一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 纤维连接蛋白（简称FN)广泛分布于细胞表面和血浆中，其中血浆型的纤维连接 蛋白存在于血浆和体液中，具可溶性。大量国内外的研宄结果证明，纤维连结蛋白在进化 过程中保守性很强，各种动物的纤维连接蛋白具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因 而不同来源的FN可以相互替代使用。由于血浆纤维连接蛋白浓度增高常见于急性和慢 性肝炎、脂肪肝、肝硬化、阻塞性黄疸、脑血管病变、妊娠晚期、妊高症、胰腺癌、肺癌、癌性腹 水、腺癌广泛转移等，浓度降低常见于急性白血病、弥散性血管内凝血（简称DIC)、暴发性 肝衰竭、烧伤、创伤、休克、细菌性或病毒性感染、急性呼吸窘迫综合症、糖尿病并发酮症酸 中毒、尿毒症、急性循环衰竭、绝经期妇女以及部分化疗耐受差的患者。所以纤维连接蛋白 主要应用于细胞培养、伤口修复和愈合、癌症的诊断和治疗、治疗血液系统和心脑血管系统 疾病、修复并加速愈合宫颈糜烂异常细胞、败血症和休克等急救的辅助治疗。目前国内纤维 连接蛋白市场几乎全部被国外产品所占领，国内现在还处在早期的研宄及分离纯化工艺的 开发，在工艺的优化设计中，层析介质也几乎全部被国外产品所占领，而层析介质的选择决 定了整个产品的质量和规模化生产的进度。
[0003] 现有制备技术是通过微囊发生器-静电法、离子凝聚法和三次冻干法制得三维多 孔壳聚糖/明胶微球，主要步骤为：将1. 5%壳聚糖乙酸溶液和2%明胶B水溶液按体积比， 吸入安装在便携式微量注射泵上的注射器中，注射器针头末端连接高压脉冲微胶囊成型仪 的正极，针头下方的金属导线环连接高压脉冲微胶囊成型仪的负极，导线环下方为液氮罐， 依次打开高压脉冲微胶囊成型仪、便携式微量注射泵开关，在高压静电作用下使得形成的 液滴滴入液氮中快速冷冻成球，成球后再进行冻干，控制冻干温度为_60°C至_80°C，冻干 24-48h后得到一次冻干的壳聚糖/明胶微球1 ;将微球1用含有饱和三聚磷酸盐（TPP) 85% 的乙醇溶液，控制体系pH值在5-6,交联固化24-72h后，终止交联反应，放入-20 °C冰箱过 夜，次日上冻干机，控制冻干温度为_60°C至_80°C，冻干24-48h后得到二次冻干的微球2 ; 将微球2充分水化，加入2%水溶性交联剂碳二亚胺/N-羟基琥珀酰（EDC/NHS)和2%明胶 A，在38°C水浴、避光反应24-48h后，洗去未反应EDC/NHS和明胶A，放入-20°C冰箱过夜，次 日进行第三次冻干，控制冻干温度为_60°C至_80°C冻干24-48h后即得到三维多孔壳聚糖 /明胶微球3。（彭承宏，黄芳，韩宝三，吴旭波，董亚东，崔龙.一种三维多孔壳聚糖/明胶 微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用[P].中国专利：201110025674,2011-01-24)
[0004] 现有分离纯化技术是通过盐析沉淀，再过亲和层析柱分离纯化FN，最后过分子筛 层析柱脱盐，超滤浓缩，冷冻干燥得到FN成品，主要过程为：采集新鲜动物血，加入柠檬酸 三钠抗凝，迅速离心，分别收集血浆和血球，贮存于l〇°C以下环境中；向血浆中加硫酸铵至 饱和度20-30%，静置1小时以上，过滤，取沉淀物溶解；上亲和层析柱，提取分离出FN主峰 液；再经分子筛纯化，超滤浓缩，除菌，最后冷冻干燥，得到FN产品。（王德亮.动物血纤维 连接蛋白联产工艺[P]?中国专利：200510017717,2005-06-22)
[0005] 现有制备技术的缺点为该制备方法分三步冻干，反应和清洗过程均繁琐复杂，时 间过长；所需生产设备过多且昂贵，严重增加了生产成本；对设备及过程控制较为严格，只 适合实验室级别制备，不易放大至生产线规模生产；产品的圆度较差，粒径和孔径过大，生 产过程中过低的温度会导致产品的质量不稳定和重复性不高等。
[0006] 现有分离纯化技术的缺点为分离纯化步骤过多，耗时过长，纤维连接蛋白活性偏 低，蛋白浓度和纯度过低。
【发明内容】
[0007] 鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种明胶亲和层析介质的制备方法，并 利用制备的明胶亲和层析介质来分离纯化纤维连接蛋白，具有纯化效率高、生产周期短、工 艺简单等优点。
