专利名称：用于甘油三酯合成途径的基于细胞的测定的制作方法
技术领域：
提供了一种同时检测用稳定同位素标记的脂肪酸孵育的细胞中脂类和磷脂酸酯中间体的方法。该方法可用于以高通量形式筛选调节甘油三酯生物合成的化合物。相关技术说明甘油三酯或三酰甘油是真核生物主要的转运源和能量贮存。甘油三酯从一个甘油分子和三个脂肪酸分子合成而来。每个脂肪酸分子通过酯键连接到甘油分子三个羟基中的每一个。像很多中性脂类一样，甘油三酯含有各种链长的脂肪酸分子，通常长度为16、18或 20个碳。甘油三酯的两种主要生物合成途径是甘油-3-磷酸途径(主要存在于肝脏和脂肪组织中)和单酰甘油途径(主要存在于肠中)。肝脏中产生超过90%的甘油三酯的甘油-3-磷酸途径如下所示
CH2OHCH2OOCRCH2OOCR
^HOH _Ι3^Τ ^ 0HOH _AGPAT , 0HOOCR. ιFA-CoAιFA-CoA_
CH2OPO3HCH2OPO3HCH2OPO3H
甘油-3-骑酸溶血磷脂酸4脂酸
PAPCH2OOCR 0HOOCR· CH2OH 二酰甘油
DGAT FA-CoA
ir
CH2OOCR CHOOCR' CH2OOCR" 三酰甘油其中FA-CoA是脂肪酸辅酶A，GPAT是甘油_3_磷酸酰基转移酶，AGPAT是1_酰基甘油-3-磷酸-O-酰基转移酶，PAP是磷脂酸磷酸酶，DGAT是酰基辅酶A: 二酰基甘油酰基转移酶。甘油-3-磷酸的生物合成途径的最后步骤可由DGATl或DGAT2催化(Cases等 1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 13018 ;Cases 等 2001 J Biol Chem 276:38870)。虽然DGATl和DGAT2两者均能将甘油二酯转化成甘油三酯，但它们在核苷酸或氨基酸序列方面没有相似性。已有报道指出缺少DGATl的敲除小鼠(Dgatl+)肝脏没有显示明显的甘油三酯代谢变化(Smith等2000，Nat Genet 25 :87)。此夕卜，缺少DGAT2 (Dgat2+)的敲除小鼠肝脏显示甘油三酯的含量严重减少(Stone等2004，J Biol Chem 279:11767)。而且，研究
3已表明用反义寡核苷酸抑制DGAT2降低啮齿类的肝脏甘油三酯含量(Choi等2007，J Biol Chem 沘2 :2洸78 ;Liu 等 2008，Biochim Biophy Acta 1781 :97)，并且逆转大鼠中饮食诱导的肝脏脂肪变性和胰岛素抗性(Choi等2007，J Biol Chem 282 :22678) 0这些研究表明 DGATl和DGAT2在甘油三酯生物合成中功能不同。因此，特异性靶向DGATl或DGAT2可在有限毒性下提供调节甘油三酯益处。甘油三酯代谢的紊乱或失调与肥胖症、代谢综合征、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝病和冠心病的发病机理及增加的风险相关(Lewis等2002，Endocrine Reviews 23 :201 ； Malloy and Kane 2001,Adv Intern Med 47 :111)。因此，在甘油三酯生物合成途径中调节酶活性的化合物，包括DGATl和DGAT2，可用作针对代谢疾病的潜在治疗靶标。放射性底物和薄层层析法已广泛应用于监测甘油三酯合成(Stone等2004，J Biol Chem 279 :11767 ；Zhu 等 2002，Atherosclerosis 164 :221)。Stone 等在原代肝细胞中用 3H-甘油标记甘油三酯，并用薄层层析法和放射成像分析检测放射性同位素标记的甘油三酯(Stone等2004，J Biol Chem 279 :11767)。