其中提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞的步骤包括(a)提供来自所述受试个体的包含成纤维细胞的组织的活组织样品；(b)从所述的活组织样品分离自体同源的成纤维细胞；(c)培养所述的成纤维细胞；(d)悬浮所述的成纤维细胞；(e)提供来自所述受试个体的肌肉组织的活组织样品；(f)从所述的肌肉组织分离肌细胞；(g)培养所述的肌细胞；以及(h)悬浮所述的肌细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述的包含成纤维细胞的组织选自齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓和脂肪组织。
30.权利要求28的方法，其中所述的肌肉组织选自舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌和胸锁乳突肌。
31.权利要求28的方法，其中所述成纤维细胞和所述肌细胞的所述培养是在包括防止支原体生长的试剂的培养基中。
32.权利要求31的方法，其中所述的试剂包括泰洛星。
33.权利要求32的方法，其中所述的试剂进一步包括一种或多种选自庆大霉素、环丙氟哌酸、阿拉沙星、阿奇霉素和四环素的化合物。
34.权利要求26的方法，其中所述的可生物降解的非细胞基质在与所述成纤维细胞和所述肌细胞的所述悬浮液组合前，包括一种或多种选自胶原、糖胺多糖、白明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿骨、羟基磷灰石和非有机骨的物质。
35.权利要求34的方法，其中所述的一种或多种物质包括与戊二醛交联的胶原和糖胺多糖。
36.权利要求34的方法，其中所述的一种或多种物质选自白明胶、聚乙醇酸、肠线、脱矿骨和羟基磷灰石。
37.权利要求36的方法，其中所述的一种或多种物质选自白明胶、聚乙醇酸和肠线。
38.权利要求34的方法，其中所述的一种或多种物质是胶原。
39.权利要求38的方法，其中所述的胶原是牛胶原。
40.权利要求38的方法，其中所述的胶原是猪胶原I型或猪胶原III型。
41.权利要求26的方法，其中所述的成纤维细胞和所述的肌细胞是在所述的培养前组合的。
42.权利要求26的方法，其中所述的成纤维细胞和所述的肌细胞是分别加入所述培养中的。
43.权利要求26的方法，其中所述的培养包括(1)在含有0.1％-大约20％之间的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。
44.权利要求26的方法，其中所述的培养包括在无血清的培养基中培养。
45.权利要求26的方法，其中足够的成纤维细胞和肌细胞结合在所述可生物降解的非细胞基质上和基质内，以基本上充满所述可生物降解的基质上和基质内细胞可占据的空间。
46.用于修复受试个体中组织的方法，其中所述的方法包括(a)提供权利要求7的组合物；(b)确定所述受试个体中组织缺陷或组织变性的部位；以及(c)将所述的组合物置于所述的部位以修复所述的组织缺陷或变性。
47.权利要求46的方法，其中所述的组织缺陷或组织变性导致尿失禁、膀胱输尿管逆流、或胃食管逆流。
48.权利要求46的方法，其中所述的自体同源的成纤维细胞来源于所述受试个体的齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓，或脂肪组织。
49.权利要求46的方法，其中所述的自体同源的肌细胞来自于所述受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌或胸锁乳突肌。
50.用于修复受试个体中组织缺陷的方法，其中所述的方法包括(a)提供药物组合物，其包括(1)自体同源的传代成纤维细胞，(2)自体同源的传代肌细胞，和(3)其药物学上可接受的载体；其中所述的药物组合物基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(b)确定所述受试个体中与选自尿失禁、膀胱输尿管逆流和胃食管逆流的失调相关的组织缺陷或组织变性的部位；(c)将治疗有效量的所述药物组合物注射到邻近所述组织缺陷或变性的部位，其中所述的注射导致所述组织缺陷或变性的修复。
51.权利要求50的方法，其中提供药物组合物的步骤包括(a)提供来自所述受试个体的包含成纤维细胞的组织的活组织样品；(b)从所述的活组织样品分离成纤维细胞，以提供基本上不含细胞外基质和非成纤维细胞的成纤维细胞；(c)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下培养所述的成纤维细胞；(d)将所述的传代成纤维细胞暴露于导致所述成纤维细胞悬浮的条件；(e)提供来自所述受试个体的肌肉组织活组织样品；(f)从所述的肌肉组织分离肌细胞；(g)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的肌细胞的条件下培养所述的肌细胞；(h)将所述肌细胞暴露于导致所述肌细胞悬浮的条件；以及(i)将所述的成纤维细胞悬浮液与所述的肌细胞悬浮液和药物学上可接受的载体组合以形成所述的药物组合物。
