包含血细胞凝集素的组合物、制造其的方法与使用其的方法

专利名称：包含血细胞凝集素的组合物、制造其的方法与使用其的方法
相关申请案
本申请案为美国临时申请案第60/779,854号(2006年3月7日申请)、第60/784,497号(2006年3月20日申请)、第60/790,457号(2006年4月7日申请)、第60/814,292号(2006年6月16日申请)、第60/830,881号(2006七月14日申请、第60/838,007号(2006年8月16日申请)、以及第60/856,451号(2006年11月3日申请)的延续案并主张其优先权。上述申请案的全部教示以引用方式并入本文。
背景技术：
流感病毒感染可能会导致疾病。用以预防管控与流感病毒感染关连的疾病的策略，可包括以灭活病毒与药物施打疫苗。然而，此类策略可能需要花费金钱来维持需要的供给，而因此其供应有限；可能导致易变的保护作用及不令人满意的症状减轻，故而无效于预防或治疗与流感病毒感染关连的疾病的不适以及后果(在有些案例中为死亡)。因此，有需要研发用于预防及管控与流感病毒感染关连的疾病的治疗的新颖、改良及有效的治疗方法。


发明内容
本发明是关于组合物，例如刺激保护性免疫反应的组合物，及制造可刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法。
在一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，其中该蛋白质部分包括至少一种球状头部，以及一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转化至原核宿主细胞中；及培养该原核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分自天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括至少球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括至少球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为昆虫真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为经稳定转化的昆虫宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母真核宿主细胞，亦不为经稳定转感染的昆虫宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫反应的方法，其包含将一种含有通过包含以下步骤的方法制得的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该部分的核酸序列转化至原核宿主细胞中；及培养该原核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
于其它实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括得自天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分的组合物给药予该个体的步骤，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母真核宿主细胞，亦不为经稳定转感染的昆虫宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列感染入昆虫细胞宿主细胞中；及培养该昆虫宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含将编码至少一种缺乏跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的核酸序列，转化原核宿主细胞；及培养该原核宿主细胞，而由此制造该蛋白质的步骤。
于其它实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含通过包括以下步骤的方法制得的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤将一种包含通过其包含将编码至少一种缺乏膜跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的核酸序列，转化原核宿主细胞；及培养该原核宿主细胞，。
在另一项实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括具有至少一种缺乏跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤，其中该蛋白质表达于原核宿主细胞中。
于另外的实施方式中，本发明为一种包含至少一种病原体-关连的分子型式(pathogen-associated molecular pattern)的至少一部分及天然病毒血细胞凝集素的一部分的组合物，其中该天然病毒血细胞凝集素的部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该天然病毒血细胞凝集素的部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。
本发明的另一实施方式是一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一项实施方式中，本发明为一种包含其为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物，其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个半胱氨酸残基，其位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
于另外的实施方式中，本发明为一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
本发明的另一实施方式，为一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
本发明的其它实施方式，为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
本发明的另外实施方式，为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物给药予该个体的步骤，其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个半胱氨酸残基，其位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
本发明的方法及组合物可用于刺激个体内免疫反应，尤其是保护性免疫。本发明的优点包括(例如)有成本效益的方法与可以相对上较大量生产的组合物，以供用于预防及治疗与流感病毒感染相关的疾病。所请求保护的方法与组合物可用于预防或治疗流感病毒感染，而因此可避免因流感病毒感染所造成的严重不适及死亡。



图1描述PR8A型流感病毒血细胞凝集素(HA)晶体结构(1RU7)的带状图。以图表示从左至右为HA三聚体、单体、球状头部功能域及三种疫苗候选者的选择。所兴趣的分子或功能域，以虚线圈出来强调，例如三聚体结构中的单体，及于单体结构内的球状头部功能域。三种疫苗候选者的功能域边界以交叉记号标示。亦于个别疫苗示意图中标记各选择的残基数。
图2描述B/李/40HA(SEQ ID NO36)的疏水性作图分析，使用ProtScale(http://ca.expasy.org/tools→Primary structure analysis→ProtScale)以确定所选择的边界是该蛋白质的亲水性区域。
图3描述STF2.HA B株蛋白质的夹层ELISA分析。ELISA板涂覆以针对鞭毛蛋白的抗体，并培育所指定的蛋白质以进行捕获。使用针对B/马来西亚/2506/2004的雪貂抗血清，与经酶标定的山羊抗-雪貂抗体检测蛋白质。
图4描述STF2.HA B株蛋白质的TLR生物活性。将HEK293(TLR5+)细胞与所指定的蛋白质培育过夜，并收取细胞培养物上清液，且通过ELISA分析IL-8。
图5描述STF2.HA B株蛋白质的TLR生物活性。将HEK293(TLR5+)细胞与所指定的蛋白质培育过夜，并收取细胞培养物上清液，且通过ELISA分析IL-8。
图6描述于BALB/c小鼠中对STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)的剂量-依赖性抗体反应。将小鼠(10/组)依指示于第0及14天进行免疫，并于第12及21天进行采血。于第28天通过ELISA检验抗-HA IgG反应。纳入恢复期的抗血清(x)做为阳性对照组。数据表示每组10个别血清的平均值±SD。
图7描述试管内与经流感病毒感染细胞的血清反应性。将图6中所描述的第21天血清样本与仿-及PR/8/34-感染的MDCK细胞培育。数据代表10个别血清/组的OD450平均值±SD。
图8A描述经STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免的BALB/c小鼠的存活率。于第28天将得自图8与图9的小鼠以LD90(8x103EID)的A型流感病毒PR/8/34，经鼻内给药进行激发(激发后的第0天)。
图8B描述经STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免的BALB/c小鼠的重量。于第28天将得自图6与图7的小鼠以LD90(8 x 103EID)的A型流感病毒PR/8/34，经鼻内给药进行激发(激发后的第0天)。该图反映出基于每日测量个别动物达19天的每组平均重量。
图8C描述经STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免的BALB/c小鼠的临床分数。于第28天将得自图6与图7的小鼠以LD90(8 x 103EID)的A型流感病毒PR/8/34，经鼻内给药进行激发(激发后的第0天)。该图反映出基于每日测量个别动物达19天的每组平均临床分数。临床分数的分析如下4点＝健康，3点＝减少梳理，2点＝身体活性减低，及1点＝垂死。
图9描述得自于第0及14天以所指定剂量的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ IDNO90)进行免疫，并于第21天进行采血的BALB/c小鼠的免疫血清的中和活性。各样本的终点效价是计算为，抑制由病毒介导的细胞溶解达至少50％的效价。计算得各剂量组的几何平均值±SD并绘图。
图10A与10B描述于第0及14天以皮下注射3μg STF2.HA1-2(PR8)(SEQID NO90)，或以3或0.3μg STF2.HA1-2(NV)(SEQ ID NO95)致免的BALB/c小鼠的抗-HA抗体反应。于第21天，将血清分离并以(图10A)从A型流感病毒/越南/1203/2004(得自BEI资源Cat#NR-660)纯化得的HA及(图10B)重组鞭毛蛋白(STF2)(SEQ ID NO96)通过ELISA检验其反应性。
图11描述使用Bac-至-Bac杆状病毒(Baculovirus)表达系统，以表达pFastBac构建体所需的步骤流程图。
图12A与12B描述于经STF2.HA1-1融合蛋白质致免的BALB/c小鼠中的抗-HA特异性IgG反应。将小鼠(10/组)于第0及14天以所指定的STF2.HA1-1融合蛋白质致免，并于第21天进行采血。通过ELISA检验抗-HA及抗-鞭毛蛋白IgG反应。纳入恢复期的抗血清做为阳性对照组。数据表示每组10个别血清的平均值±SD。
图13A描述经重组STF2.HA1-1蛋白质致免的BALB/c小鼠的存活率。于第28天，将得图12中的小鼠经鼻内(i.n.)以LD90(8 x 103EID)的A型流感病毒PR/8/34进行激发。于激发后检测个别小鼠的存活率21天。
图13B描述经重组STF2.HA1-1蛋白质致免的BALB/c小鼠的重量。于第28天，将得图12中的小鼠经鼻内以LD90(8 x 103EID)的A型流感病毒PR/8/34进行激发。该图反映出基于每日测量个别动物达19天的每组平均重量。
图13C描述经重组STF2.HA1-1蛋白质致免的BALB/c小鼠的临床分析。于第28天，将得图12中的小鼠经鼻内以LD90(8 x 103EID)的A型流感病毒PR/8/34进行激发。该图反映出基于每日测量个别动物达21天的每组平均重量。临床分数的分析如下4点＝健康，3点＝减少梳理，2点＝身体活性减低，及1点＝垂死。
图14描述经10μg STF2.HA1-2(VN)致免后的小鼠的抗-HA抗体效价。
图15描述经3μg STF2.HA1-2(VN)致免后的小鼠的抗-HA抗体效价。
图16描述经1μg STF2.HA1-2(VN)致免后的小鼠的抗-HA抗体效价。
图17描述经10 LD90的A型流感病毒/越南/1203/04激发后的小鼠的存活率。
图18描述其中强调出重要功能域及残基的全长鞭毛蛋白(STF2)的氨基酸序列。灰色＝经实验确定的TLR5结合位点(史密斯等人，2003)；K＝赖氨酸残基；下划线＝对应于STF2Δ构建体的鞭毛蛋白序列(肽连接子未示出)。
图19描述鞭毛蛋白(STF2)的空间-填充模型，其中TLR5结合位点(左半部)与赖氨酸残基(右半部)以灰色强调。
图20描述鞭毛蛋白(STF2)的空间-填充模型，其中仍保留于STF2Δ中的残基以黑色强调。
图21描述pMT/STF2Δ的两步骤PCR克隆的示意图。
图22描述于ELISA中识别STFΔ蛋白质的鞭毛蛋白抗原表位。
图23描述HEK293细胞经所指定的STF2Δ蛋白质刺激后的TLR5-依赖性IL-8分泌。
图24描述STF2Δ.铰链CysCysH1C1的S200色层分析图谱。空隙＝管柱空隙体积；共轭物＝蛋白质肽共轭物的洗脱峰；图中指示出A260、A280及导电性。
图25描述RAWhTLR5细胞(实心记号)或TLR5-阴性RAW细胞(空心记号)经STF2Δ.铰链Cys(方形)、STF2Δ.铰链CysCysH1C1共轭物(圆形)或STF2.OVA(三角形)刺激后的TLR5-依赖性IL-8分泌。
图26描述STF2.4xH1C1的S200色层分析图谱。空隙＝管柱空隙体积；共轭物＝蛋白质肽共轭物的洗脱峰；图中指示出A260、A280及导电性。
图27描述于经天然H1C1肽或Pam3Cys.H1C1肽致免的BALB/c小鼠中的抗-H1C1抗体反应。
图28描述于经天然H1C1肽或Pam3Cys.H1C1肽致免，然后以LD90(8 x 103EID)的A型流感病毒/波多黎各/8/34病毒激发的BALB/c小鼠的存活图。
图29描述鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白第2型(fljB/STF2)的氨基酸序列(SEQ ID NO498)，其中铰链区加下划线标示。
图30描述编码SEQ ID NO498的核酸序列(SEQ ID NO499)。编码铰链区的核酸序列加下划线标示。
图31描述不含铰链区的fljB/STF2(于本文亦称为“fljB/STF2Δ”或“STF2Δ”)的氨基酸序列(SEQ ID NO500)。
图32描述编码SEQ ID NO500的核酸序列(SEQ ID NO501)。
图33描述大肠杆菌鞭毛蛋白fliC(于本文亦称为“大肠杆菌fliC”)的氨基酸序列(SEQ ID NO502)，其中铰链区加下划线标示。
图34描述编码SEQ ID NO502的核酸序列(SEQ ID NO503)。编码铰链区的核酸序列加下划线标示。
图35描述慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白fliC(于本文亦称为“慕尼黑沙门氏杆菌fliC”)的氨基酸序列(SEQ ID NO504)，其中铰链区加下划线标示。
图36描述编码SEQ ID NO504的核酸序列(SEQ ID NO505)。编码铰链区的核酸序列加下划线标示。
图37描述pMT/STF2的氨基酸序列。肽连接子加下划线标示，且Bip分泌信号为粗体(SEQ ID NO506)。
图38描述编码SEQ ID NO506的核酸序列(SEQ ID NO507)。编码肽连接子的核酸序列加下划线标示，且编码Bip序列核酸序列为粗体。
图39描述Pam3Cys.M2e融合蛋白质。M2e的氨基酸序列(SEQ ID NO510)以粗体型式表示。
图40描述抗原-展现性细胞(APC)受类-钟样受体(TLR)信号传递的活化。
图41A与41B描述用于表达H1与H5(SEQ ID NO536)A型流感病毒分离株的M2(例如，SEQ ID NOS510、554)氨基-末端的质粒构建体。pMT基于金属硫蛋白启动子的表达载体。Bip免疫球蛋白结合性蛋白的分泌信号序列。STF2鼠伤寒沙门氏杆菌的全长鞭毛蛋白。STF2Δ铰链区缺失的STF2。MCS多重克隆位点。
图42描述经设计用于表达H1与H5A型流感病毒分离株的HA的质粒构建体。AOX1pPICZα表达载体(因维托金公司，卡斯贝得，CA)的AOX1启动子。αf酵母菌的分泌信号序列。STF2鼠伤寒沙门氏杆菌的全长鞭毛蛋白。STF2Δ铰链区缺失的STF2。MCS多重克隆位点。
图43描述HA(PR8)的氨基酸序列(SEQ ID NO561)。
图44描述编码SEQ ID NO561的核酸序列(SEQ ID NO562)。
图45描述不含铰链区的大肠杆fliC的氨基酸序列(SEQ ID NO563)。
图46描述pMT/STF2Δ(SEQ ID NO585)的氨基酸序列。肽连接子加下划线标示，且Bip分泌信号为粗体。
图47描述编码SEQ ID NO585的核酸序列(SEQ ID NO586)。编码肽连接子的核酸序列加下划线标示，且编码Bip序列核酸序列为粗体。
图48描述不含铰链区的慕尼黑沙门氏杆菌fliC(其于本文亦称为“慕尼黑沙门氏杆菌fliCΔ”)的氨基酸序列(SEQ ID NO595)。
图49描述编码SEQ ID NO595的慕尼黑沙门氏杆菌fliCΔ核酸序列(SEQID NO596)。
图50描述TLR5+细胞经刺激后的IL-8分泌。
图51描述TLR2+细胞经刺激后的TNF分泌。
图52描述M2e-特异性IgG。
图53描述OVA-特异性IgG。
图54描述M2e-特异性IgG血清效价。
图55描述促升后的M2e-特异性血清IgG效价。
图56描述Pam3Cys.M2e剂量反应。
图57描述M2e-特异性血清IgG效价。
图58描述对M2e的兔IgG反应。
图59描述于引发后14天的兔中STF2.4xM2e的免疫原性。
图60描述经激发后的BALB/c小鼠的存活率。将小鼠于第0及14天依说明中所指示进行致免，并于第28天通过鼻内给药LD90的A型流感病毒/波多黎各/8/34病毒激发(激发后的第0天)。于激发后检测小鼠的存活率达21天。
图61描述pET24载体中的融合构建体。T7T7启动子；lacOlac操纵子；STF2鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白；STF2Δ＝其铰链区已缺失的STF2；EIII+为西尼罗病毒被膜蛋白的功能域III，其具有功能域I氨基酸的6个氨基酸。
