抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA及其表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA及其表达载体和应用，属于生物工程技术。本发明是将肌丝联合蛋白1L2-siRNA导入肿瘤细胞后，可以靶向作用于肌丝联合蛋白1L2基因的mRNA，从而阻断其翻译过程，有效地沉默肌丝联合蛋白1L2基因，特异性抑制人肌丝联合蛋白1L2的基因表达，有效地抑制胶质瘤细胞的增殖活性，还可诱导细胞凋亡，从而抑制胶质瘤细胞的生长。可用于制备高效、快速、特异性强的抗胶质瘤药物。
【专利说明】抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA及其表达载体和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程技术，特别是一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA及其表达载体和应用。
【背景技术】
[0002]接头蛋白是一类没有酶活性，但却具有调节功能结构域的蛋白。在蛋白信号转导过程中，这些蛋白通过其结构域介导蛋白质之间的作用，从而起到信号转导的作用。已经证明，许多的接头蛋白与肿瘤的发生发展有密切的联系。例如，AFAP(actin filamentassociated protein, AFAP)不仅在细胞粘附、肌动蛋白应力纤维的形成中有重要的作用，而且在前列腺癌形成过程中也起着举足轻重的作用；又如，接头蛋白酪氨酸激酶底物5有5个SH3同源结构域，能调节不同肿瘤细胞的迁移和侵袭。更多的研究表明接头蛋白在肿瘤的发生、肿瘤的诊断和治疗中都有作用。近年新发现的一种新的接头蛋白肌丝联合蛋白1L2在肿瘤的发生中也有重要的作用。肌丝联合蛋白1L2是Shiozaki等在研究AFAP的过程中发现的。肌丝联合蛋白1L2基因位于染色体10q25.3，编码818个氨基酸，分子量约为130kD。研究发现:肌丝联合蛋白1L2可能是酪氨酸激酶介导的信号通路的一个底物和调节子。内源性的肌丝联合蛋白1L2与c-Src酪氨酸激酶相互作用。在细胞中将二者共表达，c-Src的活性增加且多个蛋白的酪氨酸磷酸化增强。在A549细胞中沉默肌丝联合蛋白1L2，c-Src的活性减低，Akt和GSK3 0磷酸化。研究还发现，肌丝联合蛋白1L2是RET/PTC信号级联通路下游的一个调节子，他通过与PI3K的亚单位ρ85 α结合从而活化Akt。国内外研究证实，肌丝联合蛋白1L2反义寡核苷酸可以在体外抑制胶质瘤细胞的增殖，但该技术也存在转染效率低，作用时间短的不足，使其抑瘤作用受到限制，另外，人工合成寡核苷酸的费用昂贵，也使该技术的应用遇到技术困难。
[0003]近年的研究发现，一些小的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)可以高效、特异地促使体内特定基因mRNA降解，诱使细胞出现特定基因缺失的表型，这种技术即RNAi。在RNAi作用的起始阶段中外源性或内源性的双链RNA被Dicer酶切割为19~21bp的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs , siRNAs);随后siRNA与核酶复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC )； RISC激活后通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上并切割mRNA，从而部分或完全抑制目的基因的表达。另一方面，细胞在RNA依赖性RNA聚合酶作用下，可以siRNA为引物、以mRNA为模板，合成出mRNA的互补链，从而使mRNA也变成了 dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。
[0004]从RNAi的作用机制中可见，这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明显优势:RNAi基因抑制效果确切，应用微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上、甚至可以达到基因敲除的效果；其次，RNAi抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，因而应用此项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不致相互干扰；同时，RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研究；此外，RNAi序列识别的特异性即或对由野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有效的封闭效果而对野生型基因没有影响。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实:肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制，化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效地抑制内源性RNA的表达。
【发明内容】
[0005]本发明就是为了解决胶质瘤等肿瘤基因治疗问题，以RNA干扰机制为基础，通过人工合成或表达质粒序列转录形成的肌丝联合蛋白1L2小双链RNA(siRNA)可以祀向作用于肌丝联合蛋白1L2基因的mRNA，从而阻断其翻译过程，达到使肌丝联合蛋白1L2基因表达降低的结果，而提供一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA及其表达载体和应用。
本发明以RNA干扰技术为基础,从GenBank中获得肌丝联合蛋白1L2 mRNA的全长序列，根据siRNA靶序列选择的基本原则，针对肌丝联合蛋白1L2基因设计了 4条长度为19个核苷酸的siRNA (见表1)(由上海吉玛公司合成)。通过一系列体外实验证实(实施例1)，4条siRNA中肌丝联合蛋白lL2-siRNA-4的抑制效果最好。将肌丝联合蛋白lL2_siRNA_4序列设计shRNA正义链和反义链，以loop环相连，称为shRNA。合成每条shRNA的DNA模板的两条单链，两条单链DNA退火即为DNA双链模板，再克隆至含U6启动子的psiHIV-mU6质粒中，构建质粒表达载体psiHIV-mU6/mcherryFP/Amp-sh肌丝联合蛋白1L2,并进行酶切鉴定和测序。酶切结果证明构建的shRNA已插入载体，经测序证明与设计的序列相同(实施例2)。然后采用脂质体介导的方法将质粒表达载体转染入高表达肌丝联合蛋白1L2的胶质瘤细胞系U251中。根据红色荧光蛋白表达情况检测转染效率，同时应用MTT法观察转染细胞的增殖活性的变化。应用RT-PCR法检测转染细胞mRNA表达的变化。用Annexin V-FITC /PI双色标记的流式细胞仪法检测转染细胞的凋亡状态。