同样地，Zhu等在人肝癌细胞中用3H-油酸标记甘油三酯，并用薄层层析法检测标记的甘油三酯(Zhu等2002，AtherOSClerOSiS 164 221)。最近，Magkos等用质谱技术检测中性脂类(Magkos等2007，J Lipid Research 48 :1204)。Magkos等在体内给予1，1，2，3，3- -甘油和2，2- -棕榈酸酯，并通过氯仿/ 甲醇和超速离心从血浆中提取极低密度脂蛋白甘油三脂。Magkos等用气相层析-质谱系统检测从甘油三酯释放的标记的甘油和甲基化棕榈酸酯(Magkos等2007，J Lipid Research 48 :1204)。Magkos等未检测完整的甘油三酯(如特定的甘油三酯分子)，也未检测甘油三酯途径中的不同中间体。据申请人所知，现有测定法不监测或检测在甘油三酯生物合成期间生成的包括溶血磷脂酸、磷脂酸和二酰基甘油在内的中间体。此外，现有测定法需要额外的提取程序以及繁琐的检测技术。另外，这些方法的通量有限并难以适用于筛选大量化合物的高通量形式。 因此，仍需要开发一种以高通量形式分析甘油三酯生物合成和鉴定调节甘油三酯途径的化合物的方法。发明概述本申请的一个目标是提供一种用于鉴定抑制酰基辅酶A 二酰基甘油酰基转移酶 (DGAT)活性的化合物的方法。该方法包括如下步骤在化合物存在或不存在情况下，使稳定同位素标记的脂肪酸与细胞接触，用异丙醇提取细胞，在化合物存在的情况下测定稳定同位素标记的甘油三酯的水平，以及在化合物不存在的情况下测定稳定同位素标记的甘油三酯的水平；其中所述稳定同位素标记的甘油三酯的水平变化表明所述化合物抑制DGAT 活性。本申请的另一个目标是提供一种测定参与甘油三酯合成的酶活性的方法。该方法包括如下步骤使稳定同位素标记的脂肪酸分子与细胞接触，用异丙醇提取细胞，并检测稳定同位素标记的溶血磷脂酸、磷脂酸、二酰甘油或甘油三酯的存在情况。依据本申请，稳定同位素标记的脂肪酸可为13C18-油酸。此外，依据本申请，稳定同位素标记的甘油三酯可通过液相层析-质谱分光光度计系统检测。根据下文详述并结合附图，本发明的其他目标和特征将显而易见。然而，应理解的是，附图的设计仅为说明的目的而非作为限定限制本发明，为此，应参考所附权利要求。还应理解的是，附图不一定是按比例绘制的，除非另有说明，附图仅意在概念上说明本文描述的结构和步骤。附图简述
图1具有3个油酰基-13C18侧链的13C标记的三油酸甘油酯的提取的离子层析图， 显示在0分钟(A)、30分钟⑶、60分钟(C)、120分钟⑶和180分钟(E)时FU5AH细胞中游离的13C18-油酸全部掺入甘油三酯。图2使用LC-MS阳离子和阴离子切换同时监测三油酸甘油酯合成的中间体和最终产物㈧油酰基溶血磷脂酸酯、⑶单-油酰基甘油、(C) 二油酰基磷脂酸酯、⑶二油酰基甘油和(E)三油酰基甘油。图3 DGATl和DGAT2抑制剂对HUH7肝细胞中新合成的具有三个油酰基-13C18链的三油酸甘油酯的作用的评价。图4 DGATl抑制剂对3T3-L1分化的脂肪细胞中新合成的具有三个油酰基」％8链的三油酸甘油酯的作用的评价。图5 HUH7肝细胞中DGATl抑制时具有2个油酰基-13C18链的甘油二酯的瞬时增加。图6 DGAT2抑制剂对MCF7细胞中新合成的具有三个油酰基」％8链的三油酸甘油酯的作用的评价。图7在与油-1Vw酸培养60分钟后的FU5AH细胞中，同时检测具有1、2和3个油酰基-13Cw侧链的三油酸甘油酯㈧在m/z 903.0检测内源性三油酸甘油酯，⑶在m/z 921. 0检测13C18-三油酸甘油酯，(C)在m/z 939. 0检测13C36-三油酸甘油酯和(D)在m/z 957. 