专利名称：一种高纯度银杏内酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及采用高速逆流色谱法(HSCCC)从银杏叶中制备银杏内酯的方法，特别是一种高纯度银杏内酯的制备方法。
背景技术：
银杏为银杏科落叶乔木。其叶、果实、种子均有较高的药用价值。银杏在我国分布很广，资源十分丰富。国内外对其研究报道较多，其药理作用不断被认识，临床应用范围逐步扩大。银杏叶的有效成份主要有黄酮甙和二萜内酯两类，银杏叶黄酮甙主要有槲皮素甙、山奈酚甙及双黄酮类化合物，银杏叶中的双黄酮成份为银杏双黄酮、异银杏双黄酮及7-去甲基银杏双黄酮。到目前为止，从银杏叶中共提得6个萜类化合物银杏苦内酯A、B、C、M、J和银杏新内酯，它们都具有二萜或半萜结构，银杏内酯分子具有独特的十二碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和6个5元环，包括一个螺(44)壬烷，一个四氢呋喃环和3个内酯环，常见代号BN52020、BN52021、BN52022、BN52023、BN52024，分别代表银杏内酯A、B、C、M、J，其中BN52021在银杏中的含量为0.2％，它的抗PAF(由血小板和多种炎症细胞产生和分泌的一种内源性磷脂)选择性和活动性最强。银杏叶的药理作用有血小板聚集和止血作用，能扩张冠脉血管增加冠脉流量，保护大脑，有抗炎、抗过敏和抗休克作用。银杏内酯A、B、C或单独用银杏内酯B可以应用于转移癌的治疗。它能提高抗癌化疗剂的效果，减少不良反应。银杏内酯还应用于肺移植的供体和受体中，使远距离肺移植成为可能。
银杏内酯的结构式如下
银杏内酯A R1＝OH，R2＝R3＝H银杏内酯B R1＝R2＝OH，R3＝H银杏内酯C R1＝R2＝R3＝OH银杏内酯J R1＝R3＝OH，R2＝H白果内酯的结构式如下 银杏内酯A的分子式C20H24O9，物化特性熔点300℃分解，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇，不溶于石油醚、正己烷等。
银杏内酯B的分子式C20H24O10，物化特性熔点300℃分解，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇，不溶于石油醚、正己烷等。
银杏内酯C的分子式C20H24O11，物化特性熔点300℃分解，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇，不溶于石油醚、正己烷等。
银杏内酯J的分子式C20H24O10，物化特性熔点300℃分解，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇，不溶于石油醚、正己烷等。
白果内酯的分子式C15H18O8，物化特性熔点300℃分解，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇，不溶于石油醚、正己烷等。
银杏叶中的五个银杏内酯共同存在，由于这五个化合物结构相似、极性相近，因而分离工作较为困难，各个内酯之间的分离只能用传统的色谱法进行有效分离。有机溶剂提取法是国内外使用最为广泛的方法，由于银杏叶中含黄酮类化合物和内酯较少(分别为1.7％及0.6％左右)，因此最终所得浸膏中此两类成分含量往往不高，所含杂质较多，需将此浸膏用液-液萃取法、沉淀法和吸附洗脱法进行进一步的分离纯化，但回收率低，成本高；树脂吸附纯化法近年来有较大的发展，将银杏叶以65％乙醇回流提取，减压浓缩，ZTC澄清剂沉降。其黄酮苷和内酯含量分别达到26％和6％以上。对吸附银杏叶中银杏总内酯用50％乙醇沸提银杏叶干粗粉，滤液上724吸附树脂柱，最后得淡黄色粉术状提取物，含黄酮苷和银杏总内酯分别为27.4％，10.6％。该法操作简单，能耗低，但步骤复杂，回收率低；近年来国际上超临界流体提取技术的迅速发展，用该技术提取植物中的活性成分也越来越广泛。与有机溶剂法相比，具有提取效率高，无溶剂残留，活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点，通过控制温度和压力以及调节改性剂的种类和用量，还可以实现选择性萃取和分离纯化，欧洲已有专利报道采用SFE技术除去银杏叶粗提物中的杂质。近年来国内学者(姚渭溪.银杏叶中活性成分的提取工艺测定及其进展.中草药，1995，26(3)157)也探索和研究用该技术提取银杏叶黄酮类化合物，得黄绿色精提物，收率为4.1％，其中黄酮苷含量在35％成本高。以乙醇和用大孔树脂提取的银杏叶精提物，于CO2-SFE精制前，毒性成分白果酸含量为2.0％，而用CO2-SFE精提后，白果酸含量降低到0.02％(夏开元.二氧化碳超临界流体萃取研究进展.中成药，1997，19(5)43)；高速逆流色谱技术(High-SpeedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，其原理是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固体相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固体相中分配比例大的后被洗脱。它避免了固态支持体或载体带来的各种问题——样品容易被吸附、损耗和变性，使其他液相色谱技术进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨率，分离量大、样品无损耗、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱仪能直接进大量粗提物样品或合成混合物，分离结果能够达到相当高的纯度，甚至能直接接质谱仪等仪器。因此，HSCCC具有操作简便，理论回收率为100％，重现性好和分离效率高、分离量较大的特点，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化，使其成为制备银杏黄酮苷元以及各银杏内酯和白果内酯对照品的较佳手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是采用高速逆流色谱法(HSCCC)，提供一种高纯度银杏内酯的制备方法。
本发明的技术方案包括如下步骤1.制备银杏总内酯作为进样物将银杏提取物以乙醇加热溶解，按1∶1-10的比例拌入硅胶，以乙酸乙酯、丙酮、正己烷-乙醇混合液、石油醚-丙酮混合液等有机溶剂进行洗脱，洗脱液蒸干浓缩。
2.制备银杏内酯A采用高速逆流色谱制备方法，银杏总内酯作为进样物，体系1为四个组分(A，B，C，D)，溶剂A组分可选自石油醚、正庚烷、正己烷等正构烷烃，B组分可选自乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷，C组分可选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮等脂肪醇及脂肪酮，D组分为水。
调节体系1中A，B，C，D四组组分的体积比依次为1-5∶5-9∶3-7∶1-5例如2∶6∶3∶5；3∶5∶3∶5；10∶50∶30∶50等，经一次分离后可得到银杏内酯A、混合组分a、混合组分b。其中混合组分a包括银杏内酯C和银杏内酯J；混合组分b包括银杏内酯B和白果内酯。
