测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、系统及方法

测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、系统及方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、系统和方法，该试剂盒、系统和方法的应用基于流式细胞仪，所述试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂：CD34-FITC、VEGFR2-PE、CD45-PerCP和CD133-APC。所述系统中设有主控计算机单元和存储有前瞻性研究的数据和图形的存储单元，该硬件的配置是实现测定的重要保证。本发明首次将CD45-CD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中的表达比例作为评价造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境品质的指标之一，对于预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生具有指导意义，对于临床治疗方案的制定具有重要的参考价值。
【专利说明】测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、系统及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种特殊应用环境中使用的细胞表型专用试剂盒及系统，具体涉及一种用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、测定系统及实现定性定量分析的方法。
【背景技术】
[0002]异基因造血干细胞移植是治疗血液恶性疾病的有效方式之一，但是移植后植入不良(英文名称Poor graft function，缩写PGF)的发生率在5 - 27%之间，仍然是异基因造血干细胞移植后的主要并发症之一，严重时影响移植患者的长期生存。尽管文献报道，植入不良可能与移植前预处理剂量、免疫排斥、移植物抗宿主病、病毒感染、移植的CD34+细胞数等诸多因素有关，但移植后植入不良的发病机制尚未阐明，骨髓微循环环境在特定的植入条件下是否在与后期并发症具有重要内在联系尚未明确的研究结果。
[0003]采用骨髓细胞体外长期培养实验和集落形成实验是替代体内研究来评估血液病患者骨髓基质细胞造血支持作用的常用方法。既往研究借助于上述研究方法证实，接受长期化疗的血液病患者骨髓基质细胞受损，接受自体造血干细胞移植的患者在移植前和移植后I年均可检测到骨髓基质细胞受损。我们由此推测骨髓微循环环境受损也可能参与了造血干细胞移植后植入不良的发生。但是骨髓细胞体外长期培养实验和集落形成实验具有一定的局限性:其目标细胞群包括成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞等一组异质性的骨髓基质细胞组分。特别是在造血干细胞移植后的早期，患者体内重建的骨髓基质细胞数量很少，严重限制了上述研究方法的推广应用。因此，迫切需要建立新的、方便快捷的检测方法对造血干细胞移植后血液病患者的骨髓微循环环境组分进行有效性评估。这涉及到造血干细胞移植后植入不良能否及时预测以及临床治疗方案的制定是否更加科学、高效与个体化。
[0004]对于血液病患者来讲，骨髓配对找到合适的骨髓捐献者本来就是十分不易之事，如果因为某种因素延误了后期的治疗与恢复，浪费了宝贵的社会资源，则是医学界的悲哀。

【发明内容】

[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种用于测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、系统及方法，利用该试剂盒中的经过精确标定和定量的专用试剂、配套的设备系统及技术操控方法，可以快速、准确地测定CD45_CD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中所占比例，从而得出造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境品质的定性和定量结论，从而可以快速、准确地预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生，对临床治疗方案的制定具有重要的指导意义。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案I是:
提供了一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，该试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂:CD34-FITC、VEGFR2-PE、CD45_PerCP 和 CD133-APC。
