专利名称：一种天然细胞复合生长因子的制备方法
技术领域：
本发明属于生物组织培养技术领域，具体涉及一种天然细胞复合生长因子的制备方法。
背景技术：
体外培养的细胞可以自分泌和旁分泌氨基酸、多肽或蛋白质等细胞因子，包括生长因子、营养因子等，这些因子对多种细胞生理功能和代谢活动具有生物调节作用，在体内含量极微，但生物活性极高。这些因子能够与存在于靶细胞上的特异受体相结合而发挥作用，其主要生物学效应为趋化诱导炎症细胞刺激靶细胞增殖和分化，促进靶细胞合成并分泌细胞外基质(如胶原等)；能够调节T细胞、B细胞、组织细胞、朗罕氏细胞和树突状细胞的形成、发育及代谢功能，并影响它们的迁移和生长速率，同时也刺激结缔组织、表皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等分泌细胞因子、淋巴因子、胞外蛋白和基质多糖；对于发育成熟的组织器官、创伤后引发的器官受损、功能削弱，这些细胞分泌的因子都有显著的修复重建功能。
迄今为止，发现的这类因子有几十种，如胰岛素样生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、转化生长因子β、神经营养因子、血小板衍化生长因子、胚胎干细胞营养因子等等。目前这类因子的制备主要是依靠基因工程的方法，其不足之处在于基因工程仅能制备单一类型的因子，且产品的生物活性难以达到天然产物的活性。另外，目前相关的文献报道基本上是将细胞在培养瓶或某种基质上培养，以二维方式培养来获取上清，采用这种方式培养的细胞与体内的生长方式有所不同，因此其所合成并分泌的蛋白质难以达到理想的生理效果，与天然物有质和量上的差别。
发明内容
本发明的目的是提出一种天然细胞复合生长因子的制备方法，使其具有周期短、成本低、方法简便、易于操作、材料来源广泛的优点，所获得的细胞复合生长因子生物活性高、无过敏反应及其他副作用、安全可靠。
本发明提出的天然细胞复合生长因子的制备方法，包括有组织工程化组织的构建，其特征在于，采用组织工程方法在体外构建人工组织器官，收集组织器官培养过程中的上清液，经分离纯化后得到天然细胞复合生长因子。其组织工程化组织构建中所用细胞是来自人体按常规方法进行不同细胞的原代培养、传代培养，并大量扩增获取。这些细胞可以包括表皮细胞、成纤维细胞、雪旺细胞、神经细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、腺上皮细胞、骨细胞、软骨细胞、胰岛细胞、肝细胞等，也可以是胚胎干细胞或造血干细胞，间充质干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞，血管内皮干细胞，肝脏干细胞、胰腺干细胞、肠上皮干细胞及生殖干细胞等成体干细胞，或是经基因工程修饰过的细胞。
本发明制备方法的具体方案如下1.组织工程化组织的构建人工构建的组织在适宜的环境下可以按照生理情况继续生长、发育和成熟；在组织构建完成后进行组织培养，在组织生长发育的培养过程中，开始由培养液中收集上清液。组织构建和培养所用的培养液是根据所选择的培养细胞来确定基本培养基，例如DMEM，F12，RPMI 1640，αMEM等商品化的培养基，基本培养基可根据所选择培养细胞的养分需求添加其他辅助成分，包括血清、生长促进剂或生长抑制剂、维生素等；其组织培养的方式采用已有培养技术，包括液下培养、气液面培养、旋转培养或生物反应器等方法进行培养。
2.上清液的分离和纯化收集上述培养过程中的上清液采用目前已知的蛋白质分离纯化的技术方法；上清液的浓缩可采用中空纤维柱或切向流超滤方法，同时滤去低分子量代谢产物和盐类；上清液内蛋白质的分离和纯化，可采用透析、超滤、盐析、电泳、吸附层析、薄层层析、聚焦层析、凝胶层析、离子交换凝胶层析、亲和层析、气相色谱、高效液相色谱和疏水作用色谱等任一种或多种方法的联合应用，所得到的蛋白组成为一种或几种的混合物，称为天然细胞复合生长因子。提纯后将其冷冻干燥，可在4℃下长期储存。
3.天然细胞复合生长因子的应用天然细胞复合生长因子可制备成包括水剂、油剂、粉剂等各种剂型，作为添加剂用于细胞培养、化妆品、食品、药品等方面。
本发明组织工程技术是将体外大量扩增的细胞与生物材料相复合，构建三维组织器官的方法，在组织器官的培养过程中，通过细胞-细胞和细胞-细胞外基质的相互作用，合成并分泌大量的复合生长因子；在培养组织器官内含有两种或两种以上细胞时，不同细胞间也会产生相互作用，类似于体内组织的生长发育状况，最终会形成成熟的组织器官，并以生理速度和浓度分泌大量的生长因子和其他蛋白到培养基中。因此用这种方式合成的生长因子将完全是天然的组分和比例，可以同时收获多种因子，其效率和活性优于人工合成的基因产品。所以收集组织器官的培养液并进行分离和提纯，可以获得大量的细胞合成并分泌的因子，包括许多已知和未知的生长因子和营养因子，甚至包括胚胎来源的营养因子；同时所获得的因子则是天然组成，这也是人工方法无法达到的效果。
本发明所制备的天然细胞复合生长因子具有极高的生物活性，是多种细胞生长因子和/或营养因子的混合。经实验表明，具有显著诱导血管新生、加快创面修复速度、减少瘢痕形成、提高愈合质量的作用，表现为创面肉芽组织生成增多、增厚，创面胶原合成增加，创面再上皮化速度加快，成纤维细胞成熟加快且数量增多，毛细血管增加，局部循环改善及愈合时间缩短等；本发明所制备的天然细胞复合生长因子来自人体，无过敏反应及其他副作用。并且本发明制备方法具有周期短、成本低、方法简便、易于操作、材料来源广泛、安全性高的优点。
具体实施例方式
实施例1.
