口腔用组合物的制作方法
【专利摘要】提供一种有生物膜形成抑制作用的口腔用组合物。该口腔用组合物含有至少1种肉桂酸或其类似物,以肉桂酸或其类似物至少具有1个甲氧基为特征。
【专利说明】口腔用组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的龋齿生物膜形成抑制剂。
【背景技术】
[0002]细菌和细菌产生的菌体外粘性多糖(糖萼，夕'' 1J -力1J 'y >7 , glycocalyx)在固相表面形成的集合体称为生物膜，在地球环境中有水的地方大多能看到生物膜，口腔内的牙菌斑(牙垢)是通过唾液产生生物膜的典型例子。口腔内常驻菌群?致龋菌在牙齿表面形成的生物膜和牙周病原性细菌等牙周袋内形成的生物膜是由多种微生物及其产物构成的，相互之间互相影响，营养源共通，形成了对药物显示出抗性等作为共同体的小宇宙。现有的抗菌剂和抗体难以渗透到该生物膜中，对于浮游细菌有效果的抗菌剂和抗体对生物膜的形成的抑制的方面实际效果非常弱。为了发挥这些药物的生物膜形成抑制效果，需要机械性地破坏该生物膜一次。与生物膜内的病原性细菌相关的感染症称为生物膜感染症，龋齿、牙周病等都是生物膜感染症的一种。
[0003]牙垢是由生活在口腔内富于变化的环境中的细菌和其他微生物群落构成的。该群落被称为“生物膜”，主要形成于牙的牙釉质等坚硬组织表面。生物膜经由一个连续的过程形成，可分为数个阶段。第一阶段，形成获得性膜，这是在牙齿表面吸附了特定的唾液蛋白、通过蛋白质分子间的凝集蓄积形成的膜，因此附着了大量细菌。口腔内的链球菌等作为形成初期菌落的细菌最初在膜上附着，形成聚集。形成初期菌落的细菌一旦开始分裂.繁殖即进入第二阶段，在细菌周围形成基质。形成中期到后期菌落的细菌可以通过该基质进行附着。附着的细菌菌落生长、牙垢中的生物数量增加，一旦成熟则生物膜的复杂结构将发生变化。其结果是，对抗菌药物的耐受性增强，更加难以去除。生物膜外侧的细菌由于充分地得到了氧气，实现了营养物质和氧气的利用，并且在内侧被包围的间隙中没有氧气也可繁殖的厌氧菌开始繁殖。认为很多这样的细菌是病因，实际上与牙周病的发病相关。另外牙菌斑生物膜也可形成于牙齿之间和咬合部位的小洞等间隙中。
`[0004]附着在物体表面的微生物不是单独存在的，而是在具有特征的结构中与其他的微生物一起形成生物膜。也考虑过该生物膜是否也同对固定化微生物的利用一样起到对人类有益的作用，但事实表明正相反它是引起龋齿及食品污染的原因，近年来正积极地进行着对它的研究。
[0005]口腔生物膜由700种以上的细菌构成，Img中存在IO8个以上的菌。其中占多数(20%~40% )的链球菌(Streptococci)在以口腔表面的细菌间传达为基础，通过动态的细菌间活性物质形成生物膜。其中，变形链球菌(Streptococcus mutans:S.mutans)产生具有粘着性的菌体外多糖，起到形成具有病原性的生物膜的中心作用。已知口腔生物膜是导致龋齿及牙周病的原因，已经发现这些疾病是微生物感染症。
[0006]以往的龋齿预防中，主流的思考方法是将变形链球菌灭菌来抑制龋齿，但由于实际上龋齿病灶上存在生物膜，妨碍了抗菌物质的渗透，不仅往往得不到预想的效果，还常常伴有出现耐性菌的风险。此外，也有人认为通过刷洗或刮除等机械性的除去生物膜最有效，但对于像需护理的高龄者等难以进行这种机械的口腔生物膜的控制的人们而言，用现在的方法难以实施精确的口腔护理，期望开发与以往不同的切入口下的生物膜除去、预防蛀牙的方法。
[0007]近年来，已知作为信息传达体系的分子机理的群体效应(QS ；Quorum sensing ;依赖于细菌密度的基因表达调控体系)对变形链球菌的生物膜的病原性表达起作用，以及变形链球菌的QS由感受态刺激肽(Competence stimulating peptide:CSP)调控。现在，以该QS为靶点的病原性的表达和控制的研究不仅与口腔疾患有关，也期待与其他微生物感染症的预防方法开发有关联，虽然尝试了各种研究，但尚未实现实用化。
