一种半乳糖配体分子的酶促合成方法
【专利摘要】本发明涉及一种半乳糖配体分子的酶促合成方法。本发明首次采用生物酶催化合成这一配体分子，酶促合成法能够克服以往化学法在合成类似半乳糖配体分子过程中的不足，具有高效、高选择性、高产率和低毒等优势。本发明方法制备得到的半乳糖配体分子是一种可修饰脂质体的载体原料，包载药物形成肝靶向脂质体复合物，从而实现半乳糖配体分子介导相关药物靶向到肝细胞，降低其对正常组织的毒性，提高药物的肝病防治效果。
【专利说明】一种半乳糖配体分子的酶促合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】，具体是涉及一种小分子量半乳糖配体，其酶促合成法 及利用该半乳糖配体制备的肝靶向脂质体及肝靶向药物。
【背景技术】
[0002] 在新药研发中，如何让活性成分有效地靶向到目标细胞或组织中是重要的研究课 题之一。例如，不论某药物的药理作用如何好，如果不能到达需治疗的组织，如病灶部位，也 不能达到期望的药理效果。除了局部给药方法外，通常，活性药物成分（药物），需要经过口 服或注射的方式给药，药物经血液运输达到作用部位后发挥其药理作用。如果药物不能有 效到达治疗组织，就需要加大药物的给药剂量，但药物的副作用随之增加。为了提高药物在 靶点部位的聚集，需要供助载体、配体或抗体将药物通过胃肠道、或全身血液循环而选择性 地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构，我们称这种定向的给药方式为靶向给 药系统。
[0003] 去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR)是位于肝实质细胞表面的内吞性受体，可专一识别 未端带有非还原性半乳糖残基的糖蛋白或小分子化合物。由于ASGPR是肝实质细胞特有 受体，专一存在于肝实质细胞表面，因此ASGPR成为肝脏定向转移的最佳受体，为肝癌的治 疗、肝脏基因的定向表达和肝功能检测提供了良好的研究途径。利用ASGPR的特性，可设计 一种含半乳糖配基的小分子化合物，将其共价偶联于脂质体表面得到肝脏靶向脂质体，用 于装载药物发挥导向作用，选择性提高肝实质细胞内的药物浓度、延长作用于肝部位药物 的时效、同时减少给药剂量、降低药物毒性，提高药物的治疗指数。
[0004] 其中可被ASGPR专一性识别的未端带有非还原性半乳糖残基的糖蛋白或小分子 化合物，我们称之为半乳糖配体。目前半乳糖配体分子的合成多采用化学合成法。化学合 成法工艺较复杂，合成步骤多，产率较低，所用试剂多含有一定毒性。例如，Shao-ning等 (Wang S N, Deng Y H, Xu H, et al. Synthesis of a novel galactosylated lipid and its application to the hepatocyte-selective targeting of liposomal doxorubicin[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2006, 62 (I) :32-38.)用胆固醇、乳糖酸I丐、乙二胺、琥拍酸酐等为 原料，分三步合成目标产物：第一步将乳糖酸脱水形成内酯，然后与乙二胺酰化生成1-N_[ 0-β -D_Galactopyranosyl-(l，4)-D-Gluconamide]-2_N'-methylamine (LA-ED);第二步胆 固醇、玻拍酸酐和N-轻基玻拍醜亚胺生成N-Hydroxysuccinimidly5-Cholesten_3-yloxy Succinate(CHS-NHS);第三步 LA-ED 与 CHS-NHS 生成目标产物（5-Cholesten-3-yl) 4-oxo -4-[2_ (lactobionyl amido) ethylamido] butanoate (CHS-ED-LA)，如果以乳糖酸I丐为起始 原料计算收率，最终得率为10. 8%，前述反应过程可参见下文所列反应式：
[0005]
【权利要求】
1. 一种半乳糖配体分子的合成方法，其特征在于：所述方法是在酶的催化条件下，酯 化而合成，具体包括以下步骤： 步骤1 :固醇基连接碳桥步骤：将一定量的二乙烯酯、固醇ROH在脱水有机溶剂中溶解 后，加入适量酶催化剂，温度35°C?55°C，反应0?48h后，过滤，滤液浓缩挥去有机溶剂， 浓缩液重结晶即得中间产物式Π ;反应表示为：
其中η = 0?99 ; 其中ROH为固醇，R为固醇基，R选自以下5种基团的至少一种：
其中，固醇与二乙烯酯的投料摩尔比为1 : 1?20 : 1; 其中，所述的脱水有机溶剂为异辛烷、正己烷、环己烷、石油醚、丙酮其中至少一种或任 意几种的组合； 其中所采用的酶催化剂为选自RCL、Chirazyme L-2脂肪酶、Chirazyme L- 1脂肪酶 及Lipase QLM中的一种； 步骤2 :半乳糖基连接碳桥步骤：将步骤1得到的中间产物式II与乳糖醇或半乳糖或 乳糖R' OH在脱水有机溶剂中溶解后，加入适量的另一种酶催化剂和适量的分子筛，置于恒 温20?60°C，反应0. 5?48h，抽滤，滤液真空低温浓缩挥去有机溶剂，浓缩液层析纯化，得 到半乳糖配体分子式I，上述反应过程表示如下：
其中R' OH为乳糖醇、半乳糖或乳糖，R'为半乳糖基，反应位点为C-6位，R'选自以下 结构中的一种：
其中，步骤1得到的中间产物式II与R'OH的投料摩尔比为1 : 1?20 : 1; 其中，所选的为南极假丝酵母脂肪酶B，或者其商品化固定酶Novozym435 ; 其中，所用反应溶剂选自吡陡、吡陡+丙酮、吡陡+THF、吡陡+叔戊醇、吡陡+乙二醇二 甲醚、吡啶+DMF及吡啶+DMS0中的一种。
2. 根据权利要求1所述的半乳糖配体分子的合成方法，其特征在于：所述的步骤1与 步骤2的顺序能够互相颠倒。
3. 根据权利要求1或2所述的半乳糖配体分子的合成方法，其特征在于：步骤2所采 用的脱水有机溶剂为丙酮+吡啶，按照丙酮：吡啶1 : 1?1 : 10的混合而组成。
4. 根据权利要求1或2所述的半乳糖配体分子的合成方法，其特征在于：步骤1的固 醇R0H与二乙烯酯的投料摩尔比为5 : 1?10 : 1，步骤1酶的用量为1?20mg/mL反应 体系。
5. 根据权利要求1或2所述的半乳糖配体分子的合成方法，其特征在于：在步骤2中， 中间产物式Π与乳糖或半乳糖或乳糖醇R'OH的投料摩尔比为3 : 1?10 : 1，步骤2酶 的用量为：1?50mg/mL反应体系。
【文档编号】C12P19/14GK104293859SQ201410327610
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】程怡, 高幼衡, 聂华, 郑品劲 申请人:程怡