图62A与62B描述STF2.EIII+(SEQ ID NOS657、658)与STF2ΔEIII+(SEQ ID NOS673、674)融合蛋白的TLR5生物活性。将经纯化蛋白的系列稀释加至HEK293(TLR5+)细胞过夜，并通过ELISA测量IL-8含量。使用经纯化的STF2.OVA做为阳性对照组(图129A)。使用TLR2拮抗剂Pam3CSK4做为阴性对照组(图129B)。
图63描述通过ELISA分析得的STF2Δ.EIII+抗原表位。将板涂覆以全长WNE(空心柱)(SEQ ID NO642)或STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)，并以所指定的抗体(mAb)探测。Poly＝针对WNE的多克隆抗血清；3D9至7H2＝对WNE抗原表位的中和单克隆抗体；抗-鞭毛蛋白＝针对鞭毛蛋白的单克隆抗体。
图64A、图64B、图64C与图64D描述STF2.E(SEQ ID NOS761、762)；STF2.EIII+(SEQ ID NOS657、658)及STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)融合蛋白与针对WNE及鞭毛蛋白的单克隆抗体的反应性。将板涂覆以融合蛋白，封阻并与针对WNE或鞭毛蛋白的抗体培育。于与HRP-标定的物种特异性IgG培育后检测抗体反应性。将板于TMB底物存在下呈色，并使用TECAN板计读机与Magellian软件读取O.D.450/650。
图65描述以融合蛋白注射后的IgG血清。将小鼠以PBS、含有STF2.E的果蝇条件培养基(CM，阳性对照组)、25μg的STF2Δ.EIII+(SEQ IDNOS673、674)i.p.、25μg STF2Δ.EIII+s.c.、25μg STF2.EIII+(SEQ IDNO659，658)i.p.、25μg STF2.EIII+(SEQ ID NOS657，658)或25μg STF2.E(SEQID NOS761、762)致免。于第35天，将经致免的动物以WNV激发。将得自个别小鼠(第35天)的血清通过直接ELISA特征化，而测定得IgG浓度。于此项分析是使用经纯化WNV-E蛋白(SEQ ID NO:642)做为抗原。此抗原(60)是于果蝇中制得，呈一种加his-标签的蛋白质。
图66描述STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673674)及STF2.EIII+(SEQ ID NOS657、658)对WNV病毒激发的保护免疫性。将小鼠致免，并于第35天以致死剂量的WNV病毒株2741激发。检测存活率达21天。
图67描述经融合蛋白致免后的IgG血清效价。STF2Δ.EIII+蛋白诱发WNV-特异性IgG抗体。将小鼠于第0、14及28天以单独PBS或约25μg的STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673、674)(045[阳性对照组])、STF2Δ.EIII+(067，三聚体)、STF2Δ.EIII+(070，单体)或STF2Δ.EIIIs+(SEQ ID NOS675、676)(069)致免。于第35天，将得自个别小鼠的血清通过直接ELISA特征化，而测定得IgG浓度。于此项分析是使用经纯化WNV-E蛋白(060，于果蝇中制得，呈一种加his-标签的蛋白质)做为抗原。
图68描述小鼠中STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673、674)及STF2.EIII+(SEQID NOS657、658)免于WNV致死激发的保护免疫性。于以融合蛋白致免后的第28天，将所有组别皆以致死剂量的WNV病毒株2741激发，并检测存活率达21天。各组(10小鼠/组)的存活率是以百分比表示。
图69描述竞争分析。将得自经致免小鼠的系列稀释(五倍稀释开始于1:25)抗血清与生物素化WNE蛋白(SEQ ID NO642)培育，然后加至经涂覆以浓度约2mg/ml的mAb 7H2的各孔。使用亲和素-HRP将各孔呈色，以测定因与mAb 7H2竞争所造成的对West Nile蛋白结合的抑制。
图70描述由STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS675，676)融合蛋白质所诱发的抗体反应的抗原表位作图。对得自经所指定STF2Δ-融合蛋白质(E2-21、E27-E52，图142)致免的动物的免疫血清，检验其识别对应于WNE被膜蛋白的功能域I与III的连接处的重叠肽的能力。
图71描述由STFΔ.EIIIs+(SEQ ID NOS675、676)E-21(被膜蛋白)抗原表位融合蛋白质所诱发的抗体反应的抗原表位作图。评估得自经所指定STF2Δ-融合蛋白质(E2-21、E2-21-1(S，C)、E2-21-2(C，S)、E2-21-2(C，S)及E2-21-4至E2-21-24，参见图139)致免的动物的免疫血清，以鉴定出定义西尼罗病毒被膜蛋白的E-21抗原表位的残基。数据反映对其半胱氨酸经丝氨酸取代(以C，S表示)；及后续以丙氨酸进行氨基酸取代的E-21的血清反应。受测试的肽列示于图139。
图72描述诱发EIII-特异性IgG抗体的Pam3Cys.WNV001(SEQ ID NO771)。将小鼠于第0、14及28天以单独PBS、22mg未经修饰的WNV001(SEQID NO771)或30μg的Pam3Cys.WNV001致免。于第35天，将得自个别小鼠的血清通过直接ELISA特征化，而测定得对合成WNV001肽的IgG浓度。
图73描述西尼罗病毒、日本脑炎病毒与登革热病毒(血清型1至4)的EI/EIII连接处的氨基酸序列(SEQ ID NOS691-698)。加下划线标示使用得自经STF2Δ.EIIIs+致免动物的抗血清鉴定得的西尼罗病毒抗原表位。此序列相当于肽E2-21(SEQ ID NO728)。
图74描述三棕榈酰基化的肽。
图75描述鞭毛蛋白的D1功能域、D2功能域、TLR5活化功能域及高变区(D3功能域)。
图76描述鞭毛蛋白的D1功能域、D2功能域、TLR5活化功能域及高变区(D3功能域)(米仓等人，自然424，643-650(2003))。
图77描述鞭毛蛋白的D0、D1、D2与D3功能域，及位于D2与D3功能域中适于抗原插入或取代的区域(例如，成熟剪切位点，HA、M2e)。
图78描述绿脓杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO815)。以星号标示赖氨酸残基。
图79描述鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO816)。以星号标示赖氨酸残基。
图80描述单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白(GenBank登录号Q92DW3)的氨基酸序列(SEQ ID NO820)。以星号标示赖氨酸残基。

具体实施例方式 以下将更特别描述本发明的特征与其它细节(以本发明的步骤，或以本发明部分的组合呈现)，并于权利要求中指出。应了解，本发明的特别实施方式是以例举说明的方式提出，而非用以限制本发明。在不偏离本发明的范围下，本发明的原理特征可用于各种实施方式。
本发明大体而言是关于，制造刺激个体内免疫反应，例如保护性免疫反应的组合物的方法，及关于该组合物，与例如通过将该组合物给药予个体的治疗方法。
“刺激免疫反应”用于本文意指，产生针对某一抗原的至少一部分，例如本文所述血细胞凝集素(HA)的蛋白质部分(例如，HA1-1、HA1-2蛋白)的抗体与/或T-细胞。可产生针对流感病毒蛋白质(A、B及/或C型流感病毒的HA与M2蛋白)的至少一部分的抗体与/或T-细胞，特别是流行性感冒病毒蛋白。刺激个体内免疫反应可包括制造其对抗原(例如病毒蛋白)具反应性的体液及/或细胞免疫反应。
可使用已建立的方法，评估本发明用于供刺激个体内免疫反应的方法的组合物，刺激个体内免疫反应的能力。用于测定本发明组合物是否于个体刺激免疫反应的例举性方法包括，通过适合技术例如ELISA分析测量特异于该抗原的抗体(例如，IgG抗体)的制造；诱发续发感染的抗体-依赖性增强作用的潜能；类-巨噬细胞分析；通过使用蚀斑减少中和试验(Plaque ReductionNeutralization Test，PRNT80)进行分析的中和；及于非人类模型(例如，小鼠、兔、猴子)中产生血清抗体的能力(普纳克等人，疫苗(Vaccine)234442-4452(2005))。
“刺激保护性免疫反应”用于本文意指，给药本发明组合物，例如血细胞凝集素(HA)蛋白(例如，本文所述的HA1-1、HA1-2蛋白)，导致产生针对该蛋白质的抗体，而由此使个体自某一病毒蛋白(例如流感病毒HA)的致死剂量的激发存活。用于测定病毒(例如流感病毒)致死剂量的技术为该项技艺人士已知(参见，例如，WHO/CDS/CSR/NCS2002.5“WHO对于动物流感诊断及监督手册”世界卫生组织，传染性疾病监督及反应部门，WHO世界流感要目(“WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance”World HealthOrganization，Dept of Communicable Disease Surveillance and Response，WHOGlobal Influenza Programme)；哈孟，M.W.等人，J.Clin.Microbiol.26333-337(1988)；李得，L.J.等人，Am.J.Hyg.27493-497(1938)；罗塞，T.等人，J.Clin.Microbiol.37937-943(1999)；瓦尔斯，H.H.等人，J.Clin.Microbiol.23240-245(1986)；免疫学的现今策略(Current Protocols in Immunology)，19.11.1-19.11.32，柯提，R.等人，约翰威利父子股份有限公司(2001)(John Wiley & Sons，Inc))。用于测定致死剂量的例举性技术可包括，给药各种病毒剂量并测定于给药病毒剂量后仍存活的个体百分比(例如，LD10、LD20、LD40、LD50、LD60、LD70、LD80、LD90)。例如，导致个体族群的50％死亡的病毒致死剂量称为“LD50”；导致个体族群的80％死亡的病毒致死剂量称为“LD80”；导致个体族群的90％死亡的病毒致死剂量称为“LD90”。
例如，可通过经鼻内给药各种剂量(例如稀释液，如8 x 103蛋-感染剂量(EID)的对数及半-对数稀释液)，随后于以该病毒感染约14天至约21天后分析个体的存活率，而于个体(例如小鼠)中进行LD90的测定。可通过个体的身体表征、一般行为(活力)、体重(起初体种流失，随后回复至大约等于该个体以病毒感染前的体重)及经病毒感染约14至约21天后分析个体的存活率，而分析保护性免疫。
保护性免疫的刺激的分析，亦可通过利用其是分析于对本发明组合物(例如，天然病毒蛋白的一部分，如血细胞凝集素的蛋白质部分)的反应中所产生的抗体，可中和病毒蛋白质(例如血细胞凝集素蛋白)与宿主细胞结合的能力的分析而达成(参见，例如，免疫学的现今策略，19.11.1-19.11.32，柯提，R.等人，约翰威利父子股份有限公司(2001))。保护性免疫的刺激的分析亦可通过，利用其是测量抗体抑制血细胞凝集素结合的能力的分析而达成(参见，例如，柏内特，F.M.等人，J.exp.Biol.Med.Sci.25227-233(1947)；沙克，J.E.J.Immunol.4987-98(1944)；免疫学的现今策略，19.11.1-19.11.32，柯提，R.等人，约翰威利父子股份有限公司(2001))。
咸相信，血细胞凝集素结合的抑制作用为抗体(自组合物及通过本发明方法所形成)中和天然病毒血细胞凝集素的唾液酸结合位点(HA结合的中和)，由此因刺激产生保护性免疫反应而预防宿主细胞受感染的能力的指标。血细胞凝集素结合的抑制或中和，咸相信是与用以保护对抗病毒致死剂量的免疫反应的能力相关。
HA结合的中和可通过，试管内分析(参见，例如，免疫学的现今策略，19.11.1-19.11.32，柯提，R.等人，Suppl.42，约翰威利父子股份有限公司(2001)及WHO对于动物流感诊断及监督手册，韦伯斯特，R.等人，第28-36、48-54、82-92页(2002))进行分析。例举性病毒中和分析仰赖血清特异性结合，并防止流感病毒于培养物(例如，于马丁-达比犬肾脏(MDCK)细胞系)中复制的能力。简言的，将细胞于预先定效价的病毒存在下培养于96孔板中，并于显微镜下观察复制病毒的致细胞病变效应。对于测试血清，制备得系列稀释血清，并与储备病毒于37℃下进行预培育2小时，之后将其感染MDCK细胞。将混合物再另培育2小时，其后将病毒/血清混合物去除，并置换以新鲜培养基。使细胞生长4天。若对于某一所给定的血清稀释度，至少约一半孔中有至少约50％细胞死亡，则将孔的病毒生长记为正分。保护约一半细胞免于死亡(于至少约一半孔数中)的最高血清稀释度的倒数，即视为中和效价。
或者，可进行微量-中和试管内分析，以分析HA结合的中和作用。例如，将血清稀释并如上所述与已知效价的病毒预培育，再与MDCK细胞混合。经2天培育后，将细胞清洗并以丙酮固定。将板依ELISA使用针对流感核抗原NP的单克隆抗体呈色。微量中和效价是测定为，其产生少于仅含病毒的对照组孔所得抗-NP读值的约50％的最高血清稀释度的倒数。
血细胞凝集素抑制(HAI)分析是基于存在流感病毒表面上的HA抗原会使红血球(RBC)凝集，及防止红血球细胞沉淀。与HA的唾液酸结合区特异性结合的抗体，会防止凝集而使沉淀发生。该分析是于含有新鲜鸡RBC的96孔V底板中进行。将病毒抗原储备物定效价，以使存在的抗原量为相对于防止沉淀所需最小量的约4-倍过量。将测试血清(可得自数种物种，包括小鼠、雪貂、家禽或人类)加热至约56℃以使补体去活化。将经去活化的血清进行2-倍稀释，并与储备HA混合。于室温下30分钟后，将RBC加入并将板培育约30至约45分钟。将结果通过观察计分凝集导致混浊状孔，而抑制作用产生沉淀于孔底部的红血球“钮扣状物”。对照组包括不含HA的RBC组，其形成钮扣状物，以及HA与RBC不含血清组，其仍保持混浊状。特定血清样本的HAI效价为，防止凝集(亦即形成钮扣状物)的最后稀释度的倒数。例如，若1:128稀释度呈钮扣状物，但是1:256稀释度不呈现，则其HAI效价为约128。
在一项实施方式中，本发明为制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，而由此形成蛋白质部分的步骤，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。将编码该蛋白质部分的核酸序列转化至原核宿主细胞中，并培养该原核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
“蛋白质的一部分”或“蛋白质部分”用于本文关于天然病毒血细胞凝集素意指，其小于完整天然病毒血细胞凝集素的任何天然病毒血细胞凝集素的部分。“天然病毒血细胞凝集素”用于本文意指，如其在自然界中的形式的完整病毒血细胞凝集素。
蛋白质部分可进一步缺乏信号序列。蛋白质部分可进一步包括唾液酸结合位点。
用于本发明组合物及方法的天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分，可为正黏液病毒科(流感病毒A、B、C)、副黏液病毒(副流感病毒、呼吸道融合性病毒、新城鸡瘟病毒、立百病毒(Nipah)、麻疹病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒)、呼肠孤病毒科(轮状病毒)、小脱氧核糖核酸病毒科(人类小DNA病毒、猪小DNA病毒)、正痘病毒属(猴痘病毒、鼠痘病毒)、黄病毒科(西尼罗病毒、日本脑炎、圣路易、墨累谷、昆津(Kunjin)病毒)、禽痘病毒(鸡禽痘病毒)、立百病毒(谷劳姆V.等人，J.Virol.，807546-54(2006))；犬瘟热病毒(新格坦K.等人，J Gen Virol.，871635-42(2006))；新城鸡瘟病毒(迪李欧O.S.等人，JGen Virol.，861759-69(2005)；及美拉森V.R.等人，J Virol.，7813053-61(2004)；邓R.等人，病毒学(Virology)，20417-26；(1994))、麻疹(马沙N.等人，J Virol.，789051-63(2004))、仙台病毒(多马西M.等人，FEBS Lett.，1156-60(2003))、人类副流行性感冒(波尔托M.等人，J Virol.，792383-92(2005)；鹤道M.等人，病毒学，213190-203(1995)；波塞T.等人，病毒学，209654-7(1995)；及滝本T.等人，J Virol.，667597-600(1992))的一部分。
病毒血细胞凝集素(例如，流感病毒A、流感病毒B与流感病毒C病毒血细胞凝集素)的部分(“蛋白质部分”)，可包括至少一种选自由本文称作“HA1-1”、“HA1-2”及“HA1-3”的蛋白质部分所组成的组群的成员。
“HA1-1”用于本文意指病毒血细胞凝集素的蛋白质部分，其包括至少约一个包括底物结合位点的β-夹层(β-sandwich)，其包括至少约两个β-折板(β-sheet)、至少约二至约三个短α-螺旋、至少一个小β-折板与至少一个位于该分子底部的额外的小β-夹层，及至少四个二硫键。包括HA1-1的底物结合位点的β-夹层，包括至少约四个β-股做为顶端折板，及至少约三至约四个β-股做为底部折板。HA1-1部分的至少约一个α-螺旋是位于其包括底物结合位点的β-夹层的旁边，且至少约约一个至约二个是位于其包括底物结合位点的β-夹层的底部。HA1-1的小β-夹层于各β-折板中可包括至少约二至约三个β-股；或包括约三至约四个β-股。例举性HA1-1蛋白质部分包括SEQ ID NOS8、11、14、17、20、38、40、45、47、49、179、180、181及182。
“HA1-2”用于本文意指病毒血细胞凝集素的蛋白质部分，其包括至少约一个其包括底物结合位点的β-夹层、至少约二至约三个短α-螺旋、至少约一个位于该分子底部的小β-折板及至少约二个二硫键。病毒血细胞凝集素中的β-股可包括约2至约15个氨基酸。小β-折股可包括约二个氨基酸；或约二至约三个氨基酸；或约二至约四个氨基酸；或约二至约五个氨基酸。小β-折板可包括约二至约三个β-股；或约二至约四个β-股。包括HA1-2底物结合位点的β-夹层，可进一步包括至少约四个β-股做为顶端折板，及至少约三至约四个β-股做为底部折板。HA1-2部分的至少约一个α-螺旋是位于其包括底物结合位点的β-夹层的旁边，且至少约一至约二个是位于其包括底物结合位点的β-夹层的底部。例举性HA1-2蛋白质部分包括SEQ ID NOS9、12、15、18、21、24、26、28、30、32、39、41、46、48及50。
“HA1-3”用于本文意指病毒血细胞凝集素的蛋白质部分，其包括至少约一个其包括底物结合位点的β-夹层、至少约二个短α-螺旋及至少约一个二硫键。“β-夹层”用于本文意指至少约二组形成至少约一个相互作用层的β-折板组。“底物结合位点”用于本文关于β-夹层是意指具有与某一分子作用或结合的天然病毒血细胞凝集素的任何部分。例如，包括该部分的底物结合位点的β-夹层，可包括与唾液酸结合的部分。包括HA1-3底物结合位点的β-夹层可进一步包括至少约四个β-股做为顶端折板，及至少约三个β-股做为底部折板。HA1-1部分的至少一个α-螺旋，是位于包括底物结合位点的β-夹层的旁边，且至少一个其它α-螺旋是位于包括底物结合位点的β-夹层的底部。短α-螺旋于一α-螺旋中可包括少于约5个转角(2、3、4、5个转角)。病毒血细胞凝集素中的α-螺旋可有一至约15次个转角；或约二至约15次个转角。例举性HA1-3蛋白质部分包括SEQ ID NOS10、13、16、19、22、25、27、29、31与33。
