专利名称：红景天多糖在制备抗冻剂中的新用途及其产品和制备方法
技术领域：
本发明涉及低温生物学领域，涉及一种具有抗冻功能的新产品，特别涉及红景天多糖在制备抗冻剂中的新用途及产品和其制备方法。
背景技术：
红景天为景天科景天属(Rhodiola)植物，多分布在北半球的高寒地带，大多数都生长在海拔3500～5000米左右的高山地带，目前对于红景天的研究主要集中在红景天的药理学方面，具有多种药理作用①可以抵抗各种高原反应；②具有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老的作用；③具有抗肝、肾间质纤维化，保护器官损伤，预防和治疗心血管疾病；④此外还具有提高机体免疫能力、抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、提高记忆力和防治老年痴呆、降血糖和改善蛋白质、脂肪代谢等药理作用。但是，红景天多糖在抗冷冻技术领域的研究从未见报道。
另外，目前生物细胞抗冷冻技术领域一直存在下列问题细胞、器官或者组织经过特殊处理保存在超低温状态下(-196℃)，完全抑制了其代谢活动，让生命在静止状态下保存下来，一旦升温又能复苏而不失去生命活动能力。复苏原因比较公认的是在冷冻过程中，在冷冻保护剂作用下，防止或降低了细胞内水分形成冰晶而造成对细胞、器官或组织的机械损伤，使含有细胞、器官或组织的溶液形成玻璃态，达到保存目的。
冰晶化是在降温过程中，溶液中的水分子重新按几何图形排列形成冰晶(结晶体)，冰晶造成细胞死亡的原因是(1)细胞外水分首先形成冰晶，细胞外水分子数量减少，通过半透膜使细胞内部水分子扩散到细胞外，从而造成细胞脱水，电解质浓度增高，酸碱度失去平衡，原生质变性，造成不可逆的损伤；(2)细胞外水分结成冰晶后，体积增大，冰晶块的增大和移动，对细胞产生的机械压力，使细胞原生质表层破坏而失去保护作用；同时，冰晶还能扩展到细胞内部，破坏细胞结构，从而引起细胞死亡，结晶越大，对细胞危害也越大。
玻璃化是在超低温下，水分子保持原来的无序排列，呈现微粒结晶且坚实均匀的纯粹玻璃样结构(即玻璃化冻结)。细胞在玻璃化冻结状态下，不会出现原生质脱水，细胞结构受到保护，解冻后的细胞仍能恢复活力。
冰晶化和玻璃化形成的条件冰晶化必须在0～-60℃低温(冰晶化温度)区域内，在缓慢降温的条件下形成。玻璃化是在-60～-250℃超低温(玻璃化温度)区域内，快速越过冰晶化阶段后形成，但玻璃化是可逆性不稳定的，当缓慢升温再经过冰晶化温度区域时，玻璃化又变为冰晶化再变为液态。
因此，在细胞冷冻技术中，如何使细胞在冷冻过程中穿越冰晶温度区进入玻璃化温度区是这一问题解决的关键，解决的办法就是在细胞稀释液中加入抗冻剂，采用快速冷冻、快速解冻方法，使细胞解冻过程中迅速越过细胞致死危险温区(-15～-60℃)，降低冰晶的形成，使细胞得以存活。
目前所采用的方法是，在稀释液中添加抗冻物质如甘油、2-甲基亚砜等，对防止冰晶的发生有重要作用。甘油等亲水性很强，它可在水结晶过程中限制和干扰水分子晶格排列，阻抑水形成结晶，使其处于过冷状态，降低水形成结晶的温度，缩短了细胞快速穿越冰晶温度区的时间，但甘油等对细胞有毒害作用，造成细胞内蛋白质结构的变性，在冷冻保护液中尽量减少甘油的使用是目前研究的一个方向。为了解决这一问题，目前科研工作者进行了大量的尝试，但是冷冻后细胞的存活率依然较低。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题与不足，提供一种红景天多糖在制备生物细胞冷冻抗冻剂中的应用。
发明人研究发现，红景天为景天科景天属(Rhodiola)植物，多分布在北半球的高寒地带，大多数都生长在海拔3500～5000米左右的高山地带，这里的温度大多属于冰晶形成温度区，但是红景天能够很好的生长，说明其体内具有特殊的抗冻物质。根据这一个思想，发明人经过多年的试验研究，首次发现红景天只所以能够在高寒地带生长，是因为它身内含有红景天多糖，对抗冷冻具有重要的作用。
红景天多糖具体制备方法见实施例1。
物理性质所得红景天多糖为褐色粉末或褐色块状固体，易溶于水。
本发明还有一目的是红景天多糖在制备保护哺乳动物的精液冷冻抗冻剂中的应用。
本发明还有一目的是红景天多糖在制备保护卵母细胞冷冻抗冻剂中的应用。
本发明还有一目的红景天多糖在制备保护体细胞冷冻抗冻剂中的应用。
