Pivka-ii测定方法、测定试剂和测定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了与以往的方法相比，血清/血浆相关性良好的PIVKA-II的测定方法、以及用于该测定的试剂和试剂盒。本发明的PIVKA-II的测定方法包括：通过使用与凝血酶原片段F1特异性结合的抗F1抗体或其抗原结合性片段、和与凝血酶原片段F2特异性结合的抗F2抗体或其抗原结合性片段的混合物，以及与PIVKA-II特异性结合的抗PIVKA-II抗体或其抗原结合性片段的免疫测定，来测定样品中的PIVKA-II。
【专利说明】PIVKA-I I测定方法、测定试剂和测定试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及与血清/血浆相关性良好的PIVKA-II测定方法、以及PIVKA-II免疫 测定试剂和试剂盒。
【背景技术】
[0002] PIVKA-II (维生素 K 缺乏诱导的蛋白-II (Protein induced by vitamin K absence-II))是与血液凝固相关的、具有与凝血酶原类似结构的糖蛋白。凝血酶原是622 个残基的蛋白质，位于N末端附近的10个谷氨酸（Glu)残基受到γ-羧基化，形成γ-羧 基谷氨酸（Gla)残基。已知该凝血酶原在生物体内产生时，由于维生素 K的缺乏，肝功能衰 竭、维生素 K拮抗剂的给予、肝细胞损伤等，γ -羧基化不完全，10个残基中的全部或一部分 形成Glu残基的糖蛋白出现在血液中。该蛋白质是被称作异常凝血酶原的PIVKA-II。近年 来，有报道称在肝细胞癌患者血浆中高浓度检出PIVKA-II，作为肝细胞癌的标志被用于诊 断的监测物。
[0003] 作为特异性检出样品中PIVKA-II的方法，有人报道了使用特异性识别PIVKA-II 的单克隆抗体和抗凝血酶原的多克隆抗体两者，以其中一方作为固定抗体，以另一方作为 标记抗体进行测定的免疫测定法（专利文献1)。
[0004] 在测定来自血液的样品中的被检物质时，主要使用血清或血浆。根据被检物质的 性质或测定系统等，在由同一受试者得到的血清/血浆样品对中，血清样品和血浆样品中 的被检物质的测定值不同，即血清/血浆相关性低，只能测定血清和血浆样品中的一方。这 在同时测定两种被检物质时特别成为问题。例如，在同时测定两种被检物质时，一种被检物 质只能用血清测定时，如果另一种被检物质也可以用血清测定，则由患者采集的样品可以 只是血清样品。但是，如果另一方的被检物质只能用血浆样品测定时，则必须由患者采集血 清和血浆两种样品，样品的取得或处理麻烦，并且也增加了患者的负担。因此，人们希望可 以建立血清/血浆相关性高的测定系统。
[0005] 在采用ELISA法的PIVKA-II测定中，在以特异性识别PIVKA-II的单克隆抗体作 为固相抗体、以抗凝血酶原的多克隆抗体作为二次抗体使用时，已知，与凝血酶显示反应性 的抗体包含在二次抗体中，因此，血清样品对测定系统产生不良影响，无法获得稳定的测定 值（专利文献2)。专利文献2中报道，为了解决该问题，是使用不与人凝血酶反应、而与人凝 血酶原特异性反应的抗体作为二次抗体，由此，即使是血清样品也可以稳定测定PIVKA-II。 但是，专利文献2所述的方法中，为了从抗人凝血酶原的多克隆抗体中除去抗凝血酶的抗 体，必须使用人凝血酶原亲和柱，在取得与凝血酶原反应的抗体后进行透析，再进一步使用 人凝血酶亲和柱，取得不与凝血酶反应的抗体，进行透析，抗体的纯化工序非常麻烦。另外， 专利文献2的方法中，虽然血清/血浆相关性得到改善，但人们希望进一步的改善。并且， 多克隆抗体因批次不同而出现偏差，因此为了严格确保特异性，与多克隆抗体相比，人们通 常希望采用单克隆抗体。专利文献2中虽然记载，在采用ELISA法的PIVKA-II测定法中， 使用不与人凝血酶反应、而与人凝血酶原特异性反应的单克隆抗体，但是，对于使用这样的 单克隆抗体时它们对血清/血浆相关性的影响或问题则未有任何记载。
