一种鲍鱼内脏新鲜程度的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及水产品精深加工与品质控制领域，特别是涉及一种鲍鱼内脏新鲜程度的指纹图谱检测方法。

背景技术：

鱼油是来源于深海鱼类脂肪的提取物，属于鱼脂类。鱼油所含的磷脂是动物脑、神经组织、骨髓、心、肝、卵和脾中不可缺少的组成部分，同时有助于脂的消化吸收、转运和形成，又是生物膜的重要结构物质。鱼油富含ω-3系多不饱和脂肪酸(DHA和EPA)，可以降低人体血液中的低密度脂蛋白胆固醇，减少血液的粘稠度，具有调节血脂，防止血液凝固，预防脑血栓、脑溢血及中风，抗炎等健康益处。

鲍鱼营养丰富，位列“海产八珍”之一，素有“软黄金”之美誉。我国鲍鱼产量居世界第一，2011年，我国鲍鱼养殖产量达到76786吨，占世界养殖总产量的86％，年产值100多亿元。鲍鱼养殖产量增长迅猛，2015年产量为127967吨。在鲍鱼加工过程中，占其体重1/3的大量鲍鱼内脏被丢弃，或者简单加工成饲料，造成了非常大的资源浪费和环境污染。这些组织中富含具有抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤作用的脂类生物活性成分，如多糖、蛋白质、氨基酸、脂肪、性激素等。如能将这些产品的高营养价值开发出来，转化为营养保健、皮肤护理甚至药品等高利润产品，颇具市场潜力。

同时，鲍鱼内脏脂肪的劣变，如氧化、降解，气味、风味成分的变化等等，是鲍鱼新鲜度的重要指标。重金属或贺尔蒙污染，很大部分是累积在内脏里，在各种微生物以及酶，以及适宜的温度和湿度环境中，内脏极易发生腐败，其脂肪成分以及蛋白质成分发生降解，氧化，产生氨(NH)和胺(R-NH)等碱性含氮物，因而腐败后的会产生腥臭味，微生物的代谢，可引起食品化学组成的变化，并产生多种腐败性产物。例如，三甲胺有鱼腥恶臭味。氧化三甲胺存在于鲍鱼的体内，在其活着的时候用于调节浸透平衡，死后，在厌氧微生物或酶的作用下，氧化三甲胺很容易降解生成三甲胺、二甲胺等脂肪族胺的衍生物，产生腥味；因不饱和脂肪酸含量高，更易发生氧化变腥；不饱和脂肪酸在发生酶促氧化或自动氧化时产生氢过氧化物，氢过氧化物可以进一步分解成许多挥发性的小分子醛、酮、酸等，而这些次级氧化产物的形成也是腥味产生的主要原因，高脂肪含量鱼类在储藏中比低脂肪鱼类产生更多的腥味物质，并且脂肪氧化程度越高，腥味越浓；当内脏新鲜度改变后，其风味发生一系列变化，进而影响了整个鲍鱼的新鲜度以及风味成分。

我国鱼油的生产要符合很多标准，才能进行推广，特别是多烯鱼油，在符合SC/T 3502-2000中鱼油的基本理化性质外，必须要符合ST/T3503-2000中EPA、DHA的含量要求。因此，必须对鲍鱼内脏新鲜度进行严格把关，才能确保生产的鱼油的安全健康性，因此本专利针对这个问题，对其原料鲍鱼内脏的新鲜度的检测方法进行探究，确保其最安全有效的储藏期。