[0008] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0009] 一种明胶亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 1)利用激活液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质（优选地，激活液的体积为 CNBr-琼脂糖亲和层析介质的体积的5-10倍），去除激活液；再用结合液清洗CNBr-琼脂糖 亲和层析介质（优选地，结合液的体积为CNBr-琼脂糖亲和层析介质的体积的5-10倍），去 除结合液，得到已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质；所述激活液为HCl溶液或NaCl-HCl 溶液，pH为2. 0-4. 5 ;所述结合液为NaCl-NaHCO3溶液，pH为7. 0-8. 6 ;
[0011] 2)利用结合液配制明胶的浓度为5-20mg/mL的明胶溶液（其中溶质为明胶，溶剂 为步骤1)所述的结合液），混匀；
[0012] 3)向步骤2)得到的明胶溶液中加入等体积的步骤1)中已激活的CNBr-琼脂糖亲 和层析介质，4-35°C条件下搅拌偶联1-24小时；
[0013] 4)偶联完毕，过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测并计算CNBr-琼 脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度；
[0014] 5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质抽干，用封闭液清洗（优选地，封 闭液的体积是已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3-5倍），所述封闭液为HO(CH 2)2順2或 pH 为 7. 0-8. 6 的 0? OOl-L Omol/L Tris 溶液（优选地，pH 为 7. 0-8. 6 的 0? OOl-L Omol/L Tris-HCl溶液），去除封闭液后，并加入等体积的封闭液控温（4-35°C条件下）慢速（转速 为100-200rpm)搅拌封闭（时间为3-18h)，得到封闭液处理后的明胶亲和层析介质；
[0015] 6)将步骤5)得到的封闭液处理后的明胶亲和层析介质抽干，利用酸清洗液和碱 清洗液交替清洗，再用水清洗，加入乙醇溶液，保存，得到明胶亲和层析介质；所述碱清洗液 为NaCl-Tris溶液，pH为7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，pH为2. 0-4. 5。
[0016] 本发明的有益效果是：
[0017] 本发明中明胶亲和层析介质与一般的亲和层析介质相比（例如三维多孔壳聚糖/ 明胶微球）具有以下优势：
[0018] 1、提高了明胶亲和层析介质的圆度，降低了粒径和孔径，本发明制备的明胶亲和 层析介质的粒径为45-165微米、孔径为0. 003-0. 9微米，而现有技术中的亲和层析介质的 粒径为300-800微米、孔径为50-200微米；由于分辨率是由孔径大小决定的，孔径越小，分 辨率越高，从而本发明所述的明胶亲和层析介质可以显著提高分辨率和纯化效率；
[0019] 2、针对现有的制备技术中存在的问题（例如：制备方法需要分三步冻干，反应和 清洗过程均繁琐复杂，时间过长），本发明所述明胶亲和层析介质的制备只需要一步反应和 一步封闭，反应过程操作简单、易于控制、品质稳定，生产周期大大缩短至24小时内；
[0020] 3、针对现有技术中所需生产设备过多且昂贵，严重增加了生产成本（例如现有技 术种使用的主要设备为：高压脉冲微胶囊成型仪30000元/台左右、便携式微量注射泵 3000元/台左右、真空冷冻干燥机100000元/台左右、冷冻冰箱5000元/台左右）；本发 明所述的明胶亲和层析介质的制备过程中所需设备更少更便宜，大大降低了生产成本，更 适合大规模生产。
[0021] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0022] 进一步，所述激活液含有0-0? 5mol/L NaCl和0? 001-0. lmol/L HC1，所述激活液的 pH为 2. 0-4. 5。
[0023] 采用上述进一步方案的有益效果是：pH为2. 0-4. 5可以保证配基的激活最高，激 活液含有0-0?5mol/L NaCl和0? 001-0.lmol/L HCl可以保证在后续步骤中CNBr-琼脂糖 亲和层析介质与明胶中的蛋白质的结合量最高。
[0024] 进一步，所述结合液含有 0? 001-0. 5mol/L NaCl 和 0? 001-0. 5mol/L NaHCO3，所述 结合液的pH为7. 0-8. 6。
[0025] 采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述pH和浓度可以保证在后续步骤中 CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶中的蛋白质的结合量最高。
