专利名称：：脂蛋白毛细管涂层及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一类脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，其目的在于研制出一种大分子涂层，并保留一定生物活性和生物相容性，使之既可用于毛细管表面吸附的抑制和电渗调控，又可以用于生化分析和临床检测等具体应用。脂蛋白包括极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和乳糜微粒。本发明的另一目的在于提供上述脂蛋白涂层的制备方法，该方法操作简单，易于保持脂蛋白的活性和稳定性。本发明所涉及的脂蛋白毛细管涂层的制备可以通过两种方法实现，即物理吸附法(或称自组装法)和化学键合法。物理吸附法(自组装法)制备脂蛋白毛细管涂层的原理在一定浓度的缓冲溶液(0.l-100mM，pH4-9)和温度(4_37°C)条件下，使脂蛋白(浓度0.Ol-lOmg/mL)与石英或玻璃毛细管内壁的硅羟基发生疏水、静电吸引等非共价相互作用，从而自组装到内壁表面形成结合层；然后用缓冲液洗去未结合的脂蛋白，制得脂蛋白毛细管涂层。化学键合法制备脂蛋白毛细管涂层的原理先依据溶胶-凝胶技术，用Y-氨丙基三乙氧基硅烷或Y-氨丙基三甲氧基硅烷等硅烷化试剂对毛细管进行改性，引入氨基活性基团，制得氨基修饰的毛细管；然后以过量的戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)或辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)或l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺体系(EDC/NHS)为偶联剂，在一定缓冲溶液pH值(pH4-9)、温度(4_37°C)以及脂蛋白浓度(0.l-10mg/mL)的条件下，共价连接毛细管上的氨基与脂蛋白上的氨基酸残基，将脂蛋白固定到毛细管内壁；最后用缓冲液洗去未结合的脂蛋白，制得脂蛋白毛细管涂层。本发明所涉及的脂蛋白毛细管涂层及制备方法具有以下几个特点具有良好的生物相容性，适用于生物大分子的分离和分析；保留脂蛋白的活性，可模拟生物膜进行其与生物大分子、小分子之间的相互作用研究，可用于临床诊断和药理研究；可根据脂蛋白的等电点(pI5-6)，通过选择电泳缓冲液来对电渗进行调控；具有磷脂和载脂蛋白等活性组份，可为药物载体的设计和外源性物质体内运输过程的机制提供研究工具。图1为化学键合法制备脂蛋白涂层的合成路线示意图。图2为缓冲液pH与低密度脂蛋白涂层产生电渗的关系图。图3为脂蛋白毛细管涂层用于蛋白质的分离色谱图。具体实施例方式脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，用以下实施方案举例说明。在制备脂蛋白涂层之前，首先要进行毛细管的预处理。毛细管先用色谱纯甲醇冲洗l小时，然后用lmol/L氢氧化钠冲洗l-2小时，去离子水清洗毛细管15分钟，再用lmo1/L盐酸冲洗1-2小时，最后用去离子水冲洗15分钟，高纯氮气吹干备用。预处理完成后，进行脂蛋白涂层的制备。实施例1物理吸附法制备低密度脂蛋白毛细管涂层称取5.0mg的低密度脂蛋白冻干粉，充分溶解于5.0mL的25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，配制成1.0mg/mL的涂层溶液。将该涂层溶液在10psi压力下通过经预处理的毛细管15分钟，然后用硅橡胶封住毛细管两端，毛细管内灌注有上述低密度脂蛋白涂层溶液，于室温下静置2-4小时。再次灌装涂层溶液，封住毛细管两端，于室温下静置2小时以上。完成上述操作后，用25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)冲洗毛细管30分钟，去除未与管壁结合的低密度脂蛋白，毛细管两端用硅橡胶密封，并置于冰箱内4t:保存。高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将低密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。实施例2氨丙基修饰的毛细管的制备移取0.lmL的Y-氨丙基三甲氧基硅烷，溶于1.0mL的水(稀醋酸调pH5)-甲醇(2:8，体积比)的混合溶液中，充分混匀后迅速充入预处理的毛细管中，将毛细管两端用硅橡胶密封，室温下反应2-4小时。反应完成后，依次用甲醇、水冲洗毛细管各30分钟，然后毛细管在高纯氮气保护下，置于105-12(TC的烘箱内陈化干燥2小时以上。通过上述处理步骤，得到氨丙基修饰的毛细管。实施例3以戊二醛为偶联剂的化学键合法制备低密度脂蛋白毛细管涂层移取0.5mL50%的戊二醛水溶液，加入到4.5mL的25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，充分混匀后，在5psi的压力下充入由实施例2制备的氨丙基修饰毛细管，1小时后用硅橡胶密封毛细管两端，静置于室温反应2-6小时。然后用25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)将反应未尽的戊二醛溶液冲出，得到戊二醛修饰的毛细管。