一种多肽片段以及制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种多肽片段，经检测后发现其为细胞色素C氧化酶Ⅷ(cytochromeCoxidasesubunitⅧ)的一个片段，由细胞色素C氧化酶Ⅷ的52-69位的氨基酸残基组成，我们记作COX52-69。其氨基酸序列为：LLPAGWVLSH?LDSYKKRE。经实验证明该多肽片段具有抑制胰岛分泌胰岛素的作用。
【专利说明】一种多肽片段以及制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞色素C氧化酶VDI (cytochrome C oxidase subunit VDI)截短后的片段cox52_69，该多肽片段具有抑制胰岛分泌胰岛素的作用，本发明同时还提供了上述多肽片段的制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞色素c氧化酶是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的关键酶。它承担着细胞色素c (Cytoehroine c, cyt c)到氧分子(0:)的电子传递功能,催化氧分子还原为水分子，并与质子泵功能相偶联。所有哺乳动物真核细胞的COX由13个亚基组成，其中构成级联反应核心的最大3个亚基(C0X 1、II和111)由mtDNA编码。其余10个亚基(CO IV，Va，Vb, Via, VIb,VI c,Wa.VII b，VII c，和VDI)均由 nDNA 编码，即由细胞核内基因经胞浆中的核糖体翻译后经过不同途径转运至线粒体的。这10个亚基有明显的种族和器官特异性，其功能尚不明确。要形成功能复合物，需要COX所有结构基因的表达以及超过24个COX特异基因的参与，这些特异基因可以影响COX合成的所有方面，尤其在COX 全酶装配和稳定中起着重要作用。但有关在线粒体中酶是怎样装配，目前尚不清楚。所以总体来说目前还不知道细胞色素C氧化酶珊的功能。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种多肽片段，经检测后发现其为细胞色素C氧化酶珊截断后的片段，由细胞色素C氧化酶VDI的52-69位的氨基酸残基组成，其氨基酸序列如下:LLPAGWVLSH LDSYKKRE。
[0004]
本发明提供了上述多肽的制备方法，包括以下步骤:(I)、将猪肠道洗净后浸入沸水中浸泡3-7分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在0~10° C条件下用醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，用盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽；
·(2)、将耐热肠多肽溶解于水中，加入抗氧化剂及足量异丙醇溶液，室温下充分静置后离心除去沉淀，然后再加入足量温度为-25V~_15°C的异丙醇溶液并在-25V~-15°C条件下充分静置后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值调节为5.8~6.1，再在-25°C~-15°C 条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀充分洗涤后即制得粗肽；
(3)、将步骤(2)中制得的粗肽溶液于醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到所要分离物，将分离物冻干得粗提取物；
(4)、将粗提取物溶解于碳酸氢铵溶液中并搅拌，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8.0、浓度为0.02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高效液相色谱分离后，将分离物冻干即制得权利要求1 所述氨基酸序列的多肽。
[0005]步骤(1)中醋酸的浓度为0.5mol/L，盐酸的浓度为0.2mol/L。[0006]步骤(2)中抗氧化剂为硫二甘醇，添加量为1.2毫升；洗涤分两次进行，第一次洗涤选用异丙醇溶液，第二次洗涤选用乙醚溶液，第二次洗涤完成后将白色沉淀放入真空环境中使乙醚在真空中蒸发。
[0007]所述步骤(4)中的两次高效液相色谱分离中，第一次分离所用洗提液为0.1%的三氟乙酸水溶液与0.1%的三氟乙酸的乙腈溶液；第二次分离后所得沉淀收集并冻干。
[0008]本发明同时还提供了上述多肽的用途，用于制造抑制胰岛分泌胰岛素的药物。
[0009]本发明同时还提供了所述多肽作为药物靶向的用途，其特征在于:用于提高组织对胰岛素的敏感性，对抗组织对胰岛素的耐受。
【具体实施方式】[0010]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。
[0011]实施例1
本实施例中采用以下制备步骤:
本发明提供了上述多肽的制备方法，包括以下步骤:(I)、取30千克新鲜猪肠，将猪肠道洗净后浸入沸水中浸泡5分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在5° C条件下用
0.5mol/L的醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，然后用0.2mol/L的盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽约30克，耐热肠多肽的产率约为猪肠湿重的0.01%。
[0012](2)、将30克耐热肠多肽溶解于0.24L水中，加入1.2毫升抗氧化剂硫二甘醇及
1.08L异丙醇溶液，室温下静置2小时后离心除去沉淀，然后再加入1.32L温度为_20°C的异丙醇溶液并在-20°C条件下静置24小时后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值用盐酸调节为6，再在-20°C条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀分两次进行洗涤，第一次洗涤选用异丙醇溶液，第二次洗涤选用乙醚溶液，第二次洗涤完成后将白色沉淀放入真空环境中使乙醚在真空中蒸发即制得粗肽6.5克。
[0013](3)、将步骤(2)中制得的粗肽6.5克溶液于300mL0.2mol/L的醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到？分离物，将分离物冻干得粗提取物；
(4)、将粗提取物溶解于81.5mL0.01mol/L的碳酸氢铵溶液中并搅拌20分钟，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8.0、浓度为0.02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高效液相色谱分离后，所述的两次高效液相色谱分离中，第一次分离所用洗提液为0.1 %的三氟乙酸水溶液与0.1%的三氟乙酸的乙腈溶液；第二次分离后所得沉淀收集并冻干即制得权利要求1所述氨基酸序列的多肽。
[0014]对上述步骤中制的多肽经SDS-PAGE胶纯化。进行氨基酸测序用Edman降解法做妝序列分析。Applied Biosystems 477A 仪器偶联 120 A analyzer、Milligen 6600、Waters 440分析仪,进行氨基酸序列分析。
[0015]测序结果如下:
本发明多肽: LLPAGWVLSH LDSYKKRE
与细胞色素C氧化酶VDI的氨基酸序列:52 LLPAGffVLSH LDSYKKRE 69具有很大的相似性。从中可知，本发明中的多肽为细胞色素C氧化酶珊第52至第69氨基酸残基所组成的多肽片段。我们写作C0X52_69.对本发明中制得的多肽性能进行研究，测试在离体大鼠胰岛灌流系统进行葡萄糖诱导的胰岛素分泌的影响。雄性SD大鼠(200-250克)经麻醉剂后取出胰腺，然后轻轻地用胶原酶酶消化。胰岛在37°C培养过夜下的RPMI 1640培养基5%的二氧化碳含11毫米葡萄糖和10%热灭活小牛血清。选三个胰岛做胰岛素释放测试。培养液中分别为3.3或16.7毫米葡萄糖或IOnM COX52_69。放射免疫分析法被用来确定溶液中释放的胰岛素量。测定结果分别为(uU): 2.695+-1.57 ；34.62+-5.05 ；20.03+-3.12。可见 COX52_69 具有明显的抑制胰岛素分泌的作用。
【权利要求】
1.一种多肽片段细胞色素 C 氧化酶VDI 52-69 cytochrome C oxidase subunit VIH 52-ω(C0X52_69)，其氨基酸序列如下: LLPAGffVLSH LDSYKKRE。
2.权利要求1所述多肽向的用途，其特征在于:用于制造抑制胰岛分泌胰岛素的药物。
【文档编号】A61K38/10GK103571803SQ201310471571
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】李臣鸿, 陈正望 申请人:中南民族大学