[0026]进一步，所述封闭液为 HO (CH2) 2順2或 pH 为 7.0-8.6 的0?lmol/L Tris-HCl。
[0027] 采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述的pH和浓度可以保证封闭明胶中 的蛋白质的效果最好。
[0028] 进一步，所述碱清洗液含有 0? 001-0. 5mol/L NaCl 和 0? 001-0. 5mol/L Tris，所 述碱清洗液pH为7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液含有0? 001-0. 5mol/L NaCl和0? 001-0. 5mol/L NaAc，所述酸清洗液的pH为2. 0-4. 5。
[0029] 采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述pH和浓度可以保证制备的明胶亲 和层析介质的适用稳定性和重复性。
[0030] 进一步，所述激活液、结合液、封闭液、酸清洗液、碱清洗液均为预冷溶液，预冷溶 液的温度为4-8°C ;步骤6)的水为预冷的水，预冷的水的温度范围为4-8°C，所述保存的温 度为4-8°C。
[0031] 采用上述进一步方案的有益效果是：可以保证即使在长时间的操作下，也能够保 持明胶中的蛋白质的活性不受温度的影响而变性。
[0032] 本发明中，HO(CH2)2NH2的中文名称为2-羟基乙胺，为液体，质量分数为100%。
[0033] 本发明所述的明胶亲和层析介质的制备过程中：
[0034] 步骤1)将CNBr-琼脂糖亲和层析介质上活化的氰酸酯基团进行水解，从而激活 CNBr-琼脂糖亲和层析介质；
[0035] 步骤2)溶解明胶，便于明胶中的基团与CNBr-琼脂糖亲和层析介质上的基团进行 连接反应；
[0036] 步骤3)将CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶偶联，将CNBr-琼脂糖亲和层析介质 上水解活化的基团与明胶中的伯胺基团或相似的亲和基团反应形成异脲连接物；
[0037] 步骤4)CNBr_琼脂糖亲和层析介质与明胶结合浓度检测，中间过程质量控制，实 时监测并控制CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶的结合浓度；
[0038] 步骤5)封闭，增加CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶中的蛋白质的结合作用，防 止明胶中的蛋白质在其他条件下与CNBr-琼脂糖亲和层析介质分离；
[0039] 步骤6)明胶亲和介质清洗，使明胶亲和介质具有更好的稳定性和重复性。
[0040] 本发明所述的明胶亲和层析介质的制备方法中，在步骤4)过滤后，可以通过检测 滤液在UV280处的吸光度值，根据测定明胶的标准曲线计算出虑液中的明胶浓度，最终计 算出CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度。
[0041] 利用上述方法制备的明胶亲和层析介质可以用于蛋白质的分离和纯化，尤其是纤 维连接蛋白的分离和纯化。
[0042] 一种利用上述方法制备的明胶亲和层析介质分离纯化纤维连接蛋白的方法，包括 以下步骤：
[0043] 1)将制备的明胶亲和层析介质用水清洗（优选地，水的体积是明胶亲和层析介质 的体积的5-10倍），去除水；再用平衡液清洗（优选地，平衡液的体积是明胶亲和层析介质 的体积的3-5倍），去除平衡液；之后，向明胶亲和层析介质中加入平衡液，混匀后装入层析 柱中，直至柱面无变化；所述平衡液为〇? 001-0. 5mol/L Na2HP04、0. 001-0. 5mol/L KH2P04、 0? 001-0. 5mol/L KC1、0. 001-0. 5mol/L NaCl 的混合液，所述平衡液的 pH 为 7. 0-8. 6 ; [0044] 2)打开蛋白纯化系统，打开检测器预热，清洗管路并将步骤1)中的层析柱与蛋白 纯化系统连接，设置参数，用5-10倍体积（指层析柱中明胶亲和层析介质的柱体积）的平 衡液以恒速平衡层析柱至各参数不变IOmin以上，调零；
[0045] 3)将待分离纯化纤维连接蛋白的样品恒速流过装有明胶亲和层析介质的层析柱， 分管收集样品流穿峰，利用蛋白电泳检测收集的样品；
[0046] 4)利用平衡液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱（优选地，所述平衡液的 体积是层析柱中