指纹图谱检测是指某种备检物质经制样处理后，使用的分析手段，得到能够标志被检测物质特征的色谱图的方法，指纹图谱既具有能判断该油脂本质的真伪，又能反映出同种油料的不同产地、不同采收期和使用不同生产工艺的生产出的油脂的特性，从而能够从整体上控制被检测油脂的质量。油脂指纹图谱一般常用的算法有相关系数法、夹角余弦法、距离法，其算法一般都直接引用的是成熟的中药指纹图谱的算法。对油脂指纹图谱算法进行独立研究、比较性研究、权重分配研究及各算法的适应性研究较少。因此，有必要在现有的技术水平之上，研究涉及一种操作便捷，能准确快速、全面通过鲍鱼内脏由腐化程度不同引起的成分的差异来鉴定鲍鱼内脏腐化程度。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提供明一种鲍鱼内脏新鲜程度的指纹图谱检测方法，基于HS-SPME-GC-MS和PLS-DA法对鲍鱼内脏腐化程度的研究并运用到保藏期的应用上，该方法准确、快速、高效地对鲍鱼内脏腐化程度的进行鉴别。

本发明采用以下方案实现：一种鲍鱼内脏新鲜程度的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：对鲍鱼内脏进行基于HS-SPME的处理得到鲍鱼内脏样品；

步骤S2：对气相和质谱仪的参数进行设置，采集所述鲍鱼内脏样品的GC-MS谱图信息；

步骤S3：采用PLS-DA法分析所述鲍鱼内脏样品的GC-MS谱图信息，得出检测结果。

进一步地，所述步骤S1中，对鲍鱼内脏依次进行提取、富集、浓缩和解吸四个处理过程，具体为：将清洗干净的放置不同时间条件的鲍鱼内脏利用高速搅拌机打成浆状，称取一定的质量，在顶空瓶中按2:7-4:7的料液比加入饱和氯化钠溶液，于一定预热温度T下预热一段时间t，推动SPME手柄将萃取纤维头伸入顶空瓶中，然后置于磁力搅拌加热器中，在固定平衡温度T₁下，在一定转速R下保持一定的时间t₁，收回萃取纤维头，从顶空瓶中取出SPME手柄，并插入到GC-MS的进样口中，在气相色谱进样口解析一段时间t₂。

进一步地，所述顶空瓶中内置有磁力转子。

进一步地，所述步骤S3中，采用PLS-DA法分析鲍鱼内脏样品的GC-MS谱图信息，得出结果，具体包括以下步骤：

步骤S3-1：依据标准质谱图库对不同腐化程度的鲍鱼内脏样品的GC-MS图谱的成分进行检索定性，采用面积归一化法进行定量分析，提取样品组分的共有信息，用共有化学成分的峰面积为指标，以不同腐化程度的鲍鱼内脏样品为类别对象，构建训练样本的自变量矩阵X，并设定分类变量矩阵Y；

步骤S3-2：用PLS回归方法对训练样本的自变量矩阵X和分类变量矩阵Y进行分解，并使得X和Y的主成分最大程度的线性相关，其模型表示为：

X＝TP^T+E

Y＝UQ^T+F

其中，T和U分别为X和Y的得分矩阵，P和Q分别为X和Y的载荷矩阵，E和F分别为X和Y的残差矩阵，上标T表示转置运算；

步骤S3-3：将T和U作线性回归：U＝TB，预测待测样本时，根据P求出待测样本x的得分向量t，最终求得预测值y＝tBQ，根据y的值对待测样本的分类进行判定，其中，回归因子B＝(T^TT)^-1T^TU。

进一步地，所述萃取纤维头采用50/30μm的DVB/CAR/PDMS纤维头，且所述萃取纤维头在使用之前在进样口温度250℃的条件下老化1h。

进一步地，所述预热温度T为25–35℃，平衡温度T₁为65–80℃，转速R为75–100rad/min，时间t为10–20min，t₁为40–60min，t₂为5min。

进一步地，所述步骤S2中，采集鲍鱼内脏样品GC-MS谱图信息时，色谱条件包括：30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛细柱；升温程序为先以35℃的温度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，继续以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；He载气的流速为1–1.2mL/min；分流比为1:10–40。

