虾类网格蛋白轻链基因及其靶向dsRNA的制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】虾类网格蛋白轻链基因及其靶向dsRNA的制备方法与应用，涉及一种网格蛋白轻链基因。虾类网格蛋白轻链基因为源自红螯螯虾(C.quadricarinatus)，命名为Cq-CLC。靶向虾类网格蛋白轻链基因的dsRNA靶向基因为Cq-CLC，命名为Cq-CLC?dsRNA。制备方法：1)参考试剂盒设计引物及制备dsRNA；2)将步骤1)所得的dsRNA转染红螯螯虾Hpt细胞，检测其对靶向基因Cq-CLC的敲除效率；3)按照步骤2)敲除Cq-CLC，并感染WSSV，检测Cq-CLC敲除的Hpt细胞中WSSV入胞量，与对照组进行比较。Cq-CLC可作为抗WSSV类新药开发的重要靶点。
【专利说明】虾类网格蛋白轻链基因及其靶向dsRNA的制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种网格蛋白轻链基因 （Clathrin light chain, CLC)，尤其涉及一种 从红螯螯奸（Cherax quandricarinatus)分离得到的CLC一Cq-CLC基因，该基因参与对虫下 白斑病毒（WSSV)入胞感染；还涉及到一种靶向Cq-CLC的双链RNA(Double strands RNA， dsRNA)，该dsRNA介导的Cq-CLC基因敲除能够抑制WSSV感染。
【背景技术】
[0002] 内吞作用是细胞通过质膜变形运动将细胞外物质转运至细胞内的过程，所转运物 质包括一些大分子物质（如糖类、脂质、蛋白质等）或颗粒（如细菌、病毒）。根据入胞机 制的差异可将细胞内吞分为多种不同方式，如网格蛋白介导的内吞、巨胞饮、小窝介导的内 吞和其他内吞作用等。研究发现，内吞是许多病毒入胞的重要途径（Yamauchi Y，HeleniUS A. Virus entry at a glance [J].J Cell Sci, 2013, 126 (Pt6) :1289-1295),而网格蛋白介导 的内吞是目前报道最多的病毒入胞途径，其核心组成包括网格蛋白和衔接蛋白（Adaptor protein，AP)复合体。
[0003] 在水生甲壳动物中，研究人员发现，网格蛋白介导的内吞是黄头病毒（Yellow head virus)感染斑节对奸（Penaeus monodon)的重要途径，基因敲除衔接蛋白AP17明显 抑制 YHV 的感染增殖（Jatuyosporn T, Supungul P, Tassanakajon A, et al. The essential role of clathrin-mediated endocytosis in yellow head virus propagation in the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]· Dev Comp Immunol, 2014, 44(1) : 100-110) 〇
[0004] 对于WSSV,目前有研究报道，小窝介导的内吞途径可能参与病毒感染或螯 虫下(Duan H, Jin S, Zhang Y, et al. Granulocytes of the red claw crayfish Cherax quadricarinatus can endocytose beads, E.coli and WSSV, but in different ways[J]. Dev Comp Immunol, 2014；Huang Z J,Kang S T,Leu J H, et al.Endocytic pathway is indicated for white spot syndrome virus(WSSV)entry in shrimp[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 35 (3) : 707-715)，但其分子机制有待于进一步的确证。前期研究中 本 申请人:从WSSV感染红螯螯奸造血组织（Haematopoietic tissue, Hpt)干细胞 cDNA文库中发现Cq-CLC基因表达被WSSV感染诱导（Liu H P, Chen R Y, Zhang Q X，et al. Differential gene expression profile from haematopoietic tissue stem cells of red claw crayfish, Cherax quadricarinatus, in response to WSSV infection [J]. Dev Comp Immunol, 2011，35(7) :716-724)，提示 Cq-CLC 分子可能参与 WSSV 感染过程。
[0005] RNA干扰（RNA interference, RNAi)是一种在进化上高度保守的、高效特异性 降解同源mRNA的现象。RNAi以其快速、简便地特异敲除目的基因表达特性成为鉴定基 因功能的重要研究手段，并且在人类疾病治疗领域也具有快速发展（Czech M P，Aouadi M, Tesz G J. RNAi-based therapeutic strategies for metabolic disease[J]. Nat Rev Endocrinol, 2011，7(8):473-484)。