52.权利要求51的方法，其中所述的包含成纤维细胞的组织选自齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓和脂肪组织。
53.权利要求51的方法，其中所述的肌肉组织选自舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌和胸锁乳突肌。
54.权利要求51的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养包括(1)在含有0.1％-大约20％之间的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。
55.权利要求51的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养包括在无血清的培养基中培养。
56.权利要求51的方法，其中所述导致所述成纤维细胞或肌细胞悬浮的条件包括蛋白水解酶。
57.权利要求50的方法，其中所述的注射包括将一定体积的所述药物组合物注射到所述受试个体的尿道或邻近尿道的组织内，以使得尿道内腔被压缩。
58.权利要求50的方法，其中所述的注射包括将一定体积的所述药物组合物注射到所述受试个体的邻近输尿管口的组织内，以使得所述的口被压缩。
59.权利要求50的方法，其中所述的注射包括将一定体积的所述药物组合物注射到所述受试个体的邻近食道下部括约肌的组织内，以使得食管被压缩。
60.用于修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调或缺陷而变性的组织的可注射组合物，所述的可注射组合物包括(a)自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞，其中所述的成纤维细胞和所述的肌细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；和(b)可生物降解的非细胞的可注射填充剂。
61.权利要求60的可注射组合物，其中所述的自体同源的成纤维细胞来源于所述受试个体的齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓，或脂肪组织。
62.权利要求60的可注射组合物，其中所述的自体同源的肌细胞来自于所述受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌或胸锁乳突肌。
63.权利要求60的可注射组合物，其中所述可生物降解的非细胞的可注射填充剂，在与所述的成纤维细胞和肌细胞组合前，包括一种或多种选自下列的物质(a)自体同源的胶原纤维的可注射分散物；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；以及(f)分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸和来自所述受试个体的等分血浆。
64.权利要求63的可注射组合物，其中所述的一种或多种物质包括自体同源的胶原纤维的可注射分散系。
65.权利要求64的可注射组合物，其中在所述的可注射分散系中的所述自体同源的胶原纤维的浓度是至少24mg/ml。
66.权利要求63的可注射组合物，其中所述的一种或多种物质包括胶原。
67.权利要求66的可注射组合物，其中所述的胶原是牛胶原。
68.权利要求66的可注射组合物，其中所述的胶原包括与戊二醛交联的重新构成的牛胶原纤维。
69.权利要求63的可注射组合物，其中所述的一种或多种物质选自溶解的白明胶、溶解的聚乙醇酸和溶解的肠线。
70.权利要求63的可注射组合物，其中所述的一种或多种物质包括分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸和来自所述受试个体的等分血浆。
71.权利要求70的可注射组合物，其中所述的氯化钠溶液和所述的等分血清的比率是1∶1的体积比。
72.权利要求71的可注射组合物，其中所述的氯化钠溶液包括0.9％体积的氯化钠。
73.制备用于修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调或缺陷而变性的组织的可注射组合物的方法，其中所述方法包括(a)提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞，其中所述的成纤维细胞和所述的肌细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(b)提供可生物降解的非细胞填充剂；以及(c)将所述的自体同源的传代成纤维细胞、所述的自体同源的传代肌细胞和所述的可生物降解的非细胞填充剂相组合。