“唾液酸结合位点”用于本文关于得自天然病毒血细胞凝集素的蛋白质的部分，意指具有可与唾液酸残基作用的能力的蛋白质部分的一部分。
“唾液酸结合位点”用于本文亦指“唾液酸结合域”。
“至少一部分”用于本文意指，某一组成(例如，球状头部、二级结构)或分子(例如，蛋白质、抗原、钟样受体、肽、鞭毛蛋白、HA、基质2蛋白(M2)、基质2胞外功能域(M2e))的任何一部分；或整个该组成或该分子。“至少一部分”用于本文亦称作“片段”。
“至少一部分”用于本文关于鞭毛蛋白(例如，fljB/STF2、大肠杆菌fliC、慕尼黑沙门氏杆菌fliC)是指，鞭毛蛋白中可引发对于钟样(Toll)受体的胞内信号传递的任何一部分(例如，基序(motif)C；基序N；功能域1、2、3)或鞭毛蛋白整体。
单一多肽可呈现数类型二级结构。在无任何安定化胶互作用下，多肽可采取无规则卷曲构型。然而，二级结构(例如阿伐(α)-螺旋与β(β)-股)可稳定蛋白质或蛋白质的一部分。β-股间的侧向缔合形成β-折板(于本文亦称作“β-折叠”)。二级结构可位于该部分、蛋白质或天然蛋白质(例如，病毒血细胞凝集素、鞭毛蛋白、M2e)的表面。蛋白质的三级结构为氨基酸残基的三-维排列。相对于二级结构，其是通过(例如)氢键、α-螺旋、β-股稳定，三级结构因该部分、蛋白质或天然病毒血细胞凝集素的非极性侧链间的疏水作用所造成。疏水作用使无规则卷曲中的螺旋股呈紧密内部支架。蛋白质的大小与形状可依其一级氨基酸序列，以及二级结构的数目、大小与排列。
“球状头部”用于本文意指其包括受体或唾液酸结合区的天然病毒血细胞凝集素的蛋白质的一部分。“球状头部”于本文亦称作“球状功能域”。已基于如(例如)威尔森I.A.等人，Nature 289366-373(1981)；陈，J.等人，细胞(Cell)95409-417(1998)；哈Y.等人，The EMBO Journal 21865-875(2002)；鲁塞尔，R.J.病毒学325287-296(2004)；及柯克斯，N.J.等人，于托普立与威尔森的微生物学及微生物感染(Toply and Wilson’s Microbiology and MicrobialInfections)，BWJ马帝等人编着，卷1(第9版)纽约，NY，牛津大学出版(OxfordUniv.Press)，第32章，p.634(1998)所述的x-射线晶体学测定出病毒血细胞凝集素蛋白质的球状头部。天然病毒血细胞凝集素的球状头部为(例如)流感病毒血细胞凝集素的HA1亚单位的组成。除了受体结合功能域之外，球状头部可包括如(例如)哈Y.等人，The EMBO Journal 21865-875(2002)所述的E-次功能域及F-次功能域。
语词“使球状头部实质上仍保有其三级结构”用于本文意指维持天然病毒血细胞凝集素的球状头部足以刺激个体内保护性免疫反应的三级结构。
病毒血细胞凝集素的膜融合功能域为病毒血细胞凝集素中结合宿主细胞的区域(涉及病毒血细胞凝集素的结合)。病毒血细胞凝集素的跨膜功能域为，病毒血细胞凝集素中跨越病毒膜的部分。病毒血细胞凝集素的胞质功能域为，病毒血细胞凝集素中位于病毒细胞质表面上的部分。
天然病毒血细胞凝集素的蛋白质的部分(本文亦称作“蛋白质部分”)可进一步缺少信号序列。用于本文所述方法的球状头部的部分可包括至少一二级结构的至少一部分，该二级结构包括至少一β-折叠的至少一部分-；至少一个α螺旋及/或至少一种选自由盐桥、亮氨酸拉链与锌指结构所组成的组群的成员。球状头部部分可进一步包括至少约一个二硫键、至少约两个二硫键、至少约三个二硫键、至少约四个二硫键、至少约五个二硫键及至少约六个二硫键。
制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法可进一步包含以编码至少一个选自由亲水性氨基酸残基、极性氨基酸残基及中性氨基酸残基所组成的组群的氨基酸残基的核酸序列，取代编码该蛋白质部分中至少一个疏水性氨基酸残基的核酸序列的步骤。被取代的疏水性氨基酸残基，可包括至少一种选自由苯丙氨酸残基、色氨酸残基与酪氨酸残基所组成的组群的成员。取代疏水性氨基酸残基的极性氨基酸残基，可包括至少一种选自由天冬氨酸残基与谷氨酸残基所组成的组群的成员。
天然病毒血细胞凝集素的蛋白质的部分可为天然病毒血细胞凝集素蛋白质(例如流感A、B与C)的一部分。流感A病毒血细胞凝集素蛋白质可为至少一种选自由H1、H2、H3、H5、H7及H9所组成的组群的成员。
用于本文所述方法的宿主细胞可为一种原核宿主细胞。原核宿主细胞可为至少一种选自由大肠杆菌原核宿主细胞、假单胞菌属原核宿主细胞、芽孢杆菌属原核宿主细胞、沙门氏杆菌属原核宿主细胞及荧光假单胞菌原核宿主细胞所组成的组群的成员。
制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法可进一步包括将原核宿主细胞以分子伴侣(chaperone)核酸序列转化的步骤。分子伴侣核酸序列可为至少一种选自由groES-groEL分子伴侣、dnaK-dnaJ-grpE分子伴侣、groES-groEL-tig分子伴侣及tig分子伴侣所组成的组群的成员。
制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法可进一步包括将钟样受体(TLR)激动剂的至少一部分融合至该蛋白质的步骤。编码钟样受体激动剂的至少一部分的核酸序列，可经操作性连结至编码病毒血细胞凝集素的蛋白质部分的核酸序列。连接子(例如肽连接子)可介于钟样受体激动剂与病毒血细胞凝集素的部分之间。
钟样受体是指一种与黑腹果蝇(Drosophila melangogaster)托尔蛋白同源的受体蛋白质家族。钟样受体为以胞外富亮氨酸重复功能域，及与介白素1受体同源的胞内功能域为特征的第I型跨膜传讯受体蛋白质。钟样受体包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11与TLR12。
“激动剂”用于本文关于TLR是意指活化TLR传讯途径的分子。TLR传讯途径是一种由可受TLR配体或TLR激动剂活化的特定TLR所利用的细胞内信号传递路径。一般胞内途径是由TLR利用，且包括(例如)NF-κB、Jun N-端激酶及促细胞分裂剂-活化的蛋白质激酶。钟样受体激动剂可包括至少一种选自由TLR1激动剂、TLR2激动剂(例如Pam3Cys、Pam2Cys、细菌脂蛋白)、TLR3激动剂(例如dsRNA)、TLR4激动剂(例如细菌脂多糖)、TLR5激动剂(例如纤毛蛋白)、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂(例如未经甲基化脂DNA基序)、TLR10激动剂、TLR 11激动剂及TLR 12激动剂所组成的组群的成员。
用于本发明方法及组合物的钟样受体激动剂可为一种是钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成，其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个半胱氨酸残基，其位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处，由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
用于本发明组合物及方法的TLR4配体(例如TLR4激动剂)，可包括至少一种选自由SEQ ID NOS359-406(参见，PCT/US 2006/002906/WO2006/083706；PCT/US 2006/003285/WO 2006/083792；PCT/US 2006/041865；PCT/US 2006/042051)所组成的组群的成员。
GGKSGRTG (SEQ ID NO359) KGYDWLVVG(SEQ ID NO360) EDMVYRIGVP (SEQ ID NO361) VKLSGS (SEQ ID NO362) GMLSLALF (SEQ ID NO363) CVVGSVR (SEQ ID NO364) IVRGCLGW (SEQ ID NO365) AAEERTLG (SEQ ID NO366) WARVVGWLR(SEQ ID NO367) SEGYRLFGG(SEQ ID NO368) LVGGVVRRGS (SEQ ID NO369) GRVNDLWLAA (SEQ ID NO370) SGWMLWREGS (SEQ ID NO371) ERMEDRGGDL (SEQ ID NO372) KLCCFTECM (SEQ ID NO373) AVGSMERGRG(SEQ ID NO374) RDWVGGDLV (SEQ ID NO375) FFEVAKISQQ(SEQ ID NO376) WWYWC (SEQ ID NO377) MHLCSHA (SEQ ID NO378) WLFRRIG (SEQ ID NO379) YWFWRIG (SEQ ID NO380) MHLYCIA (SEQ ID NO381) WPLFPWIV (SEQ ID NO382) DMRSHAR (SEQ ID NO383) MHLCTHA (SEQ ID NO384) NLFPFY(SEQ ID NO385) MHLCTRA (SEQ ID NO386) RHLWYHA (SEQ ID NO387) WPFSAYW (SEQ ID NO388) WYLRGS(SEQ ID NO389) GKGTDLG (SEQ ID NO390) IFVRMR(SEQ ID NO391) WLFRPVF (SEQ ID NO392) FLGWLMG (SEQ ID NO393) MHLWHHA (SEQ ID NO394) WWFPWKA (SEQ ID NO395) WYLPWLG (SEQ ID NO396) WPFPRTF(SEQ ID NO397) WPFPAYW(SEQ ID NO398) FLGLRWL(SEQ ID NO399) SRTDVGVLEV (SEQ ID NO400) REKVSRGDKG (SEQ ID NO401) DWDAVESEYM (SEQ ID NO402) VSSAQEVRVP (SEQ ID NO403) LTYGGLEALG (SEQ ID NO404) VEEYSSSGVS (SEQ ID NO405) VCEVSDSVMA (SEQ ID NO406) 用于本发明组合物及方法的TLR2配体(例如TLR2激动剂)，亦可包括至少一种选自由SEQ ID NOS455-494(参见，PCT/US 2006/002906/WO2006/083706；PCT/US 2006/003285/WO 2006/083792；PCT/US 2006/041865；PCT/US 2006/042051)所组成的组群的成员。
NPPTT (SEQ ID NO455) MRRIL (SEQ ID NO456) MISS(SEQ ID NO457) RGGSK (SEQ ID NO458) RGGF(SEQ ID NO459) NRTVF (SEQ ID NO460) NRFGL (SEQ ID NO461) SRHGR (SEQ ID NO462) IMRHP (SEQ ID NO463) EVCAP (SEQ ID NO464) ACGVY (SEQ ID NO465) CGPKL (SEQ ID NO466) AGCFS (SEQ ID NO467) SGGLF (SEQ ID NO468) AVRLS (SEQ ID NO469) GGKLS (SEQ ID NO470) VSEGV (SEQ ID NO471) KCQSF (SEQ ID NO472) FCGLG (SEQ ID NO473) PESGV (SEQ ID NO474) DPDSG (SEQ ID NO475) IGRFR (SEQ ID NO476) MGTLP (SEQ ID NO477) ADTHQ (SEQ ID NO478) HLLPG (SEQ ID NO479) GPLLH (SEQ ID NO480) NYRRW (SEQ ID NO481) LRQGR (SEQ ID NO482) IMWFP (SEQ ID NO483) RVVAP (SEQ ID NO484) IHVVP (SEQ ID NO485) MFGVP (SEQ ID NO486) CVWLQ (SEQ ID NO487) IYKLA (SEQ ID NO488) KGWF (SEQ ID NO489) KYMPH (SEQ ID NO490) VGKND (SEQ ID NO491) THKPK (SEQ ID NO492) SHIAL (SEQ ID NO493) AWAGT (SEQ ID NO494) TLR2配体(例如TLR2激动剂)亦可包括至少一种选自由新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)的鞭毛蛋白修饰蛋白FlmB；细菌第III类型分泌系统蛋白；沙门氏杆菌的侵入蛋白；假单胞菌的第4型菌毛生源蛋白(fimbrialbiogenesis protein)(PilX)；沙门氏杆菌SciJ蛋白；链霉菌的推定整合性膜蛋白(intergral membrane protein)；假单胞菌的膜蛋白；百日咳嗜血杆菌的黏附素(adhesin)；霍乱弧菌的肽酶B；博德氏杆菌的毒力感应蛋白；脑膜炎双球菌的推定整合性膜蛋白；梭菌属的鞭毛生物合成蛋白FliR与FlhB的融合体；不动杆菌属的外膜蛋白(膜孔蛋白)；螺杆菌属的鞭毛生物合成蛋白FlhF；黄单胞菌属(Xanthomonas)的ompA相关蛋白质；布氏杆菌属的omp2a膜孔蛋白；沙门氏杆菌的推定膜孔蛋白/菌毛组装蛋白(LHrE)；沙门氏杆菌的wbdk；涉及LPS生物核成的糖基转移酶；沙门氏杆菌推定通透酶所组成的组群的成员的至少一部分。
TLR2配体(例如TLR激动剂)可包括至少一种选自由脂蛋白/脂肽类(各种病原菌)；肽聚糖(革兰氏-阳性菌)；脂磷壁酸(lipoteichoic acid)(革兰氏-阳性菌)；脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan)(分枝杆菌属)；酚-可溶性调控蛋白(modulin)(表皮葡萄球菌)；糖基肌醇磷脂类(克氏锥虫)；糖脂类(嗜麦芽糖密螺旋体(Treponema maltophilum))；膜孔蛋白(奈瑟菌)；酵母聚糖(真菌)及非典型LPS(问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)与牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis))所组成的组群的成员的至少一部分。
TLR2配体(例如TLR2激动剂)亦可包括，至少一种选自由SEQ ID NOS495-497(参见，PCT/US 2006/002906/WO 2006/083706；PCT/US2006/003285/WO 2006/083792；PCT/US 2006/041865；PCT/US 2006/042051)所组成的组群的成员的至少一部分。
KGGVGPVRRSSRLRRTTQPG(SEQ ID NO495) GRRGLCRGCRTRGRIKQLQSAHK (SEQ ID NO496) RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR (SEQ ID NO497) TLR2激动剂可包括细菌脂蛋白(BLP)的至少一部分。
TLR2激动剂可为一种细菌脂蛋白，例如Pam2Cys(S-[2，3-双(棕榈酰基氧基)丙基]半胱氨酸)、Pam3Cys([棕榈酰基]-Cys((RS)-2，3-二(棕榈酰基氧基)-丙基半胱氨酸)或绿脓杆菌OprI脂蛋白(OprI)。例举性OprI脂蛋白包括SEQ IDNO782，其由SEQ ID NO783编码。一种本文所述的用于本发明的例举性大肠杆菌脂蛋白，为由SEQ ID NO785编码的SEQ ID NO784。活化TLR传讯途径(TLR2激动剂)的细菌脂蛋白为包括棕榈油酸的细菌蛋白质(奥姆提，K.O.等人，J.Biol.Chem.28036616-36625(2005))。例如，SEQ ID NOS783及785于细菌表达系统(例如大肠杆菌)中的表达，导致将棕榈油酸部分加至所成蛋白质(例如，SEQ ID NOS782及784)的半胱氨酸残基上，由此产生用于本发明组合物、融合蛋白及多肽的TLR2激动剂。经由将二酰基甘油基团加至半胱氨酸(例如SEQ ID NO784的半胱氨酸21)的硫氢基，随后将信号序列剪切，并将第三酰基链加至同一半胱氨酸的游离态N-端基团，会在细菌中制造三棕榈酰基化脂蛋白(亦称作三酰基-脂蛋白)(桑卡蓝，K.等人，J.Biol.Chem.26919706(1994))，而产生如(例如)图74所示的三棕榈基化肽(TLR2激动剂)。
本发明组合物中的钟样受体激动剂可进一步包括至少一个位于钟样受体激动剂的氨基端的末端氨基酸及/或羧基端的末端氨基酸的半胱氨酸残基。例如，SEQ ID NO359可进一步包括至少一个存在与氨基端甘氨酸残基肽键结合的半胱氨酸残基，及/或至少一个存在与羧基端甘氨酸残基肽键结合的半胱氨酸残基；SEQ ID NO360可进一步包括至少一个存在与氨基端赖氨酸残基肽键结合的半胱氨酸残基，及/或至少一个存在与羧基端甘氨酸残基肽键结合的半胱氨酸残基；SEQ ID NO361可进一步包括至少一个存在与氨基端谷氨酸残基肽键结合的半胱氨酸残基，及/或至少一个存在与羧基端脯氨酸残基肽键结合的半胱氨酸残基。
用于本发明方法的TLR5激动剂可包括鞭毛蛋白的至少一部分。鞭毛蛋白为可活化TLR5的病原体-关连分子型式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)。
本文所述组合物及方法中的鞭毛蛋白可为鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白(Genbank登录号AF045151)的至少一部分；选自由SEQ ID NO498、SEQ IDNO812、SEQ ID NO816与SEQ ID NO500所组成的组群的鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白的至少一部分；慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白(Genbank登录号AB028476)的至少一部分，其包括SEQ ID NO504与SEQ ID NO813的至少一部分；绿脓杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，其包括SEQ ID NO815的至少一部分；单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白的至少一部分，其包括SEQ ID NO820的至少一部分；大肠杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，其包括SEQ ID NO502与SEQ ID NO814的至少一部分；耶尔森菌鞭毛蛋白的至少一部分；及弯曲杆菌鞭毛蛋白的至少一部分。
用于本发明组合物的鞭毛蛋白，亦可包括SEQ ID NO498、SEQ ID NO500、SEQ ID NO504与SEQ ID NO502的多肽；SEQ ID NO498的至少一部分、SEQ ID NO500的至少一部分、SEQ ID NO504的至少一部分与SEQ IDNO502的至少一部分；由SEQ ID NO499、SEQ ID NO501、SEQ ID NO505与SEQ ID NO503所编码的多肽；及由SEQ ID NO499、SEQ ID NO501、SEQ ID NO505与SEQ ID NO503所编码的多肽的至少一部分。
