专利名称：一种缓释生长因子的无细胞基质材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种无细胞基质材料技术领域，具体地说，是关于一种缓释生长因子的无细胞基质材料。
背景技术：
膀胱替代的临床病例很多，但膀胱替代一直是泌尿科医生的难题，其中的关键因素是缺乏合适的膀胱替代材料。本发明人研发组和其他很多研究小组已经明确膀胱无细胞基质(bladder acellular matrix allograft，BAMA)可以作为支架允许膀胱再生，但存在明显的挛缩。中国专利申请号200810020808. 0公开了一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法。但是关于可以长期、平稳缓释生长因子的膀胱无细胞基质，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种缓释生长因子的无细胞基质材料。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种缓释生长因子的无细胞基质材料，所述的材料由可降解疏水聚合物，血管再生的生长因子和无细胞基质组成。所述的无细胞基质是指膀胱无细胞基质、真皮无细胞基质或血管无细胞基质。所述的血管再生的生长因子是指VEGF或bFGF。所述的可降解疏水聚合物是指聚乙交酯丙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)或聚(丙交酯-乙交酯-己内酯)。所述的缓释生长因子的无细胞基质材料是由双乳化溶剂蒸发方法制备得到，双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间1-10分钟，乳化速率1-6千转/分钟，有机相-外水相体积比 0. 1-0. 8。所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间优选为5. 5。所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化速率优选为6。所述的双乳化溶剂蒸发方法中有机相-外水相体积比优选为0. 45。所述的材料是采用25%的F127溶液制备得到的纳米凝胶材料。所述的纳米凝胶材料的凝胶、溶胶转变温度为20°C。本发明优点在于
1、本发明的缓释生长因子的无细胞基质材料采用生物可降解型聚合物制备，可以实现血管再生的生长因子的长效缓释。2、本发明将液状的纳米缓释系统转换为具有溶胶-凝胶转变特性的F127嵌段聚合物溶液，得到温敏纳米凝胶体系热敏凝胶可防止嵌入猪膀胱无细胞基质的纳米粒子溢出，使血管再生的生长因子实现在基质内的长效释放，同时凝胶可加强纳米粒子的缓释效果，延长血管再生的生长因子在基质内的作用时间，为缺损膀胱组织的再构建提供长效的生长因子供应。3、本发明将纳米缓释系统成功地复合到膀胱无细胞基质中，缓释出的生长因子仍有效保持其生物学特性，缓释过程长且平稳。本发明得到了可以长期、平稳缓释生长因子的膀胱无细胞基质，完成了对膀胱无细胞基质的生长因子修饰。4、本发明深入研究了纳米粒子制备各环节的关键影响因素对纳米粒子粒径、包封率、粒子多分散性能的影响，优选出载蛋白纳米粒子的最佳配方和制备参数。
图1 单纯的纳米粒子的扫描电镜照片。图2 包被在F127凝胶中的纳米粒子的扫描电镜照片。图3 不同浓度的Pluronic F127的温敏行为转变的温度点。图4 纳米粒子一F127的溶胶一凝胶转变行为。A，15°C时纳米粒子(50mg/ml)溶于20% (左)、25% (右)F127中，处于溶液状态；B，20°C时纳米粒子(50mg/ml)溶于20% (左) F127中，仍为溶液状态；溶于25% (右)F127中，转变为溶胶状态；C，全厚层猪膀胱无细胞基质；D，VEGF-NPs (纳米粒子)-F127多点序贯性注入膀胱无细胞基质后。图5 裸鼠体内温敏行为的荧光检测(a)量子点一纳米粒子一F127溶胶注射在裸鼠皮下；(b)量子点一纳米粒子溶液注射在裸鼠皮下；(c)量子点生理盐水溶液注射于裸鼠皮下。量子点使用剂量均为ang/kg。