使蛋白质稳定的制剂的制作方法

使蛋白质稳定的制剂的制作方法
【专利摘要】一方面，本发明提供使蛋白质稳定的制剂，其中所述制剂包含缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。在一些实施方案中，所述蛋白质为治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
【专利说明】使蛋白质稳定的制剂
发明领域
[0001]本发明提供使蛋白质稳定的制剂，所述蛋白质包括治疗性蛋白质如抗凝血酶。
[0002]发明背景
[0003]治疗性蛋白质有限的稳定性是制药工业生产阶段和用于给药的最终的治疗性蛋白质制剂的保存中普遍的问题。例如，在治疗性蛋白质的生产过程中(例如，合成、重组或转基因)，蛋白质通常在各种纯化和处理步骤间长期保存，而且制剂组分可影响治疗性蛋白质的稳定性。

【发明内容】

[0004]一方面，本发明提供使蛋白质(如治疗性蛋白质)稳定的制剂。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，且其中所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐具有相同的抗衡离子。在一些实施方案中，所述抗衡离子为钠离子或钾离子。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
[0005]在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂基本上由磷酸一氢钾和磷酸二氢钾组成。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂基本上由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠组成。在一些实施方案中，所述制剂不同时包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述制剂不同时包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钠。
[0006]在一些实施方案中，所述制剂包含治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
[0007]—方面，本发明提供包含治疗性蛋白质和缓冲剂的制剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为IOmM至lOOmM。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为50mM。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述制剂还包含氯化钾。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述氯化钾浓度为100至150mM。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述氯化钾浓度为120mM。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述制剂的pH为7.5至8.5。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述制剂的pH为8。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述制剂包含澄清的乳制品。在本文所公开的任何制剂的一些实施方案中，所述制剂包含其它蛋白质。
[0008]一方面， 本发明提供包含抗凝血酶的制剂。在本文所公开的任何含抗凝血酶制剂的一些实施方案中，与保存前的肝素结合功能相比，在2-8°C保存3个月后所述抗凝血酶维持至少90%肝素结合功能。在本文所公开的任何含抗凝血酶制剂的一些实施方案中，在
2-8°C保存3个月后聚集形式的抗凝血酶增加的量(以重量计)小于保存前的聚集形式抗凝血酶的量(以重量计)的3倍。在本文所公开的任何含抗凝血酶制剂的一些实施方案中，在2-8°C保存3个月后抗凝血酶氧化增加的量小于保存前抗凝血酶氧化的量的2倍。
[0009]一方面，本发明提供生成使治疗性蛋白质稳定的制剂的方法，所述方法包括提供含缓冲剂的溶液，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠，并将治疗性蛋白质加入至所述溶液中从而得到使所述治疗性蛋白质稳定的制剂。
[0010]一方面，本发明提供生成使治疗性蛋白质稳定的制剂的方法，所述方法包括提供含治疗性蛋白质的溶液，并将缓冲剂加入至所述溶液中从而得到使治疗性蛋白质稳定的制剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和
磷酸二氢钠。
[0011]在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，所得缓冲剂的浓度为50mM。在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，所述制剂还包含氯化钾。在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，所得溶液的pH为8。在本文所公开的任何方法的一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
[0012]一方面，本发明提供生成稳定抗凝血酶的制剂的方法，所述方法包括从含抗凝血酶的乳组合物(milk composition)分离抗凝血酶从而得到含抗凝血酶的溶液，巴氏灭菌该含抗凝血酶的溶 液，将该含抗凝血酶的溶液与缓冲剂交换，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠，从而生成稳定抗凝血酶的制剂。
[0013]本发明的各项限制可涵盖本发明的各种实施方案。因此，可预期本发明涉及任何一种要素或要素组合的各项限制可包含于本发明的各个方面。本发明不限于其在以下说明书中所述或附图中所示的组成详情和组分布置的应用。本发明能够有其它实施方案并可以多种方式实施。而且，本文所用的术语和短语用于说明目的且不应视为对本发明的限制。
[0014]附图简沭
[0015]图1显示在多种缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的氧化状态。
[0016]图2显示在多种缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的肝素亲和性。
[0017]图3显示在多种缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的聚集。
[0018]图4显示在多种缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶的氧化状态。
[0019]图5显示在多种缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶的肝素亲和性。
[0020]图6显示在多种缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶的聚集。
[0021]图7提供在磷酸盐系统中冻/融后抗凝血酶稳定性参数的概述。
[0022]图8提供在磷酸盐系统中在2_8°C保存I个月后抗凝血酶稳定性参数的概述。
[0023]图9提供在磷酸盐系统中在2_8°C保存3个月后抗凝血酶稳定性参数的概述。
[0024]图10显示在多种缓冲剂中在2_8°C保存I个月后抗凝血酶稳定性参数的概述。
