专利名称：玄参多糖、生产方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从中药材中提取的多糖同系混合物，特别是涉及从生药玄参中提取的玄参多糖SnPS-1、其生产方法和用途。
背景技术：
玄参是一种传统的中药材，具有“凉血滋阴、降火、生津、解毒”之功效。文献报道，[张雯洁等，云南植物研究，16(4)，407(1994)]，[李医明，蒋山好，高文运，朱大元，药学学报，34(6)，448(1999)]，[邹臣亭，杨秀伟，中草药，31(4)，241(2000)]，其化学成分主要有生物碱、黄酮甙、甾醇、氨基酸、脂肪酸、挥发油、胡萝卜素、环烯醚萜甙类成分以及微量元素等，而有关玄参中多糖类的研究尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种玄参多糖SnPS-1及其生产方法和用途。
本发明是从生药玄参中提取获得的多糖，其化学结构特征为SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→为主链，以及少量糖链→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和极少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖为Galp(1→。由此可见，SnPS-1是一条以直链为主，分支极少的杂多糖。
本发明的制备方法是将生药用水浸泡，采用有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获得总多糖。玄参总糖用活性炭处理，再经离子交换柱和凝胶柱层析纯化得多糖纯品SnPS-1。
该多糖由完全酸水解、还原、乙酰化和GC分析得知由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比推荐为1.8∶6.4∶1∶1.2∶2.8∶12.7，平均分子量推荐在90～105万道尔顿，由HPLC分析得知分子量例如105万道尔顿，进一步推荐的平均分子量在100万道尔顿。其谱图数据如下面所述109.49ppm信号为→2)Araf(1→产生的，108.089ppm信号为→5)Araf(1→产生的，103.74ppm信号为→3)Glcp(1→产生的，103.87ppm信号为→3)Rhap(1→产生的，103.93ppm信号为→6)Manp(1→产生的，98.387ppm信号为→2)Galf(1→产生的；5.300ppm信号为→2)Araf(1→产生的，5.193ppm信号为→5)Araf(1→产生的，4.742ppm信号为→3)Glcp(1→产生的，5.118ppm信号为→6)Manp(1→产生的，5.013ppm信号为→2)Araf(1→产生的。
从SnPS-1甲基化、还原、乙酰化衍生物的GC-MS图谱分析得知，SnPS-1含有碎片→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，Galp(1→，→3)Rhap(1→，→2，4)Xylp(1→，→3)Araf(1→，→2)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→2)Galf(1→，其摩尔比为4∶2∶3∶5∶3∶2∶15∶9∶35。根据甲基化、NMR等分析，可以得知SnPS-1具有以下的结构SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→为主链，以及少量糖链→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和极少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖为Galp(1→。
本发明的制备方法包括将生药玄参干燥用水浸泡，采用有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获的玄参总糖。玄参总糖经活性炭处理，再经离子交换柱和凝胶柱层析纯化可的玄参多糖纯品SnPS-1。
具体来说，将干燥后的生药玄参粉碎或切片，用水浸泡，其中生药玄参与水浸泡的重量比推荐是玄参∶水＝1∶10～15，尤其推荐用10～12倍重量或更多的水，浸泡24～36小时。所述水推荐为无离子水。浸泡液的pH值推荐保持在5.0～8.0。
过滤，滤液经或不经浓缩，用有机溶剂沉淀后离心。离心所得沉淀用水溶解，推荐用1-5倍重量的水溶解。
离心，上清液透析或膜分离，透析时间推荐为24-72小时，透析用透析膜、透析袋，其孔径推荐截留分子量在1000以下。
浓缩干燥获得总糖，其中干燥或减压浓缩温度推荐低于60℃进行，最好采用低温真空浓缩或冷冻干燥，例如在30～60℃干燥或浓缩，压强推荐控制在0.08～0.1M Pa。