图 6 在 10 ng/ml VEGF、20 ng/ml VEGF 以及含 10 ng/ml VEGF 的纳米介质(VEGF in NPs),20 ng/ml VEGF的纳米介质(VEGF in NPs)刺激下，人脐血管内皮细胞培养1—— 5天的增殖情况，设无VEGF的纳米介质(NL-NPs)和无血清培养基(Control)为阴性对照。 X轴为培养天数，Y轴为与无血清培养基相比的增殖倍数。*表示P<0.05，**表示P<0.01。图7 =PLGA纳米粒子在PBS溶液(PH7. 4、37°C)中的时间——VEGF缓释百分比曲线。图中 Released from F127 gel 从 F127 中缓释 VEGF，Released from NPs:从纳米粒子中缓释，Released from包被在膀胱无细胞基质中的NPs—F127凝胶中缓释。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1 实验材料
Pluronic F127 (聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段聚合物)
Tween 80 (聚山梨酯80) 聚乙烯醇(PVA) (Mw 14-16 kDa)
乙交酯丙交酯共聚物(PLGA，乙交酯丙交酯比例50:50，购自济南岱罡生物材料公司)
ThVEGF165 (购自 P印rotech 公司)
rhVEGF ELISA试剂盒(购自P印rotech公司)其余试剂未特殊说明均购自Sigma-Aldrich公司。(一)纳米粒子的制备优化及表征评价纳米粒子制备方法
采用双乳化溶剂蒸发技术制备载VEGF的PLGA纳米粒。具体为精密称取20mgPLGA (50:50)，溶于体积二氯甲烷中作为有机相；将VEGF、HAS、Hp (1:500:1)溶于100μ 1、ρΗ值为7. 4的磷酸盐缓冲溶液中作为内水相；将有机相注入内水相中，使用高速剪切机在3krpm 转速下勻化anin得初乳(W1/0)；新鲜配制1. 5%PVA和2%Tween80水溶液作为外水相，将初乳加入外水相中，使用高速剪切机勻化后得复乳(Wl/O/W》，迅速将复乳转移至旋转蒸发器中，室温下将有机溶剂蒸发，溶液中乳滴收缩，在表面效应下形成球形纳米粒子；将纳米粒子分散液旋转搅拌，固化后经高速冷冻离心后分离，加入超纯水洗涤、重新分散纳米粒子， 共洗涤3次，分散后加入适量甘露醇冷冻干燥，得纳米粒子冻干粉。预实验表明，纳米粒子粒径、多分散性和载药率为控制纳米粒子药物释放的关键指标。一般聚合物材料用量越多，纳米粒子粒径越大，因此为保证均一性，研究中每个优化配方统一使用等量聚合物材料；外水相中表面活性剂的种类与用量，也是影响纳米粒子制备的关键因素，一般用量越少纳米粒子粒径越大，但用量过多会造成溶液粘稠，并且使过多表面活性剂残留在纳米粒子中，因此研究统一采用1. 5%PVA和2%Tween80水溶液作为外水相。除聚合物材料及表面活性剂因素外，研究发现有机相与外水相体积比、复乳制备时的勻化速度和时间为控制关键指标的关键因素，因此着重考察这三项因素对纳米粒子粒径、多分散性和载药率的影响。实验阵列安排见表1.
为直观考察纳米凝胶温敏行为及生物体相容性，制备了载有CdTe量子点荧光探针(激发波长400nm，发射波长590nm)的纳米粒。制备方法为将量子点加入内水相溶液中替代蛋白药物，按上述方法制备。同时制备不含VEGF或量子点的纳米粒为对照备用。纳米粒子在超纯水中重新分散，加入到嵌段聚合物F127，搅拌使溶解，使F127浓度至25%，得纳米粒子温敏凝胶-溶胶体系。纳米粒子蛋白包封率的测定
取刚制备好的纳米粒子PVA、Tween80分散液，定溶后在20，000 X g, 4°C，10 min条件下离心，弃去沉淀，BCA法测定上清液中的蛋白总量，同时测定制备纳米粒子加入的蛋白总量，按以下公式计算纳米粒子包封率包封率(％)=[(总蛋白量-上清液中蛋白量)]/总蛋白量X 100%。结果与讨论