以皮肤组织的气液面培养获取上清液举例说明本发明的实施方式。
1.无菌条件下将胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素按照9∶1∶1的重量比例混合，用0.1％的醋酸溶液按重量比配制成6％的溶液(可在1～10％范围内选)，再按其体积的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培养基，调节pH值为7.4，加入体外培养的5～40代人成纤维细胞悬液，使终浓度为105个细胞/ml，置于CO2孵箱中37℃固化30分钟后，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养，每天换液。
2.培养3天后，在其表面按104个细胞/cm2将体外培养的5～40代的人表皮细胞种植，继续培养，每天换液，4天后形成皮肤组织。
3.开始每天收集上清液，将上清液在4℃条件下采用0.22μm的滤膜初步过滤，再用中空纤维柱系统浓缩至1/10体积，将浓缩样品在4℃条件下加入Sephacryl S-200凝胶层析柱，用0.01M的PB缓冲液(pH7.0)洗脱，用280nm紫外光实时检测，自动分布收集蛋白峰，冻干。
将获得的不同分子量蛋白按不同用途进行组合形成所需的产品。
实施例2.
以成纤维细胞和表皮细胞在生物反应器中培养举例说明本发明实施方式。
1.在旋转式培养装置(一种密闭圆柱状培养瓶，通过外力使培养瓶轴向以20～40转/分钟的速度旋转的培养系统，为已有技术装置)中加入含10％胎牛血清的DMEM培养液和体外培养的人成纤维细胞，并按5mg～40mg/ml的比例加入微载体(直径60-250μm)进行旋转培养，成纤维细胞贴附在微载体上生长并增殖，形成以微载体为核心的成纤维细胞团；2.培养5天后，在培养装置中加入体外培养的表皮细胞，使用表皮细胞培养液培养3天，表皮细胞包裹成纤维细胞团形成多个小皮肤组织；3.开始收集上清液，将每天收取的上清液在4℃条件下使用0.22μm的滤膜初步过滤，再用切向流超滤系统浓缩，其过滤系统截留分子量为1000～3000K道尔顿，浓缩至液体体积的1/10，然后将浓缩样品在4℃条件下加入高效液相色谱分析仪进行蛋白检测分离，收集分离获得的蛋白峰，冻干。
将获得的不同分子量蛋白按不同用途进行组合形成所需产品。
实施例3.
以骨髓间充质干细胞与细胞外基质的培养举例说明本发明的实施方式。
1.在无菌条件下，将细胞外基质(为各型胶原的混合物，与实例1相同)与0.1％的醋酸溶液按重量比配制成1％的溶液，加入1/10体积的胎牛血清、10mg/ml的DMEM培养液，调节pH值至7.2，加入体外培养的5～40代骨髓间充质干细胞悬液，使终浓度为105个细胞/ml，置于37℃的CO2孵箱中固化30分钟后，加入培养液培养，每天换液。
2.开始每天收集上清液，将收获的上清液在4℃条件下使用0.22μm的滤膜过滤，再用中空纤维柱系统浓缩至液体体积的1/10，然后将浓缩样品在40℃条件下加入离子交换层析柱，用0.01M的PB缓冲液(pH7.0)洗脱，用280nm紫外光实时检测，自动分布收集蛋白峰，冻干。
将获得的不同分子量蛋白按不同用途组合形成所需的产品。
权利要求
1.一种天然细胞复合生长因子的制备方法，包括有组织工程化组织的构建，其特征在于，采用组织工程方法在体外构建人工组织器官，收集组织器官培养过程中的上清液，经分离纯化后得到天然细胞复合生长因子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备的具体步骤为，①.构建组织工程化组织，构建完成后进行组织培养，并开始由培养液中收集上清液，组织构建和培养所用的培养液，是根据所选择的培养细胞来确定基本培养基和需添加的其他辅助成分；②.将收集的上清液采用中空纤维柱或切向流超滤方法浓缩，同时滤去低分子量代谢产物和盐类；采用蛋白质分离纯化方法将上清液内蛋白质分离和纯化，所得到的蛋白组成为天然细胞复合生长因子，提纯后将其冷冻干燥，在4℃下储存。
3.按照权利要求1所述制备方法获得的天然细胞复合生长因子的用途，其特征在于，所述的天然细胞复合生长因子能制成水剂、油剂、粉剂的剂型，作为添加剂用于细胞培养、化妆品、食品、药品方面。
全文摘要
一种天然细胞复合生长因子的提取方法。本发明通过采用组织工程方法在体外构建人工组织器官，收集组织器官培养过程中的上清液，经分离纯化后得到天然细胞复合生长因子。获得组织或器官培养过程中细胞合成并分泌的大量氨基酸或蛋白质，包括生长因子、营养因子等，分离纯化后可用于细胞培养、化妆品、食品、药品等方面。
文档编号C12N5/06GK1958793SQ20061010495
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月23日 优先权日2006年11月23日
发明者张勇杰, 金岩 申请人:西安组织工程工程技术研究中心