本发明还有一目的红景天多糖在制备保护早期胚胎冷冻抗冻剂中的应用。
本发明还有一目的红景天多糖在制备保护器官组织冷冻抗冻剂中的应用。
本发明还有一目的是提供以红景天多糖为主要活性成份的生物细胞冷冻抗冻剂，它是由下述重量配比的原料组成葡萄糖2～5％、柠檬酸钠0.5～3.5％、卵黄10～50％、青霉素G钠5～15万IU、双氢链霉素2～10％、甘油1～5％、红景天多糖1～1.5％、去离子水50～90％。
所述的红景天多糖是从生长在海拔3500～5000米的景天科景天属植物红景天中提取。
所述的卵黄为两天内产下的新鲜鸡蛋黄。
本发明的最后一个目的是提供制备上述生物细胞冷冻抗冻剂的方法，包括下列步骤1)按比例称取各原料葡萄糖、柠檬酸钠、卵黄、青霉素G钠、双氢链霉素、甘油、红景天多糖、去离子水备用；2)将所述重量的葡萄糖、Tris、柠檬酸钠用去离子水配置成基础液；3)将步骤2)所配置的基础液和卵黄按照5～9∶1～5配制，然后加入所述重量青霉素和所述重量链霉素配制成I液；4)在步骤3)所配置的I液中加入所述重量的甘油配制成II液；5)在步骤4)所配置的II液中加入所述重量红景天多糖即得本发明的生物细胞冷冻抗冻剂。
本发明首次将红景天多糖添加到基础冷冻液，进行细胞、精液、器官组织的冷冻保存，均获得了良好的效果，细胞解冻后的存活率大大提高，尤其解决了猪精液冷冻解冻后存活率低的世界性难题，该发明进一步拓展了超低温生物学研究的范围，为超低温保护材料提供了新的途径。该方法无论在超低温生物学领域，还是在动物繁殖生产方面，均具有其创造性和实用性。
具体实施例方式
下面结合发明人给的具体试验数据和使用方法，进步一步说明本发明的有益效果。
试验例1以猪精液冷冻保存进行说明1.生物细胞冷冻抗冻剂选用实施例1配制的产品；2.荧光染液的配制称取0.002g罗丹明123溶于1mlDMSO，0.45μm滤膜过滤后，避光贮存；增光剂，甘油∶PBS(9∶1)；封片采用无色指甲油。
3.精液的采集与预处理用手握法采精，选择中段浓度精液经4层纱布过滤，除去胶状物后，用生物显微镜于37℃下进行常规品质检查。选择无异味，色泽乳白色，形态正常，活率在0.7以上的精液供试。
将质量合格的精液保存在32～35℃的水浴中平衡60～80min，使精子与精清充分接触，然后经800r/min离心10min，弃掉精清。
4.精液冷冻1)采集新鲜的猪精液在离心机中以17℃、800g/min的速度离心10min，弃上清，得到白色沉淀。将得到的沉淀用基础液等温稀释后轻轻摇匀，并置于17℃恒温下平衡3h。将平衡的溶液用离心机以17℃、800g/min的速度离心10min，加稀释I液至2ml，轻轻摇匀后置于5℃的恒温下平衡2h，然后加入稀释II液轻轻摇匀置于5℃的恒温下平衡2h。
2)将所得的稀释后的精液吸入冷冻管中，进行冷冻，具体冷冻步骤如下首先置于程序冷冻仪中缓慢降温，开始设定的温度为5℃，然后以3℃/min的速度缓慢降温到-6℃，最后投入液氮内。
5.解冻与活率鉴定1)用镊子将冷冻管迅速取出，放入37℃恒温水浴锅内解冻45s。
2)将解冻后的细管精液，用等温的基础液稀释调整密度至3～6×106个精子/ml。先取等温的100μl HEPES/BSA缓冲液置于预温的1.5mlEppendorf离心管中，然后加入1μl罗丹明123贮存液，避光孵育10min，最后加入50μl精液，在37℃、黑暗潮湿的环境孵育30min。取10μl精子悬液于载玻片上，加少量增光剂，混匀后盖上盖玻片，荧光显微镜(400×)下观察。死精子在波长488nm紫外光激发下头部核区发红色荧光。活精子和有活性线粒体的精子头部不发光，而尾部线粒体部分(中段)有亮绿色荧光。
6.评定结果本发明冷冻保存液可使精子活率达0.5以上。
试验例2以大鼠胰腺细胞冷冻保存进行说明1.获得细胞(一般传代细胞)，使用胰蛋白酶将贴壁细胞消化，制成细胞悬浮液。加含有牛血清的保护液DMEM，阻止消化。
2.将上述细胞悬浮液离心1200r/min，5min弃掉上清夜。添加冷冻保护液液，形成悬浮液(配置方法参照实例1步骤1)。
3.装管(方法同实例1步骤4)，装管后，平衡15～20min，再将细管放入冷冻仪；按照冷冻仪程序冷冻，-5.5～5.9℃平衡5～10min，在7～10s内植冰，继续平衡5min，再以0.2～0.6℃/min的速率下降至-40～-50℃，在平衡5min后投入液氮保存。