[0006]因此，本发明提供一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA，其具有特异性抑制肿瘤细胞的作用，其碱基序列如Sequence所示,作用部位如下:
5，-GAUGAGGA⑶ACAUUUAUATT-3，
5，-UAUAAAUGUACUCCUCAUCTT-3，
作用于人肌丝联合蛋白1L2 mRNA的第1362位。
[0007]一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA质粒表达载体，其包含如上所述的siRNA，其具有特异性抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达，特异性抑制人胶质瘤细胞的作用。
[0008]所述抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA质粒表达载体，其DNA序列中真核质粒载体是 psiHIV_mU6/mcherryFP/Amp。
[0009]所述抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA质粒表达载体，其DNA序列中病毒表达载体是慢病毒。
[0010]如上所述一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA在制备抑制肿瘤药物中的应用。[0011]如上所述一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA质粒表达载体在制备抑制肿瘤药物中的应用。
[0012]结果表明:psiHIV-mU6/mcherryFP/Amp-sh肌丝联合蛋白1L2可通过脂质体介导作用成功转染入胶质瘤细胞内。转染psiHIV-mU6/ mcherryFP/Amp-sh肌丝联合蛋白1L2后的细胞代谢受抑制，细胞生长减慢。MTT吸收值在转染后48小时和72小时下降，与正常对照组和阴性对照组相比都具有统计学意义。RT-PCR结果显示:转染了不同浓度psiHIV-mU6/mcherryFP/Amp-sh肌丝联合蛋白1L2的细胞mRNA表达均受抑制。流式细胞分析实验表明:肌丝联合蛋白lL2-siRNA组在24小时和48小时早期凋亡与晚期凋亡都较正常对照组和阴性对照组明显增多。
[0013]这样，本发明提供的肌丝联合蛋白lL2_siRNA及其质粒表达载体可以特异性、高效地抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达，能有效抑制肿瘤细胞的增殖活性，还可诱导细胞凋亡。从而达到抑制肿瘤发生和生长的目的。该siRNA及其质粒表达载体可用于制备高效、快速、特异性强的抗胶质瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是正常对照组和siRNA各组转染U251细胞48小时后肌丝联合蛋白1L2的表达； 图2是质粒重组载体的琼脂糖电泳鉴定；
图3是转染后24小时红色荧光蛋白表达情况；
图4是转染后48小时红色荧光蛋白表达情况；
图5是重组质粒转染细胞后肌丝联合蛋白1L2的表达；
图6是转染后各时间点MTT吸收值；
图7是实验组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图8是阴性对照组转染后流式测定细胞凋亡情况；
图 9 是 psiHIV-mU6/mcherryFP/Amp 质粒载体图谱；
图10是肌丝联合蛋白lL2-siRNA碱基序列图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
[0016]实施例一:干扰人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA序列设计和筛选 1.siRNA序列设计
利用NCBI Genbank检索肌丝联合蛋白lL2mRNA的全长序列(图10)，参照siRNA设计原则，并运用RNA structure软件模拟祀mRNA的二级结构,尽量避免自身结合的莖区,选择配对区域较少的序列，如线区和环区。筛选出4个19个核苷酸的序列，并将它们带入BLAST基因组数据库进行比对，排除了和其他编码序列/EST同源。并将其分别命名为肌丝联合蛋白lL2-siRNA-l、肌丝联合蛋白lL2-siRNA-2、肌丝联合蛋白lL2_siRNA_3、肌丝联合蛋白lL2-siRNA-4 (见表1)(由上海吉玛公司合成)。
[0017]
【权利要求】
1.一种抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的SiRNA，其具有特异性抑制肿瘤细胞的作用，其碱基序列如Sequence I所示,其作用部位如下:
5，-GAUGAGGA⑶ACAUUUAUATT-3，
5，-UAUAAAUGUACUCCUCAUCTT-3， 作用于人肌丝联合蛋白1L2 mRNA的第1362位。
2.一种抑制人肌丝联合蛋白1L 2基因表达的SiRNA质粒表达载体，其特征在于:包含如权利要求1所述的SiRNA，其具有特异性抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达，特异性抑制人胶质瘤细胞的作用。
3.根据权利要求2所述抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的SiRNA质粒表达载体，其特征在于:DNA序列中真核质粒载体是psiHIV-mU6/mcherryFP/Amp。
4.根据权利要求2所述抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的SiRNA质粒表达载体，其特征在于:DNA序列中病毒表达载体是慢病毒。
5.权利要求1所述抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA在制备抑制胶质瘤药物中的应用。
6.权利要求2所述抑制人肌丝联合蛋白1L2基因表达的siRNA质粒表达载体在制备抑制胶质瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103898118SQ201410169293
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】王金环, 王琼, 张飚, 孙树鹏, 武俏丽, 王修玉, 豆玉超 申请人:天津市环湖医院