[0025]图11显示在多种含氯化钾的缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的氧化状态。
[0026]图12显示在多种含氯化钾的缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的肝素亲和性。
[0027]图13显示在多种含氯化钾的缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的凝集。
[0028]图14提供在多种含氯化钾的缓冲剂中冻/融后抗凝血酶稳定性参数的概述。
[0029]图15显示在多种含氯化钾的缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶的氧化状态。[0030]图16显示在多种含氯化钾的缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶的肝素亲和性。
[0031]图17显示在多种含氯化钾的缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶的聚集。
[0032]图18显示在多种含氯化钾的缓冲剂中在2_8°C保存后抗凝血酶稳定性参数的概述。
[0033]图19显示在24个月内抗凝血酶的氧化。
[0034]图20显示在24个月内抗凝血酶的聚集。
[0035]图21显示在24个月内抗凝血酶的肝素亲和性。
[0036]图22显示使用常规方法的肝素洗出液的流量数据。
[0037]图23显示使用澄清乳的肝素洗出液的流量数据。
[0038]图24显示肝素洗出液的SDS Page电泳。
[0039]图25显示抗凝血酶制剂批号300-21-DS的稳定性。
[0040]图26显示抗凝血 酶制剂批号300-22-DS的稳定性。
[0041 ] 图27显示抗凝血酶制剂批号300-23-DS的稳定性。
[0042]图28显示抗凝血酶制剂的氧化。
[0043]图29显示抗凝血酶制剂的肝素亲和性。
[0044]图30显示抗凝血酶制剂的聚集。
[0045]图31显示抗凝血酶制剂的蛋白质浓度。
[0046]图32显示抗凝血酶制剂的凝血酶抑制活性。
[0047]图33显示抗凝血酶制剂的比活性。
[0048]这些附图用于解释本发明的可实施性而不是实施本发明所必需的。
[0049]发明详沭
[0050]一方面，本发明提供使蛋白质(如治疗性蛋白质)稳定的制剂。
[0051]本文所用的治疗性蛋白质为可被施用于患者治疗疾病或病症的蛋白质。治疗性蛋白质包括由生物体如细菌、植物、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞系和转基因哺乳动物产生的蛋白质，和合成产生的蛋白质。治疗性蛋白质的实例包括抗体(例如，单克隆抗体)、血液蛋白质(例如，因子VIII)、酶(例如，α-半乳糖苷酶)和激素类如胰岛素。本文所用的蛋白质(和治疗性蛋白质)还包括经修饰(例如通过糖基化，或通过标记)的蛋白质(和治疗性蛋白质)。
[0052]在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，其中所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐具有相同的抗衡离子。在一些实施方案中，所述抗衡离子为钠离子或钾离子。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
[0053]在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂基本上由磷酸一氢钾和磷酸二氢钾组成。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂基本上由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠组成。在一些实施方案中，所述制剂不同时包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述制剂不同时包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钠。
[0054]在一些实施方案中，所述制剂包含蛋白质。在一些实施方案中，所述制剂包含治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。[0055]在一些实施方案中，本发明提供允许蛋白质长时间保存而不损害该蛋白质稳定性的制剂。在一些实施方案中，本文所公开的制剂允许蛋白质(例如，治疗性蛋白质)在生产和纯化过程中的不同阶段长时间保存。在一些实施方案中，本文所公开的制剂允许蛋白质(例如，治疗性蛋白质)在升高温度(即，_20°C、4°C或室温)条件下长时间保存，同时维持该蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，本文所公开的制剂允许蛋白质(例如，治疗性蛋白质)在较低温度(即，_40°C或-60°C )长时间保存，同时维持该蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，本文所公开的制剂维持蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的稳定性，即使保存条件不理想，例如含该蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的制剂经受冻融循环。
[0056]出乎意料地，本文发现含缓冲剂的制剂可维持蛋白质的稳定性，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，且其中两种磷酸根离子具有相同的抗衡离子。因此，一方面，本发明提供含缓冲剂的制剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，且其中两种磷酸根离子具有相同的抗衡离子。出乎意料地，本文还发现含缓冲剂的制剂(其中所述缓冲剂包含磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，且其中两种磷酸根离子不具有相同的抗衡离子)不维持蛋白质的稳定性。
[0057]本发明发现含缓冲剂(其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾)的制剂和含缓冲剂(其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠)的制剂可使治疗性蛋白质稳定。相反，含缓冲剂(其中所述缓冲剂 包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钠)的制剂或含缓冲剂(其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钾)的制剂不稳定该治疗性蛋白质。
[0058]在一些实施方案中，本文所公开的制剂使蛋白质稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使治疗性蛋白质稳定。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
[0059]本文所公开的制剂可用于使蛋白质稳定而无论该蛋白质的制备方法(例如，转基因、重组或合成)。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使乳制蛋白质(milk-producedprotein)稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使重组产生的蛋白质稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使乳制治疗性蛋白质稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使重组产生的治疗性蛋白质稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使乳制抗凝血酶稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂使重组产生的抗凝血酶稳定。