所述玄参总糖加水溶解，其中推荐1～5倍重量的水溶解。然后用活性炭处理，再经凝胶柱层析作进一步纯化，用水或稀盐溶液洗脱，收集糖峰，纯度可达99.6％。凝胶柱层析所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，选用的分离范围为1×103～5×104道尔顿。推荐凝前述的用有机溶剂沉淀，所述有机溶剂推荐与水互溶的有机溶剂，可以是低碳链的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推荐乙醇，例如用2～6倍体积的75％～95％的乙醇；沉淀时间推荐为12～72小时。
经生物活性试验，研究结果表明玄参多糖SnPS-1具有脑缺血保护作用。
本发明首次从玄参中提取玄参多糖SnPS-1。本发明的提取分离方法简便，产率高和适于工业化生产。本发明取得到的玄参多糖粗品或纯品能够有效的用于制备具有脑缺血保护作用的药物。
图1是玄参多糖SnPS-1的HPLC图。分析柱为Bio-sep，洗脱液水，流速1mL/min，检测器RI，分析得到单一对称峰，表明其具有均一性。
图2是玄参多糖SnPS-1的GC-MS图谱中的GC图谱。其表明有8个碎片峰，具体碎片质量见图5-12。
图3是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的13.216min峰，表明有→6)Manp(1→。
图4是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的13.397min峰，表明有→5)Araf(1→。
图5是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的15.421min峰，表明有Galp(1→。
图6是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的15.540min峰，表明有→3)Rhap(1→。
图7是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的16.126min峰，表明有→2，4)Xylp(1→。
图8是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的18.078min峰，表明有→2)Araf(1→。
图9是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的19.290min峰，表明有→3)Glcp(1→。
图10是玄参多糖SnPS-1的MS图谱，其对应于GC图中的22.150min峰，表明有→2)Galf(1→。
图11是不同剂量的玄参多糖SnPS-1对大鼠脑缺血梗死体积的影响，各给药组通过大鼠尾静脉注射。初步结论不同剂量给药组与缺血对照组差异显著(p＜0.01)，各个剂量组之间无明显差异。
图12是0.2％剂量的玄参多糖SnPS-1对大鼠缺血及再灌注各时间点脑血流量图，其中R 30min表示再灌注后30min，R 2h表示再灌注后2h。
图13表示玄参多糖SnPS-1对大鼠缺血及再灌注各时间点脑血流量图，其中R 30min表示再灌注后30min，R 2h表示再灌注后2h。初步结论0.2％剂量组除了缺血后即刻，其余各时间点均与对照组差异显著(p＜0.05)，0.04％和0.4％剂量组除了缺血后2小时与对照组有显著差异(p＜0.05)，再灌注后半小时及两小时均无显著差异。
具体实施例方式
实施例1将生药玄参500g洗净干燥，粉碎，用5升无离子水室温浸泡24小时，过滤。残渣用2.5升无离子水继续浸泡12小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至1～2升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇终浓度为80％，沉淀24小时。离心，沉淀用1.25升水溶解，离心，无离子水透析48～72小时。60℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得玄参总糖8.9g。加水2升溶解，加活性炭处理，反复脱三次，然后减压浓缩，离心，冷冻干燥，获得玄参总糖3.0g，纯度为80％。
实施例2将生药玄参500g洗净干燥，粉碎，用5升无离子水室温浸泡36小时，过滤。残渣用2.5升无离子水继续浸泡12小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩至2升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇终浓度为82％，沉淀48小时。离心，沉淀用2升水溶解，离心，无离子水透析72小时。50℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得玄参总多糖9.5g。加水2升溶解，加活性炭处理，反复脱三次，然后减压浓缩，离心，冷冻干燥，获得玄参总多糖3.1g，纯度为80％。