4.解冻后存活率达40％以上。
试验例3以牛卵母细胞冷冻保存进行说明1.从废弃的卵巢中获得卵母细胞，经过反复2～3次清洗干净后，移入冷冻保护液平衡10～20min。
2.按照实施例2步骤3的方法进行冷冻。
3.解冻后进行培养，统计活率，达92％。
试验例4以猪胚胎冷冻保存进行说明。
1.将体外受精的猪胚胎按照实施例3方法进行冷冻。
2.解冻后活率达85％。
试验例5以小鼠卵巢冷冻保存进行说明1.将取出的卵巢组织立即移入实验室放入冰冷的培养液中，去掉髓质，保留皮质。将组织切成1×2×1mm3的小块进行进一步分析和处理。
2.将组织切片放入冰冷的缓冲培养液中平衡30min，该缓冲培养液中包含冷冻保护剂(12g/l的红景天和1mol/l的DMSO)，5％的血清。
3.按照实施例1步骤4的方法装管，放于程序冷冻仪内冷冻。
4.从0℃开始，以2℃/min的速度降至-7℃，植冰，以0.3℃/min速度降至-40℃，再以10℃/min速度降至-140℃，投入液氮罐内保存。
5.按照100℃/min的速度解冻。
6.解冻后从卵巢组织上获取的卵母细胞受孕率达85％。
以下结合发明人给的具体实施例来进一步说明本发明生物细胞冷冻抗冻剂制备方法。
实施例1红景天多糖的提取工艺准确称取干燥的高山红景天茎杆500克，切成1×1×2cm3大小的块状，用蒸馏水浸泡12h，过滤后除去滤液，放入1000ml烧杯中，加入500ml蒸馏水蒸煮2h，蒸煮过程中需不停地翻动块状固体，如此反复蒸煮3次后过滤，去掉固形物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至200ml，加入一定量的无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，静置12h，然后纱布过滤，将沉淀在60℃的温度下干燥，即可得到红景天粗多糖。将粗多糖用适量蒸馏水溶解，加入氯仿∶正丁醇(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，混匀，充分振荡30min后，用电动离心机(1000r/min)离心1min，分离水层和氯仿层，反复5次。收集水层，将水层浓缩，在60℃的温度下干燥，用乙醚在45℃恒温水浴锅中用索氏提取器回流提取3次，每次1h，过滤。60℃恒温干燥，即得到红景天多糖。
物理性质所得红景天多糖为褐色粉末或褐色块状固体，易溶于水。
实施例2生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法用电子分析天平称取2.5g葡萄糖和1.8g柠檬酸钠，将其溶于50ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配制成100ml基础液。取基础液80ml与20ml卵黄(新鲜鸡蛋黄)混匀，添加10万IU青霉素配制成I液；在I液中添加3％的甘油即配制成II液；在II液中添加红景天多糖，使红景天多糖的浓度为6g/l，再用精密PH计调整pH为6.21，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入2～5℃冰箱中备用。I、II液需现用现配。
实施例3生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法用电子分析天平称取3g葡萄糖和1.4g柠檬酸钠，将其溶于50ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配制成100ml基础液。取基础液80ml与20ml卵黄(新鲜鸡蛋黄)混匀，添加10万IU青霉素配制成I液；在I液中添加2％的甘油即配制成II液；在II液中添加红景天多糖，使红景天多糖的浓度为8g/l，再用精密PH计调整pH为6.21，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入2～5℃冰箱中备用。I、II液需现用现配。