[0006] 专利文献3中记载了，使用特异性识别PIVKA-II的单克隆抗体和抗凝血酶原的单 克隆抗体两者，以其中一方作为固定抗体、另一方作为标记抗体进行测定的免疫测定法。还 记载了，将PIVKA-II特异性单克隆抗体混合使用。但是专利文献3中仍然完全未记载免疫 测定系统中血清/血浆相关性的问题，专利文献3所述的方法对于血清/血浆相关性有何 影响是不清楚的。
[0007] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :日本特开昭60-60557号公报 专利文献2 :日本特开平5-249108号公报 专利文献3 :日本特开平9-43237号公报。
【发明内容】
[0008] 发明所要解决的课题 本发明的目的在于提供：与以往的方法相比，血清/血浆相关性良好的PIVKA-II的测 定方案。
[0009] 解决问题的方案 本发明人对于PIVKA-II的测定进行了深入的研宄，结果发现：通过使用将与人凝血酶 原片段1特异性结合的抗体、和与人凝血酶原片段2特异性结合的抗体的混合而成的混合 抗体作为免疫测定中的抗体，与以往的方法相比，血清/血浆相关性大幅改善，从而完成了 本发明。
[0010] S卩，本发明提供PIVKA-II的测定方法，该测定方法包括：通过使用与凝血酶原片 段Fl特异性结合的抗Fl抗体或其抗原结合性片段、和与凝血酶原片段F2特异性结合的 抗F2抗体或其抗原结合性片段的混合物，以及与PIVKA-II特异性结合的抗PIVKA-II抗 体或其抗原结合性片段的免疫测定，来测定样品中的PIVKA-II。本发明还提供样品中的 PIVKA-II的免疫测定试剂，该免疫测定试剂包含：与PIVKA-II特异性结合的抗PIVKA-II 抗体或其抗原结合性片段、与凝血酶原片段Fl特异性结合的抗Fl抗体或其抗原结合性片 段、和与凝血酶原片段F2特异性结合的抗F2抗体或其抗原结合性片段。本发明进一步提 供样品中的PIVKA-II的免疫测定试剂盒，该试剂盒包括所述本发明的免疫测定试剂。
[0011] 发明效果 根据本发明，可提供血清/血浆相关性良好的PIVKA-II的测定方法、以及用于该测定 的试剂和试剂盒。本发明的方法与以往的方法相比，血清/血浆相关性进一步得到大幅改 善，作为PIVKA-II测定方法，其实用性更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是表示实施例1中制备的单克隆抗体与全长人凝血酶原（I)、F1区⑵和F2 区（3)的反应性的图表。
【具体实施方式】
[0013] 凝血酶原含有凝血酶原片段I(Fl)区和凝血酶原片段2(F2)区和凝血酶区。 PIVKA-II是因为N末端附近的10个Glu残基中的γ-羧基化不完全而10个残基的全部或 一部分未形成Gla、仍为Glu的糖蛋白，PIVKA-II也含有凝血因酶原片段I(Fl)区和凝血酶 原片段2 (F2)区和凝血酶区。
[0014] SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列是PIVKA-II的氨基酸序列，第44号-第198号 氨基酸区是凝血酶原Fl区，第199号-第314号氨基酸区是凝血酶原F2区。含有Fl区 的一部分的第25号-第88号氨基酸区被称作Gla区。凝血酶原中，SEQ ID NO: 1中的 10个"Xaa"全部形成γ-羧基谷氨酸（Gla)残基。该凝血酶原序列在GenBank中以登录 号ΝΡ_000497登记。SEQ ID NO: 2所示的碱基序列是编码SEQ ID NO: 1的PIVKA-II和 NP_000497的凝血酶原的序列，在GenBank中以登录号NM_000506登记。SEQ ID NO: 2中 的第44号-第1912号的碱基区域是编码区。
