一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光pcr引物、探针和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒。所述引物如序列SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：2所示，所述探针如序列SEQ?ID?NO：3至SEQ?ID?NO：5所示。本发明试剂盒灵敏、快速、准确，能同时对13种蛙病毒属病毒进行检测，这项技术在外来重大水生疫病蛙病毒属病毒的监控中具有非常大的应用前景。
【专利说明】-种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和 试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒，可 同时筛查13种娃病毒属病毒，属于检验检疫领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，由虹彩病毒科蛙病毒属引起的鱼类、两栖类和爬行类的疾病遍布全球，涉 及许多组织系统性感染疾病，出现病症后的宿主动物死亡率高达100%,给水产业造成了非 常大的经济损失。在亚洲、大洋洲、欧洲、北美洲和南美洲等地区从自然生存、养殖、健康以 及死亡的蛙中均分离到了蛙病毒属病毒，蛙病毒属已被世界动物卫生组织（0ΙΕ)规定为必 须申报的水生动物疫病之一。
[0003] 蛙病毒属属于虹彩病毒科，为裸露或有囊膜的二十面体病毒粒子，病毒直径约 150?170nm，基因组是单一线状双链DNA，全长为150?170kb，GC含量为49%?55%，在 细胞核和细胞质中都能复制。其结构蛋白主衣壳蛋白（major capsid protein, MCP)占整 个病毒粒子多肽的40?45%，具有高度的保守性，又具有足够的变异性，氨基酸同源性达 65. 9%，是虹彩病毒进化和分类的重要依据，所以本发明利用MCP的同源性差异进行蛙病 毒属病毒的鉴别和区分，该方法是可靠的。
[0004] 由于蛙病毒属病毒的基因序列相似性达90%以上，所以设计特异的引物和探针对 于区分和鉴别娃病毒属病毒非常关键。目前，研究者们建立了虹彩病毒娃病毒属实时突光 PCR的检测方法、虎纹蛙病毒（tiger frog virus，TFV)的普通PCR方法、大口黑鲈虹彩病 毒（Largemouth bass virus，LMBV)的双重PCR检测方法以及大銳虹彩病毒ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)TaqMan实时突光定量PCR的检测方法，上述方法，对于同一个检 测样本，最多能鉴别和区分2种蛙病毒属病毒，而本发明第一次建立了蛙病毒属病毒的三 重实时突光PCR方法，对于同一个检测样本，可同时鉴别和区分13种娃病毒属病毒，降低了 检测成本，节省了检测时间，实现了高通量处理样本的简便性，该方法具有快速性、准确性 和高灵敏性的特点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种简便、快速、灵敏、特异和高效的鉴别蛙病毒属病毒的 三重实时荧光PCR引物、探针和试剂盒。该方法检测覆盖蛙病毒属病毒种类多，是一种特异 性强，准确性高、灵敏性高的检测方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明提供一组鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针，其中，采 用一对通用引物，正向引物为V -ATGGTGCARAACGTCA-3' (SEQIDN0:1)，反向引物为 5' -GCTCCAKSACSGTGTT-3; (SEQ ID N0 ：2)〇
[0008] 所述探针如下所示：
[0009] 探针 1 :5' -CTTCCGTCGGCTCCAATTACACC-3，（SEQ ID NO :3)
[0010] 探针 2 :5，-CCAACAACAGGAGTGACGCAAGTG-3，（SEQ ID NO :4)
[0011] 探针 3 :5，-CTGTGGGTTCAAATTATACGTGTGT-3，（SEQ ID NO :5)
[0012] 其中，所述序列SEQ ID NO :3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒RGV(Rana grylio virus)、中华鳘虹彩病毒 STIV(Soft-shelled Turtle iridovirus)、虹彩病毒 3 型 FV3 (frog virus3)、饰纹汀蟾（穴居娃）虹彩病毒 BIV (Limnodynastes ornatus or bohel iridovirus)、虎纹娃病毒 TFV (tiger frog virus)、大銳虹彩病毒 ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)、流行性造血器官坏死症病毒 EHNV(Epizootie hematopoietie necrosis virus)、欧洲鮰鱼病毒 ECV(European catfish iridovirus)和欧 It 病毒 ESV(European sheetfish iridovirus)的探针，并且Y端标记FAM突光报告基团，3'端标 记BHQ1淬灭基团。