优选正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水，体积比5∶5∶5∶4。
3.分别制备银杏内酯C、J和银杏内酯B、白果内酯体系2为上述四个组分(A，B，C，D)，调节体系2中A，B，C，D四组组分的体积比依次为0.5-3∶8-15∶2-5∶8-15例如2∶8∶3∶9；3∶11∶3∶12；10∶80∶30∶90等，取混合组分a经体系2分离后可得到银杏内酯C、银杏内酯J；优选体系2为正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水，体积比1∶8∶2∶8。
体系3为上述三个组分(B，C，D)，调节体系3中B，C，D三组组分的体积比依次为1-5∶3-7∶1-5例如2∶3∶5；3∶3∶5；10∶30∶50等，取混合组分b经体系3分离后得到银杏内酯B和白果内酯；优选体系3为氯仿—甲醇—水，体积比5∶4∶3。
实验条件适合温度15-30℃，在上述温度范围内，温度较低时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对峰形无多大影响。
主机转速和流速需控制在一定范围内，按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，采用TBE-300高速逆流色谱仪，该机型柱体积为300ml，进样圈为20ml，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为700-1200rpm，以1.0-2.5ml/min的流速将流动相泵入柱内。
本发明制备步骤包括有三个体系，二次分离过程。经过体系1的一次分离后收集到的银杏内酯A的馏分蒸干后乙醇结晶，可得到银杏内酯A的白色片状结晶。接收到的混合组分a经过体系2分离后，得到银杏内酯C、银杏内酯J；馏分蒸干后乙醇结晶可分别得到白色针状结晶和无色棱柱状结晶；接收到的混合组分b经过体系3分离后，得到银杏内酯B和白果内酯，馏分蒸干后乙醇结晶可分别得到白色棱柱状和白色粉术状结晶，经过紫外和蒸发光散射仪检测，纯度均在99％以上。
本发明方法采用了高速逆流色谱分离技术，是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使被分离物回收率高，理论达100％，本发明实际达到99％以上。又因为采用优选的溶剂体系，控制实验条件温度、调整主机转速和流速的工艺条件，可以高效率的分离，获得高纯度的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯单体(达到99％以上)。并且适合从各种工艺途径制备的银杏提取物。保证较高峰形分辨度，分离量大、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂、操作简便。
图1 银杏内酯分离流程。
具体实施例方式
实施例11.银杏内酯A的分离将银杏内酯粗提物以乙醇加热溶解，按1∶8的比例拌入硅胶，以乙酸乙酯、丙酮、正己烷-乙醇混合液、石油醚-丙酮混合液等有机溶剂进行洗脱，洗脱液蒸干浓缩后作为进样物。
从体系1中选取正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯A。按5∶5∶5∶4体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取1000mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上，同时得到包括银杏内酯C和银杏内酯J的混合组分a和包括银杏内酯B和白果内酯混合组分b。
2.银杏内酯C和银杏内酯J的分离从体系2中选取正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯C和银杏内酯J。按1∶8∶2∶8体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度控制在25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取混合组份a 700mg溶于10ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯C的白色针状结晶和银杏内酯J的无色棱柱状晶体，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上。
3.银杏内酯B和白果内酯的分离从体系3中选取氯仿—甲醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯B和白果内酯。按5∶4∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度控制在25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取混合组分b 400mg溶于10ml流动相中待用。用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯B的白色棱柱状和白果内酯的白色粉末状晶体，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上。
实施例21.银杏内酯A的分离将银杏内酯粗提物以乙醇加热溶解，按1∶2或1∶9的比例拌入硅胶，以乙酸乙酯、丙酮、正己烷-乙醇混合液、石油醚-丙酮混合液等有机溶剂进行洗脱，洗脱液蒸干浓缩后作为进样物。
从体系1中选取正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯A。按2∶6∶4∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取1000mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上，同时得到包括银杏内酯C和银杏内酯J的混合组分a和包括银杏内酯B和白果内酯混合组分b。
2.银杏内酯C和银杏内酯J的分离从体系2中选取正庚烷—乙酸乙酯—甲醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯C和银杏内酯J。按0.5∶9∶3∶8体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度控制在25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取混合组分a 700mg溶于10ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯C的白色针状结晶和银杏内酯J的无色棱柱状晶体，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上。