[0006] 在水产养殖业中，RNAi在典型水产病害防治方面也具有广阔的应用前景（Lima P C, Harris J 0, Cook M. Exploring RNAi as a therapeutic strategy for controlling disease in aquaculture[J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34(3) :729-743) 〇
【发明内容】
[0007] 本发明的第一目的在于提供一种虾类网格蛋白轻链基因。
[0008] 本发明的第二目的在于提供靶向虾类网格蛋白轻链基因的dsRNA及其制备方法。
[0009] 本发明的第三目的在于提供Cq-CLC dsRNA的应用。
[0010] 所述虾类网格蛋白轻链基因为源自红螯螯虾（C.quadricarinatus)，故又命名为 Cq-CLC。所述靶向虾类网格蛋白轻链基因的dsRNA靶向基因为Cq-CLC，故又命名为Cq-CLC dsRNA。
[0011] 所述Cq-CLC基因的序列为：
[0012] ggagtgggca gcactgacag ctggcacgac catcacacac catctacacc tctctctatc 60 accatggatg ggtttggcga tagttttgta cctctagtgg aagggtctgc accagcagca 120 gaggtggatc ctgctgcaga attcttagct cgggagcagg accagctagc tggct-tgggg 180 gacgatattc ttccagctac cctaggtcaa gatcagtcaa cagtggcatc aggccttggt 240 ggagaagctg acttgtttgg ctgtgccccc gtcaatggtg gccctgacct ggagagtttt 300 gagatgctgg gtggagatga ggttgcccaa gcccggtcgc ctattcccca tgtggtaagg 360 gaggatccag agaaaataaa aatct-ggcgt gagcaacaac ggatccgtct- ggagcagaaa 420 gatgctgctg aggaggtaag Cciagatagag cttaaggaga aagcaaggaa agagcttgaa 480 gactggtata agcagcatga agaacaggtt gctaaaacac gacaggccaa caggtctgct 540 gagaaggaac tagttgctga tacagcgaag atggaaccag gcacagagtg ggaacgaata 600 accaagttgt gcaattttaa ccctaagact tccaaatcct caagagacat ttctcgaatg 680
[0013] cgctccatc? ttctgc?ggt gaagcagiiat cctcccatcit aggctt<isiat gctcaa<ii-iac 720 ttiuitcttcc attgttatga gtitacatgta 1111<stgata cc;tgt:attat gitaacacHg 780 tatatgatca afitatgatag antc11tgcc ttactgtaga ggctacagca aa.-maaaaaa 840 i'iaa<ic'iaa<iaa <ifiaa<iaa 85?
[0014] 所述Cq-CLC dsRNA其中一链的序列为：
[0015] t_tacgact. cactataggg aacagtggca t.caggccttg gtggagaagc tgacttgttt 60 ggctgtgccc ecgtaiatgg tggecctgHC ctggagiigtt ttgagatgct gggtggHgat 120 gaggttgccc Hagcceggte geetattecc eatgtggtaa gggHggatix agagaaaata 180 a；ruuitctggc gtgaguaaea aeggatccgt ctggagcaga migatgetge tgaggaggta 240 agcaagatag agcttaagga gaaagcaagg aaagagcttg aagactggta taagcagcat 300 gaagaacagg ttgctaaaac acgacaggcc aacaggtctg ctgagaagga actagttgct 380 gatacagcga agatggaacc aggcacagag tgggaaegaa taaccaagtt gtgcaatlrt.t 120 aaecetaaga cttcx'aaate ctcaagagac atttctcgaa tgegetccat cattctgcag 480 gtgaagcaga atccteccat caaggcttaa atgcccctat agtgagtcgt atta 53-1
[0016] 所述Cq-CLC dsRNA的制备方法包括以下步骤：
[0017] 1)参考试剂盒设计引物及制备dsRNA ;
[0018] 2)将步骤1)所得的dsRNA(400ng/孔）转染红螯螯虾Hpt细胞，检测其对靶向基 因 Cq-CLC的敲除效率；