0检测13C54-三油酸甘油酯。图8在用或不用13C18-油酸孵育120分钟的THP-I单核细胞中，同时检测具有1、 2和3个油酰基-13C18侧链的三油酸甘油酯㈧13C18-油酸不存在下，在m/z 921. 0未检测到13C18-三油酸甘油酯、⑶13C18-油酸存在下，观察到13C18-三油酸甘油酯、(C)13C18-油酸不存在下，在m/z 939. 0未检测到"C36-油酸、(D) 13C18-油酸存在下，观察到13C36-三油酸甘油酯、(E) 13C18-油酸不存在下，在m/z 957. 0未检测到13C54-三油酸甘油酯和(F) 13C18-油酸存在下，观察到"C54-三油酸甘油酯。优选实施方案详述本申请提供了一种克服用于分析甘油三酯合成的现有测定法限制的方法。本文所描述的方法在反应混合物中使用稳定同位素标记的脂肪酸，使得反应混合物包含细胞、生长培养基和稳定同位素标记的脂肪酸。本文所描述的方法还可用于筛选调节参与甘油三酯合成的酶的化合物。为筛选目的，反应混合物还可以包括参与甘油三酯的酶的调节剂，如甘油-3-磷酸途径中的DGAT。任何原核和真核细胞可用于本发明。优选为脂肪细胞、肝癌细胞、癌细胞或白血病细胞，例如 3T3-L1、HUH7、FU5AH、THP-U H印G2、C3HT101/2、McA_RH7777、MCF7、A549 和 RA拟64. 7。细胞可通过市售来源获得或通过公知方法分离。例如，分离肝细胞的方法可参见 Berry 和 Friend，1969，J Cell Biol 43 :506，分离脂肪细胞的方法可参见 Green 等 1990， J Biol Chem 265 :5206。白细胞可分离自取自个体的生物样品，例如任何体液或组织样品。任何体液包括但不限于血清、血浆、淋巴、囊液(cystic fluid)、尿、粪便、脑脊液(csf)和腹水。合适的组织样品包括全血、精液、唾液、眼泪、尿、粪便材料、汗液、颊膜涂片、皮肤、特定器官组织例如肌肉或神经组织的活检和毛发。生物样品中甘油-3-磷酸途径活性的分析可用作监测患者对用于代谢疾病药物治疗的应答的生物标记物。可将细胞保持于常规的生长培养基，如Dulbecco改进的fegle培养基、极限必需培养基、RPMI等。有些细胞可在分析之前被诱导或分化。本领域技术人员会意识到需要合适的培养基和条件来保持和/或诱导特定细胞系。例如3T3-L1前脂肪细胞可保持在Dulbecco 改进的fegle培养基，并在诱导培养基的诱导下变成成熟的脂肪细胞。用稳定同位素标记的任何脂肪酸分子可用于本文所描述的方法。本文所用术语 “稳定同位素”通常意指不具放射性的同位素分子，包括1V或咕。稳定同位素标记的脂肪酸可自制合成或通过市售获得。优选的脂肪酸分子包含Cltl-C2tl的链长度，例如单去饱和C16 和ci8。脂肪酸分子可通过1V或2H —致或部分标记；例如，一致标记的13c-14:0、"c-16:1、 13C-16 0、13C-18 2、13C-18 1 和 13C-18 0、2H29_16 1、2H31_16 0、2H33_18 U2H35-18 0 或质量漂移(mass shift)至少4amu的部分标记的2H。在一个实施方案中，标记的分子为13C18-油酸。稳定同位素标记的脂肪酸可掺入生成新合成中间体或稳定同位素标记产物的途径的每 “■步 ο反应混合物还可以包括多种其他试剂。这些试剂包括可用来促进酶活性的如盐、 缓冲剂、中性蛋白(例如白蛋白)、去污剂等试剂。这类试剂也可降低反应组分的非特异性或背景相互作用。也可用其他提高测定效率的试剂如抑制剂、抗微生物剂等。在用于分析甘油三酯生物合成的方法开始之前，通过用活性炭-处理的血清或无血清培养基培养细胞适当的时间，耗尽内源性脂肪酸。