算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度 为 4. 18mg/mL;。
[0091] 5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3 倍体积的4°C预冷封闭液（即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3倍，封 闭液含有0. lmol/L Tris-HCl，封闭液的pH为8. 3)清洗，抽干后装入容积为3L的反应瓶 中，再向反应瓶中加入IL的封闭液在水浴锅中4°C、IOOrpm搅拌条件下封闭18h。
[0092] 6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽 干，用5倍体积的4°C预冷碱清洗液（碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体 积的5倍，碱清洗液含有0? lmol/L NaCl和0? lmol/LTris-HCl，碱清洗液的pH为8. 0)清 洗，再用5倍体积的4°C预冷酸清洗液（酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质 体积的5倍，酸清洗液含有0? lmol/L NaCl、0? lmol/L NaAc，酸清洗液的pH为4.0)清洗，酸 清洗液和碱清洗液交替清洗3次，之后用10倍体积的4°C预冷纯水清洗（纯水的体积为封 闭反应后的明胶亲和层析介质体积的10倍），抽干装瓶，加入200mL体积分数为20%的乙 醇溶液，4°C保存，最终得到明胶亲和层析介质。
[0093] 7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用10倍体积的纯水清洗 (即纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的10倍），再用5倍体积的平衡液（即平衡液 的体积是明胶亲和层析介质的体积的5倍，平衡液含有0? OOlmol/L Na2HP04、0.0 Olmol/L KH2P04、0.0 Olmol/L KCl和0? OOlmol/L NaCl，调平衡液的pH为7. 4)清洗，加入少量平衡液 搅拌均匀后倒入中压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵 将平衡液以流速10mL/min压柱IOmin以上至柱面高度无变化。
[0094] 8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白 纯化仪管路连接，设置参数，用5倍体积的平衡液（即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的 体积的5倍）以恒速8mL/min的速率平衡层析柱至各参数不变IOmin以上，调零。
[0095] 9)上样：将牛血液在4°C下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以 恒速8mL/min的速率过层析柱，收集样品流穿峰，取样进行SDS-PAGE检测，电泳条带见附图 3的流穿液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
[0096] 10)清洗：用5倍体积的平衡液（即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5 倍）以恒速8mL/min的速度清洗层析柱中的杂蛋白至各参数不变IOmin以上，收集样品清 洗峰，取样SDS-PAGE进行检测，见附图3的清洗液，可以看出清洗液中含有少量目的蛋白， 明胶亲和介质的蛋白结合载量已达饱和。
[0097] 11)洗脱：用3倍体积的洗脱液（洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的 3 倍，洗脱液含有 O.OOlmol/L Na2HP04、0.001mol/L KH2P04、0.001mol/L KCl、0.001mol/L NaCl和3. Omol/L Urea，调pH为7. 4)，以恒速8mL/min的速度洗脱纤维连接蛋白至各参数 不变IOmin以上，收集样品洗脱峰的洗脱液233mL，利用紫外分光光度计检测稀释10倍后的 洗脱液的UV280吸光度为0. 817,根据测定纤维连接蛋白的标准曲线（y = 0. 781x，其中X 是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度），计算出纤维连接蛋白浓度为6. 38mg/mL，再计 算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量为I. 86mg/mL，取样SDS-PAGE进行检测， 见附图3的洗脱液，可以看出洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
[0098] 12)再生：用5倍体积的碱清洗液（即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体 积的5倍，碱清洗液含有0? lmol/L NaCl和0? lmol/L Tris-HCl，调pH为8. 5)清洗，再用5 倍体积的酸清洗液（即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，酸清洗液含有 0? lmol/L NaCl和0? lmol/L NaAc，调pH为4. 5)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次， 再用10倍体积的纯水（即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍）清洗，最后用 3倍体积20%体积分数的乙醇溶液清洗（即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的 3倍），4°C保存。
[0099] 实施例2 :
[0100] 1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗 中，用真空泵抽滤清洗，用5倍体积的6°C预冷激活液（即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼 脂糖亲和层析介质的5倍，激活液含有0? 5mol/L NaCl和0? OOlmol/L HC1，调pH为3. 0) 清洗15min，过滤，除去滤液；再用5倍体积的6°C预冷结合液（即结合液的体积是汇琼亲 CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的5倍，结合液含有0? 5mol/L NaCl和0? 2mol/L NaHCO3, 调pH为8. 3)清洗，测定重力沉降介质的重量lkg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层 析介质。
[0101] 2)称取IOg的明胶加入到IL结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫 外分光光度计检测明胶溶液的UV280吸光度为0.841，根据测定明胶的标准曲线y = 11. 862x(其中X是UV280的吸光度，y是明胶浓度）计算出明胶的浓度为9. 98mg/mL。
[0102] 3)将步骤2)中得到的明胶溶液与Ikg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介 质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中25°C、50rpm搅拌条件下偶联lh。
[0103] 4)偶联完毕，用〇? 45微米过滤膜的ro-io柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明 胶亲和层析介质；检测滤液的UV280吸光度为0. 296,根据测定明胶的标准曲线计算出滤液 中的明胶浓度为3. 51mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度 为 6. 47mg/mL〇
