一种伯克氏菌株、其有机磷酯水解酶和基因及其在有机磷农药降解中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定为伯克氏属(Burkholderia?jiangsuensis)的菌株ECU1088，其保藏号为CGMCC?No.9028；该菌种表达的有机磷酯水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及利用该有机磷酯水解酶或重组有机磷酯水解酶降解有机磷农药的方法。本发明的有益效果在于：利用本发明提供的伯克氏菌株及其重组有机磷酯水解酶降解有机磷农药具有催化效果好、反应条件温和、对环境友好等显著优点。
【专利说明】一种伯克氏菌株、其有机磷酯水解酶和基因及其在有机磷农药降解中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】,具体涉及一株伯克氏属新种菌株Burkholderiajiangsuensis E⑶1088，其保藏号为CGMCC9028，该伯克氏新菌株表达的有机磷酯水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，及其重组酶的制备方法，还涉及有机磷酯水解酶或其重组酶作为催化剂降解有机磷农药的应用。
【背景技术】
[0002]有机磷农药是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，对人体具有较高毒性，威胁人类健康。农药残留是大量施用农药后的必然现象，如果超过最大残留限量，会对人畜产生不良影响，或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害。农药的发明和使用虽然大大提高了农作物的产量和效益，但随着科学技术的发展和人们生活水平的提高，农药残留对环境及人类健康造成的负面影响日益显露出来。
[0003]大量研究表明，土壤微生物对环境中的农药降解起着重要作用，筛选农药降解菌株无疑是控制农药残留量，保护生态环境及人类健康的有效手段，有机磷农药降解菌主要是从有机磷农药污染的土壤、水体或污泥等环境中直接分离筛选或经过富集培养获得。目前已报道的有机磷农药降解菌主要为真菌和细菌，崔中利等人首次从Pseudomonas sp.M6的基因文库中克隆了一种新的有机磷酯水解酶基因mpd(Appl.Environ.Microbiol.，67:4922-4925)，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基对硫磷的活力仅为 0.96U/ml,而后，人们分别从 Pseudomonas, Bacillus, Stenotrophomonas 等种属的微生物中克隆出mpd基因 ，得到MPH酶。武汉病毒所周宁一等人从Pseudomonassp.WBC-3中克隆出mpd基因，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基对硫磷的比活力为12.7U/mg (Biochem Biophys Res Commun.，334:1107-1114),纯酶液为 50.5U/mg (Research inMicrobiology.，158:143-149)，目前研究报道的重组有机磷酯水解酶催化活力还有待提高，且降解菌株的多样性和新颖性也有待丰富。
【发明内容】
[0004]因此，本发明要解决的技术问题就是丰富降解菌株的多样性，并从中挖掘新的有机磷农药降解酶。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是:
[0006]1.本发明提供了一株伯克氏新菌株 Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028,是发明人从浙江、江苏、上海、陕西等地区的150多份有机磷农药污染的土壤样品中，经过初筛、复筛及分离纯化，得到的产有机磷酯水解酶的新菌株。
[0007]2.筛选菌株所用的培养基为本领域常规使用的培养基，本发明所述培养基优选配方为:
[0008](I)富集培养基(MSM)配方:(NH4) 2S041.0g.l-1，K2HPO40.8g.l-1，KH2PO40.2g.l-1，MgS040.2g ?L-1, CaSO40.08g ?L-1, FeSO4 *7H200.005g.L-1，Na2MoO4 *2H200.0033g ?L-1,用自来水配制，pH7.0，第一轮添加终浓度为25mg.L-1的甲基对硫磷(MP)，每一轮逐步增加MP的浓度，直至底物浓度达到200mg.L-1 ；