接着，将稳定同位素标记的脂肪酸例如"C18-油酸加入反应物中。然后用磷酸缓冲盐水洗涤细胞并用异丙醇提取脂类分子。还可用其他溶剂系统包括己烷、氯仿、庚烷、丙酮、二甲基亚砜和丁醇提取脂类分子。可通过任何适用于检测同位素存在情况或测定同位素分子分子量的方法来检测新合成的标记的脂类中间体或产物。例如，可用薄层层析和质谱。在一个实施方案中，液相层析-质谱(LC-MQ系统用来检测和定量含有稳定同位素标记的酰基链的新合成脂类分子。此外，可同时检测多种标记的脂类分子。在一个实施方案中，修改质谱系统用于同时分析多种中性脂类，包括甘油-3-磷酸途径中的单、二和三-酰甘油和磷脂酸酯中间体。修改包括在质谱系统中无需柱前衍生化以正负切换电喷雾离子化的运行。同时检测多种脂类也可在一次分析运行中完成。—旦检测到标记的脂类分子，可通过标准化浓度方法测定它们的近似水平。作为实例，标准化浓度通过1，3_ 二棕榈酰-2-硬脂酰-甘油-d5(PSP_d5)内标准确定。获得样品中三油酸甘油酯或新合成的脂类分子对内标准的相对响应并用于定量。本文发现约 μΜ 的PSP-d5异丙醇溶液可直接用于提取脂类分子。此外，m/z 858. 0的PSP_d5铵加合离子可用于离子提取和整合(integration)。本领域技术人员可通过其他常用的方法确定所检测分子的特定水平。为评价一种化合物是否能够调节甘油三酯合成，将该化合物加入到含稳定同位素标记的脂肪酸、生长培养基和细胞的反应化合物中。将反应物孵育适当的时间，例如约10 分钟至约24小时。用异丙醇从反应物提取脂类分子并用LC-MS系统分析。当含有化合物的反应中标记的甘油三酯水平与不含化合物的反应中标记的甘油三酯水平有显著差异时， 该化合物可能调节参与甘油三酯合成的酶。本文所用术语“显著差异”意指该差异使本领域技术人员认为甘油三酯合成被调节。标记甘油三酯水平的差异可为至少10%，优选至少 25%。尽管化合物通常为有机化合物，但化合物涵盖众多化学种类。此外，化合物包含与多肽结构上相互作用所需的化学官能团，且通常包括至少胺基、羰基、羟基或羧基，优选至少两种化学官能团，且更优选至少三种化学官能团。化合物可包含由一个或多个上述官能团取代的碳环结构或杂环结构和/或芳族结构或多芳族结构。化合物也可为生物分子例如肽、糖类、脂肪酸、固醇、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶、上述物质的衍生物或结构类似物、或其组合等。当化合物为核酸时，尽管还考虑具有非天然键或亚基的经修饰的核酸，但化合物通常为DNA或RNA分子。化合物可获自多种来源，包括合成或天然化合物文库。例如可用众多手段随机和直接合成多种有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸的表达、合成的有机组合文库、随机肽的噬菌体展示文库等。也可使用本领域已知的组合文库法中众多手段中的任一种获得化合物，包括生物文库、空间可寻址的平行固相或溶液相文库、需要去褶合 (deconvolution)的合成文库法、“一珠一化合物”文库法以及用亲和层析选择的合成文库法(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12 :145)。或者，也可获得或容易产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，可通过常规化学的、物理的和生化手段容易地修饰天然和合成产生的文库和化合物。此外，已知的药理学药剂可经过定向或随机的化学修饰如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，从而产生这些药剂的结构类似物。