用于本发明组合物及方法的鞭毛蛋白，可缺乏铰链区的至少一部分。铰链区为鞭毛蛋白的高变区。鞭毛蛋白的铰链区于本文亦称作“D3功能域或区域”、“螺旋桨功能域或区域”、“高变区或区域”及“变化域或区域”。“缺乏”鞭毛蛋白的铰链区意指包含于鞭毛蛋白的铰链区的至少一个氨基酸，或至少一个编码该至少一个氨基酸的核酸密码子，不存在于鞭毛蛋白中。铰链区的实例包括SEQ ID NO498的氨基酸176-415，其是由SEQ ID NO499的核酸528-1245所编码；SEQ ID NO502的氨基酸174-422，其是由SEQ ID NO503的核酸522-1266所编码；或SEQ ID NO504的氨基酸173-464，其是由SEQ ID NO505的核酸的核酸519-1392所编码。因此，若氨基酸176-415从SEQ ID NO498的鞭毛蛋白缺失，则该鞭毛蛋白将缺乏铰链区。缺乏铰链区的至少一部分的鞭毛蛋白，于本文亦称作鞭毛蛋白的“截短版本”。
“铰链区的至少一部分”用于本文意指鞭毛蛋白的铰链区的任何部分，或整个铰链区。“铰链区的至少一部分”于本文亦指“铰链区片段”。fljB/STF2的铰链区的至少一部分可为(例如)SEQ ID NO498的氨基酸200-300。因此，若氨基酸200-300从SEQ ID NO498缺失，则所成STF2的氨基酸序列将缺乏铰链区的一部分。
或者，可将天然鞭毛蛋白的至少一部分，以至人造铰链区的少一部分置换。“天然”关于鞭毛蛋白氨基酸序列意指该氨基酸序列存在于天然鞭毛蛋白，(例如，鼠伤寒沙门杆菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白，慕尼黑沙门氏杆菌(S.muenchin)鞭毛蛋白，大肠杆菌(E.coli)鞭毛蛋白)。天然存在的铰链区为存在于天然鞭毛蛋白中的铰链区。例如，SEQ ID NO498的氨基酸176-415、SEQID NO502的氨基酸174-422及SEQ ID NO504的氨基酸173-464，分别相当于STF2、大肠杆菌fliC及慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白(fliC)的天然铰链区。“人造”用于本文关于鞭毛蛋白的铰链区意指，插入天然鞭毛蛋白中任何含有或曾含有天然铰链区的铰链区。
可将鞭毛蛋白的铰链区缺失，及以抗原(例如HA1-1、HA1-2、成熟剪切位点)置换，并将所成的构建体融合至另一种抗原(例如4xM2e)。
人造铰链区可用于缺乏铰链区的至少一部分的天然鞭毛蛋白，其可助于鞭毛蛋白的羧基-与氨基末端用以与TLR5结合的相互作用，及因此活化TLR5固有的信号传递途径。缺乏铰链区的至少一部分的鞭毛蛋白，是以该鞭毛蛋白名称后加“Δ”来命名。例如，缺乏铰链区的至少一部分的STF2(例如SEQ ID NO498)，是称作“STF2Δ”或“fljB/STF2Δ”(例如SEQ ID NO500)。
用于本发明组合物及方法的鞭毛蛋白，可为鞭毛蛋白的至少一部分，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5；其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5；其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5；其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5，如本文所述。
可通过将TLR激动剂操作性连结至该蛋白质部分，而产生重组融合蛋白(例如，HA1-1、HA1-2)。“融合蛋白”用于本文意指从至少两种相似或不同的组成(例如，HA与TLR激动剂的蛋白质部分)产生的蛋白质。融合蛋白可以重组方式产生或以化学接合产生。在一项实施方式中，HA和TLR激动剂的蛋白部分的融合蛋白(例如，SEQ ID NOS89-92，95，151-160，177，209，210和211)可与TLR动剂和M2e蛋白的融合蛋白(例如，SEQ ID NOS528，587，589和591)混合或一同投予，给药至个体以刺激免疫反应，例如保护性免疫反应。
本发明的融合蛋白可由该融合蛋白的组成以“.”断开而命名。例如，“STF2.HA1-2”是指包含一个STF2蛋白质与一个HA1-2蛋白质的融合蛋白；而“STF2Δ.HA1-2”是指包含一个不含铰链区的STF2蛋白质与一个HA1-2蛋白质的融合蛋白。本发明的例举性融合蛋白包括SEQ ID NOS89-92、95、151-160、177、209、210及211。
融合蛋白可包括(例如)二、三、四、五、六或多种钟样受体激动剂(例如，鞭毛蛋白)，与二、三、四、五、六或多种抗原(例如，蛋白质部分如HA1-1、HA1-2)。当二或多种TLR激动剂与/或二或多种蛋白质部分包含本发明的融合蛋白时，彼等亦称作“多聚体”。例如，HA1-1的多聚体可为四个HA1-1序列，于本文其被称作4xHA1-1。同样，“2xHA1-1”为由两个HA1-1序列组成的多聚体(参见，例如SEQ ID NOS342-346及348)。
本发明的融合蛋白可进一步包括，介于融合蛋白的至少一个组成(例如TLR激动剂)与融合蛋白的至少一个其它组成(例如HA1-1、HA1-2)间的连接子，介于融合蛋白的至少量个相似组成(例如HA1-1、HA1-2)间的连接子，或其任意组合。“连接子”用于本文关于本发明的融合蛋白意指，以使融合蛋白的各组成不直接连结的方式，介于融合蛋白的各组成间的连接物。例如，融合蛋白的一部分(例如鞭毛蛋白)可经连接至融合蛋白的不同部分(例如，蛋白质部分如HA1-1、HA1-2、抗原)。同样，可连接融合蛋白的至少二或多个相似或类似的组成(例如，两鞭毛蛋白可进一步包括介于各鞭毛蛋白间的连接子，或者两HA蛋白质可进一步包括介于各HA蛋白质间的连接子)。
此外(或另供选择地)，本发明的融合蛋白可包括介于融合蛋白的各组成间与融合蛋白的相似或类似组成间的的连接子组合。例如，融合蛋白可包含至少两种TLR激动剂，其进一步包括介于(例如)二或多种鞭毛蛋白间的连接子；至少两个HA的蛋白质部分，其进一步包括介于彼等间的连接子；介于融合蛋白的一种组成(例如，鞭毛蛋白)与融合蛋白的另一种不同组成(例如，HA的蛋白质部分)间的连接子，或其任意组合。
连接子可为氨基酸连接子。氨基酸连接子可包括合成或天然氨基酸残基。用于本发明融合蛋白的氨基酸连接子，可包括至少一种选自由赖氨酸残基、谷赖氨酸残基、丝赖氨酸残基及精赖氨酸残基所成的组群的成员。氨基酸连接子可包括(例如)SEQ ID NOS521、523、524与526，分别由SEQ ID NOS520、522、525及527的核酸序列编码。
本发明融合蛋白的钟样受体激动剂可融合至，HA的蛋白质部分(例如HA1-1、HA1-2或其它抗原，如基质2蛋白的胞外功能域、成熟剪切位点)的羧基端、氨基端或羧基与氨基端二者。
融合蛋白可通过将HA的蛋白质部分(或其它抗原，例如HA的成熟剪切位点)融合至鞭毛蛋白的四个区域(区域1、2、3及4)(其已经基于鞭毛蛋白的晶体结构(PDB1UCU)鉴定出，参见图77)中至少其中一个而产生。
区域1为TIAL(SEQ ID NO823)...-...GLG(SEQ ID NO841的95-111)。对于鼠伤寒沙门氏杆菌fljB构建体的相对应残基为TTLD(SEQ ID NO824)...-...GTN(SEQ ID NO841的196-216)。此区域为位于(SEQ ID NO841)的两β股(GTDQKID(SEQ ID NO825)与NGEVTL(SEQ ID NO826)的沟中的伸展肽。此肽以某一抗原(例如HA成熟剪切位点)的取代，可模拟HA0中野生型成熟剪切位点肽的构型。可被取代的例举性氨基酸包括鞭毛蛋白残基SGLDDAAIKAAT(SEQ ID NO827)(SEQ ID NO841的201-212)，经成熟剪切位点残基RGIFGAIAGFIE(SEQ ID NO828)，其相当于A/H3N2亚型，或RGLFGAIAGFIE(SEQ ID NO803)，其相当于得自A/H2N1、A/H1N1、A/H5N1亚型的成熟剪切位点残基，或经RGFFGAIAGFLE(SEQ ID NO805)，其相当于流感B HA成熟剪切位点残基取代。
沙门氏杆菌鞭毛蛋白的区域2为1UCU结构中的小环GTG(SEQ ID NO841的238-240)(参见图77)。沙门氏杆菌fljB中的相对应环为GADAA(SEQID NO829)(SEQ ID NO841的244-248)。于此环中插入抗原(例如HA的蛋白质部分、成熟剪切位点肽)，或以抗原(例如HA的蛋白质部分、成熟剪切位点肽)置换整个环，应保留成熟剪切位点肽与天然HA分子缔合的伸展环结构。
区域3为存在于区域1的相反侧上的较大环(参见图77)。此环可同时与区域1一起被取代，而产生双拷贝抗原(例如HA的蛋白质部分、成熟剪切位点肽)。该环起始于AGGA(SEQ ID NO830)，而终结于PATA(SEQ ID NO831)(SEQ ID NO841的259-274)。相对应的沙门氏杆菌fljB序列为AAGA(SEQ IDNO832...-...ATTK(SEQ ID NO833)(SEQ ID NO841的266-281)。可将序列AGATKTTMPAGA(SEQ ID NO834)(SEQ ID NO841的267-278)置换以抗原(例如HA的蛋白质部分、成熟剪切位点肽)。
区域4为连结1UCU结构中的短α-螺旋(TEAKAALTAA(SEQ ID NO836))与β-股(ASVVKMSYTDN(SEQ ID NO837))的环(VTGTG(SEQ ID NO835))(参见图77)。沙门氏杆菌fljB中的相对应环为较长的环VDATDANGA(SEQID NO838(SEQ ID NO841的307-315)。可将抗原(例如HA的蛋白质部分、成熟剪切位点肽)插入或置换此区域。
可插入或使用抗原(例如，成熟剪切位点肽)的多拷贝置换列示于前述四区域中的肽。较佳地，置换应位于区域1及区域3。
HA的成熟剪切位点肽的例举性序列，系列示于下 序列 亚型 NVPEKQTRGIFGAIAGFIE A/H3N2(SEQ ID NO800) NVPQIESRGLFGAIAGFIE A/H2N1(SEQ ID NO801) NIPSIQSRGLFGAIAGFIE A/H1N1(SEQ ID NO802) RERRRKKRGLFGAIAGFIE A/H5N1(SEQ ID NO839) PAKLLKERGFFGAIAGFLE B/HA(SEQ ID NO804) X-射线模式(1UCU)与SEQ ID NO841的序列校准 75.1％同一性存在于506个残基重叠；评分1703.0； 空隙频率2.6％ 1UCU 1 AQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGL sfla 2 AQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGL ************************************************************ 1UCU 61 TQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLN sfla 62 TQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLN ************************************************************ 1UCU 121 EIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVQQKYKV sfla 122 EIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDV ************************************************** **** * *\ UCU 181 SDTAATVTGYAD--TTI---ALDNSTFKASATGLGGTDQKIDGDLKFDDTTGKYYAKVTV sfla 182 KDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGG *** * ** ** **** * ** * ***** 1UCU 236 TGGT--GKDGYYEVSVDKTNGEVTLAGGATSPLTGGLPATATEDVKNVQVANADLTEAKA sfla 242 FTGADAAKNGDYEVNV-ATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ** * *** * * * **** **** **** 1UCU 294 ALTAAGVTGT----ASVVKMSYTDNNGKTIDGGLAVKVGDDYYSATQNK-DGSISINTTK sfla 301 ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS ** * ** * ******* ***** ** * * ** ** * * * ** 1UCU 349 YTADDGTSKTALNKLGGADGKTEVVSIGGKTYAASKAEGHNFKAQPDLAEAAATTTENPL sfla 361 YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL *** *** *** * *** ******* * **** **** ** ***** ****** ****** 1UCU 409 QKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSVRSRIEDSDYATEVSNMSRA sfla 421 QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA *********** ************************** ****************** 1UCU 469 QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR (SEQ ID NO840) sfla 481 QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR (SEQ ID NO841) ************************** 制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法可进一步包括将编码载体蛋白的核酸序列操作性连结至编码病毒血细胞凝集素的一部分的核酸序列的步骤。
“载体(carrier)”用于本文意指，可增强保护性免疫反应的刺激的分子(例如，蛋白质、肽类)。载体可经物理方式接附(例如，通过重组技术、肽合成、化学共轭或化学反应连接)至组合物(例如天然感病毒血细胞凝集素的蛋白质部分)，或与该组合物掺合。
用于本发明方法及组合物的载体，可包括(例如)至少一种选自由破伤风类毒素(TT)、霍乱弧菌类毒素、白喉类毒素(DT)、白喉类毒素的交叉反应性突变型(CRM)、大肠杆菌肠内毒素、大肠杆菌热不稳定性肠内毒素的B亚单位(LTB)、烟草花叶病毒(TMV)外壳(coat)蛋白、狂犬病毒(RV)包膜(envelope)蛋白(糖蛋白)、甲状腺球蛋白(Thy)、热休克蛋白HSP 60Kda、钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、早期分泌抗原结核病-6(ESAT-6)、外毒素A、霍乱类毒素(choleragenoid)、B型肝炎核心抗原及脑膜炎双球菌的外膜蛋白复合体(outer membrane protein complex，OMPC)所组成的组群的成员(参见，例如，许奈森，R.等人，Prog Clin Biol Res 4777-94(1980)；许奈森，R.等人，J Exp Med 152361-76(1980)；邱，C.等人，Infect Immun 40245-56(1983)；安得森，P.，Infect Immun 39233-238(1983)；安得森，P.等人，J Clin Invest7652-59(1985)；芬威克，B.W.等人(Fenwick，B.W.)，54583-586(1986)；奎，J.U.等人，Infect Immun 562645-9(1988)；奎J.U.等人，Infect Immun 562645-9(1988)；奎，J.U.等人，Infect Immun 562645-9(1988)；穆雷，K.等人，Biol Chem380277-283(1999)；芬格鲁特，E.等人，Vet Immunol Immunopathol 112253-263(2006)；及格蓝诺夫，D.M.等人，疫苗11Suppl 1S46-51(1993))。