[0015] 本发明的测定方法中，使用抗Fl抗体和抗F2抗体的混合物、以及与PIVKA-II特 异性结合的抗PIVKA-II抗体进行夹心免疫测定。通过使用抗Fl抗体和抗F2抗体的混合物 作为夹心法中抗体的一方，可以合乎需要地改善PIVKA-II测定值中的血清/血浆相关性。
[0016] 抗Fl抗体是与凝血酶原Fl特异性结合的抗体。即，在PIVKA-II的凝血酶原Fl区 内具有表位，是识别该表位而与PIVKA-II结合的抗体。例如，只与凝血酶原或PIVKA-II的 Fl区片段结合、实质上不与F2区片段以及凝血酶区片段的任意一方结合的抗体就是"与在 Fl区内具有表位的凝血酶原Fl特异性结合的抗体"。这里所述的"实质上不结合"是指：不 与F2区片段以及凝血酶区片段的任意一方以可检测的水平结合（S卩，与F2区片段以及凝 血酶区片段的结合为背景噪声以下），或者即使是以可检测的水平结合，也仅以本领域技术 人员清楚的程度结合，即与它们结合的程度明显少于与Fl区片段的结合，并非与F2区片段 或凝血酶区片段结合。抗Fl抗体可以是可与PIVKA-II的Fl区、也与凝血酶原的Fl区结 合的抗体，可以不具有PIVKA-II分子特异性（S卩，不与凝血酶原结合而只与PIVKA-II结合 的结合性）。
[0017] 抗F2抗体是与凝血酶原F2特异性结合的抗体。即，在PIVKA-II的凝血酶原F2 区内具有表位，是识别该表位而与PIVKA-II结合的抗体。例如，只与凝血酶原或PIVKA-II 的F2区片段结合、实质上不与Fl区片段以及凝血酶区片段的任意一方结合的抗体是"与 凝血酶原F2特异性结合的抗体"。这里所述的"实质上不结合"是指：不与Fl区片段以及 凝血酶区片段的任意一方以可检测的水平结合（即，与Fl区片段以及凝血酶区片段的结合 为背景噪声以下），或者即使是以可检测的水平结合，也仅以本领域技术人员清楚的程度结 合，即与它们结合的程度明显少于与F2区片段的结合，并非与Fl区片段或凝血酶区片段 结合。F2区的氨基酸序列在PIVKA-II和凝血酶原中均相同，因此抗F2抗体通常是可以与 PIVKA-II的F2区、也可以与凝血酶原的F2区结合的抗体。
[0018] 抗PIVKA-II抗体是只与PIVKA-II结合、实质上不与凝血酶原结合的抗体。
[0019] 抗Fl抗体、抗F2抗体和抗PIVKA-II抗体各自可以是单克隆抗体，也可以是多克 隆抗体。从免疫测定的再现性等角度考虑，可优选使用单克隆抗体。另外，这些抗体也可以 以保持与对应抗原的结合性的抗体片段（抗原结合性片段）的形式使用。
[0020] 多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合性片段的制备方法本身是周知的常规方法， 抗Fl抗体、抗F2抗体、抗PIVKA-II抗体以及它们的抗原结合性片段可按照常规方法制备。 另外，这些抗体也存在市售商品，因此也可以使用市售的抗体。
[0021] 抗Fl多克隆抗体例如可如下获得：将Fl多肽或其部分片段与适当的佐剂一起免 疫动物（人除外），由从该动物采集的血液获得抗血清，纯化该抗血清中的多克隆抗体。为 了使被免疫动物中抗体效价升高，免疫通常需要花费数周进行多次。抗血清中的抗体的纯 化例如可通过用硫酸铵沉淀或采用阴离子色谱的分离、亲和柱纯化等进行。抗F2多克隆抗 体也可以以F2多肽或其部分片段作为免疫原类似地制备。
[0022] 抗Fl单克隆抗体例如可通过周知的杂交瘤法制备。具体来说，可将Fl多肽（Fl 区片段）、凝血酶原、PIVKA-II或它们的部分片段与适当的佐剂一起免疫动物（人除外）， 从该动物采集脾细胞或淋巴细胞等的抗体生成细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤， 选择生产与Fl多肽结合的抗体的杂交瘤，使其增殖，从培养上清中获得抗Fl单克隆抗体。 抗F2单克隆抗体也同样，以F2多肽、凝血酶原、PIVKA-II或其部分片段作为免疫原，通过 选择生产与F2多肽结合的抗体的杂交瘤来制备。