[0008]专利文献I涉及显示了对蛀牙(龋齿)的形成非常相关的、以变形链球菌(Sreptococcus mutans)为代表的口腔内微生物的繁殖有优良阻止效果,可防止与口腔内微生物有关的牙垢的形成，对预防蛀牙有效的蛀牙防止剂。公开了该蛀牙防止剂中适用的有效成分异戊酸、2-甲基丁酸，例举了显示出对变形链球菌繁殖有阻止效果的一类化合物肉桂酸。然而，没有确认肉桂酸对于牙垢形成有阻止效果，也完全没有公开和提示其对生物膜形成的效果。
[0009]本发明以发现显示了生物膜形成抑制效果的物质为目的，着眼于变形链球菌的生物膜形成中的群体效应系统，探索通过阻碍依赖CSP的生物膜的形成完成阻碍龋齿生物膜形成的物质，尝试开发新的龋齿抑制原材料。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1:日本专利特公平3-60802号公报
【发明内容】
[0013]发明所要解决的技术问题
[0014]一直以来，使用抗菌剂的龋齿抑制方法由于口腔生物膜妨碍抗菌剂的渗透，难以得到所希望的龋齿抑制效果；另外，抗菌剂的使用中存在出现耐性菌的危险性高、不理想的问题。为了解决这样的问题，不从龋齿原因菌类的控制而从作为更安全高效的龋齿抑制法的生物膜控制的观点出发进行了研究。
[0015]解决技术问题所采用的技术方案
[0016]为了解决上述技术问题，进行认真研究的结果是，发现肉桂酸及其类似物具有与群体效应相关的蛀牙生物膜形成抑制效果，从而完成了本发明。
[0017]即，本发明通过抑制蛀牙细菌形成蛀牙生物膜的群体效应系统从而预防蛀牙，并在肉桂酸及其类似物中发现了该群体效应抑制剂。
[0018]发明的效果
[0019]本发明为一种涉及有生物膜形成抑制作用的化合物的、采用新作用机理的龋齿预防剂，由于它比蛀牙细菌的抗菌剂和葡糖基转移酶抑制剂更有效和安全，作为新的口腔组合物中新的原材料，可对口香糖和糖果等各种产品开展应用。
【专利附图】
【附图说明】
`[0020]图1是表示结构类似于肉桂酸的化合物的生物膜形成抑制活性的图。[0021]图2是表示肉桂酸类似物的不同用量下的生物膜形成抑制活性的图。
[0022]图3是表示化学结构中有无双键时生物膜形成抑制活性的差的图
[0023]图4表示肉桂酸的不同取代基对生物膜形成抑制活性的影响的图。
[0024]图5表示二甲氧基肉桂酸的结合位置不同时生物膜形成抑制活性的图。
[0025]图6表示肉桂酸中导入甲氧基数量导致的生物膜形成抑制活性的差的图。
【具体实施方式】
[0026]为了发现与以往原材料不同作用机理的龋齿预防原材料，着眼于变形链球菌的群体效应，对CSP诱导生物膜形成抑制物质进行了研究。Bodet C等人的研究报告了鲍耳山油柑(Acronychia baueri Schott)中含有的3_ (4’ -猶牛儿氧基_3’ -甲氧基苯基)_2_反式丙烯酸对变形链球菌和牙銀口 B卜啉单胞菌(Prphyromonas gingivalis)的生物膜的形成抑制效果，因此在确认了结构类似的化合物的CSP诱导生物膜形成抑制活性后，认为肉桂酸及其类似物具有活性。在对肉桂酸及结构相似的其他化合物的活性进行比较时，确认结构中的细微差别会影响活性，形成的生物膜的量有很大变化。该现象中化合物的什么部位起到识别作用尚不明确，但如果考虑变形链球菌能够识别细微差别，这将是非常令人感兴趣的现象。
[0027]另外，在研究肉桂酸的取代基后，暗示甲氧基可能是表达活性的一个关键。由于除肉桂酸之外，甲氧基苯甲醛和莨菪亭、二甲氧基苯甲酸、茴香脑等具有甲氧基的化合物也发现了生物膜形成抑制活性，考虑甲 氧基对活性有较大影响。