用于本文所述方法及组合物的例举性载体蛋白，可包括至少一种选自由SEQ ID NOS788-795所组成的组群的成员 白喉类毒素的交叉反应性突变型(CRM)包括，CRM197 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS(SEQ ID NO788) 烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白 MMAYSIPTPSQLVYFTENYADYIPFVNRLINARSNSFQTQSGRDELREILIKSQVSVVSPISRFPAEPAYYIYLRDPSISTVYTALLQSTDTRNRVIEVENSTNVTTAEQLNAVRRTDDASTAIHNNLEQLLSLLTNGTGVFNRTSFESASGLTWLVTTTPRTA(SEQ ID NO789) 苜蓿镶嵌病毒(AMV)的外壳蛋白 MSSSQKKAGGKAGKPTKRSQNYAALRKAQLPKPPALKVPVAKPTNTILPQTGCVWQSLGTPLSLSSSNGLGARFLYSFLKDFAAPRILEEDLIFRMVFSITPSHAGSFCLTDDVTTEDGRAVAHGNPMQEFPHGAFHANEKFGFELVFTAPTHAGMQNQNFKHSYAVALCLDFDALPEGSRNPSYRFNEVWVERKAFPRAGPLRSLITVGLFDDADDLDRQ(SEQ ID NO790) 马铃薯病毒X的外壳蛋白 MTTPANTTQATGSTTSTTTKTAGATPATTSGLFTIPDGEFFSTARAIVASNAVATNEDLSKIEAIWKDMKVPTDTMAQAAWDLVRHCADVGSSAQTEMIDTGPYSNGISRARLAAAIKEVCTLRQFCMKYAPVVWNWMLTNNSPPANWQAQGFKPEHKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKEGLIRPPSEAEMNAAQTAAFVKITKARAQSNDFASLDAAVTRGRITGTTTAEAVVTLPPP(SEQ ID NO791) 源自奈瑟菌属的蛋白质，例如 脑膜炎双球菌的第I类外膜蛋白 MRKKLTALVLSALPLAAVADVSLYGEIKAGVEGRNYQLQLTEAQAANGGASGQVKVTKVTKAKSRIRTKISDFGSFIGFKGSEDLGEGLKAVWQLEQDVSVAGGGATQWGNRESFIGLAGEFGTLRAGRVANQFDDASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPAQNSKSAYKPAYWTTVNTGSATTTTFVPAVVGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARHANVGRDAFELFLLGSGSDQAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKTKNSTTEIAATASYRFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAWLKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF(SEQ IDNO792) 主要菌毛亚单位蛋白第I型(菌毛蛋白(Fimbrillin)) MVLKTSNSNRAFGVGDDESKVAKLTVMVYNGEQQEAIKSAENATKVEDIKCSAGQRTLVVMANTGAMELVGKTLAEVKALTTELTAENQEAAGLIMTAEPKTIVLKAGKNYIGYSGTGEGNHIENDPLKIKRVHARMAFTEIKVQMSAAYDNIYTFVPEKIYGLIAKKQSNLFGATLVNADANYLTGSLTTFNGAYTPANYANVPWLSRNYVAPAADAPQGFYVLENDYSANGGTIHPTILCVYGKLQKNGADLAGADLAAAQAANWVDAEGKTYYPVLVNFNSNNYTYDSNYTPKNKIERNHKYDIKLTITGPGTNNPENPITESAHLNVQCTVAEWVLVGQNATW(SEQ ID NO793) 发酵枝原体(Mycoplasma fermentans)巨噬细胞活化性脂肽(MALP-2) MKKSKKILLGLSPIAAVLPAVAVSCGNNDESNISFKEKDISKYTTTNANGKQVVKNAELLKLKPVLITDEGKIDDKSFNQSAFEALKAINKQTGIEINSVEPSSNFESAYNSALSAGHKIWVLNGFKHQQSIKQYIDAHREELERNQIKIIGIDFDIETEYKWFYSLQFNIKESAFTTGYAIASWLSEQDESKRVVASFGVGAFPGVTTFNEGFAKGILYYNQKHKSSKIYHTSPVKLDSGFTAGEKMNTVINNVLSSTPADVKYNPHVILSVAGPATFETVRLANKGQYVIGVDSDQGMIQDKDRILTSVLKHIKQAVYETLLDLILEKEEGYKPYVVKDKKADKKWSHFGTQKEKWIGVAENHFSNTEEQAKINNKIKEAIKMFKELPEDFVKYINSDKALKDGNKIDNVSERLEAIISAINKAAK(SEQ ID NO794) 结核分枝杆菌的P19蛋白质 ATTLPVQRHPRSLFPEFSELFAAFPSFAGLRPTFDTRLMRLEDEMKEGRYEVRAELPGVDPDKDVDIMVRDGQLTIKAERTEQKDFDGRSEFAYGSFVRTVSLPVGADEDDIKATYDKGILTVSVAVSEGKPTEKHIQIRSTN(SEQ ID NO795) 本发明组合物可进一步包括至少一种佐剂。佐剂含有可增强对抗其本身具有差免疫原性的物质的免疫反应的剂(参见，例如，免疫学方法手册(Immunology Methods Manual)，卷2，I.里夫柯维斯编着，学院出版(AcademicPress)，圣地亚哥，CA，1997，ch.13)。免疫学方法手册可购得呈四卷套书(产品代号Z37,435-0)；CD-ROM光盘书(产品代号Z37,436-9)；或二者成套(产品代号Z37,437-7)。佐剂可为(例如)天然或合成化合物的混合物，其当与本发明组合物(例如通过本文所述方法制得的刺激保护性免疫反应的蛋白质)一起给药时，可进一步增强对该蛋白质的免疫反应。进一步包括佐剂的组合物可通过(例如)刺激细胞及/或体液反应(亦即，免除疾病的保护作用对抗体制造)，而进一步增强由本发明组合物所刺激的保护性免疫反应。佐剂可经由增进蛋白质吸收与定位、延展或增长蛋白质释放、巨噬细胞活化作用、及T与B细胞刺激而执行作用。用于本文所述方法及组合物的佐剂，可为无机盐类、油乳液、分枝杆菌产物、皂素、合成产物及细胞介素。佐剂可经物理方式接附(例如，通过重组技术、通过肽合成或化学反应连接)至本文所述组合物，或与该组合物掺合。
在另一实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。在另一实施方式中，该蛋白质部分可进一步缺乏信号序列。在另一实施方式中，该蛋白质部分可进一步包括唾液酸结合位点。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为昆虫真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为经稳定转化的昆虫宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至昆虫细胞宿主细胞(例如，杆状病毒昆虫宿主细胞，如Sf9或High5细胞)中；及培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，可进一步包括缺失至少一个存在于编码该蛋白质部分的核酸序列中的糖化位点的步骤。经缺失的糖化位点可包括N-糖化位点。
用于本发明方法的真核宿主细胞，可包括酵母属真核宿主细胞、昆虫真核宿主细胞(例如，至少一种选自由经杆状病毒感染的昆虫细胞，如草地黏虫(Spodoptera frugiperda)(Sf9)或粉纹夜蛾(Trichhoplusia ni)(High5)细胞；与果蝇昆虫细胞如Dm12细胞所组成的组群的成员)、真菌真核宿主细胞、寄生虫真核宿主细胞(例如利什曼原虫(Leishmania tarentolae)真核宿主细胞)、CHO细胞、酵母菌细胞(例如毕赤酵母)及乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)宿主细胞。
适宜的真核宿主细胞与载体亦可包括植物细胞(例如，西红柿；叶绿体；单-与双子叶植物细胞；阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)；大麦；玉米；马铃薯例如Solanum tuberosum；红萝卜例如胡萝卜(Daucus carota L).；及烟草例如Nicotiana tabacum、Nicotiana benthamiana(吉尔斯，M.等人，PlantBiotechnol J.3613-20(2005)；席，D.M.等人，Colloids Surf B Biointerfaces(2006)；黄，Z.等人，疫苗192163-71(2001)；康德瓦，A.等人，病毒学308207-15(2003)；马奎特-布罗恩，E.等人，Plant Mol Biol 51459-69(2003)；苏达谢那，M.R.等人，Plant Biotechnol J.4551-9(2006)；法桑尼，A.等人，VirusRes，12091-6(2006)；卡马加达S.等人，Expert Rev Vaccines 5839-49(2006)；小谷V，等人，Infect Immun.738266-74(2005)；张，X.等人，Plant Biotechnol J.4419-32(2006))。
由本发明方法制得的蛋白质，及本发明的组合物可利用已熟知方法(例如，凝胶层析术、阳离子交换层析术、SDS-PAGE)进行纯化与特征化。
对于大规模生产，可使用如本文所述的发酵技术。其它例举性发酵技术可包括一种已提出的循环，其可从经接种入6L的MRBR培养基的培养物(如本文所述)开始，保持于约30℃、约pH 7及控制DO至大于约30％。然后可在葡萄糖耗尽后至少约30分钟，开始6升喂料。所提出的6升喂料培养基，当与6L的MRBR培养基组合时，可提供基于约52％生长碳利用率的大肠杆菌生长所需要的条件。喂料可或可不包括IPTG。可将批份以至少2mM IPTG(以大丸剂形式，于喂料开始启动生产后不久导入)进行诱导。喂料速度可开始于约20mL喂料每小时每升生物反应槽体积，之后基于培养物可接受更多葡萄糖而不造成葡萄糖累积的能力，而随时间增加。当喂料完成时，即可收取培养物。6升喂料培养基(约pH 6.0)可包括葡萄糖180g/L；KH2PO4 2g/L；NaH2PO4(H2O)4g/L；(NH4)2HPO4 12g/L；(NH4)2HSO4 4g/L；DL-丙氨酸40g/L；柠檬酸4g/L；MgSO4(7H20)5.5g/L；微量金属6mL；CaCl2 2.5g/L；FeSO47H2O 1g/L。
于大规模制造中的细胞破坏与澄清化，可包括从再悬浮缓冲液去除TritonX-100；通过将50mM Tris、25mM NaCl、8M尿素，约pH 8加至溶胞产物而使不溶物溶解；添加PEI(聚乙胺)接着与一或多种缓冲液进行离心脱除，以去除核酸且/或帮助过滤；添加絮凝剂例如Aerosil 380、Aerosil 200、AlkoxideAlu C与Celpur；及接着通过离心脱除以助于过滤。阳离子交换层析术可包括使用加工树脂，增添其含有至多8M尿素与至多约2％ Triton X-100的变性内毒素去除步骤，及步骤梯度洗脱。步骤洗脱梯度可包括约100至约200mMNaCl。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫反应的方法，其包含将一种包括通过包含以下步骤的方法制得的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤将蛋白质的一部分自天然病毒血细胞凝集素分离，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该部分的核酸序列转化至原核宿主细胞中；及培养该原核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
在另一项实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括得自天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分的组合物给药予该个体的步骤，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。
在一项其它实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含将蛋白质的一部分从天然病毒血细胞凝集素分离出，由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中该真核宿主细胞不为黑腹果蝇真核宿主细胞；及培养该真核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
在另一项实施方式中，本发明为一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含将原核宿主细胞以编码至少一种缺乏跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的核酸序列进行转化；及培养该原核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的步骤。
本发明的另外实施方式中为一种刺激个体内保护免疫性的方法，其包含将一种包括通过以下步骤的方法制得的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤将原核宿主细胞以编码至少一种缺乏跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的核酸序列进行转化；及培养该原核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
在另一项实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护免疫性的方法，其包含将一种包括具有一种缺乏跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤，其中该蛋白质表达于原核细胞中。
在另一项实施方式中，本发明为一种包含至少一种病原体-关连的分子型式的至少一部分及天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分的组合物，其中该天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中该天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。
病原体-关连分子型式(PAMP)，例如鞭毛蛋白或细菌脂蛋，意指一类存在微生物中，当与一模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)结合时，会引发天然免疫反应的分子(例如，蛋白质、肽、糖类、脂质、脂蛋白、核酸)。PRR可为钟样受体(TLR)。
TLR为被表达于抗原-展现性细胞(APC)上的模式识别受体(PRR)的特征已被定出最多的类性。APC利用TLR勘查微环境，并通过结合TLR的关连配体(PAMP)来检测病原体感染的信号。PAMP与TLR相互作用会引发天然免疫反应，其为对抗病原体侵入的第一线防御，其表现为释出细胞介素、趋化因子与其它发炎介导物质；召集吞噬细胞性细胞；及导致共刺激性分子表达，及将抗原有效加工并展现予T-细胞的重要分子机制。
PAMP与TLR的结合活化天然免疫途径。标靶细胞可促使将共刺激性分子以及结合主要组织兼容性复合体分子的抗原展示于细胞表面(参见图40)。本发明的组合物、融合蛋白质或多肽可包括与TLR(例如TLR5)结合的PAMP(例如鞭毛蛋白)，促进APC分化与成熟，包括共刺激性信号的制造及展示(参见图40)。组合物可通过其与TLR的交互作用而被内化，并透过溶酶体途径进行加工而产生抗原性肽类，其被以与主要组织兼容性复合体分子结合的方式展示于表面上。
本发明的组合物、融合蛋白质或多肽利用引发导致以下细胞事件的病原体-关连分子型式(TLR激动剂)共刺激性分子表达、重要细胞介素与趋化因子分泌的；及将抗原有效加工并展现予T-细胞。如上所述，TLR识别PAMP包括细菌细胞壁组成(例如，细菌脂蛋白与脂多糖)、含有未甲基化CpG残基的细菌DNA序列及细菌鞭毛蛋白。TLR作用为天然免疫反应的引发子，与适应性免疫反应的闸门管控者(美席妥夫，R.等人，Cold Springs Harb.Symp.Quant.Biol.64429(1999)；派萨尔，C.R.等人，Semin，Immunol 1623(2004)；美席妥夫，R.等人，Nature 388394(1997)；巴顿，G.M.等人，Curr.Opin.Immunol14380(2002)；班德列克，A.等人，J.Exp.Med.195F19(2002))。
如上所论述者，PAMP与TLR的结合活化用于本发明组合物、融合蛋白质及多肽的免疫途径，其可用于刺激个体内免疫系统。本发明的组合物、融合蛋白质及多肽可引发针对某一种抗原(例如，病毒蛋白质如流感病毒)的免疫反应，并且引发个体的天然与适应性免疫系统的信号传递途径，而由此刺激个体免疫系统。个体免疫系统的刺激可预防由抗原或病毒(例如流感病毒)造成的感染，并由此治疗该个体，或预防个体发生病症、疾病与(可能地)死亡。
在一项另外实施方式中，本发明为一种包含其至少其为鞭毛蛋白的一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
“鞭毛蛋白成分”用于本文意指，完整鞭毛蛋白的至少一部分。
“活化”当关于钟样受体(TLR)时意指该组成(例如，鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成)可刺激与TLR关连的反应。例如，细菌鞭毛蛋白刺激TLR5及宿主发炎反应(史密斯，K.D.等人，自然免疫学(Nature Immunology)41247-1253(2003))。细菌脂肽活化TLR1；Pam3Cys、Pam2Cys活化TLR2；dsRNA活化TLR3；LBS(LPS-结合蛋白)与LPS(脂多糖)活化TLR4；咪唑并喹啉(抗-病毒化合物与ssRNA)活化TLR7；且细菌DNA(CpG DNA)活化TLR9。TLR1与TLR6需要与TLR2进行异元双聚化，以识别配体(例如TLR激动剂、TLR拮抗剂)。TLR1/2是由三酰基脂蛋白(或脂肽，例如Pam3Cys)活化，而TLR6/2是由二酰基脂蛋白(例如Pam2Cys)活化，虽然可能有某些交叉识别存在。除了天然配体之外，合成型小分子包括咪唑并喹啉(其中有对TLR7或TLR8具特异性的次类)可刺激TLR7及TLR8。亦有可活化TLR4的合成型LPS类似物，例如单磷酰基脂质A[MPL]。
TLR的活化作用可导致透过MyD88与NF-κB进行的传讯。已有些证据指出，不同TLR诱导不同的免疫结果。例如，赫许婓等人，Infect Immun691477-1482(2001)及雷等人，J Biol Chem 27637692-37699(2001)证实，TLR2与TLR4于树突细胞中活化不同的基因表现型态。普得蓝等人，J Immunol1675067-5076(2001)证明，此等分歧的基因表现型态会在抗原-特异性反应中的蛋白质层次上重现，当使用透过TLR2或TLR4传讯的脂多糖导引该反应时(TLR4倾向于伴随丰富IFNγ分泌的类Th1反应，而TLR2倾向于伴随丰富IL-5、IL-10与IL-13及较低IFNγ水平的Th2-是反应)。透过不同TLR传讯的结果有很多种。
TLR的活化会导致，可例如通过测量IFNγ-分泌性CD8+细胞(例如细胞毒性T-细胞活性)，而检测到的效应细胞活性增加；可通过例如ELISA、病毒中和及流式细胞计数技术所检测到的抗体反应增加(许奈尔，M.等人，NatImmunol 2947(2001)；亚列波鲁，L.等人，Nat Med 8878(2002)；派萨尔，C.等人，科学(Science)2991033(2003)；拿波坦尼，G.等人，Nat Immunol 6769(2005)；及艾波奎斯特，S.E.等人，J Immunol 1753882(2005))。
包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物(其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5)，可进一步包括至少一种选自由钟样受体1激动剂、钟样受体2激动剂(例如，Pam3Cys、Pam2Cys)、钟样受体3激动剂、钟样受体4激动剂、钟样受体6激动剂、钟样受体7激动剂、钟样受体8激动剂、钟样受体9激动剂、钟样受体10激动剂、钟样受体11激动剂及钟样受体12激动剂所组成的组群的成员的至少一部分。
使用于组合物(例如包括为至少是鞭毛蛋白一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分包含至少一个半胱氨酸残基且该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5)的钟样受体1激动剂、钟样受体2激动剂、钟样受体3激动剂、钟样受体4激动剂、钟样受体6激动剂、钟样受体7激动剂、钟样受体8激动剂、钟样受体9激动剂、钟样受体10激动剂、钟样受体11激动剂及钟样受体12激动剂可进一步包括至少一个额外的半胱氨酸残基。