[0023] 关于抗PIVKA-II抗体，多克隆抗体可使用羧基化不完全的Gla区部分片段作为免 疫原来制备，但本发明中，必须对PIVKA-II具有足够的特异性，因此通常使用单克隆抗体。 对于PIVKA-II单克隆抗体，可使用PIVKA-II或其部分片段（含有受到羧基化的Gla区的 10个残基中的至少一部分的部分片段）作为免疫原制备杂交瘤，然后选择生产与PIVKA-II 结合而不与凝血酶原结合的抗体的杂交瘤，回收抗体。抗PIVKA-II抗体的制备方法的具体 例子可举出日本特开昭60-60557号公报、日本特开平9-249699号公报所述的方法。
[0024] "抗原性结合性片段"只要可保持原本抗体与对应抗原的结合性（抗原抗体反应 性）即可，可以是任何抗体片段。具体例子可举出：? &13、？(&13'）2、8(^ ￥等，但并不限于此。 众所周知，Fab或F(ab'）2可通过将单克隆抗体用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等的蛋白质分解 酶处理来获得。scFv(单链可变区片段，单链抗体）的制备方法也是周知的，例如可提取如 上所述制备的杂交瘤的mRNA，制备单链cDNA，使用对免疫球蛋白H链和L链为特异性的引 物进行PCR，使免疫球蛋白H链基因和L链基因扩增，将它们用接头连接，使其具有适当的限 制酶切位点，导入质粒载体中，用该载体转化大肠杆菌，使scFv表达，将其从大肠杆菌中回 收，由此获得scFv。
[0025] 作为免疫原使用的多肽或其部分片段可通过化学合成、遗传工程学方法等常规方 法制备。或者可从新鲜人血浆等中提取凝血酶原或PIVKA-II并纯化获得（参照Thromb. Diath. Haemorph. I%6; I6:469_9〇 等）〇
[0026] 化学合成法的具体例子例如可举出：Fmoc法（荷甲氧羰基法）、tBoc法（叔丁氧 基羰基法）等。还可以利用各种市售的肽合成仪，通过常规方法合成。化学合成时，可以只 根据氨基酸序列合成所需的多肽。
[0027] 通过遗传工程学方法制备多肽的方法也是周知的。具体来说，例如可通过以下 所述的方法制备。首先，由来自人的培养细胞等中提取RNA，通过反转录反应由mRNA合成 cDNA。以该cDNA为模板，使用根据人凝血酶原的mRNA序列信息设计的引物进行PCR，制备 编码凝血酶原全长或所需一部分（Fl区或F2区等）的多核苷酸。PCR中使用的引物可以根 据SEQ ID NO: 2所示的碱基序列或登记于GenBank等数据库中的人凝血酶原序列信息等 适当设计。或者，编码所需多肽的多核苷酸可通过使用市售的核酸合成仪的常规方法制备。 编码各氨基酸的密码子是公知的，因此只要特定氨基酸序列，编码该氨基酸序列的多核苷 酸的碱基序列也可确定。接着，将制备的多核苷酸掺入适当的载体，通过适当的表达系统使 多肽表达，回收该多肽，由此可获得所需的多肽。所使用的载体或各种表达系统（细菌表达 系统、酵母细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、无细胞表达系统等） 也是周知的，各种载体或宿主细胞、试剂类、试剂盒均有市售，因此，本领域技术人员可适当 选择使用。来自人的培养细胞也有市售/分开出售，容易获得。
[0028] 抗Fl抗体与抗F2抗体的混合比例只要是在PIVKA-II测定值中可得到良好的 血清/血浆相关性的范围即可，没有特别限定，以抗Fl抗体：抗F2抗体=1:0. 2-2、优选 1:0. 3-1. 5、更优选1:0. 5-1. 0的混合比例，尤其可获得良好的血清/血浆相关性。如后述 实施例所示，在只使用抗F2抗体时，血浆样品的PIVKA-II测定值比血清样品的测定值高， 未能得到良好的血清/血浆相关性。只使用抗Fl抗体时，血清样品的PIVKA-II测定值比 血浆样品的测定值高，未能得到良好的血清/血浆相关性。而通过将抗Fl抗体和抗F2抗 体混合使用，可以改善血清/血浆相关性。