按照实施例1所述方法配制1.Omg/mL的低密度脂蛋白涂层溶液，将该溶液充入上述经戊二醛处理过的毛细管中，30分钟后封住两端，于室温下继续反应2-4小时。在此反应过程中，脂蛋白与戊二醛的醛基发生共价作用，生成希夫碱式化合物。用磷酸盐缓冲溶液将反应未尽的脂蛋白涂层溶液冲出，再用浓度为0.5mg/mL的氰基硼氢化钠溶液(在25mmoL磷酸盐缓冲液中，pH6.4)冲洗20分钟。用硅橡胶密封毛细管两端，于室温下继续反应4-8小时，将不稳定的希夫碱结构还原成较稳定的亚胺结构(见附图1)。最后用25mmoL磷酸盐缓冲溶液(PH=7.4)将反应液冲出，得到低密度脂蛋白的毛细管涂层。如不立即使用，须置于冰箱4t:保存。高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将低密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。实施例4以N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)为偶联剂制备高密度脂蛋白毛细管涂层称取5.0mg的DSC溶于5mL乙腈中，充分混匀。将上述溶液充入由实施例2制备的氨丙基修饰毛细管中，20分钟后用硅橡胶密封毛细管两端，并置于45t:水浴中反应2-4小时。待反应完成后，依次用乙腈、去离子水和25mmoL磷酸盐缓冲液(pH7.4)冲洗毛细管10分钟。按照实施例1所述方法配制1.Omg/mL的高密度脂蛋白涂层溶液，将该溶液充入上述经DSC处理过的毛细管中，于室温下反应2-4小时。待反应完成后，用25mmoL磷酸盐缓冲液(pH7.4)冲洗毛细管30分钟，得到高密度脂蛋白的毛细管涂层(见附图1)。如不立即使用，须置于冰箱4t:保存。低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将高密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。实施例5以辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)为偶联剂制备高密度脂蛋白毛细管涂层以DSS为偶联剂制备极低密度脂蛋白毛细管涂层的操作与实施例4相同，仅须将N，N-琥珀酰氨基碳酸酯更换为DSS(见附图1)。低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将高密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。实施例6以EDC/NHS为偶联剂的化学键合法制备极低密度脂蛋白毛细管涂层称取5.Omg的极低密度脂蛋白，溶于5mL的25mmoL磷酸盐缓冲液(pH6.0)中；向该溶液中依次加入2.OmgEDC和3.0mgNHS，室温下漩涡震荡5分钟，静置25分钟。将上述溶液充入由实施例2制备的氨丙基修饰毛细管中，15分钟后用硅橡胶密封毛细管两端，4°C-25t:反应4小时以上。待反应完成后，用25mmoL磷酸盐缓冲液(pH7.4)冲洗毛细管30分钟，得到极低密度脂蛋白的毛细管涂层(见附图1)。高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将极低密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。实施例7脂蛋白毛细管涂层对于电渗的控制由实施例1制备的物理吸附(自组装)型脂蛋白毛细管涂层与实施例3-5制备的化学键合型脂蛋白毛细管涂层有相近的电渗控制行为。通过上述实施方案制备的脂蛋白毛细管涂层，可根据使用电泳缓冲液的不同实现对电渗的控制。电渗淌度的计算公式为电渗(cm7Vs)=毛细管总长(cm)X有效长度(cm)/[电压(V)X迁移时间(s)]以物理吸附型和化学键合型低密度脂蛋白涂层为例，选定实验条件为涂层毛细管内径50iim，总长50cm，有效长度40cm，施加电压15kV，以N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)为电渗标记物，进样压力0.5psi，进样时间5秒。在此条件下，如果将电泳缓冲液(25mmoL磷酸盐缓冲液)PH值从4逐渐改变到pH8时，电渗淌度将会发生方向和绝对值大小的改变(见附图2)。并且，线性拟合曲线与X轴(pH值)的交点在5.3-5.5之间，与低密度脂蛋白的等电点(Pl约为5.5)接近。实验结果验证了脂蛋白毛细管涂层对电渗的可控性。这一特点可以为不同的分析及分离目的提供灵活简便的操作参数，从而提高分离效率和分析速度。实施例8脂蛋白毛细管涂层用于蛋白质的生化分离和分析6采用化学键合法制备的低密度脂蛋白涂层，对细胞色素c(Cytc)、溶菌酶(Lys)、核糖核酸酶A(RNaseA)和a_糜蛋白酶原A(a-ChyA)4种碱性蛋白进行了分离。电泳条件毛细管内径50iim，总长50cm，有效长度40cm，施加电压+15kV，以25mmoL磷酸盐溶液(pH7.4)为电泳缓冲液，混合样品中各蛋白质浓度0.2mg/mL，进样压力0.5psi，进样时间5秒。结果表明，在上述电泳条件下，以上4种碱性蛋白质达到完全电泳分离，分离度大于1.5(见附图3)。蛋白质的分离效率为8700-124000块理论塔板/米，回收率在82%-96%之间，日间和日内精密度相对标准偏差(RSD)为1.2%-5.7%(见表1)，满足上述碱性蛋白质生化分离以及定性定量分析的要求。