在一项实施方式中，至少一个半胱氨酸残基是取代至少一个存在鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的氨基酸残基。
取代至少一个存在鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的氨基酸残基的半胱氨酸残基，可远离鞭毛蛋白成分的钟样受体5识别位点的至少一个氨基酸。“钟样受体5识别位点”意指与TLR5相互作用以介导细胞反应的TLR5配体(例如，TLR5激动剂)的部分。“钟样受体5识别位点”亦称作“钟样受体5活化位点”及“钟样受体5活化功能域”。
同样，“钟样受体识别位点”意指，与其个别的TLR相互作用以介导细胞反应的TLR配体(例如，TLR激动剂)的部分。“钟样受体识别位点”亦称作“钟样受体活化位点”及“钟样受体活化功能域”。
取代至少一个存在鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的氨基酸残基的半胱氨酸残基，亦可远离鞭毛蛋白成分的涉及与钟样受体5结合的至少一个氨基酸。
在另一实施方式中，鞭毛蛋白成分包含至少与半胱氨酸残基结合的天然鞭毛蛋白氨基酸序列部分。
用于与天然鞭毛蛋白氨基酸序列的至少一部分结合的半胱氨酸残基(本文亦称为“所添加的半胱氨酸”)可为至少一种选自由鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂的氨基-末端氨基酸，及鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂的羧基-末端氨基酸所组成的组群的成员(用于与其组合使用)。用于与天然鞭毛蛋白氨基酸序列的至少一部分结合的半胱氨酸残基可远离鞭毛蛋白成分的钟样受体5识别位点的至少一个氨基酸，或远离钟样受体激动剂的钟样受体识别位点的至少一个氨基酸。
用于与天然鞭毛蛋白氨基酸序列部分结合的半胱氨酸残基可远离鞭毛蛋白成分的涉及与钟样受体5结合的至少一个氨基酸，或远离钟样受体激动剂的涉及与钟样受体结合的至少一个氨基酸。在另一项实施方式中，鞭毛蛋白成分缺乏天然鞭毛蛋白氨基酸序列部分铰链区的至少一部分。
包含其为至少鞭毛蛋白的一部分的鞭毛蛋白成分，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5的组合物，可进一步包括至少一种抗原(例如，流感病毒抗原如流感病毒A、B或C抗原)的一部分。
该抗原可为实质上疏水性抗原，例如HA的成熟剪切位点。成熟剪切位点抗原可为至少一种选自由SEQ ID NOS530、532、533、534、535、600、601、602、603 and NVPEKQTRGIFGAIAGFIE(H3)(SEQ ID NO796)、NIPSIQSRGLFGAIAGFIE(H1)(SEQ ID NO797)、PAKLLKERGFFGAIAGFLE(FLU B)(SEQ ID NO798)、RERRRKKRGLFGAIAGFIE(H5)(SEQ ID NO799)、RGLXGAIAGFIE(SEQ ID NO821)、RGLXGAIAGFIE(SEQ ID NO822所组成的组群的成员。
“实质上疏水性”用于本文意指，该抗原于水性溶液或环境中具有有限的溶解度。肽或蛋白质的疏水性质可由(例如)凯特-杜利尔疏水性标尺(凯特，J.等人，Mol.Biol.157105-132(1982))测定及比较，其根据相对疏水性而对于各20种氨基酸指定一个数值。正值表示为疏水性氨基酸。负值表示为亲水性氨基酸。对于一种个别肽或多肽，此等数值的平均(通过将对于该多肽或蛋白质的各氨基酸的个别疏水性数值相加，并将总数值除以该多肽或蛋白质的氨基酸数目而计算得)，可提供总体疏水性的指标，称为“疏水性的总平均数”，亦称为＂GRAVY＂。GRAVY值大于零表示该蛋白质或肽为实质上疏水性。GRAVY值小于零表示该蛋白质或肽为实质上亲水性。根据凯特-杜利尔标尺(凯特，J.等人，Mol.Biol.157105-132(1982))，对于20种天然氨基酸的个别疏水性数值如下 丙氨酸 1.8 精氨酸 -4.5 天冬酰胺 -3.5 天冬氨酸 -3.5 半胱氨酸 2.5 谷氨酰胺 -3.5 谷氨酸 -3.5 甘氨酸 -0.4 组氨酸 -3.2 异亮氨酸 4.5 亮氨酸 3.8 赖氨酸 -3.9 甲硫氨酸 1.9 苯丙氨酸 2.8 脯氨酸 -1.6 丝氨酸 -0.8 苏氨酸 -0.7 色氨酸 -0.9 酪氨酸 -1.3 缬氨酸 4.2 用于本发明组合物及方法的抗原(例如蛋白质或肽抗原)的疏水性，可通过基于前述凯特-杜利尔(Kyte-Doolittle)标尺的疏水性数值，计算其GRAVY分数而测定得。例如，其指示为实质上疏水性肽的GRAVY分数，是通过将对于下列成熟剪切位点氨基酸肽的个别氨基酸的疏水性数值(如上述)相加而计算得 成熟剪切部位 GRAVY NVPEKQTRGIFGAIAGFIE(A/H3N2) (SEQ ID NO800)0.053 NVPQIESRGLFGAIAGFIE(A/H2N1) (SEQ ID NO801)0.453 NIPSIQSRGLFGAIAGFIE(A/H1N1) (SEQ ID NO802)0.611 RGLFGAIAGFIE(流感病毒A保守区) (SEQ ID NO803)1.067 PAKLLKERGFFGAIAGFLE(流感病毒B)(SEQ ID NO804)0.400 RGFFGAIAGFLE(流感病毒B保守区) (SEQ ID NO805)0.925 同样，对于下列肽计算得其指示为实质上疏水性肽的GRAVY分数 氨基酸序列 GRAVY 人类流感病毒M2e(SEQ ID NO806) SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP-1.129 越南流感病毒M2e(SEQ ID NO807) GSGAG SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP -0.907 香港流感病毒M2e(SEQ ID NO808) GSGAGSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDP -0.507 西尼罗病毒E肽001(SEQ ID NO809) LTSGHLKCRVKMEKLQLKGT-0.475 登革热2E肽(SEQ ID NO810) EAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK -0.333 BCRABLwt肽(SEQ ID NO811) SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP-1.129 抗原可为任何可被免疫系统的组成识别的分子(例如，蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、碳水化合物、脂质、脂肽、多糖)，而不论其是否能引发免疫系统的活化。抗原可为天然抗原的片段或部分，或为模拟天然抗原或天然抗原的一部分的合成型分子。
抗原可为抗原病毒。“抗原病毒”用于本文意指，当与TLR激动剂(例如鞭毛蛋白、Pam2Cys、Pam3Cys)组合使用或于无TLR激动剂存在下可于个体内产生免疫反应的病毒(例如流感病毒、黄病毒)的任何部分。病毒抗原可为天然病毒的一部分或片段，或为仿真天然病毒的合成型分子，例如于个体内产生免疫反应的重组或合成型蛋白质(例如，流感病毒、黄病毒)、肽、脂质、碳水化合物。流感病毒抗原可包括至少一种选自由流感病毒A抗原、流感病毒B抗原与流感病毒C抗原所组成的组群的成员。流感病毒抗原可为流感病毒整合性膜蛋白，例如HA，或HA蛋白质部分，例如HA1-1和HA1-2。
抗原可为流感病毒基质2(M2)蛋白的至少一部分，包括流感病毒M2蛋白(M2e)的胞外功能域的至少一部分。
基质蛋白2(M2或M2蛋白)为流感病毒A的质子选择性整合性膜离子通道蛋白。M2被丰富表达于受病毒感染细胞的胞质膜，但是一般由病毒体不足表达。例如，流感病毒A的M2序列的一部分为SEQ ID NO508，其是由SEQID NO509编码。M2蛋白的天然形式为同元四聚体(亦即，四个相同的以二硫键连接的M2蛋白分子)。每个单元为通过两个二硫键稳定的螺旋。M2是被低pH值活化。同元四聚体中的每一M2蛋白分子由三个功能域组成24氨基酸外或N(氨基)-末端功能域(例如，SEQ ID NO510；于本文亦称作“人类共有序列”)，其是由SEQ ID NO511编码；19疏水性氨基酸跨膜区域；及54氨基酸内或C(羧基)-末端功能域。M2蛋白可随流感病毒亚型(例如，流感病毒A的H1与H5亚型)及流感病毒来源(例如波多黎各、泰国、纽约、香港)而有变化，如例如于M2蛋白的例举性氨基-末端序列(SEQ ID NOS544-556与570-578)所示，及如PCT/US2005/046662(WO2006/069262)中所述。
M2蛋白在A型流感病毒的生命周期中扮演着重要角色。因其允许离子进入病毒粒子中，降低病毒内部的pH值，导致病毒基质蛋白M1从核糖蛋白RNP解离，故在脱去外壳(uncoating)阶段具有重要性。结果，病毒外壳脱除，且病毒的内容物便从核内体释出，而进入宿主细胞的细胞质中以进行感染。
M2信道的功能可受抗病毒药物，例如金刚烷胺(mantadine)与金刚乙胺(rimantadine)抑制，其防止病毒感染宿主细胞。此类抗病毒药物通常结合M2蛋白的跨膜区，并于空间上阻断由M2蛋白产生的离子通道，而防止质子进入及使病毒粒子脱去外壳。
用于本发明组合物及方法的M2蛋白，可包括SEQ ID NO510(由SEQ IDNO511编码)的至少一部分，或SEQ ID NO544(由SEQ ID NO603编码)的至少一部分。M2蛋白可进一步包括至少一种选自由SEQ ID NO512、SEQID NO516、SEQ ID NO531；SEQ ID NO536(Flu A H5N1 M2e，2004越南分离株，具有丝氨酸置换半胱氨酸)；SEQ ID NO537(Flu A H5N1 M2e，2004越南分离株)；SEQ ID NO538(Flu A H5N1 M2e，香港97分离株，具有丝氨酸置换半胱氨酸)；SEQ ID NO539(FluA H5N1 M2e，香港97分离株)；SEQ IDNO540(Flu A H7N2 M2e鸡/纽约95分离株，具有丝氨酸置换半胱氨酸)；SEQID NO541(Flu A H7N2 M2e，鸡/纽约95分离株)；SEQ ID NO542(Flu A H9N2M2e，香港99分离株，具有丝氨酸置换半胱氨酸)；及SEQ ID NO543(Flu A，香港99分离株)所组成的组群的成员。某些存在M2蛋白的至少一部分的天然序列中的特定半胱氨酸残基，例如SEQ ID NO537的氨基酸16与18；SEQ IDNOS539、541及543的氨基酸17与19，是经置换以丝氨酸(参见，分别地SEQ ID NOS538、540、542及544)。
包含为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分(其中该鞭毛蛋白成分包含至少一个半胱氨酸残基且由此该鞭毛蛋白成分活化进一步包含抗原(例如，成熟剪切位点胜肽、HA蛋白质部分，例如HA1-1，HA1-2)的钟样受体5)的组合物可与另一至少为鞭毛蛋白部分的鞭毛蛋白成分(其中该鞭毛蛋白成分包含至少一半胱氨酸残基且由此该鞭毛蛋白成分活化进一步包含不同、明确的抗原(例如，M2e)的钟样受体5)或TLR激动剂与抗原(例如，STF2.HA1-1、STF2.HA1-2、STF2Δ.HA1-1、STF2Δ.HA1-2、STF2.M2e、STF2.4xM2e、STF2Δ.M2e、STF2Δ.4xM2e)的融合蛋白一同投予或混合。
包含于本发明的组合物并用于本发明的方法的抗原可为微生物相关抗原，例如病原体(如病毒、真菌或细菌)抗原的至少一部分。抗原亦可为微生物相关，且与其它疾病相关的抗原，例如与过敏及癌症关连的抗原。抗原亦可为细菌、病毒、真菌、酵母、原生动物、后生动物、肿瘤、恶性细胞、植物细胞、动物细胞、激素及淀粉样-β肽的抗原的至少一部分。抗原可为一种肽、多肽、脂蛋白、糖蛋白及黏蛋白。
包含于本发明的组合物并用于本发明的方法的抗原可为病原体相关的抗原。“病原体相关的抗原”用于本文意指与病原体关连的任何分子(例如，蛋白质、肽、碳水化合物、脂蛋白、多糖)。例举性病原体相关的抗原包括(例如)痘病毒、禽痘病毒、火鸡流感病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、禽流感病毒、鸡肺炎病毒、犬小病毒、马流感病毒、FHV、新城鸡瘟病毒(NDV)、鸡/宾州/1/83流感病毒、感染性支气管炎病毒、登革热病毒、麻疹病毒、风疹病毒、假狂犬病、伊斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒、HIV、SIV、EHV、BHV、HCMV、汉他病毒、破伤风梭菌(C.tetani)、腮腺炎、麻疹病毒属、单纯疱疹病毒第1型、单纯疱疹病毒第2型、人类细胞巨大性病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病毒、呼吸道融合性病毒、人类乳头瘤病毒、流行性感冒病毒、沙门氏杆菌、奈瑟菌、疏螺旋体、衣原体、博德氏杆菌、疟原虫属(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)与间日疟原虫)、弓形虫属、隐球菌属、链球菌属、葡萄球菌、嗜血菌属、白喉、破伤风、百日咳、大肠杆菌属、念珠菌属、曲霉属、内变形虫属、梨形鞭毛虫属及锥虫属。包含于本发明组合物及用于本发明的方法的抗原可包括细菌荚膜抗原。例举性细菌荚膜抗原包括(例如)至少一种选自由B群链球菌(包括无乳链球菌)荚膜多糖Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V与VI型；肺炎群链球菌荚膜多糖1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、20、22F、23F与33F型，或此等(根据丹麦系统定型)的任意组合；金黄色葡萄球菌荚膜多糖5、8与336型；炭疽杆菌营养期荚膜聚加玛D谷氨酸；结核分枝杆菌脂-阿拉伯糖甘露聚糖荚膜；恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)表面寡聚糖；A、B、C、X、Y与W135群脑膜炎双球菌荚膜多糖或其组合。包含为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白部分的鞭毛蛋白成分(其中鞭毛蛋白成分包含至少一个半胱氨酸残基且由此该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5)的组合物可包括通过将抗原(例如，荚膜抗原、病原体-相关抗原、流感病毒抗原、黄病毒抗原)侧链进行化学修饰，由此产生可偶联(于本文亦称作化学共轭)至于本发明经取代鞭毛蛋白(如前述)上所产生的可兼容反应性基团的活性基团，而制得的抗原。完成荚膜物质的衍生化(修饰)，以使侧链的小部分(约5％)被修饰，而避免荚膜物质上的大部分免疫反应性结构遭破坏。包含于本发明的组合物并用于本发明的方法的可为至少一种选自由西尼罗病毒蛋白、蓝佳特(Langat)病毒蛋白、昆津(Kunjin)病毒蛋白、墨累谷脑炎病毒蛋白、日本脑炎病毒蛋白、蜱传脑炎病毒蛋白、登革热1病毒蛋白、登革热2病毒蛋白、登革热3病毒蛋白、登革热4病毒蛋白、C型肝炎病毒蛋白与黄热病毒蛋白所组成的组群的成员(参见，例如PCT/US2006/001623(WO2006/078657))。
黄病毒属属于黄病毒科，且由约70种病毒所组成。蚊子或壁虱为大多数此等病毒的传媒。数种黄病毒为重要的人类病原体，包括四种登革热病毒(Den1、Den2、Den3与Den4)、黄热(YF)病毒、日本脑炎(JE)病毒、西尼罗病毒(WN，于本文亦称作“WNV”)及蜱传脑炎(TBE)病毒(威弗尔S.C.等人，Nat Rev Microbiol 10789-801(2004))。黄病毒属基于交叉中和试验而分成许多血清群，包括登革热血清群，其含有四种血清学上及遗传学上不同的病毒，命名为Den1、Den2、Den3与Den4。
黄病毒为小、具有包膜及二十面体壳体的病毒。黄病毒基因组为单股正-意义RNA(约11kb)，其于感染后直接通过宿主细胞机器进行转译。病毒基因组被转译成单一多肽，其可由病毒与细胞酶进行共-及后转译剪切，产生三种黄病毒结构蛋白(壳体(C)、膜(M)与包膜(E)蛋白)；及七种非结构性蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B与NS5)(威弗尔等人，Annu RevMicrobiol 199044-649(2004))。病毒壳体由C-蛋白成分，而M-与包膜蛋白是位于病毒粒子的包膜表面上(威弗尔S.C.等人，Nat Rev Microbiol 10789-801(2004)；坎柏等人，Annu Rev.Microbiol.44649-688(1990))。黄病毒的主要免疫原为膜包膜蛋白。
黄病毒当其病毒包膜蛋白与受体结合，且因构型重排而对内体的pH质减低产生反应时，可进入宿主细胞中。构型改变诱导病毒与宿主细胞膜融合。
黄病毒的包膜可作用为一种受体结合蛋白，且有助病毒与宿主细胞膜融合。黄病毒的包膜蛋白具有共通结构(功能域I、II与III)及功能特征(病毒与宿主细胞的受体结合与融合功能)，且为第II类融合糖蛋白(雷司卡等人，Cell 105137-148(2001))。
于融合前构型中，包膜蛋白于病毒颗粒的外表面上形成同元双聚体(雷等人，Nature 375291-298；昆等人，Cell 108717-725(2002)；暮柯沛艾等人，Science 302248(2003))。每一包膜蛋白单体折叠成三个结构功能域(功能域I、II与III)，主要由β-股组成。功能域I(于本文亦称作“I”或”DI”)位于该结构中央，且于经糖化的包膜蛋白中具有N-糖化位点。包膜蛋白的功能域II(于本文亦称作“II”或”DII”)促进双聚化作用，且具有一个融合环结构，其在病毒进行pH-依赖性融合时插入标靶宿主膜中(墨迪斯等人，Nature427313-319(2004)；布瑞沙里等人，EMBO J 23728-738(2004))。功能域III(于本文亦称作“III”或”DIII”)位于包膜蛋白的羧基末端。功能域III于早期的抗原作图研究中亦称作“功能域B”。功能域III具有数种可引发病毒-中和性抗体的抗原表位(罗利格，Adv Virus Res 59141-175(2003))。
蜱传脑炎病毒包膜蛋白的功能域I对应于SEQ ID NO777的氨基酸1-51，、137-189与285-302；SEQ ID NO777的蜱传脑炎病毒包膜蛋白的功能域II对应于氨基酸52-136与190-284；而功能域III对应于SEQ ID NO777的氨基酸303-395(雷，F.A.等人，Nature 375291-298(1995))。SEQ ID NO777是由SEQID NO778编码。登革2黄病毒包膜蛋白的功能域I对应于SEQ ID NO763的氨基酸1-52，、132-193与280-296；功能域II对应于SEQ ID NO763的氨基酸53-131与194-279；而功能域III对应于SEQ ID NO763的氨基酸297-495(墨迪斯，Y.等人，Nature 427313-319(2004))。其它黄病毒(例如西尼罗病毒、日本脑炎、登革热1病毒、登革热3病毒及登革热4病毒)的功能域I、II与III的定位，是基于蜱传脑炎包膜蛋白功能域与登革2包膜蛋白功能域的同源性。因此，本文提及黄病毒蛋白的功能域(特别是不为蜱传脑炎黄病毒蛋白与登革热2黄病毒包膜蛋白)时是基于对在蜱传脑炎黄病毒包膜蛋白与登革热2黄病毒包膜蛋白中的功能域的同源性。