[0007]采用上述试剂盒与流式细胞仪配合使用，可以准确、定量测定⑶45TD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中的表达比例，为骨髓微循环环境的评测奠定了基础。
[0008]本发明还提供了一种基于上述试剂盒的专用系统，该系统的结构中包括流式细胞仪和配套的数据分析模块，所述系统中还包括主控计算机单元，以及连接在主控计算机单元配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块、配置缓存器模块的监控显示器IXD、存储有前瞻性研究的数据和图形的存储模块、暂存器模块、设置在系统操控台上的操控面板、存储有内外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块、打印机及接口电路，流式细胞仪通过通讯接口电路和主控计算机单元的数据总线连接，且流式细胞仪结构中配套设有用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的专用试剂盒，所述专用试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂:CD34-FITC、VEGFR2-PE、CD45_PerCP和CD133-APC。
[0009]本发明的关键技术在于借助主控计算机系统的完善配备和针对性任务明确的控制方法与配套软、硬件 的配套，将关键的采样设备-流式细胞仪改造成为造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境评测报告专用的系统装备。流式细胞仪的用途是测定带有荧光标记的骨髓样本，记录二维散点图。但是，被测定细胞特异性内涵的定性和进一步定量分析，流式细胞仪和配套的分析软件是无能为力的。特定任务的实现，取决于染色标记的选配是否合理，前瞻性研究的定标分界线值的选取是否的具有普遍性以及操作方法是否能为临床的结果所验证。
[0010]本发明的发明关键还在于设计了基于本发明所说的系统，测定造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境的方法，该方法包括以下步骤:
A、将待测骨髓样本采用专用试剂盒中的试剂在流式细胞仪专用试管中进行荧光标记，制成测试样本；
B、将装有测试样本的专用试管置入流式细胞仪中，启动流式细胞仪及配套的分析软件，按照存储模块中特定的数据采集条件采集相关数据，形成散点图，并进行流式设门分析，传输并分类标记存入暂存器模块；
C、调出在存储模块中前瞻性研究的数据和图形，显示在高清晰度的监控显示器LCD的上半区，在下半区调出暂存器模块中的对应图谱，借助光标尺进行对照定量分析；
D、确定⑶45XD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中表达比例的分界线值的位置；
E、将测定的⑶45XD34+VEGFR2+表达比例≥分界线值定义为骨髓微循环环境良好；⑶45—CD34+VEGFR2+表达比例〈分界线值定义为骨髓微循环环境不良；
F、从经验数据模块中调出造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境检测报告表，填入测定数据、相关图表，比对后将“良好”、“不确定”、“不良”选择填入评测结论栏中，从激光打印机上输出。
[0011]借助以上的方法，可以指导编制本系统中的主控程序中的管理软件，形成全自动式的设备，以快速检测、评估造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境。本发明对流式细胞仪的测定结果借助苏木精-伊红(英文名称Hematoxylin-eosin staining,缩写HE)染色和CD34免疫组化(IHC)染色对患者骨髓活检标本中骨髓微循环环境中的血管进行原位定量验证，证明了本发明测定方法的科学性、对本发明的研究奠定了基础。
[0012]采用本发明的试剂盒、系统和方法测定造血干细胞移植后血液病患者肝素抗凝骨髓单个核细胞中⑶45TD34+VEGFR2+的表达比例，并进一步通HE染色和⑶34免疫组化(IHC)染色对患者骨髓活检标本中骨髓微循环环境中的血管进行原位定量验证。通过临床试验和统计学分析，结果表明:通过四色流式细胞仪检测到的异基因造血干细胞移植后植入不良患者(n=19)CD45TD34+VEGFR2+的表达比例明显低于植入良好(英文名称Good graftfunction,缩写 GGF)的血液病患者(n=38)和健康供者(n=15) (0.008% vs.0.16% vs.0.18%, P〈0.0001);根据操作者工作曲线(ROC曲线)确定⑶45TD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中表达比例=0.055%为分界值，将CD45—CD34+VEGFR2+表达比例〈0.055%定义为骨髓微循环环境不良(或异常)，将⑶45—CD34+VEGFR2+表达比例> 0.055%定义为骨髓微循环环境良好(或正常)；通过HE和CD34免疫组化染色进一步在骨髓原位证实移植后PGF患者(n=19)骨髓血管数量明显低于GGF患者(n=38)和健康供者(n=15) (2 vs.4 vs.6 /骨小梁，P〈0.05);多因素预后分析提示⑶45—CD34+VEGFR2+表达比例〈0.055%是造血干细胞移植后血液病患者发生植入不良的独立危险因素。虽然本发明所测定⑶45TD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中的表达比例不能够直接得出诊断结果或者健康状况，但其作为中间结果可以作为预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生以及指导制定植入不良患者的临床治疗方案的参考信息之一。