[0060]本文所公开的制剂可用于在蛋白质产生过程的任意阶段中使蛋白质稳定。在一些实施方案中，本文所公开的制剂用于在收获阶段后立即(例如，在从转基因动物乳汁收获蛋白质后立即，在从裂解细胞收获蛋白质后立即，或在合成蛋白质后立即)使蛋白质稳定。在一些实施方案中，所述制剂包含乳。在一些实施方案中，所述制剂包含来源于裂解细胞的组分或来源于蛋白质合成的组分。
[0061]在一些实施方案中，本文所公开的制剂用于稳定仅部分纯化的蛋白质。例如，可收获所述蛋白质并在一步或两步纯化步骤之后将所述蛋白质与本文所公开的任意缓冲剂混合以生成本文所公开的任意制剂。在一些实施方案中，所述制剂包含澄清的乳制品。在一些实施方案中，所述制剂包含来源于部分纯化的细胞裂解物的组分或来源于部分纯化的蛋白质合成反应的组分。在一些实施方案中，除所述待稳定的蛋白质(例如，治疗性蛋白质)外，所述制剂包含一种或多种蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述制剂包含非蛋白质组分。
[0062]在一些实施方案中，含所述蛋白质的组合物或溶液可经多步纯化步骤，然后将所述蛋白质与本文所公开的任意缓冲剂混合以生成本文所公开的任意制剂。在一些实施方案中，含所述蛋白质的组合物或溶液经巴氏灭菌，然后将所述蛋白质与本文所公开的任意缓冲剂(例如，磷酸一氢钾和磷酸二氢钾或磷酸一氢钠和磷酸二氢钠)混合。应当理解所述蛋白质可经巴氏灭菌和纯化步骤的组合，然后与本文所公开的任意缓冲剂混合。因此，例如，蛋白质(例如，治疗性蛋白质)可经第一步纯化步骤、巴氏灭菌步骤和第二步纯化步骤，然后与本文所公开的任意缓冲剂混合。
[0063]在一些实施方案中，在转基因动物的乳汁中产生所述蛋白质且从所述转基因动物的乳汁收获所述蛋白质。在一些实施方案中，澄清所述乳汁溶液以除去不溶性组分。在一些实施方案中，通过过滤澄清所述乳汁。在一些实施方案中，未进行另外的纯化步骤且在这些部分纯化步骤后添加组分以生成本文所公开的含治疗性蛋白质的制剂。在一些实施方案中，所述含治疗性蛋白质的制剂 经进一步纯化，然后给药。在一些实施方案中，所述含治疗性蛋白质的制剂经运输，然后进一步纯化用于给药。在一些实施方案中，所述含治疗性蛋白质的制剂经纳米过滤，例如用于除去病毒和病毒颗粒，然后运输和/或给药。
[0064]在一些实施方案中，所述蛋白质制剂经纯化以允许分析该制剂蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，所述蛋白质为抗凝血酶且通过将所述制剂与肝素柱接触来纯化所述制剂以除去杂质。在一些实施方案中，通过将所述制剂与阳离子交换柱接触来纯化所述制剂。在一些实施方案中，通过测定纯化所述制剂后的“稳定性指标”例如聚集、氧化来分析蛋白质的稳定性。在一些实施方案中，所述蛋白质为抗凝血酶且通过测定在肝素柱和阳离子交换柱上纯化所述制剂后的“稳定性指标”例如聚集、氧化来分析所述制剂。
[0065]本发明涵盖制备本文所公开的含蛋白质的制剂的任何方法。在一些实施方案中，所述蛋白质(例如以固体或以浓缩物)被加入至本文所公开的任意缓冲剂中以生成本发明的制剂。在一些实施方案中，所述制剂通过将一种或多种缓冲组分(例如，一定浓度的磷酸钾)加入至含所述蛋白质的组合物或溶液来制备。在一些实施方案中，所述制剂通过用本发明的缓冲剂(例如，磷酸一氢钾和磷酸二氢钾或磷酸一氢钠和磷酸二氢钠)替换含所述蛋白质的组合物或溶液的缓冲剂来制备。替换缓冲剂可例如通过以下方法完成:将含所述待稳定的蛋白质的组合物或溶液添加至柱中使得蛋白质固定，并用一种本文所公开的缓冲剂(例如，磷酸一氢钾和磷酸二氢钾或磷酸一氢钠和磷酸二氢钠)洗脱所述蛋白质。上述制备本文所述制剂的方法的组合也涵盖在本发明内。
[0066]稳定性
[0067]一方面，本发明提供使蛋白质稳定的制剂。在一些实施方案中，所述蛋白质为治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
[0068]本文所用的“使蛋白质稳定的制剂”是在一段时间内(例如，一个月或两个月)，优选在升高的温度(例如，_20°C或4°C )，或经一次或多次冻/融循环后维持蛋白质的稳定性的制剂。
[0069]本文所公开的制剂在一段时间内使蛋白质稳定。在一些实施方案中，所述制剂稳定所述蛋白质大于I天、大于两天、大于5天、大于I周、大于I月、大于2月、大于I年、多达10年。在一些实施方案中，所述制剂稳定所述蛋白质大于I年。在一些实施方案中，所述制剂稳定所述蛋白质2年。
[0070]在一些实施方案中，本文所公开的制剂在升高的温度条件下使蛋白质稳定。在一些实施方案中，升高的温度为大于-60°C、大于_50°C、大于_40°C、大于_30°C、大于-20°C、大于-10°C、大于0°C，或大于20°C。在一些实施方案中，所述升高的温度为_20°C。在其它实施方案中，所述升高的温度在(TC至-60°C、(TC至-50°C、(TC至-40°C、(TC至-30°C、(TC至-20°C、(TC至20°C、或2°C至8°C范围内。在一些实施方案中，所述升高的温度在2V至8°C范围内。在一些实施方案中，即使当所述制剂经一次或多次冻融循环时，本文所公开的制剂也使蛋白质稳定。在一些实施方案中，所述制剂在_20°C使所述蛋白质稳定2年。
[0071]本文所用的“蛋白质的稳定性”指的是蛋白质在一段时间内的结构完整性和功能性的持久性。因此，如果蛋白质在特定时间内维持其结构完整性和功能性(例如，生物功能性)则所述蛋白质是稳定的。类似地，如上所述，使蛋白质稳定的制剂为在一段时间内维持蛋白质稳定性的制剂。
[0072]蛋白质的结构完整性指的是所述蛋白质的多肽链构象的完整性和多肽链中氨基酸和氨基酸侧链的化学(chemistry)完整性。维持结构完整性的蛋白质是指维持多肽链的构象和多肽链中氨基酸和氨基酸侧链化学的蛋白质。例如，如果与一段时间之前相比，多肽在一段时间之后具有相同的构象且如果在这段时间内多肽链中的氨基酸和氨基酸侧链的化学未发生变化，则蛋白质在这段时间内维持了结构完整性。应当理解，维持相同的寡聚态也是蛋白质 结构完整性的一种量度。因此，如果蛋白质维持了相同的寡聚态(例如，仍为单体)，则该蛋白质可能维持了结构的完整性。本领域的技术人员将知晓如何测定蛋白质的结构完整性(构象、氨基酸的化学和寡聚态)。蛋白质的构象可使用标准实验室技术(包括X-射线晶体法、光谱法(包括圆二色光谱法和荧光光谱法)以及核磁共振)来测定。氨基酸的化学(包括侧链的化学)可通过化学反应测试特定化学基团的存在(例如，测定侧链的氧化状态)来测定，或通过上述可测定该蛋白质结构的实验室技术来测定。蛋白质的寡聚态可例如通过尺寸排阻色谱法(SEC)来测定。
[0073]蛋白质的功能性指的是该蛋白质执行的功能(例如，生物学功能)。维持功能性的蛋白质是指维持执行特定(生物学)功能的能力的蛋白质。例如，如果与一段时间之前蛋白质执行特定功能的能力相比，该蛋白质具有相同的能力，则该蛋白质在这段时间内维持了功能性。功能性的实例包括执行酶促反应(例如，裂解肽键)、结合靶标(例如，阻断受体)，或诱发细胞反应(例如，通过激活受体)的能力。测定各蛋白质功能性的具体方法取决于该蛋白质的性质。本领域的普通技术人员可使用本领域已知的方法寻找测定具体蛋白质的功能性活动所需的功能分析(functional assay)。很多蛋白质的功能性需要将该蛋白质结合至靶标。因此，蛋白质的功能性通常可通过研究蛋白质是否可结合具体的靶标来测定。该结合可在结构性分析(有无结合)或功能性分析(该蛋白质能否执行其生物学功能，例如它能否启动细胞信号级联、能否阻断蛋白质-蛋白质相互作用)中测定。功能分析的实例为结合分析、酶促分析和细胞分析。