实施例3
玄参总糖经DEAE-Cellulose柱层析精制，纯度为85～90％，再经SephadexG-25和Sephadex G-75柱层析，即获得纯度为99.6％的玄参多糖SnPS-1。具体的分离方法称取玄参总糖100mg，溶于1～2mL蒸馏水中，离心(4500r/min，10min)。取上清液上Sephadex G-25柱(1.5cm×100cm)，用0.1mol/LNaCl洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集3～5mL，大约37～47管为吸收峰。收集后再经Sephadex G-75柱纯化，冷冻干燥，即获得纯多糖SnPS-150mg。
实施例4玄参总糖经DEAE-Cellulose柱层析精制，纯度为85～90％，再经SephadexG-25和Sephadex G-75柱层析，即获得纯度为99.6％的玄参多糖SnPS-1。具体的分离方法称取玄参总糖120mg，溶于2～3mL蒸馏水中，离心(4500r/min，10min)。取上清液上Sephadex G-25柱(1.5cm×100cm)，用0.1mol/L NaCl洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集3～5mL，大约38～48管为吸收峰。收集后再经Sephadex G-75柱纯化，冷冻干燥，即获得纯多糖SnPS-160mg。
权利要求
1.一种玄参多糖SnPS-1，其结构特征为SnPS-1是以→2)Galf(1→，→2)Araf(1→为主链，以及糖链→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖为Galp(1→组成，
2.如权利要求1所述的玄参多糖，其特征是鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的组成摩尔比为1.8∶6.4∶1∶1.2∶2.8∶12.7。
3.如权利要求1所述的玄参多糖，其特征是其中→6)Manp(1→，→5)Arraf(1→，Galp(1→，→3)Rhap(1→，→2，4)Xylp(1→，→3)Araf(1→，→2)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→2)Galf(1→，摩尔比依次为4∶2∶3∶5∶3∶2∶15∶9∶35。
4.如权利要求1所述的玄参多糖，其特征是分子量范围为90～105万道尔顿。
5.如权利要求1所述的玄参多糖的生产方法，其特征是包括将干燥后的生药玄参用水浸泡，用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总糖。玄参总糖加水溶解后，经活性炭处理以及凝胶柱层析纯化可得玄参多糖纯品SnPS-1。
6.如权利要求5所述的玄参多糖的生产方法，其特征是所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，选用的分离范围为1000道尔顿。
7.如权利要求5所述的玄参多糖的生产方法，其特征是生药玄参与水浸泡的重量比玄参∶水＝1∶10～15，水浸泡时间24～36小时，浸泡液的pH＝5～8。
8.如权利要求4所述的玄参多糖的生产方法，其特征是所述的有机溶剂是与水互溶的有机溶剂。
9.如权利要求5所述的玄参多糖的生产方法，其特征是所述的有机溶剂是乙醇。
10.如权利要求5所述的玄参多糖的生产方法，其特征是透析或膜分离所采用的膜，其孔径控制在截留分子量1000道尔顿。
11.如权利要求1所述的玄参多糖，其特征在于所述的玄参多糖可以制备具有脑缺血保护作用的药物。
全文摘要
本发明涉及一种从中药玄参中提取的多糖、其生产方法和用途。本发明采用水浸泡获得玄参水提液，有机溶剂沉淀、沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离，浓缩干燥获得总糖，玄参总糖经活性炭处理和柱层析获得玄参多糖SnPS－1，其化学结构特征为SnPS－1是以→2)Gal/(1→，→2)Araf(1→为主链，以及少量糖链→6)Manp(1→，→5)Araf(1→，→3)Glcp(1→，→3)Rhap(1→和极少量的分支糖→2，4)Xylp(1→，末端糖为Galp(1→。由此可见，SnPS－1是一条以直链为主，分支极少的杂多糖。本发明方法工艺简单、产率高，适宜工业化生产。经生物活性试验表明，该多糖无毒副作用，具有脑缺血保护的作用。
文档编号C08B37/00GK1486991SQ0314229
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月15日 优先权日2003年8月15日
发明者田庚元, 邓军娥 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 浙江京新药业股份有限公司