[0019] 3)按照步骤2)敲除Cq-CLC，并感染WSSV，检测Cq-CLC敲除的Hpt细胞中WSSV入 胞量，与对照组进行比较。
[0020] 在步骤 1)中，所述试剂盒可选用 MEGAscript? T7Transcription Kit (Ambion) 等。
[0021] 所述Cq-CLC是WSSV入胞感染重要因子，Cq-CLC dsRNA转染能够降低Cq-CLC表达 量，明显降低WSSV入胞数量，因此Cq-CLC可作为抗WSSV类新药设计或筛选的靶点。
[0022] 本发明根据获得的Cq-CLC基因序列设计引物，利用试剂盒合成dsRNA，所制备的 dsRNA可以高效敲除Hpt细胞中的目的基因，并抑制WSSV入侵Hpt细胞。因此，Cq-CLC可 能是WSSV感染细胞所必需的关键性宿主因子，可作为抗病毒感染新靶点设计开发抗WSSV 药物；Cq-CLC dsRNA可以高效抑制Cq-CLC基因表达，从而阻断WSSV入胞途径，为抗WSSV感 染药物设计开发提供重要参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为PCR扩增获得dsRNA体外转录模板。
[0024] 图2为Real-time PCR检测所制备的Cq-CLC dsRNA转染Hpt细胞后目的基因表达 量变化，以GFP dsRNA转染细胞为参比，即为1。
[0025] 图 3 为 Western blotting 检测 WSSV 入侵 Cq-CLC 敲除 Hpt 细胞：VP28 代表 WSSV， actin为内参。
[0026] 图4为用Quantity One分析图3所示结果光密度统计分析图，以GFP dsRNA为参 t匕，即为1，t检验分析差异显著性。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。
[0028] 实施例1红螯螯虾Cq-CLC双链RNA合成
[0029] 参照 MEGAscript? T7Transcription Kit 设计引物及制备 dsRNA。
[0030] dsDNA合成与纯化
[0031] 取2ng连接有Cq-CLC cDNA全长的质粒，作为PCR模板，配制PCR反应体系如下：
[0032] dNTP (lOmMcach) 0,4 μ? 10 xExTaq Buffer 2 μ? F 引物(ΙΟμΜ) 0,5 μ? R 引物(+10μΜ+) 0.5 μ! i .x I ;iq 0,1 μ? 校扳质粒 WOng 无菌超纯水 ~16μ1 总反应体枳 20 μ?
[0033] 混匀后，在热循环仪上按照以下程序进行PCR反应：94°C，5min ;30个循环（94°C， 30s ；60〇C,30s ；72〇C,35s) ；72〇C,3min〇
[0034] PCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
[0035] 将单一扩增条带的 PCR 产物用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,德国）纯 化获得双链模板DNA。
[0036] dsRNA合成及纯化
[0037] 配制dsRNA合成反应体系如下：
[0038] 2 μ? ATP soiuiion 2 μ? GTP solution 2 μ? UTP solution 2 μΙ CTP solution 2 μ? 10X Reaction Buffer 2 μ? Enzyme Mix 1双链DNA 反 1$体稿 20 μ!(补 iff Nudease-Free 水）
[0039] 混匀后，在37°C培养箱孵育21?22h。
[0040] 反应结束，取出反应产物用酚氯仿抽提法提纯dsRNA，具体步骤如下：
[0041] 1、在反应EP管中加入530 μ 1 Nuclease-Free水，加入0· 5ml酚：氯仿：异戊醇 (25 : 24 : 1)，震荡 20 次，混匀，室温静置 2!1^11，41：13000\8离心101^11;
[0042] 2、取上层水相于一新管中，加入0. 5ml氯仿，震荡20次，混匀，室温静置2min， 4°C 13000 Xg 离心 lOmin ;
[0043] 3、取上层水相于一新管中，加入两倍体积的异丙醇，混匀，4 °C放置30min， 4°C 13000Xg 离心 20min ;
[0044] 4、弃上清，在RNA沉淀中加入0.8ml75%的乙醇洗涤沉淀，4°C 13000Xg离心 5min ；
[0045] 5、弃上清，室温干燥3min，加入50 μ 1无 RNA酶水溶解沉淀，即得dsRNA溶液；
[0046] 6、紫外分光光度计测定总RNA溶液的浓度和纯度。
[0047] 至此完成dsRNA合成。
[0048] RNAi 试验
[0049] 在96孔细胞板上开展RNAi试验。
[0050] 1、以Cellfectin_II (Invitrogen)作为转染试剂介导dsRNA转染，对目的基因 mRNA进行敲除。
[0051] 2、48h后，取适量WSSV感染dsRNA处理的Hpt细胞。
[0052] lh后，收集细胞，用Western blotting检测细胞中WSSV病毒粒子的含量；
[0053] 或者，收集细胞，提取总RNA，并逆转录制备cDNA，用定量PCR检测目的基因 Cq-CLC 的敲除效率。本发明涉及的引物及其序列参见表1。