[0013] 所述序列 SEQ ID N0 :4 为鉴别大口黑S卢病毒 LMBV(Largemouth bass virus)、 裂唇鱼病毒DFV(doctor fish virus)和孔雀鱼病毒6型GV6(guppy virus6)的探针， 并且Y端标记HEX荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团；LMBV、DFV和GV6统称为 SCRV(Santee-Cooper ranavirus)〇
[0014] 所述序列SEQ ID NO :5为鉴别新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV(Singapore grouper iridovirus)的探针，并且Y端标记CY5荧光报告基团A端标记BHQ3淬灭基团。
[0015] 我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR 方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+浓度的优化，引物和探 针浓度的优化，得到以下试剂盒。
[0016] 鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，由以下组分组成：
[0017] 1)DNA提取试剂：可以使用现有技术中已知的提取试剂，也可以采用商业化的提 取试剂盒，本发明的DNA提取试剂购自天根生化科技有限公司。
[0018] 2)PCR反应液，表1为优化后的PCR反应液配方。
[0019] 表1PCR反应液配方
[0020]
【权利要求】
1. 一组鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物如 序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :2所示，所述探针如序列SEQ ID NO :3至SEQ ID NO :5所 /_J、1 〇
2. 根据权利要求1所述的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针，其特征 在于，所述序列SEQ ID NO :3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒、中华鳖虹彩病毒、虹彩病毒3型、 饰纹汀蟾（穴居蛙）虹彩病毒、虎纹蛙病毒、大鲷虹彩病毒、流行性造血器官坏死症病毒、欧 洲鮰鱼病毒和欧鲶病毒的探针，并且5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基 团； 所述序列SEQ ID NO :4为鉴别大口黑鲈病毒、裂唇鱼病毒和孔雀鱼病毒6型的探针，并 且Y端标记HEX荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团； 所述序列SEQ ID NO :5为鉴别新加坡石斑鱼虹彩病毒的探针，并且5'端标记CY5荧 光报告基团，3'端标记BHQ3淬灭基团。
3. 如权利要求1或2所述的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR引物和探针在制备 鉴别娃病毒属病毒的实时突光PCR试剂盒中的应用。
4. 一种鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，其包括以下组分： (1) DNA提取试剂； (2) PCR反应液：包括如序列表SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:2所示的用于鉴别蛙病毒属 病毒的引物，如序列表SEQ ID NO :3至SEQ ID NO :5所示的探针； (3) Taq DNA 聚合酶； (4) 无菌双蒸水； (5) 阴性对照； (6) 阳性对照。
5. 根据权利要求4所述的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，其特征在于， 所述序列SEQ ID NO :3为鉴别沼泽绿牛蛙虹彩病毒、中华鳖虹彩病毒、虹彩病毒3型、饰纹 汀蟾（穴居蛙）虹彩病毒、虎纹蛙病毒、大鲷虹彩病毒、流行性造血器官坏死症病毒、欧洲鮰 鱼病毒和欧鲶病毒的探针，并且5'端标记FAM荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团； 所述序列SEQ ID NO :4为鉴别大口黑鲈病毒、裂唇鱼病毒和孔雀鱼病毒6型的探针，并 且Y端标记HEX荧光报告基团，3'端标记BHQ1淬灭基团； 所述序列SEQ ID NO :5为鉴别新加坡石斑鱼虹彩病毒的探针，并且5'端标记CY5荧 光报告基团，3'端标记BHQ3淬灭基团。
6. 根据权利要求4所述的鉴别蛙病毒属病毒的三重实时荧光PCR试剂盒，其特征在于， 所述PCR反应液还包括缓冲液、MgCl 2和dNTP。
7. -种鉴别娃病毒属病毒的三重实时突光PCR检测方法，所述方法包括： (1) 用DNA提取试剂同时提取阳性对照、阴性对照以及待测样本中的核酸DNA作为PCR 检测模板； (2) 进行PCR反应； (3) 结果判定。
【文档编号】C12N15/11GK104099428SQ201410327903
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】张利峰, 李江宇, 凌凤俊, 任彤, 高志强, 谷强, 张伟, 王树云, 刘艳华, 王娜, 景宏丽, 张旻, 贾佩峤, 江育林 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 中国检验检疫科学研究院, 北京海森通生物科技有限公司