化合物可随机选择或可基于结合到和/或调节 DGAT活性的现有化合物选择。因此，候选药剂的来源为基于已知DGAT调节剂的分子文库， 其中在分子的一个或多个位置将化合物结构改变为包含更多或更少化学部分或不同化学部分。在创建类似物激活剂/抑制剂文库中对分子所作的结构改变可定向、随机或定向与随机两者结合的取代和/或添加。本领域普通技术人员在制备组合文库中能容易地制备基于现有DGAT调节剂的这样的文库。本文所用术语“调节剂”、“调节”等意指增加或降低酶活性的化合物。当在化合物存在下，酶活性降低时，该化合物被称为抑制剂。当在化合物存在下，酶活性升高时，该化合物被称为激活剂。作为实例，使用本文所述方法评价DGAT调节剂化合物1和2对甘油三酯合成的作用。W02008148868和W02004069809公开了化合物1和2，均通过引用以其整体结合到本文中。化合物1即DGAT 1抑制剂是N-[2，6-二氯-4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基]-4-{[(4-甲氧基苯基)乙酰基]氨基}苯基)哌嗪-1-甲酰氨。化合物1分子量为596. 55且结构为
化合物2即DGAT 2抑制剂是1_[环己基(3，4_ 二氯苯基)甲基]_2_硫代_2， 3- 二氢-IH-咪唑_4，5- 二甲酸二甲酯。化合物2分子量为457. 38且结构为当LC-MS系统用于检测标记的甘油三酯分子时，需要合适的溶液用于从反应混合物中提取脂类分子。一些有机溶剂例如己烷、氯仿/甲醇、DMSO等可能与反相LC-MS检测系统不相容。因此，当己烷、氯仿/甲醇、DMSO等用于提取时，需要额外的步骤来去除有机溶剂，并在用LC-MS系统检测之前，用相容的溶剂系统重构提取的反应混合物。本文发现异丙醇的使用是与LC-MS系统相容的；因此它不需要额外的步骤便可用于提取和递送脂类分子。一步提取提高了效率而且使高通量形式得以实现，这是用于筛选大量化合物和鉴定调节甘油三酯合成的化合物所需要的。术语“高通量”意指能同时简易筛选多个样品并具有机器操作能力的测定设计。高通量测定的另一个所需特征是经过优化以降低试剂使用或使操作数最少从而实现所需分析的测定设计。测定形式的实例包括96-孔板或384-孔板、漂浮小滴和用于液态处理实验的〃芯片实验室(lab on a chip)"微通道芯片。本领域熟知的是，随着塑料模具的微型化和液态处理设备的改进，或随着设计的测定设备的改进，可使用本发明的设计处理更大量的样品。在一个实施方案中，将细胞在含有多个孔的微量滴定板(例如96-孔板或384-孔板)中培养并分析。将板装入检测系统例如LC-MS等，该系统读取每个板的每个孔的反应从而生成数值数据。本文所描述的方法也可用于评价参与甘油三酯合成的酶的细胞活性， 包括DGAT、GPAT、AGPAT和PAP。该方法也可用于以高通量形式筛选甘油三酯生物合成中调节酶活性的化合物。此外，本申请的方法可用作确定人受试者分离的细胞中甘油三酯合成的代谢活性的诊断性测定。实施例1.细胞系制备将3T3-L1小鼠前脂肪细胞保持在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改进的 fegle培养基(DMEM)中。将细胞接种在96-孔板中。汇合后两天，将培养基更换为含有 IBMX、胰岛素和地塞米松的诱导培养基(Adipolysis kit,Cayman Chemical Company)。诱导三天之后，培养基更换为姨岛素培养基(Adipolysis kit, Cayman Chemical Company)。 诱导5天后，培养基用新鲜的胰岛素培养基替换两天。