西兰苔凝集素的制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供西兰苔凝集素的制备方法与应用，首先采用磷酸缓冲液浸提，硫酸铵沉淀，离心透析，再使用离子交换色谱SephadexA-52和凝胶色谱葡聚糖凝胶SephadexG-75柱分离纯化，得到纯化的西兰苔凝集素BL。本发明得到的西兰苔凝集素具有抗菌活性和抗肿瘤活性。癌细胞相比，西兰台凝集素对正常细胞的毒性小。因而，本发明得到的西兰苔凝集素有利于功能食品、医药和其它领域的开发利用。
【专利说明】西兰苔凝集素的制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及西兰苔凝集素的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]西兰苔，又称小小西兰花、芦笋型青花菜、青花笋，属十字花科芸薹属，由两种甘蓝类蔬菜西兰花与芥蓝杂交选育而成，因主要以肥嫩的花苔供食而得名。西兰花与芥蓝是蔬菜中公认的“抗癌”能手，而西兰苔集中了两者的优良性状，因此抗癌物质含量极高，同时还含有丰富的维生素A、B、E。据美国权威机构检测，其抗癌物质含量比普通蔬菜高出五到十倍，其抗肿瘤物质种类也多。
[0003]凝集素(Lectin)是指一种糖蛋白或结合糖的蛋白，广泛存在于各种植物、无脊椎动物和高等动物中。大多数凝集素存在于植物的成熟种子中，但在叶、茎和根等组织器官中也有发现，它最大的特点是能够识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂的糖链结构。凝集素对糖基的结合具有特异性，这可通过糖抑制试验进行研究，此特异性取决于凝集素中糖基结合位点的大小、形状、糖链中决定簇的位置等。
[0004]凝集素具有细胞凝集能力，不仅能凝集红细胞，还能凝集肿瘤细胞，淋巴细胞，精子，细菌等。此外，凝集素还能识别并结合细菌、肿瘤细胞表面的糖结构，从而抑制它们的生长。鉴于凝集素的诸多功能，它被广泛应用于病原菌的防治，癌症的治疗，细胞的分型，含糖基生物大分子的检测等方面。
[0005]近年来，国内外对凝集素的研究很多，越来越多的凝集素被发现，凝集素的生物学功能备受关注。但是西兰苔是一种新型蔬菜，目前国内外对西兰苔凝集素的分离纯化与应用尚未有报道。
【发明内容】
[0006]为拓展西兰苔在食品和生物医学领域的应用，大幅提高这种新型蔬菜的附加值，本发明的目的是提供西兰苔凝集素的制备方法与应用。
[0007]为实现本发明目的，采用如下技术方案:
[0008](I)将西兰苔粉碎 后加入缓冲溶液调节pH值，低温保存，过滤，取滤液离心后取上清液，盐析，低温保存后离心去沉淀，将沉淀溶解透析冷冻干燥得到西兰苔凝集素粗品；
[0009](2)取步骤(1)所得西兰苔凝集素粗品溶解于缓冲液，离子交换层析，并梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品；
[0010](3)取步骤(2)得到的西兰苔凝集素样品溶解于缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_75分离纯化，梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素。
[0011]西兰苔凝集素的制备方法，具体步骤如下:
[0012](I)将西兰苔洗净，切碎，冻干后粉粹，得到干粉，准确称取干粉10~100g，加入100~500ml缓冲液，置于冰箱中，过滤，滤液离心后收集上清液，将上清液在搅拌条件下加入硫酸铵晶体至饱和度为10%~90%，冰箱中过夜，离心取沉淀，将沉淀加入蒸馏水溶解后，置于透析袋中进行透析，24h之后冷冻干燥，即为西兰苔凝集素粗品；
[0013](2)称取步骤(1)得到的西兰苔凝集素粗品50~300mg，溶解于0.5~5ml，pH为6~9的Tris-HCl缓冲液，用DEAE Sephadex A-52离子交换层析，并用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5ml/min，每管收集8min，收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到
西兰苔凝集素样品；
[0014](3)称取步骤(2)得到的西兰苔凝集素样品10~200mg溶于0.5~5ml pH为6~9的Tris-HCl缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_75分离纯化,再用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5ml/min,每管收集8min,收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到纯化的西兰苔凝集素BL ；。