[0074]在一些实施方案中，通过比较一段时间起始时蛋白质的结构完整性和/或功能性和一段时间(例如，3个月)结束时该蛋白质的结构完整性和/或功能性来测定该蛋白质的稳定性。例如，在特定时间之前测定蛋白质的聚集百分数并与这段时间之后该蛋白质的聚集百分数比较。
[0075]在一些实施方案中，通过比较不同保存条件下蛋白质的结构完整性和/或功能性来测定该蛋白质的稳定性。例如，在于2_8°C保存特定时间的第一等份中测定蛋白质的聚集百分数，并与在于-20°C保存相同时间的第二等份中测定的该蛋白质的聚集百分数比较。
[0076]在一些实施方案中，通过测定蛋白质的结构完整性和/或功能性的绝对值而不与不同条件下不同时间点的测定值比较来测定该蛋白质的稳定性。例如，在特定时间后测定蛋白质的聚集百分数并与预定标准比较。例如，在一些实施方案中，如果在具体样品中少于5%的蛋白质聚集，则该蛋白质视为是稳定的。在一些实施方案中，如果制剂中蛋白质的聚集百分数足够低以允许该制剂的纳米过滤，则该蛋白质制剂视为是稳定的。在一些实施方案中，纳米过滤可用作测定该蛋白质制剂是否可用于运输和/或给药的试验:如果该制剂可通过纳米滤器，则该制剂可用于运输。
[0077]在一些实施方案中，可通过比较蛋白质在一段时间(例如，I个月、2个月或3个月)之前和之后的结构完整性和/或功能性来测定蛋白质稳定性。在一些实施方案中，如果与一段时间之前的结构完整性和/或功能性相比，这段时间之后维持了大于50%、大于60%、大于70%、大于80%、大于90%、大于91%等、高达大于99%的结构完整性和/或功能性，则该蛋白质被稳定了。例如，在一些实施方案中，如果与保存前的功能性相比，蛋白质保存3个月后维持了大于95%的该蛋白质的功能性，则该蛋白质被稳定了。
[0078]在一些实施方案中，通过比较蛋白质在不同温度保存一段时间(例如，I个月、2个月或3个月)的结构完整 性和/或功能性来测定蛋白质稳定性。在一些实施方案中，如果与较低温度保存相比，在升高温度保存蛋白质时，蛋白质维持了大于50%、大于60%、大于70%、大于80%、大于90%、大于91%等、高达大于99%的结构完整性和/或功能性，则该蛋白质被稳定了。例如，在一些实施方案中，如果与较低温度(例如，-200C )保存相比，在升高温度(例如，2°C至8°C )保存蛋白质时，维持了大于95%的该蛋白质的功能性，则该蛋白质被稳定了。
[0079]在一些实施方案中，所述待测定稳定性的蛋白质为治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过测定可结合肝素的抗凝血酶的百分数或量来测定。在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过测定聚集的抗凝血酶的百分数或量(以重量计)来测定。在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过测定被氧化的抗凝血酶的百分数来测定。
[0080]在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过比较保存一段时间之前和之后的结合肝素的能力来测定。在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过比较保存在升高温度的第一等份中和保存在较低温度相同时间的等份中结合肝素的能力来测定。在一些实施方案中，若与保存一段时间之前相比，保存后大于50%、大于60%、大于70%、大于80%、大于90%、大于91%等、高达大于99%的抗凝血酶可结合肝素，则抗凝血酶被稳定了。在一些实施方案中，若与保存在较低温度相同时间的等份相比，保存在升高温度后大于50%、大于60%、大于70%、大于80%、大于90%、大于91%等、高达大于99%的抗凝血酶可结合肝素，则抗凝血酶被稳定了。在一些实施方案中，若与较低温度(例如_20°C )相比，当抗凝血酶保存在升高温度(例如2°C至8°C ) —段时间(例如，3个月)时，大于95%的抗凝血酶可结合肝素，则抗凝血酶被稳定了。
[0081]在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过比较保存一段时间之前和之后抗凝血酶的聚集(以重量计)来测定。在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过比较保存在升高温度的第一等份和保存在较低温度相同时间的等份中抗凝血酶的聚集(以重量计)来测定。在一些实施方案中，若与保存前聚集量相比，保存后聚集形式的抗凝血酶低于保存前聚集量的10倍、低于其9倍、低于其8倍、低于其7倍、低于其6倍、低于其5倍、低于其4倍、低于其3倍、低于其2倍、低于其1.5倍且直到与其相同的量,则抗凝血酶被稳定了。在一些实施方案中，若与较低温度相比，当抗凝血酶在升高温度保存时，聚集形式的抗凝血酶为低于其10倍、低于其9倍、低于其8倍、低于其7倍、低于其6倍、低于其5倍、低于其4倍、低于其3倍、低于其2倍、低于其1.5倍且直到与其相同的量,则抗凝血酶被稳定了。在一些实施方案中，若与较低温度(例如_20°C)保存一段时间(例如，3个月)的量相比，当蛋白质在升高温度(例如2°C至8°C )保存时聚集形式(以重量计)的抗凝血酶的量低于其3倍，则抗凝血酶被稳定了。
[0082]在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过比较保存一段时间之前和之后的抗凝血酶的氧化来测定。在一些实施方案中，抗凝血酶的稳定性通过比较升高温度保存的第一等份和较低温度保存相同时间的等份中抗凝血酶的氧化来测定。在一些实施方案中，若与保存前氧化的量相比，保存后氧化的抗凝血酶为低于其10倍、低于其9倍、低于其8倍、低于其7倍、低于其6倍、低于其5倍、低于其4倍、低于其3倍、低于其2倍、低于其1.5倍且直到相同的量，则抗凝血酶被稳定了。在一些实施方案中，若与较低温度相比，当抗凝血酶在升高温度保存时，氧化的抗凝血酶为低于其10倍、低于其9倍、低于其8倍、低于其7倍、低于其6倍、低于其5倍、低于其4倍、低于其3倍、低于其2倍、低于其1.5倍且直到相同的量，则抗凝血酶被稳定了。在一些实 施方案中，若与较低温度(例如_20°C)保存一段时间(例如，3个月)的量相比，当蛋白质在升高温度(例如2°C至8°C)保存时氧化的抗凝血酶的量低于其2倍，则抗凝血酶被稳定了。
[0083]在一些实施方案中，若与保存前相比保存3个月后至少90%的抗凝血酶结合肝素，或若低于2%的抗凝血酶是氧化的,或若低于5%的抗凝血酶是聚集的,或若至少90%的抗凝血酶结合肝素，则抗凝血酶被稳定了。
[0084]在一些实施方案中，若与保存前相比保存3个月后至少90%的抗凝血酶结合肝素，且低于2%的抗凝血酶是氧化的，且低于5%的抗凝血酶是聚集的，且至少90%的抗凝血酶结合肝素，则抗凝血酶被稳定了。
[0085]制剂
[0086]在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂。本文所用的缓冲剂为含弱酸及其共轭碱的组合物或弱碱及其共轭酸的组合。含缓冲剂的组合物或溶液通常比不含缓冲剂的组合物或溶液具有更稳定的pH。
[0087]在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，其中所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐具有相同的抗衡离子。在一些实施方案中，所述抗衡离子为钠离子或钾离子。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