74.权利要求73的方法，其中所述的疾病、失调或缺陷与尿失禁、膀胱输尿管逆流、或胃食管逆流相关。
75.权利要求73的方法，其中所述的疾病、失调或缺陷包括口腔粘膜缺陷、口腔粘膜损伤、牙周病、糖尿病、皮肤溃疡、静脉停滞、皮肤疤痕、或皮肤皱纹。
76.权利要求73的方法，其中提供自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞的步骤包括(a)提供来自所述受试个体的包含成纤维细胞的组织的活组织样品；(b)从所述的活组织样品分离自体同源的成纤维细胞；(c)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的成纤维细胞的条件下，培养所述的自体同源的成纤维细胞；(d)将所述培养的自体同源的成纤维细胞暴露于导致所述成纤维细胞悬浮的条件；(e)提供来自所述受试个体的肌肉组织的活组织样品；(f)从所述的肌肉组织活组织样品分离肌细胞；(g)在产生基本上不含培养基血清来源的蛋白质的肌细胞的条件下，培养所述的肌细胞；以及(h)将所述肌细胞暴露于导致所述肌细胞悬浮的条件。
77.权利要求76的方法，其中所述的包含成纤维细胞的组织选自齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓和脂肪组织。
78.权利要求76的方法，其中所述的肌肉组织包括提供来自舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌和胸锁乳突肌的活组织样品。
79.权利要求76的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养包括(1)在包括0.1％-大约20％之间的人或非人血清的培养基中培养，然后(2)在无血清的培养基中培养。
80.权利要求76的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养包括在无血清的培养基中培养。
81.权利要求76的方法，其中所述成纤维细胞或所述肌细胞的所述培养是在包含防止支原体生长的试剂的培养基中。
82.权利要求81的方法，其中所述的试剂包括泰洛星。
83.权利要求82的方法，其中所述的试剂进一步包括一种或多种选自庆大霉素、环丙氟哌酸、阿拉沙星、阿奇霉素和四环素的化合物。
84.权利要求76的方法，其中所述导致所述成纤维细胞或肌细胞悬浮的条件包括蛋白水解酶。
85.权利要求73的方法，其中所述的可生物降解的非细胞填充剂，在与所述的成纤维细胞和所述的肌细胞组合前，包括一种或多种选自下列的物质，(a)自体同源的胶原纤维的可注射分散物；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；以及(f)分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸和来自所述受试个体的等分血浆。
86.权利要求85的方法，其中所述的一种或多种物质包括自体同源的胶原纤维的可注射分散系。
87.权利要求86的方法，其中在所述的可注射分散系中的所述自体同源的胶原纤维的浓度是至少24mg/ml。
88.权利要求85的方法，其中所述的一种或多种物质包括胶原。
89.权利要求88的方法，其中所述的胶原是牛胶原。
90.权利要求88的方法，其中所述的胶原包括与戊二醛交联的重新构成的牛胶原纤维。
91.权利要求85的方法，其中所述的一种或多种物质选自溶解的白明胶、溶解的聚乙醇酸和溶解的肠线。
92.权利要求85的方法，其中所述的一种或多种物质包括分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸以及来自所述受试个体的等分血浆。
93.权利要求92的方法，其中所述的氯化钠溶液和所述的等分血清的比率是1∶1的体积比。
94.权利要求93的方法，其中所述的氯化钠溶液包括0.9％体积的氯化钠。
95.用于修复由于受试个体的疾病、失调或缺陷导致的受试个体中已经变性的组织的方法，所述的方法包括将有效量的权利要求60的组合物注射到所述受试个体的所述变性部位以修复所述的组织。
96.权利要求95的方法，其中所述的注射包括将一定体积的所述组合物注射到所述受试个体的尿道或邻近尿道的组织内，以使得尿道内腔被压缩。
97.权利要求95的方法，其中所述的注射包括将一定体积的所述组合物注射到所述受试个体的邻近输尿管口的组织内，以使得所述的口被压缩。
98.权利要求95的方法，其中所述的注射包括将一定体积的所述组合物注射到所述受试个体的邻近食道下部括约肌的组织内，以使得食管被压缩。
99.权利要求95的方法，其中所述的可生物降解的非细胞的可注射填充剂，在与所述的成纤维细胞和所述的肌细胞组合前，包括一种或多种选自下列的物质(a)自体同源的胶原纤维的可注射分散系；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；以及(f)分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸和来自所述受试个体的等分血浆。