[0029] 夹心免疫测定本身是周知的常规方法。作为具体例子，可举出化学发光酶免疫测 定法（CLEIA)、酶联免疫吸附法（ELISA)、放射免疫测定、电化学发光免疫测定法等各种方 法，本发明中可以采用任意方法。
[0030] 夹心测定系统中，通常使用2种抗体中的一方作为固定于固相上的固相抗体，使 用另一方作为标记抗体。本发明中，使用抗Fl抗体/抗F2抗体混合物作为1种抗体，使用 抗PIVKA-II抗体作为另1种抗体，但是，可以使用任意一种作为固相抗体。下述实施例中， 使用抗PIVKA-II抗体作为固相抗体，使用抗体混合物作为标记抗体，但并不限于此。
[0031] 以使用抗Fl抗体/抗F2抗体混合物作为标记抗体的情形为例，具体说明本发明 的PIVKA-II测定方法。首先，将PIVKA-II抗体（固相抗体）固定于载体上。使固定的 PIVKA-II抗体与样品中所含的PIVKA-II接触，由此使固相抗体与PIVKA-II特异性结合。 接着，用适当的缓冲液洗涤除去未结合的样品中成分，例如载体，然后使用标记物标记的抗 Fl抗体/抗F2抗体混合物（S卩，标记抗Fl抗体和标记抗F2抗体的混合物）与结合于固相 抗体上的PIVKA-II结合。反应结束后，为了除去未反应的成分，例如用适当的缓冲液洗涤 载体后，用适当的方法检测来自标记物的信号，由此可测定样品中所含的PIVKA-II。
[0032] 固相没有特别限定，可以与在公知的夹心免疫测定系统中使用的固相相同。固相 的材质的具体例子可举出：聚苯乙烯、聚乙烯、琼脂糖等，但并不限于这些。固相的物理形状 本质上并不重要。所使用的固相优选为抗体与其表面的固定容易且可容易地将测定中形成 的免疫复合物与未反应的成分分离的材料。特别优选在常规免疫测定法中使用的塑料板或 磁性粒子。从操作、保存和分离的容易性等考虑，最优选使用如上所述材质的磁性粒子。抗 体与这些固相的结合可通过本领域周知的常规方法进行。
[0033] 标记物也没有特别限定，可以使用与在公知的免疫测定系统中使用的标记物同样 的物质。具体例子可举出：酶、荧光物质、化学发光物质、染色物质、放射性物质等。酶可以 使用碱性磷酸酶（ALP)、过氧化物酶、β半乳糖苷酶等公知的酶，但并不限于这些。为了提 供高检测灵敏度的测定系统，优选使用ALP。
[0034] 使用酶作为标记物时，通过使与该酶对应的显色底物、荧光底物或发光底物等底 物与该酶反应并测定由此产生的信号，可求出酶活性对测定对象物进行测定。例如，使用 ALP作为标记物时，可以使用3-(4-甲氧基螺（1，2-二氧环乙烷-3, 2'-三环[3. 3. 1. 13, 7] 癸烷）-4-基）苯基磷酸二钠（例如商品名AMPPD)等的发光底物。
[0035] 使用生物素或半抗原作为标记物时，可以使用结合了酶、荧光物质、化学发光物 质、染色物质或放射性物质等的链霉抗生物素或半抗原抗体等测定。
[0036] 信号的检测可根据标记物的种类适当选择。例如信号如果是显色，则可以使用 比色计或吸光光度计，如果是荧光则可以使用荧光光度计，如果是发光则可以使用光子计 数仪，如果是放射线则可以使用放射线测定装置。对于以各种浓度含有PIVKA-II的浓度 已知的标准样品，按照本发明的方法测定PIVKA-II，由来自标记的信号量和标准样品中 PIVKA-II的浓度的相关关系制图，制成校正曲线，对PIVKA-II浓度未知的样品同样进行测 定操作，测定来自标记的信号量，将测定值代入该校正曲线，由此可对样品中PIVKA-II进 行定量。
[0037] 本发明的方法所适用的样品是从受试者分离的样品，优选血液样品，特别优选 血浆或血清。根据本发明的测定方法，不管是血浆样品还是血清样品，均可稳定地测定 PIVKA-II。样品可根据需要适当稀释后使用。
[0038] 本发明还提供样品中的PIVKA-II的免疫测定试剂，该试剂含有：抗PIVKA-II抗体 或其抗原结合性片段（抗PIVKA-II抗体等）、抗Fl抗体或其抗原结合性片段（抗Fl抗体 等）、和抗F2抗体或其抗原结合性片段（抗F2抗体等）。该免疫测定试剂中，抗Fl抗体等 和抗F2抗体等可分别封装入容器，或者预先混合后封装入容器。还可以进一步含有对这些 抗体或其抗原结合性片段的稳定等有用的其它成分。这些抗体或其抗原结合性片段可以是 用标记物标记的形态，或固定在板、粒子等固相上的形态。