进一步地，所述步骤S2中，采集鲍鱼内脏样品GC-MS谱图信息时，质谱条件包括：EI离子源；碰撞池能量设为40～80eV；传输线温度为200～250℃；离子源温度为200℃；质量扫描范围为35～500。

与现有技术相比，本发明将油脂指纹图谱技术直接应用于鱼油生产过程中，且具有检测速度快，可重复性好，灵敏度高、操作简单等优点，对鱼油的生产安全具有很大意义。鲍鱼内脏因保藏条件的不同其成分具有很大差异，本发明通过气相色谱分析手段，结合成分含量与指纹图谱技术研究，能够告诉有效地对不同腐化程度的鲍鱼内脏进行鉴别分析，并将其充分运用到保藏中。

附图说明

图1是本发明的方法流程示意图。

图2是本发明实施例中0h检测得到GC-MS谱图。

图3是本发明实施例中12h检测得到GC-MS谱图。

图4是本发明实施例中24h检测得到GC-MS谱图。

图5是本发明实施例中48h检测得到GC-MS谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

本实施采用两组对照组，分别为组一：常温(25℃)组，组二：冷藏(4℃)组。其中，常温组包括八个样品：0h，3h，6h，12h，24h，36h，48h，72h；冷藏组与其对应。

如图1所示，步骤1：对组一、组二样品分别进行基于HS-SPME的前处理。

取组一、组二样品各10组，打匀成浆，各取0.3g左右于4mL顶空瓶中，加入一定体积的饱和食盐水(m：v＝2:7–4:7)，于25–35℃预热10–20min，推SPME手柄将萃取头纤维头伸入顶空瓶中，然后置于平衡温度为65–80℃转速为75–100rad/min的磁力搅拌加热器上，保持40–60min后收回萃取纤维头，取出固相手柄，插入到GC-MS的进样口，在气相色谱进样口解吸5min。

步骤2：分别进行组一、组二样品的GC-MS谱图信息采集。

设置气相和质谱仪的参数，具体参数如下：

色谱条件：(1)30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛细柱；(2)升温程序：先以35℃的温度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，继续以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；(3)He载气的流速为1–1.2mL/min；(4)分流比：1:10–40。

质谱条件：EI离子源；电子能量设为40～80eV；传输线温度200～250℃；离子源温度200℃；质量扫描范围在35～500之间。

待仪器稳定后，将步骤1中经过处理前处理得到的160个样品进行自动进样分析。

步骤3：采用PLS-DA法对所有样品的GC-MS谱图信息进行分析，得出结果，包括以下步骤：

(1)对GC-MS图谱的成分依据NIST和标准质谱图库进行检索定性，采用面积归一化法进行定量分析。提取160个样品组分的共有信息，用共有化学成分的峰面积为指标，以16小组的160个样本为类别对象，构建训练样本的自变量矩阵X，并设定分类变量矩阵Y，由于本例实施的样品来自两类程度，因此矩阵Y为二维向量。

(2)用PLS回归方法对训练样本的自变量矩阵X和分类变量矩阵Y进行分解，并使

得X和Y的主成分最大程度的线性相关，其模型表示为：

X＝TP^T+E

Y＝UQ^T+F

其中，T和U分别为X和Y的得分矩阵，P和Q分别为X和Y的载荷矩阵，E和F分别为X和Y的残差矩阵；

(3)将T和U作线性回归：U＝TB，预测待测样本时，根据P求出待测样本x的得分向量t，最终求得预测值y＝tBQ，根据y的值对待测样本的分类进行判定，其中，回归因子B＝(T^TT)^-1T^TU。

对于n类样本的类别分类问题，可利用n-1个PLS-DA子分类器串联实现完整的分类。基本思路是，第1个分类器将第1类和2,3...n类样本分开，第2个分类器将第2个类别和3,4...n类别分开，以此类推，一直到将所有的类别分开。在本实施例中，就需要利用1个PLS-DA子分类器串联来实现分类。