[0028]使用抗菌剂、杀菌剂等控制微生物?克服感染症的方法，处于出现耐性菌并与其对抗，新的抗生素的开发和其耐性菌的出现呈持续的交替重复的状态。但是，以信息传递分子和群体效应为目标的微生物控制方法被认为出现耐性菌的风险较低，因此今后的微生物控制方法，考虑从抗菌.杀菌向细菌内.细菌外的信息传递抑制转变。由于本发明所获得的肉桂酸类的生物膜形成抑制活性只在添加CSP时进行确认，因而在有关群体效应这一方面发挥效果的可能性较高，从出现耐性菌的观点考虑，认为安全性较高。
[0029]本发明涉及含有至少I种肉桂酸或其类似物的口腔用组合物，其中，肉桂酸具有至少I个甲氧基。
[0030]另外，本发明涉及含有至少I种肉桂酸或其类似物的群体效应抑制剂，其中，肉桂酸具有至少I个甲氧基。
[0031]另外，本发明涉及含有至少I种肉桂酸或其类似物的生物膜形成抑制剂，其中，肉桂酸具有至少I个甲氧基。
[0032]另外，本发明涉及含有上述口腔用组合物的漱口剂、牙膏、吸入剂、含片、以及食
品O
[0033]实施例
[0034]以下，通过具体实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0035]本实施例从以下观点出发对生物膜形成抑制活性进行评价。
[0036]1.肉桂酸、各个类似物的活性(图1)
[0037]2.肉桂酸、肉桂醛、肉桂酸甲酯根据用量变化的活性(图2)[0038]3.肉桂酸、苯丙酸的活性比较(图3)
[0039]4.根据肉桂酸的取代基的不同的活性比较(图4)
[0040]5.3种不同的甲氧基取代位置的二甲氧基肉桂酸的活性(图5)
[0041]6.肉桂酸中引入的甲氧基数量导致的活性差距(图6)
[0042](实施例1)
[0043](肉桂酸及其类似物的生物膜形成抑制活性评价)
[0044](1-1)试验物
[0045]作为肉桂酸及其类似物，试验物肉桂酸、香草醛、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、P-香豆酸、肉桂醛、肉桂酸甲酯、苯丙酸、2-甲氧基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、3-溴代肉桂酸、3-氟代肉桂酸、3-甲基肉桂酸、4-乙酰基肉桂酸、4-溴代肉桂酸、4-乙氧基肉桂酸、4-氟代肉桂酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、2，3-二甲氧基肉桂酸、2，5-二甲氧基肉桂酸、2，3，4-三甲氧基肉桂酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸全部使用市售的特级品。
[0046](1-2)生物膜的形成
[0047]对159株变形链球菌UA用5ml的脑心浸液培养基(Brain Heart Infusion:BHI)于37°C进行10小时的厌氧培养，在3000rpm下进行10分钟的离心分离，通过磷酸缓冲生理食盐水(PBS)将收集的细菌制备成OD55tlnm=0.5，将其作为供试菌悬浊液。生物膜形成通过使用96孔微型板来进行试 验。在各孔中添加生物膜形成抑制样品60 μ 1、CSP20 μ 1、变形链球菌供试菌悬浊液20 μ 1、添加有0.1 %蔗糖的托德一休伊特链球菌肉汤(Todd HewittBroth) 100μ 1，在37°C、5% CO2的条件下进行16小时的培养。
[0048](1-3)生物膜形成量的定量
[0049]除去培养后的上清液，用PBS对各孔进行2次清洗。清洗后，向各孔中添加0.25%番红溶液，静置15分钟后，除去多余的番红溶液，用PBS对各孔进行2次清洗。清洗后向各孔中添加乙醇，通过振荡30分钟使染色的番红溶出，使用微型板读数计测定492nm的吸光度，对生物膜形成量进行定量。