脂蛋白涂层与分析物之间除存在疏水和静电相互作用外，还可能存在一定的亲和作用。脂蛋白涂层具有良好的结构特征及生物相容性，可以抑制蛋白质等生物大分子在毛细管壁上的不可逆吸附，适用于蛋白质的生化分离和分析。表1低密度脂蛋白毛细管涂层电泳分离蛋白质的性能蛋白质柱效回收率(%)精密度(RSD%，n=5)(块塔板/m)曰间曰内Lys3900086.8±4.2%2.434.31Cytc12400096.1±3.3%1.263.35RNaseA1410089.0±5.5%2.864.76ff-ChyA870082.4±6.挑3.475.64实施例9低密度脂蛋白毛细管涂层用于自由基氧化损伤机理的研究采用低密度脂蛋白涂层毛细管，研究二价铜离子(Cu2+)诱导低密度脂蛋白的自由基氧化损伤。电泳条件毛细管内径50iim，总长50cm，有效长度40cm，施加电压+15kV，以25mmoL磷酸盐溶液(pH7.4)为电泳缓冲液，以0.2%DMF为电渗标记物，混合样品中各蛋白质浓度O.2mg/mL，进样压力0.5psi，进样时间5秒。0^04溶液的配制称取8.0mg(50iimol)的无水硫酸铜，溶于10mL的25mmoL磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，配制成5iimol的CuS04溶液。低密度脂蛋白涂层的氧化修饰将上述CuS04溶液分别冲入3支尺寸相同的低密度脂蛋白涂层毛细管内，密封两端，置于37t:水浴分别孵育2、6和12小时。反应完成后，用电泳缓冲液将管内溶液冲出，并继续冲洗20-30分钟，最后接入毛细管电泳仪进行电渗测定和蛋白质分离。按照实施例7所述方法测定电渗，按照实施例8所述方法进行蛋白质分离。脂蛋白的折合氧化率用电渗流的相对变化表示，即[(Cu2+氧化后的电渗_未氧化电渗)/未氧化电渗]X100X。结果表明，二价铜离子(Cu2+)可以诱导低密度脂蛋白的自由基氧化损伤，而且随着处理时间的增长折合氧化率也随之增加，脂蛋白涂层的稳定性下降，对蛋白质分离的效率也显著降低(见表2)。脂蛋白的氧化修饰是引发动脉粥状硬化的主要诱因之一，自由基的存在会促进脂蛋白的氧化损伤。利用脂蛋白毛细管涂层可进行脂蛋白自由基氧化损伤以及动脉粥状硬化致病机理的研究。表2Cu2+导致的涂层性能变化与脂蛋白的自由基氧化之间的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一类脂蛋白毛细管涂层，其特征在于，毛细管内壁固定有一层或多层脂蛋白；脂蛋白包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒。2.—种脂蛋白毛细管涂层的制备方法，其特征在于，可以通过物理吸附(或称自组装法)和化学键合的方法将脂蛋白固定到毛细管内壁，形成脂蛋白毛细管涂层。3.根据权利要求1所述的脂蛋白毛细管涂层，其特征在于，具有磷脂、载脂蛋白、胆固醇脂等组份，保留有脂蛋白的活性。4.根据权利要求2所述的脂蛋白毛细管涂层的方法，其特征在于，物理吸附法(或称自组装法)的原理为在缓冲溶液(0.l-100mM，pH4-9)和温度(4_37°C)条件下，使脂蛋白(浓度0.01-10mg/ml)与石英或玻璃毛细管内壁的硅羟基发生疏水、静电吸引等非共价相互作用，从而自组装到内壁表面，制得脂蛋白毛细管涂层。5.根据权利要求2所述的脂蛋白毛细管涂层的方法，其特征在于，化学键合法的原理为先采用Y-氨丙基三乙氧基硅烷或Y-氨丙基三甲氧基硅烷等硅烷化试剂对毛细管进行改性，引入氨基活性基团；然后以过量的戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)或辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)或l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺体系(EDC/NHS)为偶联剂，在缓冲溶液pH值(pH4_9)、温度(4-37°C)以及脂蛋白浓度(0.l-10mg/mL)的条件下，共价连接毛细管上的氨基与脂蛋白上的氨基酸残基，从而将脂蛋白固定到毛细管内壁。全文摘要本发明涉及一类脂蛋白毛细管涂层及其制备方法。该涂层可通过物理吸附法和化学键合法制备。物理吸附法是将浓度为0.01-10mg/mL脂蛋白溶液与毛细管内壁发生非共价相互作用，自组装到内表面形成涂层。化学键合法是先采用氨丙基硅氧烷对毛细管进行改性，引入氨基；然后以戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯或辛二酸二琥珀酰亚胺酯或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺为偶联剂，在缓冲液pH(4-9)和脂蛋白浓度(0.1-10mg/mL)条件下，共价连接毛细管壁的氨基与脂蛋白上的氨基酸残基，得脂蛋白涂层。该涂层保留有生物活性，可用于抑制毛细管表面吸附和电渗调控，也可用于生化分离分析。文档编号G01N27/447GK101750449SQ20081024010公开日2010年6月23日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日发明者宋玉玲,宋茂勇,尹俊发,汪海林申请人:中国科学院生态环境研究中心