很多可变因素会对纳米粒子的制备造成影响，有些关键因素会对载药纳米粒子的关键考核指标造成巨大影响。通常情况下，纳米粒子的粒径、多分散性、对药物的包封率被认为是影响纳米粒子形态及药物释放的关键指标粒径越大，纳米粒子的质地越疏松，药物释放就越快；多分散性越好，纳米粒子的形态就越均一，越容易得到均一的药物释放；提高对药物的包封率，可避免药物，特别是昂贵药物在载药纳米粒子制备过程中的浪费。研究采用双乳化-溶剂蒸发法制备载蛋白的纳米粒子，选用纳米粒子粒径、多分散性和对药物的包封率作为控制制备过程的关键指标。预实验中发现，二次乳化过程为载蛋白纳米粒子制备过程的关键，由此设计实验阵列，对二次乳化过程中的三个关键影响因素有机相-外水相体积比、乳化速度、乳化时间进行考察，通过优化以上三个关键因素，得到较为理想的载蛋白纳米粒子。表1所示为载蛋白纳米粒子制备实验阵列安排，激光动态光散射法测定结果表明，各配方纳米粒子粒径从观0. 8 nm到2503. 5 nm，其中配方1所制备的纳米粒子粒径最小(280. 8)，配方12所制备的纳米粒子粒径最大(2503. 5);多分散系数测定结果表明，配方 2制备的纳米粒子多分散系数最小(0.观6)，配方6多分散系数最大(0. 806);对蛋白的包封率配方1最小(35. 29士0. 07%)，配方8最大(55. 88士0. 10)。表1提示，增加乳液制备时的勻化速度可减小纳米粒子粒径，但过高的勻化速度会降低纳米粒子对蛋白的包封率，综合考虑，兼顾粒径、多分散性及包封率，配方5为较优配方。表1 载蛋白纳米粒子制备时相关变量的实验阵列。
注X1 乳化时间，X2 乳化速率，X3 有机相-外水相体积比，aZ_Ave (nm)粒径大小，E.E.包封率。纳米粒子形貌及粒径表征观察
通过kiss Ultra 55型扫描电子显微镜观察纳米粒子的形貌。样品制备方法将上述制备的纳米粒子冻干粉，加入超纯水重新分散，直接滴在导电硅片上自然干燥，然后转入干
权利要求
1.一种缓释生长因子的无细胞基质材料，其特征在于所述的材料由可降解疏水聚合物，血管再生的生长因子和无细胞基质组成。
2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于所述的无细胞基质是指膀胱无细胞基质、 真皮无细胞基质或血管无细胞基质。
3.根据权利要求1所述的材料，其特征在于所述的血管再生的生长因子是指VEGF或 bFGFo
4.根据权利要求1所述的材料，其特征在于所述的可降解疏水聚合物是指聚乙交酯丙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)或聚(丙交酯-乙交酯-己内酯)。
5.根据权利要求1-4任一所述的材料，其特征在于所述的缓释生长因子的无细胞基质材料是由双乳化溶剂蒸发方法制备得到，双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间1-10分钟，乳化速率1-6千转/分钟，有机相-外水相体积比0. 1-0. 8。
6.根据权利要求5所述的材料，其特征在于所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间优选为5.5。
7.根据权利要求5所述的材料，其特征在于所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化速率优选为6。
8.根据权利要求5所述的材料，其特征在于所述的双乳化溶剂蒸发方法中有机相-外水相体积比优选为0. 45。
9.根据权利要求5所述的材料，其特征在于所述的材料是采用25%的F127溶液制备得到的纳米凝胶材料。
10.根据权利要求9所述的材料，其特征在于所述的纳米凝胶材料的凝胶、溶胶转变温度为20°C。
全文摘要
本发明涉及一种缓释生长因子的无细胞基质材料，所述的材料由可降解疏水聚合物，血管再生的生长因子和无细胞基质组成。所述的无细胞基质是指膀胱无细胞基质、真皮无细胞基质或血管无细胞基质。所述的血管再生的生长因子是指VEGF或bFGF。所述的可降解疏水聚合物是指聚乙交酯丙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)或聚(丙交酯-乙交酯-己内酯)。本发明将纳米缓释系统成功地复合到无细胞基质中，缓释出的生长因子仍有效保持其生物学特性，缓释过程长且平稳。本发明得到了可以长期、平稳缓释生长因子的无细胞基质，完成了对无细胞基质的生长因子修饰。
文档编号A61L27/18GK102172418SQ201110040198
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月18日 优先权日2011年2月18日
发明者宋华, 崔大祥, 耿红全, 陈方, 齐隽 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院