[0015]上述方法中，步骤(1)中所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH=6~9 ;所述离心的离心温度为4~8°C，转速为3000 ~10000r/min，离心时间10~60min。
[0016]上述方法中，步骤(2)中所述梯度洗脱为用浓度为0.lmol/L~lmol/L的NaCl溶液，洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液pH6~9。
[0017]上述方法中，步骤(3)所述梯度洗脱为用浓度为lmol/L~3mol/L的NaCl溶液，洗脱5次；所述溶液溶剂为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液pH6~9。
[0018]上述方法中，所述西兰苔凝集素BL具有抗菌活性和抗肿瘤活性。
[0019]西兰苔凝集素应用于抗菌功能食品或抗肿瘤医药的制备。
[0020]与现有技术相比，本发明具有如下技术效果和优点:
[0021]本发明得到的西兰苔凝集素BL分子量约为27KDa，糖含量为7.6%，最小凝血浓度为4μg/ml，具有D-甘露糖和阿拉伯糖结合位点。更重要的是，BL具有下述抗菌活性和抗肿瘤活性:(I)对各种细菌的50%抑制浓度(IC5tl)分别为:绿脓杆菌173.58μ g/ml，痢疾杆菌158.32 μ g/ml,金黄色葡萄球菌486.33 μ g/ml,大肠杆菌228.77 μ g/ml，幽门螺杆菌143.95 μ g/ml0对各种癌细胞和正常肝细胞的50%抑制浓度(IC5tl)分别为:胃癌细胞SGC-7901215.85 μ g/ml，乳腺癌细胞 MCF-7350.93 μ g/ml，肝癌细胞 H印G2178.82 μ g/ml，正常肝细胞L02924.35 μ g/ml.说明与癌细胞相比，西兰台凝集素对正常细胞的毒性小。因而本发明得到的西兰苔凝集素有利于功能食品、医药和其它领域的开发利用。
[0022]附图表说明
[0023]图1为实施例1中西兰苔凝集素(活性组分LI)离子交换色谱DEAE-52柱层析洗脱曲线；
[0024]图2为实施例1中西兰苔凝集素BL凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadexG-75柱层析洗脱曲线；
[0025]图3为实施例1所制备的西兰苔凝集素BL的SDS-PAGE图。
[0026]图4为实施例1所制备的西兰苔凝集素BL的抗菌活性图。
[0027]图5为实施例1所制备的西兰苔凝集素BL的抗癌活性图。
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
[0029]实施例1[0030]西兰苔凝集素的制备方法，步骤如下:
[0031]( I)将新鲜的西兰苔洗净，切碎，冻干后粉粹，得到干粉，准确称取干粉60g，加入300ml pH为6的磷酸缓冲液，置于4°C冰箱中24h，用三层纱布过滤，滤液离心后收集上清液，将上清液置于磁力搅拌器上，缓慢加入硫酸铵晶体至饱和度为70%，4°C冰箱中过夜，离心弃上清，将沉淀加入适量的蒸馏水进行溶解，置于透析袋中进行透析，24h之后冷冻干燥，即为凝集素粗品。
[0032](2)称取步骤(1)得到的凝集素粗品200mg，加2ml pH为6的Tris-HCl缓冲液溶解，用DEAE Sephadex A-52离子交换层析，并用NaCl溶液梯度洗脱，即用浓度为0.6mol/L的NaCl溶液洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为pH=7Tris-HCl缓冲液，调节流速为0.5ml/min，每管收集8min，经洗脱分离收集，得到3个不同的组分，分离效果如图1所示。凝血试验表明，组分I (LI)具有较高凝集活性，收集具有凝血活性的第一个蛋白峰LI冻干保存。
[0033](3)称取步骤(2)得到的凝集素样品IOOmg溶于2.5ml pH为6的Tris-HCl缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-75分离纯化。再用NaCl溶液梯度洗脱，SP用浓度为1.5mol/L的NaCl溶液洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为pH=6的Tris-HCl缓冲液，调节流速为0.5ml/min,每管收集8min,Ll经SephadexG_75分子筛层析后，得到两个不同的组分(如图2)，凝血试验表明只有第一个组分(BL)具有凝血活性。收集具有凝血活性的第一个蛋白峰BL冻干保存，得到纯化的西兰苔凝集素BL。将BL进行SDS-PAGE检测发现只有一条带(如图3)，说明BL是单一物质，即西兰苔凝集素，其分子量约为27KDa。
[0034]基于新鲜鸡血的凝血活性表明(表1)，在PH7-8时，凝血活性最强为4 μ g/ml.糖抑制试验表明(表2)，除在蔗糖溶液中BL的凝集活性无变化外，在其他糖溶液中均有所下降，其中在D-甘露糖和阿拉伯糖溶液中下降幅度最大，说明这两种糖能够与红细胞竞争性结合BL，由此表明BL上这两种糖的结合位点较多。