[0039] 上述免疫测定试剂可以与其它试剂类等适当组合，作为样品中的PIVKA-II的免 疫测定试剂盒提供。免疫测定所必需的其它试剂类是周知的。例如，除上述免疫测定试剂 之外，本发明的试剂盒中还可以进一步含有样品稀释液、洗涤液、以及标记抗体中使用的标 记物为酶时的该酶的底物液等。 实施例
[0040] 以下通过实施例具体说明本发明。当然本发明并不受这些实施例等的限定。
[0041] 实施例1.标记抗体的制备 (A)杂交瘤的制备 将纯化凝血酶原（按照 Shapiro S.等人·，The purification of human prothrombin. Thromb. Diath. Haemorph. 1966; 16:469-90 所述的方法从新鲜人血衆中纯 化而得）在含有〇· 15M NaCl的IOmM磷酸缓冲液（ρΗ7· 3)中稀释，终浓度为0· 2-1. 0mg/mL， 与等量的弗氏完全佐剂混合，制成油包水型乳液。将该乳液腹腔内给予7周龄的BALB/c系 小鼠，之后将氟完全佐剂变更为弗氏不完全佐剂，每2周进行同样的免疫，进行2到3次。进 而在约2周后腹腔内给予100 μ L溶解于生理盐水的0. 2-1. 0mg/mL纯化凝血酶原（最终追 加免疫）。
[0042] 最终追加免疫后第3天，由该免疫动物无菌摘除脾脏，用剪刀剪成碎片，进一步使 用筛网将脾脏拆解成单个细胞，用RPMI-1640培养基洗涤3次，计测细胞数。与上述同样地 洗涤对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株P3X63Ag8-Ul，然后调节为所计测的脾细胞数的1至 1/10的细胞数，加入到50ml容量的离心管中混合。以200X g、5分钟进行离心，除去上清， 加入ImL聚乙二醇（PEG) 1500 ( y少夕制造）进行细胞融合。然后加入15mL RPMI-1640培 养基，进行聚乙二醇的稀释。
[0043] 对于融合细胞，通过离心（200 X g，5分钟）除去PEG，然后使用96孔板在含有10% 胎牛血清、次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷（HAT)的RPMI-1640培养基中培养约10天，只使杂交 瘤增殖。然后取部分培养上清，通过将纯化凝血酶原用作固相抗原的ELISA法，筛选各个生 产凝血酶原抗体的孔，得到多个生产对凝血酶原具有反应性的单克隆抗体的杂交瘤。对于 所得杂交瘤，按照常规的极限稀释法进行单克隆。
[0044] (B)单克隆抗体的制备 将按照（A)所述的方法得到的杂交瘤移植到预先腹腔内给予了 0.5mL降植烷的小鼠腹 腔内，每只移植约IXlO7个，取得在腹水中产生的单克隆抗体。该单克隆抗体的纯化是通 过利用结合了 A蛋白的琼脂糖柱（才7 7卜''制造）分离IgG流分来进行。
[0045] 接着，分别将凝血酶原多肽、Fl多肽和F2多肽分别固定在微量滴定板上，分别 对于得到的单克隆抗体研宄其对各多肽的反应性。即，将全长凝血酶原（Termo)、凝血 酶原-片段 I (Haematologic Technologies Inc.)、凝血酶原-片段 2 (Haematologic Technologies Inc.)分别用0. IM磷酸缓冲液（pH7. 0)制备成5 μ g/mL的溶液。将100 μ L 这些抗原溶液添加到微量板（Nunc，Maxisorp)的各孔中，在4°C下反应12-18小时，然后除 去抗原溶液，将300 μ L含有1%BSA、0. 1%叠氮化钠的50mM Tris-HCl缓冲液（pH7. 2)添加到 各孔中。在室温下静置2小时，然后封闭微量板的未反应部位，用含有0. 