[0088]在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂基本上由磷酸一氢钾和磷酸二氢钾组成。在一些实施方案中，所述制剂包含缓冲剂，其中所述缓冲剂基本上由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠组成。在一些实施方案中，所述制剂不同时包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述制剂不同时包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钠。[0089]“基本上”由磷酸一氢钾和磷酸二氢钾组成的缓冲剂为除磷酸一氢钾和磷酸二氢钾外不含有相似量的可作为缓冲剂的其它离子或其它组分的缓冲剂。本文所用的相似量，指的是相同量、0.9倍量、0.8倍量、0.7倍量、0.6倍量、0.5倍量、0.4倍量、0.3倍量，直到0.2倍量。因此，例如，基本上由磷酸一氢钾和磷酸二氢钾组成且包含50mM磷酸一氢钾和磷酸二氢钾的缓冲剂，不会还包含50mM的磷酸一氢钠或50mM的磷酸二氢钠。
[0090]类似地，“基本上”由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠组成的缓冲剂为除磷酸一氢钠和磷酸二氢钠外不含有相似量的可作为缓冲剂的其它离子或其它组分的缓冲剂。
[0091]因此，“基本上”由磷酸一氢钾和磷酸二氢钾组成的缓冲剂，不会还包含相似量的非钾(例如，钠)磷酸一氢盐和非钾(例如,钠)磷酸二氢盐。类似地基本上”由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠组成的缓冲剂，不会还包 含相似量的非钠(例如，钾)磷酸一氢盐和非钠(例如，钾)磷酸二氢盐。
[0092]在一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为IOmM至250mM或25mM至100mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为50mM。
[0093]在一些实施方案中，所述制剂还包含一种或多种盐。在一些实施方案中，所述盐为氯化钾。在一些实施方案中，所述氯化钾浓度为ImM至250mM、2mM至200mM，或10至150mM。在一些实施方案中，所述氯化钾浓度为120mM。
[0094]在一些实施方案中，所述制剂包含一种或多种除氯化钾之外的盐。可用于所述制剂的盐的非限制性实例包括铵盐和钙盐。在一些实施方案中，这些一种或多种额外的盐的浓度为IOmM至250mM、25mM至lOOmM。在一些实施方案中，所述盐浓度为50mM。在一些实施方案中，所述盐浓度为低于10mM。在一些实施方案中，所述盐浓度为大于250mM。在一些实施方案中，所述盐浓度为50mM。
[0095]在一些实施方案中，所述制剂包含治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为白蛋白、α-巨球蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、抗胰蛋白酶、脱辅基蛋白A、脱辅基蛋白B、脱辅基蛋白C、脱辅基蛋白D、脱辅基蛋白Ε、脱辅基蛋白F、脱辅基蛋白G、i3XIIa、Cl-抑制剂、C-反应蛋白、C7蛋白、Clr蛋白、Cls蛋白、C2蛋白、C3蛋白、C4蛋白、C4bP蛋白、C5蛋白、C6蛋白、Clq蛋白、C8蛋白、C9蛋白、羧肽酶N、血浆铜蓝蛋白、因子B、因子D、因子H、因子1、因子IX、因子V、因子VI1、因子Vila、因子VII1、因子X、因子X1、因子XI1、因子XII1、纤维蛋白原、纤连蛋白、结合珠蛋白、血红素结合蛋白、肝素辅因子I1、富含组氨酸 GP、IgA, IgD, IgE, IgG, IT1、IgM、激肽酶 I1、激肽原、溶菌酶、PAI2、PAI1、PC1、纤溶酶、纤溶酶抑制剂、纤溶酶原、前白蛋白、激肽释放酶原(prokalIikrein) >备解素、蛋白酶连接素、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、凝血酶原、TFP1、硫醇-蛋白酶、血栓调节蛋白、组织因子(TF)、TPA、钴胺素传递蛋白(transcolabamin) I1、运皮质激素蛋白、转铁蛋白、玻璃粘连蛋白，或冯.威利布兰德因子(von wiIlebrand factor)。
[0096]在一些实施方案中，所述制剂包含I至50mg/ml的治疗性蛋白质、2至25mg/ml的治疗性蛋白质、3至10mg/ml的治疗性蛋白质、4至8mg/ml的治疗性蛋白质或5至6mg/ml的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述制剂包含低于lmg/ml的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述制剂包含大于50mg/ml的治疗性蛋白质。
[0097]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含I至50mg/ml的抗凝血酶、2至25mg/ml的抗凝血酶、3至10mg/ml的抗凝血酶、4至8mg/ml的抗凝血酶或5至6mg/ml的抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含5至6mg/ml的抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含低于lmg/ml的抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含大于50mg/ml的抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含至多IOOmg/ml的抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含大于100mg/ml的抗凝血酶。
[0098]应当理解所述制剂还可包含额外的组分，包括额外的蛋白质。例如，新收获的治疗性蛋白质的溶液(例如尚未纯化或仅仅部分纯化)可包含除所述治疗性蛋白质外的其它蛋白质(例如乳蛋白或细胞裂解物中发现的蛋白质)。在一些实施方案中，所述制剂包含多种额外的非蛋白组分(例如，乳或细胞裂解物中发现的非蛋白组分)。
[0099]在一些实施方案中，所述制剂的pH为pH6至pH9或pH7.5至pH8.5。在一些实施方案中，所述制剂的pH为pH8。如果需要可向制剂中加入酸(如HCl)或碱(如NaOH)以达到所需的pH。
[0100]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶且所述制剂的pH为pH7.5至pH8.5。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶且所述制剂的pH为pH8。应当理解所述制剂的PH可取决于所述治疗性蛋白质的性质。
[0101]在一些实施方案中,所述制剂不包含稳定性赋形剂(stabilizing excipient)。
[0102]在一些实施方案中，所述制剂包含稳定性赋形剂，如羧酸或其盐。在一些实施方案中所述羧酸为柠檬酸钠。在一些实施方案中，所述制剂包含一元羧酸和/或其盐。在一些实施方案中，所述制剂包含葡萄糖酸和/或葡萄糖酸钠。在一些实施方案中，所述制剂包含二元羧酸和/或其盐。在一些实施方案中，所述制剂包含柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、马来酸、酒石酸和/或其盐。在一些实施方案中，所述制剂包含三元羧酸和/或其盐。在一些实施方案中，所述制剂包含次氮基三乙酸和/或次氮基三乙酸钠。在一些实施方案中，所述制剂包含四元羧酸和/或其盐。在一些实施方案中，所述制剂包含乙二胺四乙酸(EDTA)和/或EDTA钠。在一些实施方案中，所述制剂包含五元羧酸和/或其盐。在一些实施方案中，所述制剂包含二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和/或DTPA钠。适宜的羧酸类包括但不限于，柠檬酸化合物，如柠檬酸钠；酒石酸化合物、琥珀酸化合物、丙二酸、葡萄糖酸、1，2，3，4- 丁烷四羧酸(BTC)、EDTA 或 DTPA 或其盐。Kaushil 等人(Protein Sciencel9998:222-233)和Busby 等人(the Journal of Biological Chemistry Volume256, Number2312140-1210_12147页)描述了羧酸及其用途。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂不起缓冲剂的作用。