[0035]对西兰苔凝集素进行抗菌活性(平板培养法)和抗肿瘤活性检测(MTT检测法)，结果表明，(I)不同浓度的西兰苔凝集素(0.0625~0.5mg/mL)对各种细菌的抑制率呈现剂量效应关系(图4)，50%抑制浓度(IC5tl)分别为:绿脓杆菌173.58μ8/πι1，痢疾杆菌158.32 μ g/ml,金黄色葡萄球菌486.33 μ g/ml,大肠杆菌228.77 μ g/ml,幽门螺杆菌143.95 μ g/ml0 (2)不同浓度的西兰苔凝集素(0.0625~0.5mg/mL)对各种癌细胞和正常肝细胞的抑制率呈现剂量效应关系(图5)，50%抑制浓度(IC5tl)分别为:胃癌细胞SGC-7901215.85 μ g/ml,乳腺癌细胞 MCF-7350.93 μ g/ml,肝癌细胞 H印G2178.82 μ g/ml,正常肝细胞L02924.35μ g/ml。与癌细胞相比，西兰台凝集素对正常细胞的毒性小。
[0036]表1西兰苔凝集素BL的凝血活性
[0037]
【权利要求】
1.西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，所述制备方法为: (1)将西兰苔粉碎后加入缓冲溶液调节PH值，低温保存，过滤，取滤液离心后取上清液，盐析，低温保存后离心去沉淀，将沉淀溶解透析冷冻干燥得到西兰苔凝集素粗品； (2)取步骤(1)所得西兰苔凝集素粗品溶解于缓冲液，离子交换层析，并梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品； (3)取步骤(2)得到的西兰苔凝集素样品溶解于缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G-75分离纯化，梯度洗脱，收集第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素。
2.根据权利要求1所述西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，具体步骤如下 (1)将西兰苔洗净，切碎，冻干后粉粹，得到干粉，准确称取干粉10~100g，加入100-500ml缓冲液，置于冰箱中，过滤，滤液离心后收集上清液，将上清液在搅拌条件下加入硫酸铵晶体至饱和度为10%~90%，于冰箱中过夜，离心取沉淀，将沉淀加入蒸馏水溶解后，置于透析袋中进行透析，冷冻干燥，即为西兰苔凝集素粗品； (2)称取步骤(1)得到的西兰苔凝集素粗品5(T300mg，溶解于0.5~5 ml，pH为6~9的Tris-HCl缓冲液，用DEAE Sephadex A-52离子交换层析，并用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5 ml/min，每管收集8 min，收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到西兰苔凝集素样品； (3)称取步骤(2)得 到的西兰苔凝集素样品10~200mg溶于0.5~5 ml pH为6、的Tris-HCl缓冲液中，再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S印hadex G-75分离纯化，再用NaCl溶液梯度洗脱，调节流速为0.5 ml/min,每管收集8 min ,收集具有凝血活性的第一个蛋白峰冻干保存，得到纯化的西兰苔凝集素BL ；。
3.根据权利要求2所述的西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH=6~9 ;所述离心的离心温度为4~8 °C，转速为300(T10000 r/min,离心时间10~60 min。
4.根据权利要求2所述的西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述梯度洗脱为用浓度为0.1 mol/L^l mol/L的NaCl溶液，洗脱5次；所述NaCl溶液的溶剂为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液pH 6~9。
5.根据权利要求1所述的西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述梯度洗脱为用浓度为I m0l/L~3 mol/L的NaCl溶液，洗脱5次；所述溶液溶剂为Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液pH 6~9。
6.根据权利要求1所述的西兰苔凝集素的制备方法，其特征在于，所述西兰苔凝集素BL具有抗菌活性和抗肿瘤活性。
7.由权利要求1-6任一所述制备方法制备得到的西兰苔凝集素应用于抗菌功能食品或抗肿瘤医药的制备。
【文档编号】C07K1/30GK103951742SQ201410149248
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】张学武, 许平平 申请人:华南理工大学