2.银杏内酯B和白果内酯的分离从体系3中选取氯仿—甲醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯B和白果内酯。按2∶4∶3体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度控制在25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取混合组分b 400mg溶于10ml流动相中待用。用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯B的白色棱拄状结晶和白果内酯的白色粉末状晶体，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上。
实施例31.银杏内酯A的分离将银杏内酯粗提物以乙醇加热溶解，按1∶5的比例拌入硅胶，以乙酸乙酯、丙酮、正己烷-乙醇混合液、石油醚-丙酮混合液等有机溶剂进行洗脱，洗脱液蒸干浓缩后作为进样物。
从体系1中选取正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯A。按4∶8∶6∶4体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取1000mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯A的白色片状结晶，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上，同时得到包括银杏内酯C和银杏内酯J的混合组分a和包括银杏内酯B和白果内酯混合组分b。
2.银杏内酯C和银杏内酯J的分离从体系2中选取正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯C和银杏内酯J。按2∶14∶4∶12体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度控制在25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取混合组分a 700mg溶于10ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯C的白色针状结晶和银杏内酯J的无色棱柱状晶体，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上。
2.银杏内酯B和白果内酯的分离从体系3中选取氯仿—甲醇—水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备银杏内酯B和白果内酯。按4∶6∶4体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度控制在25℃。采用TBE-300型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，8823A-UV紫外检测器，ELSD(蒸发光散射检测仪)和Yokogawa3057便携式记录仪。
称取混合组分b 400mg溶于10ml流动相中待用。用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1.0ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。目标馏分蒸干后用乙醇结晶可得到银杏内酯B的白色棱拄状结晶和白果内酯的白色粉末状晶体，经过HPLC-UV及ELSD的检测，它们的纯度在99％以上。
权利要求
1.一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备银杏总内酯作为进样物将银杏提取物以乙醇加热溶解，拌入硅胶，用有机溶剂洗脱蒸干浓缩；(2)制备银杏内酯A采用高速逆流色谱制备方法，银杏总内酯作为进样物，溶剂体系1是四个组分(A，B，C，D)，体系A组分可选自石油醚、正庚烷、正己烷等正构烷烃，B组分可选自乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷，C组分可选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮等脂肪醇及脂肪酮，D组分为水；调节体系1中A，B，C，D四组组分的体积比依次为1-5∶5-9∶3-7∶1-5，经分离后可得到银杏内酯A、混合组分a、混合组分b；(3)分别制备银杏内酯C、J和银杏内酯B、白果内酯体系2是四个组分(A，B，C，D)，调节A，B，C，D四组组分的体积比依次为0.5-3∶8-15∶2-5∶8-15，取混合组分a经体系2分离后得到银杏内酯C、银杏内酯J；体系3是三个组分(B，C，D)，调节B，C，D三组组分的体积比依次为1-5∶3-7∶1-5，取混合组分b经体系3分离后得到银杏内酯B和白果内酯。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的实验条件温度是15-30℃，主机转速是700-1200rpm，所述的流动相泵入柱内的流速为1.0-2.5ml/min。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系1是正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水，体积比3-5∶5-7∶4-6∶3-5。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系2是正己烷—乙酸乙酯—乙醇—水，体积比0.5-1.5∶8-10∶2-4∶8-10。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系3是氯仿—甲醇—水，体积比4-5∶3-5∶2-4。
6.根据权利要求3所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系1体积比是1-3∶5-7∶3-5∶1-5。
7.根据权利要求4所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系2体积比是0.5-1∶8-10∶2-4∶7-10。
8.根据权利要求5所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系3体积比是1-5∶2-5∶2-4。
9.根据权利要求1或4或7所述的一种高纯度银杏内酯的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系2是正庚烷—乙酸乙酯—甲醇—水。
全文摘要
本发明涉及采用高速逆流色谱法(HSCCC)从银杏叶中分离一种高纯度银杏内酯的制备方法。用三个溶剂体系，分别经过两次HSCCC分离后，可得到银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯，纯度均达到99％以上。本方法适用各种型号高速逆流色谱仪和各种含量的银杏内酯的制备，具有分离量大，回收率高，操作简便的特点。
文档编号C07D493/04GK1680392SQ20051002316
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月7日 优先权日2005年1月7日
发明者符晓晖, 邓秋云 申请人:上海同田生化技术有限公司