DEN黄病毒的包膜蛋白的功能域III编码大部分黄病毒类型-特异性相邻连续/优势中和性抗原表位(罗林，J.T.，Adv.Virus Res.59141(2003))，包括四种DEN(DEN1、DEN2、DEN3、DEN4)病毒。黄病毒包膜蛋白具有高同源性。例举性包膜蛋白序列为SEQ ID NOS642、763、765、767、769及774。
西尼罗病毒(WNV)为单股正-意义RNA具有包膜的病毒。其最先于1937年在乌干达的西尼罗区域，从发烧女性成人分离及鉴定出(史密斯伯恩等人，Am J Trop Med Hyg 39-18(1954))。
日本脑炎(JE)病毒局部于亚洲与北澳洲(每年约有50,000案例，其中约10,000名死亡)。
登革热(DEN)病是由四种蚊-传染型、血清学上相关的黄病毒，称为DEN-1(于本文亦称作“Den1”或“Den1”)、DEN-2(于本文亦称作“Den2”或“Den2”)、DEN-3(于本文亦称作“Den3”或“Den3”)及DEN-4(于本文亦称作“Den4”或“Den4”)所引起。本发明的组合物、融合蛋白及多肽可包括Den 1 SEQ ID NO623；Den 1 PR 94(波多黎各，1994)SEQ ID NO624；Den 3 SEQ ID NO626；及Den 4 SEQ ID NO627。SEQ ID NOS623、624、625、626与627为Den1、Den2、Den3及Den4黄病毒的部分功能域III。
“EI”、“EII”及“EIII”用于本文分别意指，西尼罗黄病毒包膜蛋白的功能域I、II与III。“JEI”、“JEII”及“JEIII”用于本文分别意指，日本脑炎黄病毒包膜蛋白的功能域I、II与III。“Den1 I”、“Den1 II”及“Den1 III”用于本文分别意指，登革热1黄病毒包膜蛋白的功能域I、II与III。同样，对于其它黄病毒的包膜蛋白的功能域的命名，是引用该黄病毒名称之后加上该功能域编号(例如，(壁虱传染型)TBI(壁虱传染型)、TBII、TBIII、Den2 I、Den2 II、Den2 III)。
黄病毒包膜蛋白的部分可包括至少一种选自由功能域I的至少一部分、功能域II的至少一部分与功能域III的至少一部分所组成的组群的成员。当某一功能域以＂+＂命名(例如“EIII+”或“JEIII+”)时，称作“III”的包膜蛋白部分为一种该功能域加上功能域I与II其中的一或二者的至少一部分的整体的组成。例如，“EIII+”用于本文分别意指本发明的组合物、融合蛋白质及多肽包括功能域III与功能域I的至少一部分。“EIII+”亦称作“EI/III”。“JEIII+”亦称作“JEI/III”。同样，当组合物包括黄病毒包膜蛋白的功能域时，则所述功能域可为功能域I、II与III的组合，且可基于该功能域命名。例如，EI/II包括西尼罗黄病毒的功能域I与II。在引述用于本发明的组合物、融合蛋白质及多肽的包膜蛋白的功能域(例如，EIII、JEIII、Den1 III)时不加“+”，意指组合物、融合蛋白质及多肽包括该所引述的功能域。例如，“Den1 III”意指组合物、融合蛋白质及多肽包括登革热1病毒的功能域III，而非功能域I。
西尼罗病毒包膜蛋白可包括，至少一种选自由SEQ ID NO610，其为EIII+氨基酸序列，斜体字氨基酸为包膜蛋白的功能域I，而其余序列为包膜蛋白的功能域III；SEQ ID NO611，西尼罗病毒，史丹佛，CT，亦称作“西尼罗S”；SEQ ID NO612，西尼罗病毒，纽约，NY，亦称作“西尼罗NY”；与SEQ ID NO613所组成的组群的成员的至少一部分，SEQ ID NO610是由SEQ ID NO614编码。
用于本发明组合物、融合蛋白质及多肽的蓝加特病毒包膜蛋白可包括SEQID NO615的至少一部分。昆津病毒包膜蛋白可包括SEQ ID NO616的至少一部分。墨累谷脑炎包膜蛋白可包括SEQ ID NO617的至少一部分。日本脑炎包膜蛋白可包括，至少一种选自由SEQ ID NO618与SEQ ID NO619所组成的组群的成员的至少一部分。蜱传脑炎包膜蛋白可包括SEQ ID NO620的至少一部分。黄热病毒包膜蛋白可包括SEQ ID NO621的至少一部分。黄病毒的包膜蛋白可包括至少一种选自由SEQ ID NO622与SEQ ID NO643所组成的组群的成员的至少一部分。SEQ ID NOS615、616、617、618、619、620、621、622及643，为病毒包膜蛋白的功能域III的部分。
抗原可以化学方法共轭至鞭毛蛋白成分及钟样受体激动剂组成。化学共轭(本文亦称作“化学偶联”)可包括通过反应性基团，例如硫醇基(如半胱氨酸残基)，或通过将初级(例如氨基端)或次级(例如赖氨酸)基团衍生化而进行的共轭作用。可使用不同交联剂将TLR配体(例如，TLR激动剂)以化学方法共轭至蛋白质(例如，抗原、本发明组合物、本发明的HA及M2e构建体)或其它分子(例如核酸、多糖)。例举性交联剂为市售可得，例如购自皮尔斯(Pierce，洛克兰，Ill)者。将抗原以化学方法共轭至鞭毛蛋白成分的方法为已熟知，且包括使用市售可得的交联剂，例如于本文所述者。
举例而言，将肽或蛋白质抗原轭至本发明的鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成，可透过鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成的至少一个半胱氨酸残基，与蛋白质(例如流感抗原，如HA、M2e)的至少一个半胱氨酸残基，使用已建立的技术达成。可将蛋白质以同元双官能性巯基-特异性交联剂衍生化；然后将蛋白质脱盐以去除未反应的交联剂；之后将该肽或蛋白质伙伴加入，并经由至少一个半胱氨酸残基共轭。用于该共轭方法的例举性试剂，可于市面上购自皮尔斯(洛克兰，Ill)，例如BMB(目录编号22331)、BMDB(目录编号22332)、BMH(目录编号22330)、BMOE(目录编号22323)、BM[PEO]3(目录编号22336)、BM[PEO]4(目录编号22337)、DPDPB(目录编号21702)、DTME(目录编号22335)、HBVS(目录编号22334)。
或者，亦可将含有半胱氨酸的蛋白质及抗原共轭至位于本发明鞭毛蛋白成分、鞭毛蛋白、钟样受体激动剂组成及钟样受体激动剂上的赖氨酸。不含有半胱氨酸残基的蛋白质，是以异双官能性胺与巯基-特异性交联剂衍生化。经脱盐后，将含有半胱氨酸的伙伴加入并进行共轭。用于该共轭方法的例举性试剂可购自皮尔斯(洛克兰，Ill)，例如，AMAS(目录编号22295)、BMPA(目录编号.22296)、BMPS(目录编号22298)、EMCA(目录编号22306)、EMCS(目录编号22308)、GMBS(目录编号22309)、KMUA(目录编号22211)、LC-SMCC(目录编号22362)、LC-SPDP(目录编号21651)、MBS(目录编号22311)、SATA(目录编号26102)、SATP(目录编号26100)、SBAP(目录编号22339)、SIA(目录编号22349)、SIAB(目录编号22329)、SMCC(目录编号22360)、SMPB(目录编号22416)、SMPH(目录编号.22363)、SMPT(目录编号21558)、SPDP(目录编号21857)、磺基-EMCS(目录编号22307)、磺基-GMBS(目录编号22324)、磺基-KMUS(目录编号21111)、磺基-LC-SPDP(目录编号21650)、磺基-MBS(目录编号22312)、磺基-SIAB(目录编号22327)、磺基-SMCC(目录编号22322)、磺基-SMPB(目录编号22317)、磺基-LC-SMPT(目录编号.21568)。
此外(或另供选择地)，肽或蛋白质抗原亦可经由至少一个皆存在该二共轭伙伴上的赖氨酸残基共轭至本发明鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成。将该二共轭伙伴与同双官能性胺-特异性交联剂组合。然后将适当的异元共轭物从不希望的凝集物及同元共轭物纯化出。用于该共轭方法的例举性试剂可购自皮尔斯(洛克兰，I11)，例如，BSOCOES(目录编号21600)、BS3(目录编号21580)、DFDNB(目录编号21525)、DMA(目录编号20663)、DMP(目录编号21666)、DMS(目录编号20700)、DSG(目录编号20593)、DSP(目录编号22585)、DSS(目录编号21555)、DST(目录编号20589)、DTBP(目录编号20665)、DTSSP(目录编号21578)、EGS(目录编号21565)、MSA(目录编号22605)、磺基-DST(目录编号20591)、磺基-EGS(目录编号21566)、THPP(目录编号22607)。
同样地，肽或蛋白质抗原亦可经由至少一个存在其中一伙伴上的羧基(例如，谷氨酸、天冬氨酸或肽或蛋白质的羧基末端)及存在另一伙伴上的胺共轭至本发明鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成。将该二共轭伙伴与适当异双官能性交联剂混合在一起。然后将适当的异元共轭物从不希望的凝集物及同元共轭物纯化出。用于该共轭方法的例举性试剂可购自皮尔斯(洛克兰，Ill)，例如，AEDP(目录编号22101)、EDC(目录编号22980)及TFCS(目录编号22299)。
此外，碳水化合物抗原亦可经由蛋白质中的至少一个半胱氨酸，使用已相当建立的技术共轭至本发明的蛋白质、鞭毛蛋白成分、鞭毛蛋白、钟样受体激动剂组成及钟样受体激动剂。例如，首先将蛋白质以含有至少一个巯基-特异性，与至少一个肼基的异双官能性交联剂衍生化。然后将多糖或寡糖以诸如偏过碘酸钠的氧化剂处理，而产生末端醛基。然后将经氧化的碳水化合物加至经衍生化的蛋白质，并经由位于交联剂上的肼发生与该醛的共轭。用于该共轭方法的例举性试剂可购自皮尔斯(洛克兰，I11)，例如，BMPH(目录编号22297)、EMCH(目录编号22106)、KMUH(目录编号22111)及PDPH(目录编号22301)。
其它脂肽类可经由该肽链上的氨基酸侧链，而共轭至本发明的蛋白质抗原、鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成或钟样受体激动剂。其将使用与关于肽共轭至蛋白质所述相似的策略与试剂。
TLR可由核酸活化。例如，TLR3是由双股(ds)RNA活化；TLR7与TLR8是由单股(ss)RNA活化；而TLR9是由CpG DNA序列活化。可使用数种不同技术，将核酸TLR的钟样受体激动剂组成共轭至蛋白质抗原。例如，对于未经修饰的DNA分子，可将5′磷酸基团以水溶性羰二亚胺EDC(皮尔斯，Rockford，IL，目录编号22980)修饰，随后加入咪唑而形成末端磷酰基咪唑。然后可通过添加乙二胺，将末端氨基以此反应性基团取代。接着可使用异双官能性顺丁烯二酰亚胺(半胱氨酸-特异性)与NHS-酯(赖氨酸-特异性)交联剂，将经胺-修饰的核酸共轭至蛋白质上的半胱氨酸，如前文关于肽-蛋白质共轭所述。
或者(或额外地)，可通过于第二步骤中将胱胺取代乙二胺，而将巯基并入于5′端。待二硫键的还原后，自由的巯基可共轭至位于本发明蛋白质、鞭毛蛋白成分、鞭毛蛋白、钟样受体激动剂组成及钟样受体激动剂上的半胱氨酸，或使用异双官能性交联剂共轭至赖氨酸，如本文所述。另供选择地(或额外地)，可合成5′或3′端有经修饰碱基的合成型寡核苷酸。此等经修饰的碱基可包括可使用前述方法而被共轭至蛋白质的一级胺或巯基基团。可将RNA分子的3′端以化学方法修饰，以允许其与蛋白质或其它巨分子偶联。位于3′-核糖残基上的二醇，可使用偏过碘酸钠氧化而产生醛基。然后可使用含有肼基的交联剂，例如可共价修饰羰基的MPBH(皮尔斯；洛克兰，IL，目录编号22305)，然后再经由顺丁烯二酰亚胺共轭至蛋白质上的自由巯基，而将该醛共轭至蛋白质。或者，可以含有异氰酸酯的交联剂，例如其亦含有供共轭至蛋白质的巯基的PMPI(皮尔斯；洛克兰，IL，目录编号28100)，直接将3′羟基衍生化。
已经鉴定得合成型小分子TLR配体(例如，钟样受体激动剂、钟样受体拮抗剂)。例如，咪喹莫特(imiquimod，其有效活化TLR7)，与利喹莫特(resiquimod，为TLR7及TLR8的活化剂)。已合成得具有各种效能水平与特异性的此等化合物的类似物。将小分子TLR激动剂共轭至所兴趣抗原的能力，可取决于该TLR配体的化学性质。某些TLR配体可具有能被利用于化学共轭的活性基团。例如，咪喹莫特及其类似物胍喹莫特(gardiquimod)(因维沃金(InvivoGen)；圣地亚哥，CA)，与TLR7-活化性腺嘌呤类似物CL087(因维沃金；圣地亚哥，CA)具有一级氨基(-NH2)，其可为用于通过含有亚胺酯或NHS酯类的交联剂进行衍生化的标靶物。在另一项策略，胍喹莫特含有被暴露出的羟基(-OH)，其可通过含有异氰酸酯的交联剂，例如PMPI(皮尔斯；洛克兰，IL，目录编号28100)进行衍生化，以后续交联至蛋白质巯基。
此外，可安排小分子TLR配体的衍生物的订制合成，以将新颖官能基接附在该分子的不同位置上以有助于交联。订制衍生物亦可包括可接着用于直接键联至蛋白质抗原的基团，例如顺丁烯二酰亚胺。
抗原与鞭毛蛋白成分的化学共轭，可导致该作为本发明组合物的组成的抗原(例如，本质上为疏水性的抗原，例如成熟剪切位点抗原)的水溶性增加。
包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5，的组合物可包括一个位于鞭毛蛋白成分的高变区中的半胱氨酸残基。
至少一个半胱氨酸残基取代至少一个存在天然鞭毛蛋白氨基酸鞭毛蛋白成分中的氨基酸。该半胱氨酸残基可取代至少一个选自由SEQ ID NO812的氨基酸1、237、238、239、240、241与495所组成的组群的氨基酸；至少一个选自由SEQ ID NO498的氨基酸1、240、241、242、243、244与505所组成的组群的氨基酸；至少一个选自由SEQ ID NO504的氨基酸1、237、238、239、240、241与504所组成的组群的氨基酸；至少一个选自由SEQ ID NO815的氨基酸1、211、212、213与393所组成的组群的氨基酸；至少一个选自由SEQ ID NO820的氨基酸1、151、152、153、154与287所组成的组群的氨基酸；至少一个选自由SEQ ID NO502的氨基酸1、238、239、240、241、242、243与497所组成的组群的氨基酸；至少一个选自由SEQ ID NO812的氨基酸1、237、238、239、240、241与495所组成的组群的氨基酸。
鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成，可包括天然鞭毛蛋白氨基酸序列的至少一部分，与该半胱氨酸残基组合。
本发明其中该半胱氨酸残基取代天然鞭毛蛋白氨基酸序列鞭毛蛋白成分中至少一个氨基酸，或其中该鞭毛蛋白成分包括天然鞭毛蛋白氨基酸序列的至少一部分与该半胱氨酸残基组合的组合物，可活化钟样受体5。例如，半胱氨酸残基可位于邻近氨基末端及羧基末端的D1/D2功能域中，远离TLR5识别位置(参见，例如图75与76)。另供选择地(或额外地)，半胱氨酸残基可位高变功能域的末梢点(参见，例如图75与76)，位于SEQ ID NO812的约氨基酸273、约238、约239、约240及约241。取代极性或带电荷氨基酸，对于以半胱氨酸残基取代疏水性氨基酸而言为较佳。于TLR5识别位置内发生取代为最不佳。
得自鼠伤寒沙门氏杆菌STF1的鞭毛蛋白(FliC)是描述于SEQ ID NO812(登录号P06179)。TLR5识别位置为氨基酸约79至117及约408至约439。半胱氨酸残基可取代SEQ ID NO812的氨基酸约408至约439；SEQ ID NO812的氨基酸约1与约495；SEQ ID NO812的氨基酸约237至约241；及/或SEQID NO812的氨基酸约79至约117与约408至约439；或与以上者组合。
鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白STF2(FljB)是描述于SEQ ID NO498。TLR5识别位置为SEQ ID NO498的氨基酸约80至约118及约420至约451。半胱氨酸残基可取代SEQ ID NO498的氨基酸约1与约505；SEQ ID NO498的氨基酸约240至约244；SEQ ID NO498的氨基酸约79至约117及/或约419至约450；或与以上者组合。
慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白是描述于SEQ ID NO504(登录号#P06179)。TLR5识别位置为SEQ ID NO504的氨基酸约79至117及约418至约449。半胱氨酸残基可取代SEQ ID NO504的氨基酸约1与约504；SEQ ID NO504的氨基酸约237至约241；约79至约117；及/或SEQ ID NO504的约418至约449；或与以上者组合。
大肠杆菌菌鞭毛蛋白是描述于SEQ ID NO502(登录号P04949)。TLR5识别位置为SEQ ID NO502的氨基酸约79至约117及约410至约441。半胱氨酸残基可取代SEQ ID NO502的氨基酸约1与约497；SEQ ID NO502的氨基酸约238至约243；约79至约117；及/或SEQ ID NO502的约410至约441；或与以上者组合。
绿脓杆菌鞭毛蛋白是描述于SEQ ID NO815。TLR5识别位置为SEQ IDNO815的氨基酸约79至114及约308至约338。半胱氨酸残基可取代SEQ IDNO815的氨基酸约1与约393；SEQ ID NO815的氨基酸约211至约213；约79至约114；及/或SEQ ID NO815的约308至约338；或与以上者组合。
单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白是描述于SEQ ID NO820。TLR5识别位置为SEQ ID NO820的氨基酸约78至116及约200至约231。半胱氨酸残基可取代SEQ ID NO820的氨基酸约1与约287；SEQ ID NO820的氨基酸约151至约154；约78至约116；及/或SEQ ID NO820的约200至约231；或与以上者组合。
位于STF2上的经实验确定的TLR5识别位置，已经描述(参见，例如，史密斯，K.D.等人，自然免疫学41247-1253(2003))是位于氨基酸约79至约117，及约420至约451。此外，史密斯，K.D.等人(自然免疫学41247-1253(2003))基于序列同源性，鉴定出位于其它鞭毛蛋白上的TLR5识别位置，例如STF1位于氨基酸约79至约117，约408至约439；绿脓杆菌位于氨基酸约79至约117，约308至约339；L.pneumophila位于氨基酸约79至约117，约381至约419；大肠杆菌位于氨基酸约79至约117，约477至约381；S.marcesens位于氨基酸约79至约117，约265至约296；枯草芽孢杆菌位于氨基酸约77至约117，约218至约249；及单核细胞增生李斯特菌位于氨基酸约77至约115，约200至约231。