[0054] 表 1
[0055]
【权利要求】
1. 虾类网格蛋白轻链基因，为源自红螯螯虾（C.quadricarinatus)，故又命名为 Cq-CLC〇
2. 靶向虾类网格蛋白轻链基因的dsRNA靶向基因，为Cq-CLC，故又命名为 Cq-CLCdsRNA。 3. Cq_CLC基因的序列为： g，gtggg€.a gcact gacag gtggeacgae catcacacac ca.tctaeacc tctetetaie 60 accatggHtg ggtttggcga tagttttgtH cctctagtgg aagggtctgc aca-igcagca 120 gnggtggHtc ctgctgcaga eggga.gc卿τ 補c tggetf.gggg 180 g'acgi-jtat.te cctaggteari gateagteaa eagf.ggeat-c aggecttggt 240 ggagaagctg acttgtttgg ctgtgccccc gtcaatggti gccctgacct ggagagtttt 300 gagatgctgg gtggagatga igttgcccaa gcecggtcgc etattcccca tgtggtaagg 360 gaggatccag agaaaataaa aatctggcgt gagcaacaac ggatccgtct ggagcagaaa 420 gatgctgctg aggaggtaag caagatagag cttaaggaga aagcaaggaa agagcttgaa -?80 gactggtata agcagcatga agaacaggft gctaaaacac gacaggccaa caggtctgct 540 gagaaggaac tagttgctga tacagcgaag atggaaecag gcacagagtg ggaacgaata 600 m-cecf<)figuct fee mm tcct cuagagcieaf tt.ct.egmitg 860 cgctccatCH ttctgCHggt gaagaigaat ceteceatca aggettiumt gctxaaaaac； 720 ttaatcttcc a11g11atga gctachtgtn ttttatgata ectgtattat gttaacacag 780 tatatgatea agtatgatiig aiitctttgec ttaetgtaga ggctacagca aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaa 857s
4. 如权利要求2所述Cq-CLC dsRNA，其中一链的序列为： tcjatacgact cactataggg aaeagtggca teaggeettg gtggagaagc tgact*tgttt 60 ggetgtgccc ccgtcaatgg tggccctgac ctggagagtt ttgagatget gggtggagat 120 gaggttgccc aagcccggtc gcctattcce catgtggtaa gggaggatcc 180 aaaatctggc gtgageaaca acggatec-gt c-tggagetiga aagatgclrgc tgaggaggta 240 agcaagatag agettaagga gaaagcaagg iiaagagcttg aagaetggta taageageat 300 guagacjcagg ttgctcHiaac acgHcaggcc aacaggtctg ctgagaagga actagttgct 360 gatacagcga agatggaacc aggcacagag tgggaacgaa taaceaagtt: gtgcaatttt 420 aaccctmiga ettcxaaatc ctcaagagac atttetcgaa fg(-'geti-'cat cattctgcag 480 gtgaageaga atectcccat caaggcttaa. atgcccctat agtgagtcgt atta 534,
5. 如权利要求2所述Cq-CLC dsRNA的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)参考试剂盒设计引物及制备dsRNA ; 2) 将步骤1)所得的dsRNA转染红螯螯虾Hpt细胞，检测其对靶向基因 Cq-CLC的敲除 效率；dsRNA 为 400ng/ 孔； 3) 按照步骤2)敲除Cq-CLC，并感染WSSV，检测Cq-CLC敲除的Hpt细胞中WSSV入胞 量，与对照组进行比较。
6. 如权利要求5所述Cq-CLC dsRNA的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述试剂盒 选用 IVIK lAsui.ipl 丨、' T7Transcription Kit (Ambion)。
7. 如权利要求1所述Cq-CLC作为抗WSSV类新药设计或筛选的靶点。
【文档编号】C12N15/10GK104059923SQ201410327740
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】刘海鹏, 陈荣元, 王克坚 申请人:厦门大学