100.权利要求99的方法，其中所述的一种或多种物质包括胶原。
101.权利要求100的方法，其中所述的胶原是牛胶原。
102.修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调或缺陷而变性的组织的方法，所述的方法包括步骤(a)将自体同源的传代成纤维细胞注射到受试个体的组织变性部位中，其中所述的成纤维细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；(b)将自体同源的传代肌细胞注射到受试个体的组织缺陷或需要组织增生的部位中，其中所述的肌细胞基本上不含培养基血清来源的蛋白质；以及(c)将可生物降解的非细胞填充剂注射到部位中，其中所述的填充剂基本上不含培养基血清来源的蛋白质。
103.权利要求102的方法，其中所述注射步骤(a)-(c)的每一步包括注射到所述受试个体的尿道或邻近尿道的组织，其中所述的方法导致尿道内腔的压缩。
104.权利要求102的方法，其中所述注射步骤(a)-(c)的每一步包括注射到所述受试个体的邻近输尿管口的组织，其中所述的方法导致所述口的压缩。
105.权利要求102的方法，其中所述注射步骤(a)-(c)的每一步包括注射到所述受试个体的邻近食道下部括约肌的组织，其中所述的方法导致食管的压缩。
106.权利要求102的方法，其中所述的疾病、失调或缺陷包括口腔粘膜缺陷、口腔粘膜损伤、牙周病、糖尿病、皮肤溃疡、静脉停滞、皮肤疤痕、或皮肤皱纹。
107.权利要求102的方法，其中所述的自体同源的成纤维细胞来源于所述受试个体的齿龈、上颚、皮肤、固有层、结缔组织、骨髓，或脂肪组织。
108.权利要求102的方法，其中所述的自体同源的肌细胞来自于所述受试个体的舌、舌腭肌、颞肌、比目鱼肌、腓肠肌或胸锁乳突肌。
109.权利要求102的方法，其中所述的成纤维细胞和所述的肌细胞是同时注射的。
110.权利要求102的方法，其中所述的成纤维细胞，所述的肌细胞和所述的可生物降解的非细胞填充剂是同时注射的。
111.权利要求102的方法，其中所述的成纤维细胞和肌细胞是分别注射的。
112.权利要求102的方法，其中所述的成纤维细胞和所述的肌细胞是与所述的可生物降解的非细胞填充剂分别注射的。
113.权利要求112的方法，其中注射所述成纤维细胞和所述肌细胞到所述受试个体中与注射所述可生物降解的非细胞填充剂到所述受试个体之间的持续期间是大约2周。
114.权利要求102的方法，其中所述的可生物降解的非细胞填充剂，在与所述的成纤维细胞和所述的肌细胞组合前，包括一种或多种选自下列的物质(a)自体同源的胶原纤维的可注射分散系；(b)胶原；(c)溶解的白明胶；(d)溶解的聚乙醇酸；(e)溶解的肠线；以及(f)分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸和来自所述受试个体的等分血浆。
115.权利要求114的方法，其中所述的一种或多种物质包括自体同源的胶原纤维的可注射分散系。
116.权利要求115的方法，其中在所述的可注射分散系中的所述自体同源的胶原纤维的浓度是至少24mg/ml。
117.权利要求114的方法，其中所述的一种或多种物质包括胶原。
118.权利要求117的方法，其中所述的胶原是牛胶原。
119.权利要求117的方法，其中所述的胶原包括与戊二醛交联的重新构成的牛胶原纤维。
120.权利要求114的方法，其中所述的一种或多种物质选自溶解的白明胶、聚乙醇酸和肠线。
121.权利要求114的方法，其中所述的一种或多种物质包括分散在氯化钠溶液中的猪白明胶粉和氨基己酸和来自所述受试个体的等分血浆。
122.权利要求121的方法，其中所述的氯化钠溶液和所述的等分血清的比率是1∶1的体积比。
123.权利要求122的方法，其中所述的氯化钠溶液包括0.9％体积的氯化钠。
124.权利要求102的方法，其中自体同源的传代成纤维细胞和自体同源的传代肌细胞与可生物降解的非细胞填充剂的比率是大约1∶1的体积比。
125.用于修复受试个体中由于所述受试个体的疾病、失调或缺陷而变性的组织的装置，所述的装置包括(a)具有注射腔、配置其中的活塞、和与所述腔相通的孔口的皮下注射器；和(b)包括自体同源的传代成纤维细胞、自体同源的传代肌细胞和药物学上可接受载体的悬浮液，其中所述的悬浮液基本上不含培养基血清来源的蛋白质，并且其中所述的悬浮液配置在所述腔内。
全文摘要
本发明提供包含自体同源的传代成纤维细胞和任选的，自体同源的传代肌肉细胞，可生物降解的非细胞基质成分，和/或可生物降解的非细胞填充剂的组合物。本发明还提供制备该组合物的方法，以及用于施用该组合物以治疗例如尿失禁、膀胱输尿管逆流和胃食管逆流等病症的装置和方法。
文档编号A61K31/715GK1668732SQ03816329
公开日2005年9月14日 申请日期2003年4月22日 优先权日2002年5月10日
发明者O·马科, W·K·小波斯 申请人:埃索拉根技术有限公司