将人肝癌细胞系HUH7保持在含有 10% FBS,4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中。大鼠肝癌细胞系FU5AH保持在含5% FBS的极限必需培养基fegle(MEM)中。将肝癌细胞铺到96孔板并在80%汇合时使用。将人乳腺癌细胞系MCF7细胞保持在含有10%FBS、4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中。将人单核细胞白血病细胞系THP-I保持在含10% FBS的RPMI培养基中并以切IO5细胞/ml使用。实施例2.稳定同位素标记甘油三酯合成途径
在5% (X)2和37°C条件下用含10%活性炭处理的FBS(Gibco)的DMEM过夜孵育 HUH7细胞或分化的3T3-L1细胞。在5% (X)2和37°C条件下用含5%活性炭处理的FBS的 MEM过夜孵育FU5AH细胞。在5% CO2和37°C条件下，将与0. 5%无脂肪酸的BSA(SIGMA)预混合(precomplex)的约 100 μ 1 300 μ M13C18-油酸(SIGMA)加入细胞悬液中 0、30、60、120 和180分钟。然后将细胞用磷酸缓冲盐水洗涤一次并用100 μ 1异丙醇提取。在室温下孵育10分钟后，将提取物转移到小玻璃瓶并用LC-MS系统检测标记的脂类分子。LC-MS 检测通过 Z-喷雾电喷射离子源(ESI)用 Micromass triple-quadrupole Quattro Micro 质谱分光光度计(Waters，Milford，MA)接口连接的 Agilent 1100 Liquid Chromatographic system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)。代谢产物的分离在 Eclipse XDB-C5柱(2. Ix 50mm，粒度=3. 5um)上进行。流动相Α、含50mM甲酸铵的异丙醇-水(3 7)，和流动相B、含IOmM甲酸铵的异丙醇-水(9 1)用于如下的梯度洗脱 20-100%流动相B lmin，保持100%流动相B 4min，返回到20%流动相B 0. lmin，然后运行时间后4. 5min。流速为0. 5ml/min。以0. 25ml/min的流速用1 2裂缝(split)将所得 LC洗脱液引入到质谱仪。质谱仪以阳离子和阴离子切换模式运行。氮气用作喷雾气体、去溶剂化气体和锥孔帘气(cone curtain gas)。MS系统的源参数为毛细管电压，3. IkV ；锥孔电压，20V (ESI+)和15V (ESF)；提取锥孔电压(extractor)，2V ；RF透镜电压，0. IV ；源温度， 1200C ；去溶剂化温度，300°C ；LM1、HM1、LM2或HM2分辨率15;离子能1、1.0;入口和出口 ； 15。MassLynx软件4. 1版本用于系统控制和数据处理。在FU5AH细胞中，13C18-油酸掺入到甘油_3_磷酸途径通过13C18-三油酸甘油酯的存在情况来确定(图1)。通过比较在30分钟、60分钟、120分钟和180分钟时曲线下面积，13C18-三油酸甘油酯的水平随着孵育时间增加(图1)。此外，本文新开发了一种使用阳离子和阴离子切换用于同时检测油酰基溶血磷脂酸酯、2-单-油酰基甘油、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酸酯、1，2- 二油酰基-sn-甘油中间体以及三油酰基-sn-甘油最终产物的LC-MS法(图2)。这表明稳定同位素标记结合LC-MS系统检测可用于同时检测细胞中甘油三酯生物合成的多个步骤。实施例3.评价调节DGAT活性的化合物为评价调节DGATl或DGAT2活性的化合物，在37°C下将HUH7或3T3-L1细胞在 100μ 1含0. 