一种银杏内酯的提取方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种银杏内酯的提取方法，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得含量有很大提高，本发明还提供了提供银杏内酯在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用。
【专利说明】一种银杏内酯的提取方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药提取【技术领域】，具体涉及一种银杏内酯的提取方法及应用。
【背景技术】
[0002]银杏内酯化合物属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，是银杏叶中一类重要的活性成分。白果内酯(hilobalide;BB)属倍半萜内酯，是目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半職内酯化合物。银杏内酯A(ginkgolide A ;GA)、银杏内酯B(ginkgolideB ；GB)、银杏内酯 C(ginkgolide C ；GC)、银杏内脂 M(ginkgolide M ；GM)、银杏内脂J(ginkgolide J；GJ)为二萜类化合物，其差别在于含有的羟基数目和羟基连接的位置不同，银杏内酯的提取及纯化方法有:溶剂萃取法、柱提取法、溶剂萃取-柱提取法、超临界提取法及色谱或柱层析纯化法等。
[0003]现有技术中，尚未有银杏内酯在提取制备方面采用超临界和微波技术的联合应用报道，而采用上述方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004]发明目的:为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种银杏内酯的提取方法。
[0005]本发明的另一个目的在于提供银杏内酯在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用。
[0006]技术方案:本发明的目的是通过如下的方案实现的:`[0007]一种银杏内酯的提取方法，取银杏叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l-3ml/g生药.min,萃取时间150_180min,得超临界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物。
[0008]上述银杏内酯的提取方法，所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5% ο
[0009]上述银杏内酯的提取方法，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.min,萃取时间160min。
[0010]上述银杏内酯的提取方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
[0011]上述银杏内酯在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用，银杏内酯的提取步骤为:取银杏叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生药.min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物。
[0012]上述银杏内酯在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用，银杏内酯的提取方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.min，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
[0013]上述银杏内酯在制备增加骨密度药物中的应用，银杏内酯的提取步骤为:取银杏叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为
4-6%，萃取压力 15-30MPa，温度 30-50°C，C(V流量1-3ml/g生药.min，萃取时间 150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物。
[0014]上述银杏内酯在制备增加骨密度药物中的应用，银杏内酯的提取方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.π?η，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
[0015]现有技术中，银杏内酯采用醇提的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，本发明制备的银杏内酯得率增加，含量高，纯度达97-98%，现有技术未发现其在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用，表明本品有希望做成这样的药物。
【具体实施方式】
[0016]以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0017]实施例1
[0018]取银杏叶1000g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30°C，CO2流量1ml/g生药.min，萃取时间150min，得超临界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W,萃取2次，每次4分钟，每次加入的70%乙醇量为2000g，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物，经高效液相色谱法测定银杏内酯a、b、c的含量为97.8%。
[0019]实施例2
[0020]取银杏叶lOOOg，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50°C，CO2流量3ml/g生药.min，萃取时间180min，得超临界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W,萃取2次，每次8分钟，每次加入的70%乙醇量为2000g，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物，经高效液相色谱法测定银杏内酯a、b、c的含量为98.1%。
[0021]实施例3
[0022]取银杏叶lOOOg，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.min，萃取时间160min，得超临界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W,萃取2次，每次6分钟，每次加入的70%乙醇量为2000g，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物，经高效液相色谱法测定银杏内酯a、b、c的含量为98.3%。
[0023]上述实施例中银杏叶为银杏科银杏(白果树、公孙树)Ginkgo biloba L.的干燥叶。
[0024]实施例4:银杏内酯抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖的实验研究资料
[0025]I实验材料
[0026]1.1实验用 细胞株
[0027]大鼠胶质瘤(C6)，南京正亮医药科技有限公司实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0028]1.2实验药物
[0029]研究药物:本发明银杏内酯:按实施例3方法制备。
[0030]药液储液:称取IOOmg银杏内酯，溶于5ml无水乙醇中，0.2 μ m滤器过滤，500 μ Idoff管分装，-20°C存储，同时0.2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0031]1.3实验试剂
[0032]DMEM (GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419)；NaHC03 (上海久亿化学试剂有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批号:2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批号:2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批号:2010242);Str印tomycin SulfateCAMRESCO公司批号:2010382);无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号:080310182);MTT(Biosharp批号:0793) ; PBS (实验室自配)；1.4实验器材
[0033]莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DM1L);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRA MAX190) ；C02培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:ΚΑ-1000) ;0.2μπι滤器(MILLIP0RE型号:SLGP033RB) ;10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司)；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0034]2实验方法
[0035]I) C6细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养(IOcm培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 104个/ml。[0036]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ 1，培养板放入细胞培养箱中(37 °C，5%C02 )常规培养。
[0037]3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入得生片溶液，继续培养24h。
[0038]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT),继续培养 4h。
[0039]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0040]6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0041]7)结果以药物对细胞的抑制率表示:
[0042]细胞增值抑制率(％)=(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值X 100%。实验重复3次。
[0043]3统计处理
[0044]采用Microsoft Excel2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean+ S.D.表不。
[0045]4实验结果
[0046]MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对C6细胞增殖抑制有差异(p〈0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(Ρ〈0.001)。
[0047]表1银杏内酯对C6细胞增殖抑制影响研究(XlbU)
【权利要求】
1.一种银杏内酯的提取方法，其特征在于取银杏叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生药.π?η，萃取时间150_180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W,萃取2次,每次4-8分钟,每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物。
2.根据权利要求1所述一种银杏内酯的提取方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3.根据权利要求1所述一种银杏内酯的提取方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40°C, CO2流量2ml/g生药.min,萃取时间160min。
4.根据权利要求1所述一种银杏内酯的提取方法，其特征在于所述微波萃取功率500W,每次萃取6分钟。
5.根据权利要求1所述一种银杏内酯在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用，其特征在于银杏内酯的提取步骤为:取银杏叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_501:，0)2流量l-3ml/g生药.min，萃取时间150_180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物。
6.根据权利要求5所述一种银杏内酯在制备抑制大鼠胶质瘤C6细胞增殖药物中的应用，其特征在于银杏内酯的提取方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，C02流量2ml/g生药.π?η，萃取时间160min，所述微波萃取功`率500W，每次萃取6分钟。
7.根据权利要求1所述一种银杏内酯在制备增加骨密度药物中的应用，其特征在于银杏内酯的提取步骤为:取银杏叶，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生药.min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得银杏内酯提取物。
8.根据权利要求7所述一种银杏内酯在制备增加骨密度药物中的应用，其特征在于银杏内酯的提取方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml/g生药.min，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
【文档编号】A61P19/10GK103483351SQ201310471503
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】不公告发明人 申请人:南京正亮医药科技有限公司