01%TritonX-100、 0· 03M NaCl的IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 2)(以下记为洗涤液）洗涤3次，由此得到各种多肽 固相板。制备单克隆抗体hPTN7-2、PT5-23和20Β8的5 μ g/mL抗体溶液，将100 μ L该溶液 添加到固定有上述3种多肽（全长凝血酶原、凝血酶原-片段1、凝血酶原-片段2)的微量 板的各孔中，在室温下反应1小时，然后除去抗体溶液，用洗涤液洗涤3次。将100 μ L稀释 为一定浓度的碱性磷酸酶标记抗小鼠 igG( 0々夕y X A y y寸一于制造）添加到各孔 中，在室温下反应1小时，然后除去标记抗体溶液，用洗涤液洗涤3次，添加100 μ L含有作 为显色底物的IOmM 4-硝基苯基磷酸、ImM氯化镁的IM二乙醇胺-盐酸缓冲液（ρΗΙΟ. 5)， 进行显色反应。在遮光下室温静置15分钟，然后添加100 yL含有50mM EDTA的0. IM磷酸 缓冲液（ρΗ7· 0)，终止反应，然后用微量板读数仪（才7 7卜'、）测定450nm/630nm的吸 光度。
[0046] 测定结果如图1所示。单克隆抗体hPTN7-2和PT5-23与凝血酶原多肽和Fl多肽 反应，不与F2多肽反应，因此，可确认是特异性识别Fl的抗Fl单克隆抗体。而单克隆抗体 20B8与凝血酶原多肽和F2多肽反应，不与Fl多肽反应，因此，可确认是特异性识别F2的抗 F2单克隆抗体。
[0047] (C)标记抗体的制备 接着，取6mL 3mg/mL的hPTN7-2抗体溶液，添加到用0. IM柠檬酸缓冲液（pH3. 5)平衡 的G-25柱（7 7 Yシ7制造）中，进行抗体溶液的缓冲液置换。向其中加入约100 μ L lmg/mL胃蛋白酶溶液，37°C放置1小时，用Tris缓冲液将pH调至中性附近，然后添加到只 - A-r 7夕只200柱（7 7 Yシ7制造）中，进行抗体的凝胶过滤纯化。合并所得流 分在吸光度280nm下的单峰，作为hPTN7-2抗体F(ab'） 2片段。在4mL该F(ab'）2片段溶 液中添加200 μ L 0. 2M 2-巯基乙胺（以下记为2-MEA)溶液，37°C放置2小时，进行还原处 理。将其添加到G-25柱中，除去2-MEA，作为hPTN7-2抗体Fab'片段。
[0048] 将I. 5mL 10mg/mL的高比活性ALP溶液添加到用0· IM磷酸缓冲液（ρΗ7· 0)平衡 的G-25中，进行ALP溶液的缓冲液置换。向其中添加70 μ L 10mg/mL N-(4-马来酰亚胺基 丁基氧基）_琥珀酰亚胺（以下记为GMBS)的二甲基甲酰胺溶液，30°C放置1小时以进行反 应。将该溶液添加到用0. IM磷酸缓冲液（pH6. 3)平衡的G-25柱中，除去过量的GMBS，制 备马来酰亚胺化ALP。将4mL之前制备的hPTN7-2抗体Fab'片段溶液、3mL马来酰亚胺化 ALP溶液和13mL 0. IM磷酸缓冲液（pH6. 3)混合，在室温下放置1小时，由此制备ALP标记 抗体。向其中加入ImL 2M 2-MEA溶液，在室温下放置30分钟，将多余的马来酰亚胺基封 闭，然后添加到只一，一r 7夕只200柱中，进行纯化。合并吸光度280nm的几个峰中Fab' 和ALP为1:1的分子量的峰，作为纯化ALP标记hPTN7-2抗体（ALP标记抗Fl抗体）。对于 PT5-23抗体和20B8抗体，也同样地制备纯化ALP标记PT5-23抗体（ALP标记Fl抗体）和 纯化ALP20B8抗体（ALP标记抗F2抗体）。
[0049] 实施例2.测定数据 (D)PIVKA-II 的测定 样品是由同一健康受试者得到的人血清/血浆（肝素钠和EDTA-2钠）样品对。除了 使用酶标抗体之外，测定中还使用少S スフ°レ只卜PIVKA-II工一寸、<(富士 U匕、才制 造）所附的试剂（抗体结合粒子、洗涤液）。