[0009](2)丰富培养基(PY)配方:蛋白胨10.0g.L-\酵母膏5.0g ?L-1，氯化钠5.0g ?L-1，用自来水配制，ΡΗ7.0 ;
[0010]3.本发明所述菌株的筛选方法包括以下步骤:
[0011](I)富集培养:从浙江、江苏、上海、陕西等地不同环境中采取土壤样品。取Ig 土样加入到5mL第一轮富集培养基中，30°C，180rpm培养3天后，按5 %的接种量转接到5mL第二轮富集培养基中，相同条件下继续培养3d，不断传代，至MP浓度为200mg.L-1 ；
[0012](2)纯种分离:富集培养后，取400 μ I样品加入二倍体积的二氯甲烷进行萃取，分离萃取液，待二氯甲烷挥发完全后，加入20μ I乙腈，然后用薄板层析法定性检测底物是否有减少或是否有产物生成，将有明显底物减少或产物生成的富集培养液取样划线于含有200mg/L底物的MSM培养基固体平板上，30°C下倒置培养。置于30°C恒温养箱中培养I~2d，观察菌落的生长速率和水解圈的大小，初步判断其降解能力，选择水解圈大的，根据菌落颜色、大小、形态进行单菌落的分离，分离后的单菌落于-20 V保藏用于初筛。
[0013](3)菌株初筛:挑取少量平板分离得到的单菌落，接入装有5mL底物终浓度为SOOmg.r1的PY培养基的试管(15X150mm)中，于30°C，180rpm恒温通风培养5d。培养结束后取400 μ I培养液加入二倍体积的二氯甲烷进行萃取，12，OOOrpm离心2min，弃上层水相，下层有机相待二氯甲烷挥发完全后，加入20μ I乙腈重新溶解。采用薄板层析法定性检测各菌株的活性大小，根据底物斑点是否明显变淡或消失，淘汰没有活性或者活性相对较低的菌株，将活性高的菌株 取一定体积的菌液分装至事先灭菌的菌种保存管，以1:1 (v/v)的量加入50%的无菌甘油，置于_20°C保藏用于复筛。
[0014](4)菌株复筛:将初筛得到的活性较高的菌株接种到装有5ml PY培养基的试管中，于30°C，180rpm培养24h，至生长对数期OD6tltl约为0.6-0.8，将菌液于8000rpm，离心5min，用无菌水洗涤两次，加入无菌水调整0D_ = 1.0即为种子液，分别以I %的接种量接入装有5ml丰富培养基PY的试管中，添加底物MP终浓度为200mg.L-1，于30°C，180rpm恒温通风下反应。定时取样，取200μ I反应液加入二倍体积的二氯甲烷萃取产物和底物，待有机相完全挥发后，加入200 μ I乙腈重新溶解，滤膜过滤后，即可通过高效液相色谱测定底物的降解速率。根据降解速率的检测结果，淘汰性能较差的菌株，催化性能较好的菌株取一定体积的种子液分装至事先灭菌的菌种保存管，以1:1 (v/v)的量加入50%的无菌甘油，置于-70°C保藏用于进一步研究。复筛菌株降解效果如表1所示。
[0015]表1.复筛菌株对MP降解状况
[0016]
【权利要求】
1.一株伯克氏属(Burkholderia jiangsuensis)菌株 EQJ1088,其保藏号为CGMCC9028。
2.如权利要求1所述的伯克氏属(Burkholderiajiangsuensis)菌株EQJ1088,其特征在于，所述伯克氏菌株表达有机磷酯水解酶。
3.如权利要求2所述的有机磷酯水解酶，其特征在于，所述有机磷酯水解酶是具有SEQID N0.2所不氣基酸序列的蛋白质。
4.一种有机磷酯水解酶的编码基因，其特征在于，其是如下(I)或(2)的核酸: (1)如序列表中SEQID N0.1所示的核酸； (2)编码具有SEQID N0.2所不氣基酸序列的蛋白质。
5.一种重组表达载体，其包含如权利要求4所述的有机磷酯水解酶的编码基因。
6.一种重组表达转化体，其包含如权利要求5所述的重组表达载体。
7.—种重组有机磷酯水解酶的制备方法，所述方法包括:培养如权利要求6所述的重组表达转化体，获得重组表达的有机磷酯水解酶或含有机磷酯水解酶的重组生物细胞。
8.用如权利要求2所述的有机磷酯水解酶或如权利要求7所述方法获得的重组表达的有机磷酯水解酶降解有机磷农药的方法。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于:所述有机磷农药包括甲基对硫磷、甲胺磷、毒死蜱、三唑磷、氧乐果、敌敌畏和二嗪磷。
【文档编号】C12N1/20GK103952354SQ201410169274
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】许建和, 柳絮云, 李春秀, 罗晓晶, 潘江 申请人:华东理工大学