[0050]生物膜的形成量以未添加样品时的形成量为100，显示其比例。
[0051](1-4)试验结果
[0052]关于肉桂酸及其类似物:
[0053]图1表示肉桂酸以及结构类似于肉桂酸的化合物的生物膜形成抑制效果。添加了肉桂酸、P-香豆酸、咖啡酸时，生物膜形成量下降约20%。另一方面，添加绿原酸、阿魏酸、香草酸时生物膜形成量没有变化，由此确认虽然是结构类似的化合物但表现却不同。
[0054]另外，如果着眼于肉桂酸，虽然可确认结构中具有羧酸的肉桂酸的生物膜形成抑制活性呈浓度依赖性，但不能确认作为酯类的肉桂酸甲酯、肉桂酸醛等类似物有生物膜形成抑制活性。进一步，也不能确认苯丙酸的活性。由此暗示为了显示生物膜形成抑制活性，肉桂酸结构中的羧酸和双键是必需的(图2、3)。
[0055]关于肉桂酸中的取代基的影响:
[0056]确认各种取代基对活性的影响后发现，只有赋予甲氧基时才显示生物膜形成抑制活性。对取代位置进行研究后，确认只有在3位的位置上才有活性，在2位、4位赋予时生物膜形成量反而有增加的倾向(图4)。另外，使用二甲氧基肉桂酸确认甲氧基的位置和活性的强弱的相关性后发现，添加在3位上赋予甲氧基的3，4- 二甲氧基肉桂酸和2，3- 二甲氧基肉桂酸时确认存在浓度依赖性的生物膜形成抑制，但2，5- 二甲氧基肉桂酸没有看到活性(图 5)。
[0057]为了调查甲氧基的赋予数和生物膜形成抑制活性的相关性，比较了使用肉桂酸、甲氧基肉桂酸、二甲氧基肉桂酸、三甲氧基肉桂酸的活性。其结果是生物膜形成量与甲氧基的数量成正比地下降，确认甲氧基的数量对生物膜形成抑制活性有影响(图6)。
[0058]由上述实施例1确认，在探索通过群体效应的生物膜形成抑制物质后，数种肉桂酸类似物具有活性。根据赋予在肉桂酸上的取代基其活性增加或减少，在3位上赋予甲氧基时有特别显著的活性。
[0059]接着，通过常规方法制造含有本发明的包含肉桂酸及其类似物的生物膜形成抑制剂的漱口剂、牙膏、口臭用喷雾、含片、口香糖、糖果、压片糖、软糖、饮料。以下所示为它们的配方。在以下的配方中，使用了肉桂酸及其类似物中生物膜形成抑制效果最为显著的2，3，4-三甲氧基肉桂酸。本发明的范围不受这些实施例限制。
[0060](实施例2)
[0061 ] 按照下述配方制造漱口剂。
[0062]
【权利要求】
1.一种口腔用组合物，其特征在于，含有至少I种肉桂酸或其类似物。
2.如权利要求1所述的口腔用组合物，其特征在于，所述肉桂酸具有至少I个甲氧基。
3.—种生物膜形成抑制剂，其特征在于，含有至少I种肉桂酸或其类似物。
4.如权利要求3所述的生物膜形成抑制剂，其特征在于，所述肉桂酸具有至少I个甲氧基。
5.一种群体效应抑制剂，其特征在于，含有至少I种肉桂酸或其类似物。
6.如权利要求5所述的群体效应抑制剂，其特征在于，所述肉桂酸具有至少I个甲氧基。
7.漱口剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的口腔用组合物。
8.牙膏，其特征在于，包含权利要求1或2所述的口腔用组合物。
9.吸入剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的口腔用组合物。
10.含片剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的口腔用组合物。
11.食品，其特征在于，包 含权利要求1或2所述的口腔用组合物。
【文档编号】A61K8/36GK103813777SQ201280043570
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年9月6日 优先权日:2011年9月8日
【发明者】津金贵则, 佐伯洋二 申请人:罗蒂株式会社