[0050] 首先，在50 μ L结合有与PIVKA-II特异性结合的抗PIVKA-II单克隆抗体（小鼠） 的抗体结合粒子（抗PIVKA-II单克隆抗体（小鼠）结合磁性粒子）中添加20 μ L样品，搅 拌，然后在37°C下反应8分钟。通过磁力从磁性粒子中分离除去反应残余液，用洗涤液洗 涤。在洗涤后的粒子中添加在（C)中制备的ALP标记抗Fl抗体（hPTN7-2抗体或PT5-23 抗体）（终浓度〇· 4 μ g/mL)和ALP标记抗F2抗体（终浓度0· 2 μ g/mL)，搅拌后在37°C下 反应8分钟。比较例是使用ALP标记抗凝血酶原多克隆抗体作为酶标抗体。
[0051] 然后，再次通过磁力分离磁性粒子，除去反应残余液，用洗涤液洗涤。向该粒子中 添加200 μ L含有碱性磷酸酶的化学发光底物3-(2' -螺金刚烷）-4-甲氧基-4-(3' ' -磷 酰氧基）苯基-1，2-二氧环乙烷·2钠盐（AMPPD)的底物液，在37°C下进行4分钟的酶促反 应。通过发光测定仪测定反应后的化学发光量。测定仪器使用全自动化学发光免疫测定装 置;I/ Sパ；レスフ°レ只卜11(富士 U匕、才制造）。
[0052] 表1示出使用ALP标记抗凝血酶原多克隆抗体作为酶标抗体测定的9个血清/血 浆样品对的结果。表2示出使用ALP标记抗Fl抗体（hPTN7-2抗体）和ALP标记抗F2抗 体（20B8抗体）的混合物作为酶标抗体测定的9个血清/血浆样品对的结果。结果，如表 1所示，在使用ALP标记抗凝血酶原多克隆抗体时，肝素血浆中的血浆/血清比例平均约为 79%，可确认血清/血浆相关性低。而将抗Fl抗体和抗F2抗体按照重量比2:1混合作为 ALP标记抗体时，如表2所示，肝素血浆中的血浆/血清比例约为102%，EDTA血浆中的血浆 /血清比例约105%，每种情形的血清/血浆的相关性均得到改善。
[0053] [表 1]
[表2]
【权利要求】
1. PIVKA-II的测定方法，包括：通过使用与凝血酶原片段1特异性结合的抗Fl抗体 或其抗原结合性片段、和与凝血酶原片段2特异性结合的抗F2抗体或其抗原结合性片段的 混合物、以及与PIVKA-II特异性结合的抗PIVKA-II抗体或其抗原结合性片段的免疫测定， 来测定样品中的PIVKA-II。
2. 权利要求1所述的方法，其中，所述抗Fl抗体是识别Fl区内的表位而与PIVKA-II 结合的抗体，所述抗F2抗体是识别F2区内的表位而与PIVKA-II结合的抗体。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中，所述抗Fl抗体、所述抗F2抗体和所述抗 PIVKA-II抗体均是单克隆抗体。
4. 权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是通过使用所述混合物作 为标记抗体、使用所述抗PIVKA-II抗体或其抗原结合性片段作为固相抗体的夹心法进行。
5. 权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述混合物是以1:0. 2-2的比例含有抗 Fl抗体和抗F2抗体的混合物。
6. 权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述样品是血清或血浆。
7. 样品中的PIVKA-II的免疫测定试剂，包含：与PIVKA-II特异性结合的抗PIVKA-II 抗体或其抗原结合性片段、与凝血酶原片段Fl特异性结合的抗Fl抗体或其抗原结合性片 段、和与凝血酶原片段F2特异性结合的抗F2抗体或其抗原结合性片段。
8. 样品中的PIVKA-II的免疫测定试剂盒，包括：权利要求7所述的免疫测定试剂。
【文档编号】G01N33/53GK104520710SQ201380042250
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2012年8月9日
【发明者】山口建太郎, 青柳克己, 寺尾梓 申请人:富士瑞必欧株式会社, 爱代尔株式会社