05% DMSO的无血清培养基中用约0、0. 03,0. 1,0. 3、1、3或10 μ M化合物1或 2预孵育约10分钟。对照为在37°C下在不存在任何化合物的情况下用100μ 1含0. 05% DMSO的无血清培养基孵育约10分钟的细胞。将与1. 0%无脂肪酸的BSA预混合的约100 μ 1 600 μ M13C18-油酸加入细胞悬液中。在37°C下孵育约90分钟后，按实施例2所描述的提取并检测细胞。图3-6显示化合物1和2对甘油三酯生物合成的作用。在化合物1存在的情况下， HUH7和分化的3T3-L1细胞系具有降低的新合成的13C18-三油酸甘油酯水平。在HUH7细胞系中，用10μΜ化合物1孵育的细胞中"C18-三油酸甘油酯的水平约为对照水平的30%，而用10 μ M化合物2孵育的细胞中13C18-三油酸甘油酯的水平约为对照水平的75% (图3)。 此外，在用化合物1孵育的HUH7细胞中检测到13C18-油酰基-甘油二酯的瞬时增加(图5)。 这些结果表明HUH7细胞具有将13C18- 二油酸甘油酯转化为13C18-三油酸甘油酯的功能性 DGATl 禾口 DGAT2 酶。
在分化的3T3-L1细胞系中，用约10 μ M化合物1孵育的细胞中13C18-三油酸甘油酯的水平约为对照水平的33% (图4)。该结果表明在分化的3T3-L1细胞中，大部分13C18-三油酸甘油酯是通过DGATl合成的。然后，评价化合物2在MCF7细胞中的作用。将MCF7细胞接种到96-孔培养板中的含有10% FBS,4. 5g/L D-葡萄糖的DMEM中培养M小时。将汇合或接近汇合的细胞用约 150μ 1含0. 15%无脂肪酸BSA的无血清DMEM孵育1小时。接着将含3 % DMSO的DMEM中的约3 μ 1化合物2加至终浓度为约0、0. 1、0. 3、1、3、10 μ Μ。在37°C下孵育15分钟后，将板排干。然后在37°C下将细胞用150μ1与0. 15%无脂肪酸的BSA预混合的ΙΟΟμΜ 13C18-油酸和约3 μ 1含3% DMSO的DMEM中的化合物2孵育约3小时。细胞用约100 μ 1异丙醇提取， 接着进行如上所述的LC-MS检测。如图6所示，用化合物2孵育的细胞中"C18-三油酸甘油酯的水平约为对照水平的80%。该结果表明在此处所用的MCF7细胞中，大部分的13C18-三油酸甘油酯是通过DGAT2合成的。由于具有三个标记的脂肪酸链的"C18-三油酸甘油酯的生成涉及甘油-3-磷酸途径中的其他酶，因此进行了额外的实验来检测标记的中间体的存在情况。将FU5AH细胞用 13C18-油酸孵育60分钟，并用实施例2所描述的同时检测进行分析。如图7所示，具有1、 2和3个13C18-油酰基侧链的三油酸甘油酯呈现为标记分子，其分子量分别为m/z 921. 0、 939. 0 和 957. 0。实施例3的结果表明分化的脂肪细胞和HUH7细胞可用于筛选调节DGATl活性的化合物。在另一方面，MCF7细胞可用于筛选调节DGAT2活性的化合物。此外，MCF7、脂肪细胞和肝癌细胞可用于筛选调节其它酶的化合物，这些酶包括GPAT、AGPAT或PAP，其均参与甘油三酯生物合成例如甘油-3-磷酸途径。实施例4.检测白细胞中的甘油三酯生物合成为检查白细胞是否存在甘油三酯生物合成，将THP-I细胞与无血清RPMI孵育并在37°C下孵育2小时。将约200，000个细胞在500Xg下离心5分钟。将约300 μ 1与含 0. 5%无脂肪酸BSA(SIGM)的RPMI预混合的300 μ M13C18-油酸(SIGMA)加入细胞沉淀中。 在37°C下将细胞与标记的分子孵育2小时，如上所述用异丙醇提取细胞。