[0013]采用上述技术方案产生的有益效果在于:(I)本发明首次将⑶45TD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中的表达比例作为评价造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境品质的指标之一，并通过大量试验进行了验证，对于预测造血干细胞移植后血液病患者植入不良的发生具有指导意义，并且对于指导制定植入不良患者的临床治疗方案具有重要的参考价值；(2)采用本发明的试剂盒、系统以及配套的方法，可以快速测定骨髓单个核细胞中⑶45XD34+VEGFR2+的表达比例，对骨髓微循环环境的评价提供了 一种快速、准确评价的途径，是现有技术的有力补充。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1中A1、A2、A3别是健康供者、植入良好和植入不良患者的骨髓细胞增生程度典型HE染色图(XlO)；
图2是对I例健康供者骨髓细胞进行CD45_CD34+VEGFR2+测定的典型流式设门分析图； 图3A是植入不良患者与植入良好患者之间移植后CD34+的数目的差异；
图3B和图3C分别是健康者、植入不良患者以及植入良好患者⑶34+细胞和⑶45—CD34+VEGFR2+细胞占骨髓单个核细胞比例的相关性结果；
图4中A1-A3分别是健康供者、植入良好和植入不良患者骨髓血管的典型HE染色图(X40)，
图5中B1-B3分别是健康供者、植入良好和植入不良患者骨髓血管免疫组化的典型CD34 染色图(X40);
图6是本发明系统的结构示意图；
其中，I代表主控计算机单元，2代表存储有主控程序的系统管理模块，LCD代表配置缓存器模块13的监、控显示器，3代表经验数据和图形存储模块，4代表暂存器模块，5代表设置在系统操控台上的操控面板，6代表存储有内、外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块，7代表打印机及接口电路，8代表流式细胞仪，该仪器通过通讯接口电路12和主控计算机I的数据总线连接，流式细胞仪8结构中配套有对标本进行激光扫描采样的测试窗口 9，10是专用标本试管，11代表专用试剂盒。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
本实施例提供一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，该试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂:CD34-FITC、VEGFR2-PE、CD45-PerCP和CD133-APC。各单克隆抗体的荧光标记及成分等信息参见表1。
[0016]表1流式单克隆抗体信息
【权利要求】
1.一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，其特征在于该试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂:CD34-FITC、VEGFR2-PE、CD45_PerCP 和 CD133-APC。
2.根据权利要求1所述的测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还配备了红细胞溶解液、PH为7.2~7.4的IOXPBS缓冲液和配套计量的小牛血清。
3.根据权利要求1所述的测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中每种荧光标记的单克隆抗体试剂容量标准单元是:5μ L的CD34-FITC、5y L的 VEGFR2-PE、10y L的 CD45_PerCP 和 3yL 的 CD133-APC，配套设置有不小于3-5mL的流式细胞仪专用试管至少2个。
4.一种测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测系统，系统结构中包括流式细胞仪和配套的数据分析模块，其特征在于所述系统中还包括主控计算机单元(1)，以及连接在主控计算机单元(1)配套接口上的存储有主控程序的系统管理模块(2)、配置缓存器模块(13)的监控显示器(IXD)、存储有前瞻性研究的数据和图形的存储模块(3)、暂存器模块(4)、设置在系统操控台上的操控面板(5)、存储有内外数据通讯协议和数据规格转换模式的通讯模块(6)、打印机及接口电路(7)，流式细胞仪(8)通过通讯接口电路(12)和主控计算机单元(1)的数据总线连接，且流式细胞仪(8)结构中配套设有用于测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的专用试剂盒(11)，所述专用试剂盒中配置了下述荧光标记的单克隆抗体试剂:CD34-FITC、VEGFR2-PE、CD45_PerCP 和 CD133-APC。