[0103]在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂的浓度为50至600mM、250至500mM或250至350mM。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂浓度为50至100mM、50至150mM、50至200mM、50 至 250mM、50 至 300mM、50 至 350mM、50 至 400mM、50 至 450mM、50 至 500mM 或 50 至550mM。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂浓度为550至600mM、500至600mM、450至600mM、400 至 600mM、350 至 600mM、300 至 600mM、250 至 600mM、200 至 650mM、150 至 600mM或100至600mM。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂浓度为100至550mM、150至500mM、200至450mM、250至400mM或300至350mM。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂浓度为100、150、250、500或600mM。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂的浓度为低于100mM。在一些实施方案中，所述稳定性赋形剂的浓度为大于600mM。在一项实施方案中,所述稳定性赋形剂的浓度为300mM。
[0104]在一些实施方案中，所述制剂包含糖(例如，二糖)。通常，该糖可具有额外的稳定作用并可最小化蛋白质的聚集。在一些实施方案中，所述糖为二糖。可添加至所述制剂的二糖包括但不限于，蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。在一些实施方案中，所述制剂包含蔗糖或海藻糖作为所述二糖。
[0105]在一些实施方案中，所述糖以0.5至5%(重量/体积)存在。在一些实施方案中，所述糖为至少0.5%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%，或高达5%重量/体积。在一些实施方案中，所述糖以I至2% (重量/体积)存在。在一些实施方案中，所述糖以1%(重量/体积)存在。在一些实施方案中，所述糖以低于1%(重量/体积)存在。在一些实施方案中，所述糖以大于5%(重量/体积)存在。在一些实施方案中，所述糖为蔗糖或海藻糖且以1%(重量/体积)存在。
[0106]在一些实施方案中，所述稳定的液体制剂不包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述稳定的液体制剂还包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80、聚山梨酯20、吐温20或吐温80。在一些实施方案中，所述表面活性剂为0.5至1%体积/体积。在一些实施方案中，所述表面活性剂为0.5或1%体积/体积。在一些实施方案中，所述表面活性剂含有少量过氧化氢污染(例如，低于5mM、低于4mM、低于3mM、低于2mM或低于ImM过氧化氢)或无过氧化氢污染。
[0107]在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质的制剂包含于注射器、小瓶、瓶、安瓿和袋中。在一些 实施方案中，所述袋为EVA袋。在另一实施方案中，所述瓶为PETG瓶。
[0108]在一些实施方案中，所述制剂包含50mM磷酸钾盐(磷酸一氢钾和磷酸二氢钾)和120mM氯化钾，且pH=8。在一些实施方案中，所述制剂基本上由50mM磷酸钾盐(磷酸一氢钾和磷酸二氢钾)和120mM氯化钾组成且pH=8。
[0109]抗凝血酶
[0110]在一些实施方案中，所述制剂包含治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。抗凝血酶通常为具有432个氨基酸且分子量为58kDA的糖蛋白，其为抑制凝血酶和凝血因子Xa的丝氨酸蛋白酶抑制剂。所述抗凝血酶可为α形式的抗凝血酶III，但本发明的所述制剂可用于任何形式的抗凝血酶。抗凝血酶天然存在于血浆中，且人抗凝血酶可从人血浆中分离。人抗凝血酶还可通过重组方法产生,得到重组人抗凝血酶(rhAT ;除非特别说明，否则本文所用的术语“抗凝血酶”包括rhAT)。
[0111]重组抗凝血酶a可在转基因动物中产生且可用于治疗抗凝血酶a缺失的患者(见例如美国专利5，843，705、美国专利6，441，145和美国专利7，019，193)。ATryn?.是重组产生的人抗凝血酶a，其被FDA批准用于在遗传性抗凝血酶缺失的患者中预防围手术期和围产期的血栓事件。在欧洲，ATryn?被批准用于患有先天性抗凝血酶缺失的手术患者以预防临床危险情况中深静脉血栓形成和血栓栓塞。本文所用的术语“抗凝血酶”包括ATryn?。
[0112]本文所公开的抗凝血酶制剂在保存条件(如升高温度)下是稳定的。已发现本文所公开的抗凝血酶制剂在这样的保存条件下具有长贮藏期限并且维持所需的活性水平。
[0113]应当理解，本文所公开的制剂可用于稳定在给药前需进一步处理的抗凝血酶制剂和预备用于给药的制剂。因此，在一些实施方案中，所述抗凝血酶制剂在给药前可经运输，进一步处理，纯化和/或分成数批。在一些实施方案中，所述制剂包含乳制抗凝血酶。在一些实施方案中，所述制剂包含已被深层过滤纯化(US7，531，632)和/或已被TFF缓冲剂交换纯化(US6，268，487)的抗凝血酶。在一些实施方案中，所述抗凝血酶制剂还含有乳组分。在一些实施方案中，所述抗凝血酶制剂已被巴氏灭菌。
[0114]一方面，本发明提供产生稳定抗凝血酶的制剂的方法，所述方法包括从含抗凝血酶的乳组合物分离抗凝血酶从而得到含抗凝血酶的溶液，巴氏灭菌所述含抗凝血酶的溶液，将该含抗凝血酶的溶液与缓冲剂交换，其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠，从而生成稳定抗凝血酶的制剂。
[0115]加入制剂中的添加剂
[0116]在一些实施方案中，所述制剂包含一种或多种抗氧化剂。抗氧化剂为能够通过从溶液除去自由基抑制氧化的物质。抗氧化剂是本领域的普通技术人员所熟知的并包括以下物质:如抗坏血酸、抗坏血酸衍生物(例如，抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙等)、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、烷基没食子酸酯、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、连二亚硫酸钠、巯乙酸钠、甲醛次硫酸钠、生育酚和其衍生物(d-α -生育?)>d-a-生育酚乙酸酯、dl- a -生育酚乙酸酯、d- a -生育酚琥珀酸酯、β -生育酚、δ -生育酚、Y -生育酚和d- a -生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、单硫代甘油和亚硫酸钠。通常这些物料添加的范围为0.01至2.0%(重量/体积)。