实施例1

一种鲍鱼内脏新鲜程度的指纹图谱检测方法，包括以下步骤(同批次进行10组进行处理检测)：

(1)对鲍鱼内脏样品进行基于HS-SPME的前处理：将新鲜买回的鲍鱼进行除内脏，将内脏进行匀浆称量，每0.3g左右为一份于自封袋中，吹入氮气，共称取15个样，1号先进行0h的检测，其余的每7个为一组，分为两组，进行不同组别的储藏，分别于4℃冷藏，另一组于25℃恒温箱。先进行0h的检测：称取0.3217g内脏匀浆于4mL顶空瓶中，加入1.4mL的饱和食盐水，于30℃预热10min，推SPME手柄将萃取头纤维头伸入顶空瓶中，然后置于平衡温度为80℃转速为90rad/min的磁力搅拌加热器上，保持40min后收回萃取纤维头，取出固相手柄，插入到GC-MS的进样口，在气相色谱进样口解吸5min。

(2)分别进行组一、组二样品的GC-MS谱图信息采集。

设置气相和质谱仪的参数，具体参数如下：

色谱条件：(1)30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛细柱；(2)升温程序：先以35℃的温度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，继续以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；(3)He载气的流速为1mL/min；(4)分流比：1:10。

质谱条件：EI离子源；电子能量设为70eV；传输线温度230℃；离子源温度200℃；质量扫描范围在35～500之间。

(3)采用PLS-DA法对所有样品的GC-MS谱图信息进行分析，得出结果。

实施例2

一种鲍鱼内脏新鲜程度的指纹图谱检测方法，包括以下步骤(同批次进行10组进行处理检测)：

(1)对鲍鱼内脏样品进行基于HS-SPME的前处理：将新鲜买回的鲍鱼进行除内脏，将内脏进行匀浆称量，每0.3g左右为一份于自封袋中，吹入氮气，共称取15个样，1号先进行0h的检测，其余的每7个为一组，分为两组，进行不同组别的储藏，分别于4℃冷藏，另一组于25℃恒温箱。先进行0h的检测：称取0.4112g内脏匀浆于4mL顶空瓶中，加入1.5mL的饱和食盐水，于35℃预热15min，推SPME手柄将萃取头纤维头伸入顶空瓶中，然后置于平衡温度为70℃转速为85rad/min的磁力搅拌加热器上，保持60min后收回萃取纤维头，取出固相手柄，插入到GC-MS的进样口，在气相色谱进样口解吸5min。

(2)分别进行组一、组二样品的GC-MS谱图信息采集，设置气相和质谱仪的参数，具体参数如下：

色谱条件：(1)30m×0.25mm×0.25μm的DB-WAX石英毛细柱；(2)升温程序：先以35℃的温度保持2min，再以5℃/min升至120℃，保持2min，继续以10℃/min升至150℃，保持2min，最后以20℃/min升至240℃，保持3min；(3)He载气的流速为1mL/min；(4)分流比：1:40。

质谱条件：EI离子源；电子能量设为70eV；传输线温度230℃；离子源温度200℃；质量扫描范围在35～500之间。

常温组如图2、3、4、5，其中，冷藏组在3天内成分均变化不明显，故以常温组的图谱作为最佳案例。

(3)采用PLS-DA法对所有样品的GC-MS谱图信息进行分析:依据标准质谱图库(NIST)对不同腐化程度的鲍鱼内脏样品的GC-MS图谱的成分进行检索定性，采用面积归一化法进行定量分析，提取样品组分的共有信息，用共有化学成分的峰面积为指标，由图2、3、4、5可知，通过其中标志性成分的变化，例如随着储藏期变化，氨(NH)和胺(R-NH)等碱性含氮物的峰高以及面积显著增加等变化，以及一些风味成分醇、酮、萘等的显著减少，利用PLS-DA法即可将其结果进行推断，判定其新鲜度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。