5.根据权利要求4所述的测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测系统，其特征在于所述前瞻性研究的数据和图形包括按照年龄、性别为标记，分别标示的健康人、植入良好和植入不良患者的骨髓做样本的骨髓微循环环境流式数据图库；所述流式数据图库中存储着采用所述专用试剂盒(11)中的染色单克隆抗体为试剂制成的骨髓样本按照特定的数据采集条件所测得的散点图、流式设门分析图和测定的CD45_CD34+VEGFR2+细胞表达比例、及该骨髓样本相关的临床特征。
6.根据权利要求5所述的测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测系统，其特征在于流式设门分析图的分析方法是:先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为Rl区；设⑶45/SSC点图，根据各群细胞⑶45和SSC的强度，画出⑶45—区，对CD45—区中的⑶34+VEGFR2+细胞进行设门分析，得出⑶45—CD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中的表达比例。
7.根据权利要求4所述的测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测系统，其特征在于监控显示器(IXD)借助暂存器模块(13)与主控计算机单元(1)的数据总线相连、配套设置触摸式电子鼠标。
8.基于权利要求4所述的系统实现造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: A、将待测骨髓样本采用专用试剂盒中的试剂在流式细胞仪专用试管中进行荧光标记，制成测试样本； B、将装有测试样本的专用试管置入流式细胞仪中，启动流式细胞仪(8)及配套的分析软件，按照存储模块(3)中特定的数据采集条件采集相关数据，形成散点图，并进行流式设门分析，传输并分类标记存入暂存器模块(4)； C、调出在存储模块(3)中前瞻性研究的数据和图形，显示在高清晰度的监控显示器(LCD)的上半区，在下半区调出暂存器模块(4)中的对应图谱，借助光标尺进行对照定量分析； D、确定⑶45XD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中表达比例的分界线值的位置； E、将测定的⑶45XD34+VEGFR2+表达比例≥分界线值定义为骨髓微循环环境良好；⑶45—CD34+VEGFR2+表达比例〈分界线值定义为骨髓微循环环境不良； F、从经验数据模块(3)中调出造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境检测报告表，填入测定数据、相关图表，比对后将“良好”、“不确定”、“不良”选择填入评测结论栏中，从激光打印机上输出。
9.根据权 利要求8所述的检测造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境评测方法，其特征在于步骤A中所述测试样本的制备步骤包括: Al、取试剂盒配套设置的专用试管，在试管中分别加入5μ L的⑶34-FITC，5yL的VEGFR2-PE, 10 μ L 的 CD45_PerCP 和 3 μ L 的 CD133-APC，再加入不少于 300 μ L 的待测骨髓样本、且保证骨髓细胞数在5Χ106-1Χ107个，混匀，室温避光放置15分钟孵育； Α2、加入用I XPBS稀释10倍后的红细胞溶解液2mL，混匀后避光，室温放置8分钟； A3、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入2mL含0.5wt.%^2wt.%血清的PBS，混匀； A4、1500转/分离心5分钟，弃上清液，加入0.3mLl XPBS缓冲液、混匀，制成测试样本。
10.根据权利要求8所述的检测造血干细胞移植后血液病患者骨髓微循环环境的方法，其特征在于步骤B中所述流式设门分析的步骤包括: B1、先建立FSC/SSC点图，将活细胞区域划为Rl区； B2、设⑶45/SSC点图，根据各群细胞⑶45和SSC的强度，画出⑶45—区； B3、对CD45-区中的CD34+VEGFR2+细胞进行设门分析，得出CD45TD34+VEGFR2+在骨髓单个核细胞中的表达比例。
【文档编号】G01N33/577GK103743907SQ201310314467
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】黄晓军, 孔圆, 常英军, 王亚哲, 袁晓英, 胡玥, 王昱, 刘代红, 许兰平 申请人:北京大学人民医院