[0117]在一些实施方案中，所述制剂包含一种或多种等张剂。本领域中该术语可与等渗剂互换使用，且已知其为加入至药物制剂中以增加渗透压至0.9%氯化钠溶液的渗透压(其与人细胞外液如血浆等渗)的化合物。优选等张剂为氯化钠、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖和甘油。
[0118]在一些实施方案中，所述制剂包含一种或多种防腐剂。适宜的防腐剂包括但不限于:氯丁醇(0.3-0.9%ff/V)、对羟基苯甲酸酯(0.01 - 5.0%)、硫柳汞(0.004 - 0.2%)、苯甲醇(0.5 - 5%)、苯酚(0.1 - 1.0%)等(重量/体积)。
[0119]方法
[0120]一方面，本发明提供生成使治疗性蛋白质稳定的制剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向溶液中加入缓冲剂，然后加入蛋白质。在一些实施方案中，所述方法包括向溶液中加入蛋白质，然后加入缓冲剂。在一些实施方案中，所述方法包括提供含蛋白质的溶液并向所述溶液中加入缓冲剂。
[0121]在一些实施方案中，所述方法包括添加含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾的缓冲剂。在一些实施方案中，所述方法包括添加含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠的缓冲剂。在一些实施方案中，所述方法包括提供含缓冲剂的溶液并向所述溶液中加入蛋白质。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
[0122]在一些实施方案中，所述方法包括从溶液除去缓冲剂。在一些实施方案中，所述方法包括从溶液除去缓冲剂并添加含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾的缓冲剂。在一些实施方案中，所述方法包括从溶液除去缓冲剂并添加含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠的缓冲剂。在一些实施方案中，所述溶液包含治疗性蛋白质。在一些实施方案中，所述添加缓冲剂和所述除去缓冲剂同时完成。在一些实施方案中，所述添加缓冲剂和所述除去缓冲剂是相继完成的。所述添加和除去缓冲剂可在含治疗性蛋白质的溶液上完成或所述治疗性蛋白质可在所述缓冲剂交换后添加。
[0123]在一些实施方案中，在所有上述方法中，所述缓冲剂被调至如上文所述的浓度水平(例如，50mM)。在这些方法的一些实施方案中，所述制剂的pH为如上文所述或被调至如上文所述(例如，PH为8)。
[0124]从溶液中除去或向溶液中添加盐的方法是本领域已知的，且包括渗析、缓冲剂交换、柱纯化等。
[0125]给药
[0126]在一些实施方案中，本发明提供在给药前需进一步处理的治疗性蛋白质的制剂。在一些实施方案中，本发明提供准备好用于给药的治疗性蛋白质的制剂。准备好用于给药的制剂包括在给药前需要最小的步骤如融解和/或转移至注射器的制剂。在一些实施方案中，本发明的制剂预期为用于静脉内、动脉内或胃肠外给药的浓缩制剂。因此，在一些实施方案中，所述制剂也主要预期为用于注射的浓缩制剂。
[0127]当单用或联用时，可给予治疗有效量的本文所述的制剂。治疗有效量可由如下所述的参数确定；但是，在任何情况下，治疗有效量是达成治疗患有一种本文所述病症(例如，遗传性或获得性抗凝血酶缺失)的患者(如人类患者)的药物有效水平的量。有效量是指延迟所治疗病症的发作、完全抑制所治疗病症或减轻所治疗病症的进展或完全地使所治疗病症的发作或进展停止所需的单次给药量或多次给药量。当向患者给药时，有效量毫无疑问地取决于所治疗的具体病症；所述病症的严重程度；个体患者参数，包括年龄、身体状况、身高和体重；同步治疗(concurrent treatment);治疗频率；以及给药方式。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知的，且可通过不超出常规实验的方法确定。通常优选使用最大剂量，其为根据合理的医学判断最高的安全剂量。
[0128]本文所述的制剂可包含可药用载体或可将本文所述的制剂稀释至可药用载体中。本文所用的术语“可药用载体”是指一种或多种相容性固体，或半固体或液体填充剂、稀释剂或包封物，其适于给药至人类或其它哺乳动物如狗、猫、马、牛、绵羊或山羊。术语“载体”表示有机或无机成分，天然的或合成的，其与活性成分混合以促进应用。所述载体能够与本发明的制剂混合，也能彼此混合，混合的方式使得没有实质上损害所需药物有效性或稳定性的相互作用。适于静脉内、动脉内和胃肠外等制剂的载体可参见Remington’sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，Easton，Pa。
[0129]在一项实施方案中，所述治疗性蛋白质的制剂是无菌的。
[0130]在另一实施方案中，所述治疗性蛋白质的制剂包含于试剂盒中。在一项实施方案中，所述试剂盒还包括使用所述制剂的说明。在另一实施方案中，所述试剂盒还包括注射器。在另一实施方案中，该试剂盒还包括给予所述制剂的说明。在另一实施方案中，该试剂盒还包括稀释所述制剂的溶液。在另一实施方案中，该试剂盒还包括将用于稀释所述制剂的溶液与所述制剂混合的说明。本发明的另一方面也提供前述试剂盒。
[0131]以下实施例进一步解释本发明，但不应解释为进一步限制。因此，本申请全文所引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、已公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容清楚地引入作为参考，尤其作为上文所引用的教导的参考。
实施例[0132]在实施例中，“磷酸K/Na”指的是磷酸一氢钾和磷酸二氢钠；“磷酸Na/K”指的是磷酸一氢钠和磷酸二氢钾；“磷酸Na/Na”指的是磷酸一氢钠和磷酸二氢钠；“磷酸K/K”指的是磷酸一氢钾和磷酸二氢钾。这四种缓冲剂在此共同地被称为“磷酸盐系统”。
[0133]实施例1
[0134]含抗凝血酶和多种磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的溶液，pH6、pH7或pH8 (磷酸盐缓冲剂)或pH6或pH7 (柠檬酸盐缓冲剂)，经冻融循环至_20°C或_40°C。在冻-融循环过程中将所述溶液保存在60ml袋中。所用抗凝血酶的浓度为5-10mg/ml。在进行冻-融循环之前和之后测定抗凝血酶的氧化状态、肝素亲和性以及聚集。通过尺寸排阻色谱(SEC)测定抗凝血酶的聚集(以百分数表示)。通过使用RP-HPLC分离所述抗凝血酶、然后使用肽图谱法测定抗凝血酶的氧化。图1显示在多种缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的氧化状态。图2显示在多种缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的肝素亲和性。图3显示在多种缓冲剂中冻/融后抗凝血酶的聚集。图7提供在冻/融后磷酸盐系统中抗凝血酶的稳定性参数的概述。
[0135]实施例2