实施例4生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法用电子分析天平称取2g葡萄糖和2.0g柠檬酸钠，将其溶于50ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配制成100ml基础液。取基础液80ml与20ml卵黄(新鲜鸡蛋黄)混匀，添加10万IU青霉素配制成I液；在I液中添加2％的甘油即配制成II液；在II液中添加红景天多糖，使红景天多糖的浓度为10g/l，再用精密PH计调整pH为6.21，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入2～5℃冰箱中备用。I、II液需现用现配。
实施例5生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法用电子分析天平称取1g葡萄糖和3.0g柠檬酸钠，将其溶于50ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配制成100ml基础液。取基础液80ml与20ml卵黄(新鲜鸡蛋黄)混匀，添加10万IU青霉素配制成I液；在I液中添加1％的甘油即配制成II液；在II液中添加红景天多糖，使红景天多糖的浓度为12g/l，再用精密PH计调整pH为6.21，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入2～5℃冰箱中备用。I、II液需现用现配。
实施例6生物细胞冷冻抗冻剂的制备方法用电子分析天平称取1g葡萄糖和1.5g柠檬酸钠，将其溶于50ml去离子水中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，配制成100ml基础液。取基础液80ml与20ml卵黄(新鲜鸡蛋黄)混匀，添加10万IU青霉素配制成I液；在I液中添加1％的甘油即配制成II液；在II液中添加红景天多糖，使红景天多糖的浓度为15g/l，再用精密PH计调整pH为6.21，然后进行过滤灭菌，冷却至室温，放入2～5℃冰箱中备用。I、II液需现用现配。
权利要求
1.红景天多糖在制备生物细胞冷冻抗冻剂中的应用。
2.红景天多糖在制备保护哺乳动物精液冷冻抗冻剂中的应用。
3.红景天多糖在制备保护卵母细胞冷冻抗冻剂中的应用。
4.红景天多糖在制备保护体细胞冷冻抗冻剂中的应用。
5.红景天多糖在制备保护早期胚胎冷冻抗冻剂中的应用。
6.红景天多糖在制备保护器官组织冷冻抗冻剂中的应用。
7.一种生物细胞冷冻抗冻剂，其特征在于它是由下述质量配比的原料组成葡萄糖2～5％、柠檬酸钠0.5～3.5％、卵黄10～50％、青霉素G钠5～15万IU、双氢链霉素2～10％、甘油1～5％、红景天多糖1～1.5％、去离子水50～90％。
8.根据权利要求7所述的生物细胞冷冻抗冻剂，其特征在于，所述的卵黄是新鲜鸡蛋黄、新鲜鸭蛋黄、新鲜鸟蛋黄中的任一种。
9.根据权利要求8所述的生物细胞冷冻抗冻剂，其特征在于，所述的新鲜鸡蛋黄为两天内产下的新鲜鸡蛋黄。
10.制备权利要求7所述的生物细胞冷冻抗冻剂方法，其特征在于，包括下列步骤1)按配方比例称取各原料葡萄糖、柠檬酸钠、卵黄、青霉素G钠、双氢链霉素、甘油、红景天多糖、去离子水备用；2)将所述重量的葡萄糖、Tris、柠檬酸钠用去离子水配置成基础液；3)将步骤2)所配置的基础液和卵黄按照5～9∶1～5配制，然后加入所述重量青霉素和所述重量链霉素配制成I液；4)在步骤3)所配置的I液中加入所述重量的甘油配制成II液；5)在步骤4)所配置的II液中加入所述重量红景天多糖，即得到本发明的生物细胞冷冻抗冻剂。
全文摘要
本发明公开了红景天多糖在制备生物细胞冷冻抗冻剂、制备保护哺乳动物精液冷冻抗冻剂、制备保护卵母细胞冷冻抗冻剂、制备保护体细胞冷冻抗冻剂、制备保护早期胚胎冷冻抗冻剂、制备保护器官组织冷冻抗冻剂中的新用途，其产品的制备方法是先将所述重量的葡萄糖、Tris、柠檬酸钠等用无离子水配置成基础液；再将基础液和卵黄按照5～9∶1～5配制，然后加入所述重量青霉素和所述重量链霉素配制成I液，在I液中加入所述重量的甘油配制成II液；在II液中加入所述重量红景天多糖，即得到本发明的生物细胞冷冻抗冻剂。本发明红景天多糖的新用途对于哺乳动物精液、体细胞、卵母细胞、早期胚胎及器官组织冷冻保存具有十分广阔的市场应用前景。
文档编号C12N5/00GK1962852SQ200610104978
公开日2007年5月16日 申请日期2006年11月27日 优先权日2006年11月27日
发明者李青旺, 江中良, 胡建宏, 赵红卫, 李文烨 申请人:西北农林科技大学