[0104] 5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3 倍体积的6°C预冷封闭液（即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3倍，封 闭液含有0.lmol/LTris-HCl，调pH为8.3)清洗，抽干后装入3L反应瓶中，加入IL的封闭 液在水浴锅中25°C，IOOrpm搅拌封闭3h。
[0105] 6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽 干，用3倍体积的6°C预冷碱清洗液（碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体 积的3倍，碱清洗液含有0? 5mol/L NaCl和0? lmol/L Tris-HCl，调pH为8. 0)清洗，再用3 倍体积的6°C预冷酸清洗液（即酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的 3倍，酸清洗液含有0? 5mol/L NaCl和0? lmol/L NaAc，调pH为4. 0)清洗，酸碱清洗液交替 清洗3次，最后用10倍体积的6°C预冷纯水清洗（纯水的体积为封闭反应后的明胶亲和层 析介质体积的10倍），抽干装瓶，加入200mL体积分数为20%的乙醇溶液，6°C保存。
[0106] 7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用5倍体积的纯水（即纯 水的体积是明胶亲和层析介质的体积的5倍）清洗，再用3倍体积的平衡液（即平衡液的体 积是明胶亲和层析介质的体积的3倍，平衡液含有0? Olmol/L Na2HP04、0.0 lmol/L KH2P04、 0? Olmol/L KC1、0.0 lmol/L NaCl，调pH为7. 4)清洗，加入少量平衡液搅拌均匀后倒入中 压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵将平衡液以流速 10mL/min压柱IOmin以上至柱面高度无变化。
[0107] 8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白 纯化仪管路连接，参数设置，用10倍体积（即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的 10倍）的平衡液以恒速8mL/min平衡层析柱至各参数不变IOmin以上，调零。
[0108] 9)上样：将牛血液在4°C下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以 恒速8mL/min过层析柱，收集样品流穿峰处的流穿液，取样SDS-PAGE检测，见附图4流穿 液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
[0109] 10)清洗：用3倍体积（即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍）的 平衡液以恒速8mL/min清洗杂蛋白至各参数不变IOmin以上，收集样品清洗峰处的清洗液， 取样SDS-PAGE检测，见附图4清洗液，可以看出清洗液中含有少量目的蛋白，明胶亲和介质 的蛋白结合载量已达饱和。
[0110] 11)洗脱：用5倍体积的洗脱液（洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5 倍，洗脱液含有 〇? 〇lmol/L Na2HP04,0.0 lmol/L KH2P04,0.0 lmol/L KC1，0.0 lmol/L NaCl， 6. Omol/L Urea，pH为7. 4)以恒速8mL/min洗脱纤维连接蛋白至各参数不变IOmin以上， 收集样品洗脱峰处的洗脱液254mL，紫外分光光度计检测稀释10倍后的洗脱液的UV280吸 光度为1. 040,根据测定纤维连接蛋白的标准曲线（y = 0. 781x，其中X是UV280的吸光度， y是纤维连接蛋白浓度）计算出纤维连接蛋白浓度为8. 12mg/mL，再计算出明胶亲和层析介 质结合纤维连接蛋白的载量为2. 58mg/mL，取样SDS-PAGE检测，见附图4洗脱液，可以看出 洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
[0111] 12)再生：用3倍体积的碱清洗液（即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体 积的3倍，碱清洗液含有0? 5mol/L NaCl和0? lmol/L Tris-HCl，调pH为8. 5)清洗，再用3 倍体积的酸清洗液（即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，酸清洗液含有 0? 5mol/L NaCl和0? lmol/L NaAc，调pH4. 5)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，再 用10倍体积的纯水（即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍）清洗，最后用3 倍体积20%体积分数的乙醇溶液清洗（即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3 倍），6°C保存。
[0112] 实施例3:
[0113] 1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗 中，用真空泵抽滤清洗，用8倍体积的8°C预冷激活液（即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼 脂糖亲和层析介质的8倍，激活液含有0? 5mol/L NaCl和0? OOlmol/L HCl，调pH为3. 0)清 洗20min，再用8倍体积的8 °C预冷结合液（即结合液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层 析介质体积的8倍，结合液含有0? 5mol/L NaCl和0? 2mol/L NaHCO3，调pH为8. 3)清洗，测 定重力沉降介质的重量为lkg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质。
[0114] 2)称取IOg的明胶加入到IL结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫外 分光光度计检测明胶溶液在UV280处的吸光度为0. 841，根据测定明胶的标准曲线y = 11. 862x(其中X是UV280的吸光度，y是明胶浓度）计算出明胶浓度为9. 98mg/mL。
[0115] 3)将步骤2)中得到的明胶溶液与Ikg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介 质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中35°C，200rpm搅拌条件下，偶联24h。
[0116] 4)偶联完毕，用0? 45微米膜的ro-10柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲 和层析介质；检测滤液在UV280处的吸光度为0. 115,根据测定明胶的标准曲线计算出滤液 中的明胶浓度为I. 36mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度 为 8. 62mg/mL。
[0117] 5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用4 倍体积的8°C预冷封闭液HO(CH 2)2NH2(即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体 积的4倍）清洗，抽干后装入容积为3L的反应瓶中，加入IL的封闭液后，在水浴锅中35°C、 IOOrpm搅拌条件下封闭3h。
[0118] 6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质