[0136]含抗凝血酶和多种磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的溶液，pH6、pH7或pH8 (磷酸盐缓冲剂)或pH6或pH7 (柠檬酸盐缓冲剂)，在2°C至8°C保存长达3个月时间。所述溶液保存在60ml袋中。所用抗凝血酶的浓度为5-10mg/ml。在保存之前和之后测定抗凝血酶的氧化状态、肝素亲和性以及聚集(通过SEC)。通过使用RP-HPLC分离所述抗凝血酶、然后使用肽图谱测定抗凝血酶的氧化。通过将所述制剂与肝素结合柱接触、然后通过HPLC测定肝素结合。图4显示在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的氧化状态。图5显示在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的肝素亲和性。图6显示在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的聚集。图8提 供在磷酸盐系统中在2-8°C保存I个月后抗凝血酶的稳定性参数的概述。图9提供在磷酸盐系统中在2-8°C保存3个月后抗凝血酶的稳定性参数的概述。图10提供在多种缓冲剂中在2-8°C保存I个月后抗凝血酶的稳定性参数的概述。
[0137]实施例3
[0138]将氯化钾(120mM，pH7.5)加入至含抗凝血酶和多种磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的溶液中，分别为PH6、pH7或pH8 (磷酸盐缓冲剂)或pH6或pH7 (柠檬酸盐缓冲剂)。随后所述溶液经冻-融循环至-20°C或-40°C。在冻-融循环过程中将所述溶液保存在60ml袋中。所用抗凝血酶的浓度为5-10mg/ml。在进行冻-融循环之前和之后测定抗凝血酶的氧化状态、肝素亲和性以及聚集。通过使用RP-HPLC分离所述抗凝血酶、然后使用肽图谱测定抗凝血酶的氧化(以百分数表示)。通过将所述制剂与肝素结合柱接触、然后通过HPLC测定肝素结合。通过尺寸排阻色谱(SEC)测定抗凝血酶的聚集(以百分数表示)。图11显示在多种缓冲剂中在冻/融后抗凝血酶的氧化状态。图12显示在多种缓冲剂中在冻/融后抗凝血酶的肝素亲和性。图13显示在多种缓冲剂中在冻/融后抗凝血酶的聚集。图14提供在冻/融后在多种缓冲剂中在抗凝血酶的稳定性参数的概述。
[0139]实施例4
[0140]将氯化钾(120mM，pH7.5)加入至含抗凝血酶和多种磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂的溶液中，分别为PH6、pH7或pH8 (磷酸盐缓冲剂)或pH6或pH7 (柠檬酸盐缓冲剂)中。所述溶液在2°C至8°C保存长达3个月时间。所述溶液保存在60ml袋中。在保存之前和之后测定抗凝血酶的氧化状态、肝素亲和性以及聚集(通过SEC)。通过使用RP-HPLC分离所述抗凝血酶、然后使用肽图谱测定抗凝血酶的氧化(以百分数表示)。通过将所述制剂与肝素结合柱接触、然后通过HPLC测定肝素结合。图15显示在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的氧化状态。图16显示在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的肝素亲和性。图17显示在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的聚集。图18提供在多种缓冲剂中在2-8°C保存后抗凝血酶的稳定性参数的概述。
[0141]实施例5
[0142]制备中试规模(pilot scale)的三批澄清起始物料(CSM)。在20°C在IOL袋中冷冻这些CSM的每一批并保存长达两年。在多个时间点，将袋子从冷冻库中移除、融解并纯化。通过监测该研究过程中的氧化、聚集和肝素亲和性来测定所述抗凝血酶α分子的稳定性。观察到在两年冷冻保存期中任何稳定性指标参数无显著变化(见图19-21)。
[0143]转基因山羊乳经澄清、巴氏灭菌和浓缩，然后放置于保存设施中直至纯化过程需要。最初，CSM调配于PBS pH7.4(50mM磷酸钠、150mM氯化钠)中，但经_20°C冷冻后，所述溶液在融解后导致聚集并丧失肝素亲和性。
[0144]使用钾盐制备的PBS制剂(pH大于7)稳定抗凝血酶α且在_20°C完全地冷冻。使用新的澄清制剂(50mM磷酸钾，120mM氯化钾，pH8.0)按比例放大该过程以测定整体冷冻(bulk freezing)是否影响该产物。
[0145]三批CSM通过深层过滤、巴氏灭菌和浓缩/渗滤至钾CSM制剂缓冲剂中制备。在冷冻之前，移除小份样品用于小规模纯化以测定O时间点的分析结果。每批分成两份大约5L的部分并过滤至IOL袋中。立刻将所述袋在_20°C冷冻并保存直至达到适当的时间点。测试时间表的概述如表1所记录。
[0146]表1CSM冷冻稳定性时间表
[0147]
【权利要求】
1.一种制剂，其包含治疗性蛋白质和缓冲剂， 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
2.权利要求1的制剂，其中所述缓冲剂的浓度为IOmM至lOOmM。
3.权利要求2的制剂，其中所述缓冲剂的浓度为50mM。
4.权利要求1-3任一项的制剂，其还包含氯化钾。
5.权利要求4的制剂，其中所述氯化钾的浓度为IOOmM至150mM。
6.权利要求4的制剂，其中所述氯化钾的浓度为120mM。
7.权利要求1-6任一项的制剂，其中所述制剂的pH为7.5至8.5。
8.权利要求7的制剂，其中所述制剂的pH为8。
9.权利要求1-8任一项的制剂，其中所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
10.权利要求1-9任一项的制剂，其中所述制剂包含澄清的乳制品。
11.权利要求1-10任一项的制剂，其中所述制剂包含另外的蛋白质。
12.权利要求9-11任一项的制剂，其中与保存前的肝素结合功能相比，在2-8°C保存3个月后所述抗凝血酶维持至少90%的肝素结合功能。
13.权利要求9-12任一项的制剂，其中在2-8°C保存3个月后聚集形式的抗凝血酶增加的量(以重量计)小于保存前的聚集形式抗凝血酶的量(以重量计)的3倍。
14.权利要求9-13任一项的制剂，其中在2-8°C保存3个月后抗凝血酶氧化增加的量小于保存前抗凝血酶氧化的量的2倍。
15.一种方法，其用于生成使治疗性蛋白质稳定的制剂，所述方法包括: 提供含缓冲剂的溶液， 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠，并且 将治疗性蛋白质加入至所述溶液中从而得到使所述治疗性蛋白质稳定的制剂。
16.一种方法，其用于生成使治疗性蛋白质稳定的制剂，所述方法包括: 提供含治疗性蛋白质的溶液，并且 将缓冲剂加入至所述溶液中从而得到使治疗性蛋白质稳定的制剂， 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠。
17.权利要求15或16的方法，其中所得到的缓冲剂的浓度为50mM。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述制剂还包含氯化钾。
19.权利要求15-18任一项的方法，其中所得到的溶液的pH为pH8。
20.权利要求15-19任一项的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗凝血酶。
21.一种方法，其用于生成使抗凝血酶稳定的制剂，所述方法包括: 从含抗凝血酶的乳组合物分离抗凝血酶从而得到含抗凝血酶的溶液， 巴氏灭菌所述含抗凝血酶的溶液， 将该含抗凝血酶的溶液用缓冲剂交换， 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钾和磷酸二氢钾，或 其中所述缓冲剂包含磷酸一氢钠和磷酸二氢钠，从而生成使抗凝血酶稳定的制剂。
【文档编号】A61K39/00GK103945862SQ201280043567
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月7日
【发明者】S.A.埃文斯, G.J.阿拉德, N.C.马希洛 申请人:Lfb美国股份有限公司