如图8所示，在用标记的油酸培养的THP-I细胞中检测到新合成的13C18-三油酸甘油酯，而未用标记的油酸培养的对照细胞没有检测到新合成的13C18-三油酸甘油酯。当用 13C18-油酸培养THP-I细胞约120分钟时，作为标记分子检测带有1或2个13C18-油酰基侧链的三油酸甘油酯，其分子量分别为m/z 921. 0和939. 0。检测到部分标记的三油酸甘油酯表明本申请的方法可用来检测AGPAT、PAP或 DGAT的细胞活性。此外，本文所述方法可用来检测分离细胞中新合成的甘油三酯，因此可用作确定甘油三酯生物合成代谢活性的诊断测定。本部分引用的所有参考文献均通过引用以其整体结合到本文中。因此，虽然已显示、描述并指出如应用于本发明优选实施方案中的基本的新特征， 但应理解的是，本领域技术人员可对所阐述的设备及其操作做出形式上和细节上的各种省略、替换和改变，而不违背本发明的精神。例如，意在很清楚地表明所有那些以基本同样的方式执行基本相同的功能以达到相同结果的要素和/或方法步骤的组合，都在本发明的范围内。此外，应意识到，与本发明公开的任何形式或实施方案相关的所显示和/或描述的结构和/或元素和/或方法步骤可作为一种设计选择的一般情况掺入任何其它公开的或描述的或暗示的形式或实施方案。因此，意在仅受限于所附权利要求所表明的范围。
权利要求
1.一种用于鉴定抑制酰基辅酶A: 二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)活性的化合物的方法，其包括如下步骤a.在所述化合物存在和不存在的情况下，使稳定同位素标记的脂肪酸与细胞接触；b.用异丙醇提取所述细胞；c.在所述化合物存在的情况下，测定稳定同位素标记的甘油三酯水平；和d.在所述化合物不存在的情况下，测定稳定同位素标记的甘油三酯水平； 由此，稳定同位素标记的甘油三酯水平的变化表明所述化合物抑制DGAT活性。
2.权利要求1的方法，其中所述稳定同位素为13C。
3.权利要求1的方法，其中所述稳定同位素标记的脂肪酸为13C18-油酸。
4.权利要求1的方法，其中所述稳定同位素标记的甘油三酯通过液相层析-质谱分光光度计系统检测。
5.一种测定参与甘油三酯合成的酶的活性的方法，其包括如下步骤a.使稳定同位素标记的脂肪酸与细胞接触；b.用异丙醇提取所述细胞；和c.检测稳定同位素标记的溶血磷脂酸、磷脂酸或二酰基甘油或甘油三酯的存在情况。
6.权利要求5的方法，其中所述酶为酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)。
7.权利要求5的方法，其中所述酶为甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)。
8.权利要求5的方法，其中所述酶为1-酰基甘油-3-磷酸-0-酰基转移酶(AGPAT)。
9.权利要求5的方法，其中所述酶为磷脂酸磷酸酶(PAP)。
10.权利要求5的方法，其中所述稳定同位素为"C。
11.权利要求5的方法，其中所述稳定同位素标记的脂肪酸为13C18-油酸。
全文摘要
一种用于鉴定调节酰基辅酶A二酰基甘油酰基转移酶活性的化合物的方法，包括如下步骤在该化合物存在或不存在的情况下，使稳定同位素标记的脂肪酸与细胞接触，用异丙醇提取细胞，并在该化合物存在或不存在的情况下测定稳定同位素标记的甘油三酯的水平；其中所述稳定同位素标记的甘油三酯的水平变化表明所述化合物调节DGAT活性。
文档编号G01N33/50GK102378816SQ201080015824
公开日2012年3月14日 申请日期2010年2月3日 优先权日2009年2月4日
发明者J-S·齐, M·A·康奈利, W·朗 申请人:詹森药业有限公司