已测定出高解析构造STF1(FliC)(SEQ ID NO812)，且可作为分析TLR5被鞭毛蛋白的识别及半胱胺取代/添加的位置的基础。鞭毛蛋白类似一种“回力镖”，在一臂的末端具有氨基-及羧基端(参见，例如图77)。TLR5识别位置是大概位于回力镖的外侧，于朝向鞭毛蛋白氨基-及羧基端的弯曲的正下方处。铰链区，其对TLR5识别并非需要的，是位于弯曲的上方。鞭毛蛋白的具有最大序列同源性的区域，是位于TLR5识别位置中。其次的序列同源性区域是位于D1与D2功能域中，其包括TLR5识别位置及氨基-及羧基端。D1与D2功能域(有或不含连接子)为STF2Δ.(.SEQ ID NO500)，其可活化TLR5。鞭毛蛋白之间最不具有序列同源性的区域为高变区。
据相信，鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成可活化TLR5的能力，可通过使共轭位点(取代天然鞭毛蛋白氨基酸序列鞭毛蛋白成分中至少一个氨基酸的半胱氨酸残基，或天然鞭毛蛋白氨基酸序列的至少一部分与半胱氨酸残基的组合)保持远离TLR5或TLR识别位置而完成。例如，对于可高解析构造测定是可得的STF1(SEQ ID NO812)，此可于D1功能域、D2功能域或于铰链区中达成。于D1/D2功能域中，氨基-及羧基端可远离TLR5识别位置(于本文亦称作“位于远程”)，且自氨基或羧基端移开可能使共轭位点更靠近识别位置，且可能干扰TLR5活性。于铰链区中，SEQ ID NO812的氨基酸约237至约241是大概位于“回力镖”的另一尖端，且与TLR5识别位置的距离大约与氨基-及羧基端相同。此位点亦可能为维持TLR5识别的位置。
对于共轭位点的位置，可将氨基酸同一性纳入考虑。极性与带电荷氨基酸(例如，丝氨酸、天冬氨酸、赖氨酸)似乎较可能暴露于表面且较能接附抗原。疏水性氨基酸(例如，缬氨酸、苯丙氨酸)似乎较可能被包埋，且参与结构的相互作用，而应予避免。
包括具有半胱氨酸残基的鞭毛蛋白成分或具有半胱氨酸残基的钟样受体激动剂组成的组合物，可活化TLR5并能经化学方法与抗原共轭。
本发明的组合物及利用本发明组合物的方法，可进一步包括载体蛋白。载体蛋白可为至少一种选自由破伤风类毒素、霍乱弧菌类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的交叉反应性突变型、大肠杆菌热不稳定性肠内毒素的B亚单位、烟草花叶病毒外壳蛋白、狂犬病毒包膜蛋白、狂犬病毒包膜糖蛋白、甲状腺球蛋白、热休克蛋白60、钥孔虫戚血蓝蛋白与早期分泌抗原结核病-6所组成的组群的成员。
包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物(其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5)，可包括至少一个鞭毛蛋白成分的赖氨酸，已经由至少一种选自由精氨酸残基、丝氨酸残基与组氨酸残基所组成的组群的成员取代。
在另一实施方式中，本发明为一种包含其为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物，其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处的半胱氨酸残基，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。“组成”用于本文关于钟样受体激动剂组成意指钟样受体激动剂的至少一部分或整个钟样受体激动剂。
在一实施方式中，于包含其为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物(其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处的半胱氨酸残基，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体)的半胱氨酸残基，。取代钟样受体激动剂组成的天然氨基酸序列的至少一个氨基酸。该半胱氨酸可取代远离钟样受体激动剂组成的钟样受体识别位置的至少一个氨基酸。在另一实施方式中，钟样受体激动剂组成包含天然钟样受体激动剂氨基酸序列的至少一部分结合半胱氨酸残基。与天然钟样受体激动剂结合的半胱氨酸残基可远离钟样受体激动剂组成的钟样受体识别位置。
包含其为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成(其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处的半胱氨酸残基，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体)的组合物，进一步包括至少一种抗原(例如，流感病毒抗原，如流感病毒整合性膜蛋白、HA、HA1-1、HA1-2、M2、M2e)的至少一部分。
在另一实施方式中，本发明为一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
“经取代”用于本文关于鞭毛蛋白、鞭毛蛋白成分、钟样受体激动剂或钟样受体激动剂组成意指，鞭毛蛋白成分的至少一个氨基酸(例如赖氨酸)已经修饰成另一氨基酸残基，例如保守性取代(如精氨酸、丝氨酸、组氨酸)，而由此形成经取代的鞭毛蛋白成分或经取代的钟样受体激动剂组成。可通过产生编码具有取代的鞭毛蛋白的重组构建体，通过化学方法、通过蛋白质合成技术产生鞭毛蛋白的至少一部分的蛋白质或肽类，或其任何组合而制得经取代的鞭毛蛋白成分或经取代的钟样受体激动剂组成。
经一种氨基酸(例如精氨酸、丝氨酸、组氨酸)取代的赖氨酸残基，可为至少一个选自由SEQ ID NO812的赖氨酸19、41、58、135、160、177、179、203、215、221、228、232、241、251、279、292、308、317、326、338、348、357、362、369、378、384、391与410所组成的组群的赖氨酸。
鞭毛蛋白可为其包括SEQ ID NO816的鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白。经一种氨基酸(例如精氨酸、丝氨酸、组氨酸)取代的赖氨酸残基，可为至少一个选自由SEQ ID NO816的赖氨酸20、42、59、136、161，177、182、189、209、227、234、249、271、281、288、299、319、325、328、337、341、355、357、369、381、390、396、403、414与422所组成的组群的赖氨酸。
鞭毛蛋白可为其包括SEQ ID NO814的大肠杆菌fliC。鞭毛蛋白可为其包括SEQ ID NO813的慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白。鞭毛蛋白可为其包括SEQ ID NO815的绿脓杆菌鞭毛蛋白。鞭毛蛋白可为其包括SEQ ID NO820的单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白。
本发明组合物可包括其具有位于邻近鞭毛蛋白的基序C、鞭毛蛋白的基序N、鞭毛蛋白的基序C与基序N二者、鞭毛蛋白的功能域1、鞭毛蛋白的功能域2或其任意组合的区域中的赖氨酸被取代的鞭毛蛋白。鞭毛蛋白的基序C与基序N及鞭毛蛋白的功能域1与功能域2，可涉及TLR5受鞭毛蛋白的活化作用(沐尔斯等人，J.Biol.Chem.，2795667-5675(2004))。
蛋白质、肽或多肽与另一分子的化学共轭，可通过将次级基团(例如赖氨酸)衍生化。鞭毛蛋白中某些赖氨酸残基是接近或位于功能域1、基序C或基序N(可能在鞭毛蛋白与TLR5的结合中为重要的基序)。例如，位于SEQ IDNO812的氨基酸58、135、160及410的赖氨酸残基，可经至少一种选自由精氨酸残基、丝氨酸残基、组氨酸残基所组成的组群的成员取代。衍生化此类赖氨酸残基以(例如)化学共轭抗原至鞭毛蛋白，可减低鞭毛蛋白与TLR5的结合能力或结合亲和性，而因此减少由TLR5介导的固有免疫反应。以另一种氨基酸(例如精氨酸、丝氨酸、组氨酸)取代鞭毛蛋白中至少一个可能接近鞭毛蛋白的对于介导与TLR5的交互作用为重要的区域(例如，基序C、基序N、功能域1)的赖氨酸残基，可保留或增强鞭毛蛋白与TLR5的结合。在特别的实施方式中，氨基酸取代为以至少一种选自由精氨酸、丝氨酸、组氨酸所组成的组群的成员进行的保守性取代。于本文描述用于化学共轭的例举性市售可得试剂。
鞭毛蛋白中某些赖氨酸残基是存在功能域(功能域1)中，且可能对于TLR5的活化可是重要的。例如，于SEQ ID NO812的位置58、135、160及410的赖氨酸残基是存在功能域1中。衍生化此类赖氨酸残基以(例如)化学共轭抗原，可减低TLR5生物活性，而因此减少由TLR5介导的固有免疫反应。
可经取代的赖氨酸残基可包括参与TLR5活化的赖氨酸残基。位于基序N(SEQ ID NO812的氨基酸95-108)及/或基序C(SEQ ID NO812的氨基酸441-449)中的赖氨酸残基，可适合进行取代。将鞭毛蛋白中某些赖氨酸残基(例如，位于氨基酸位置19、41的赖氨酸)取代以(例如)精氨酸、丝氨酸或组氨酸，可维持鞭毛蛋白与TLR5的结合，且让其它赖氨酸可用于与其它分子，例如抗原(如蛋白质)或另一种分子(如另一种蛋白质、肽或多肽)化学共轭。
得自鼠伤寒沙门氏杆菌的鞭毛蛋白的F41片段的X-射线结晶构造，显示鞭毛蛋白的功能域结构(山马帝，F.A等人，Nature 410321(2001))。全长鞭毛蛋白含有4个功能域，命名为D0、D1、D2与D3。此等功能域其中三者有在结晶构造中显示，因为该结构是以全长鞭毛蛋白的蛋白分解片段制得。鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白对于此等区域的氨基酸序列，相对于SEQ ID NO812的编号列示于下 D0含有区域A1至A55及S451至R494 D1含有区域N56至Q176及T402至R450 D2含有区域K177至G189及A284至A401 D3含有区域Y190至V283 SEQ ID NO812的适合以(例如)精氨酸、组氨酸或丝氨酸取代的例举性赖氨酸，可包括 D0含有2个赖氨酸残基；K19、K41 D1含有4个赖氨酸残基；K58、K135、K160与K410 D2含有14个赖氨酸残基；177、179、292、308、317、326、338、348、357、362、369、378、384、391 D3含有8个赖氨酸残基；203、215、221，228、232、241、251、279。
适于取代的例举性赖氨酸残基，包括位于SEQ ID NO812的位置58、135、160及410的赖氨酸(杰契里，S.G.等人J.Bacteriol.1854243(2003)；唐奈里，M.A.等人，J.Biol.Chem.27740456(2002))。所述序列是得自网址为http://us.expasy.org/sprot/的Swiss-Prot蛋白质知识库。可经修饰的赖氨酸残基以a*标示出。
SEQ ID NO816适于取代的例举性赖氨酸残基，可包括 D0-具有两个赖氨酸于位置20、42； D1-具有五个赖氨酸于位置59、136、161、414、422； D2-具有十六个赖氨酸于位置177、182、189、299、319、325、328、337、341、355、357、369、381、390、396、403及 D3-具七个赖氨酸于位置209、227、234、249、271、281、288。
在另一实施方式中，本发明为一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在又另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
在另一实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
于一额外的实施方式中，本发明为一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
于一其它实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
本发明的另一实施方式，为一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物给药予该个体的步骤，其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个半胱氨酸残基，位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
本发明的另一实施方式，为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种其包括为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物给药予该个体的步骤，其中该钟样受体激动剂组成包括至少一个，位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处的半胱氨酸残基，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
在另一实施方式中，本发明为一种包含其包括血细胞凝集素成熟剪切位点的至少一部分的抗原组成与其包括钟样受体激动剂(例如，至少一种选自由钟样受体1激动剂、钟样受体3激动剂、钟样受体5激动剂、钟样受体6激动剂、钟样受体7激动剂及钟样受体9激动剂所组成的组群的成员)的激动剂组成的组合物，其中该钟样受体激动剂不为钟样受体2激动剂(例如，外膜蛋白复合体(OMPC)，如脑膜炎双球菌的OMPC)。血细胞凝集素成熟剪切位点可包括至少一种选自由流感A血细胞凝集素成熟剪切位点、流感B血细胞凝集素成熟剪切位点与流感C血细胞凝集素成熟剪切位点所组成的组群的成员。
在一项实施方式中，本发明组合物的抗原组成与激动剂组成可为融合蛋白质的组成。在另一项实施方式中，是将抗原组成化学共轭至激动剂组成。激动剂组成包括一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。抗原组成进一步包括基质-2蛋白的至少一部分，其可进一步包括第二激动剂组成，其包括第二种钟样受体激动剂的至少一部分(例如，至少一种选自由钟样受体2激动剂、钟样受体3激动剂、钟样受体4激动剂、钟样受体5激动剂、钟样受体6激动剂、钟样受体7激动剂及钟样受体9激动剂所组成的组群的成员的至少一部分)。基质-2蛋白可经融合至该第二激动剂组成，或化学共轭至第二激动剂组成。
“抗原组成”用于本文意指某一种抗原的一部分或整体。
“激动剂组成”用于本文意指某一种激动剂(例如钟样受体激动剂)的一部分或整体。
在一项额外的实施方式中，本发明为一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种包含其包括血细胞凝集素成熟剪切位点的至少一部分的抗原组成与其包括钟样受体激动剂的激动剂组成的组合物给药予该个体的步骤，其中该钟样受体激动剂不为钟样受体2激动剂。
在一项其它的实施方式中，本发明为一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包含其包括血细胞凝集素成熟剪切位点的至少一部分的抗原组成与其包括钟样受体激动剂的激动剂组成的组合物给药予该个体的步骤，其中该钟样受体激动剂不为钟样受体2激动剂。
在另一项实施方式中，本发明为一种其包括经融合(例如以重组方法)至或化学共轭至鞭毛蛋白、鞭毛蛋白成分或于其中铰链区已被缺失的鞭毛蛋白中的铰链区的至少一部分的HA抗原的至少一部分(例如成熟剪切位点)；及经融合(例如以重组方法)至，或化学共轭至鞭毛蛋白或鞭毛蛋白成分，例如，于鞭毛蛋白或鞭毛蛋白成分的氨基-或羧基-端的M2e蛋白的至少一部分的组合物(参见，例如图77)。
在一项额外的实施方式中，本发明包括与本发明蛋白质、多肽及肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％及至少约99％序列同一性的蛋白质、肽及多肽。
两氨基酸序列(或两核酸序列)间的百分比同一性，可通过将序列依最适比对的目的进行校准(例如，可将间隙导入第一序列的序列中)而测定得。然后比对位于相对应位置的氨基酸序列或核酸序列，而两序列间的百分比同一性为由所述序列共享的相同位置数目的函数(亦即，％同一性＝相同位置的#/位置的总#x 100)。可为比对的目的进行校准的蛋白质或核酸编码长度，为参考序列(例如，HA(如HA1-1、HA1-2)、融合蛋白质、抗原或多肽的蛋白质部分的核酸序列)长度的至少30％，较佳地至少40％，更佳地至少50％，甚至更佳地至少60％，且甚至更佳地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。
两序列的实际比对可通过已熟知的方法，例如使用数学算法来完成。此类数学算法的一项较佳、非限制性实例，是经描述于卡林等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877(1993)，其完整教示是以引用方式纳入本文)。此一算法是并入如薛佛等人(核酸研究(Nucleic Acids Res.)，292994-3005(2001)，其完整教示是以引用方式纳入本文)所述的BLASTN及BLASTX程序(2.2版)中。当使用BLAST与Gapped BLAST程序时，可使用个别程序(例如，BLASTN；可利用于国家生物技术信息中心的网际网址)的预设参数。在一项实施方式中，所搜寻的数据库为无冗余(NR)数据库，且用于序列比对的参数可设定于无滤器；预期值为10；文字大小为3；矩阵为BLOSUM62；且间代价(Gap Cost)具有存在值为11及延伸值为1。
另一种用于序列比对的数学算法为麦尔斯与米勒(CABIOS(1989)，其完整教示是以引用方式纳入本文)的算法。此类算法是被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序为GCG(Accelrys，圣地亚哥，加州)序列校准软件包的一部分。当使用ALIGN程序进行比对氨基酸序列时，是使用PAM120加权残基表，间隙长度罚则为12，及间隙罚则为4。其它用于序列比对的算法为该项技艺中已知，且包括如托瑞里斯与罗布提(Comput.Appl.Biosci.，103-5(1994)，其完整教示是以引用方式纳入本文)所述的ADVANCE与ADAM；及经描述于皮尔森与利普曼(Proc.Natl.Acad.Sci USA，852444-2448(1988)，其完整教示是以引用方式纳入本文)的FASTA。
两氨基酸序列间的百分比同一性，亦可使用GCG软件包(Accelrys，圣地亚哥，加州)中的GAP程序，使用Blossom 63矩阵或PAM250矩阵，及间隙加权为12、10、8、6或4及长度加权为2、3或4来完成。在另一实施方式中，两核酸序列间的百分比同一性，可使用GCG软件包(Accelrys，圣地亚哥，加州)中的GAP程序，使用间隙加权为50及长度加权为3来完成。
编码本发明的HA、多肽或融合蛋白质的一部分及本发明多肽的核酸序列，可包括于选择性杂交条件(例如高严苛性杂交条件)下与本发明核酸序列或本发明核酸序列的互补体(例如SEQ ID NOS53-58、64、68、71、72、73、76、78、80、84、87、104、107、110、111、112、115、116、117、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、137、139、142、143、146、147、150、167、184、185、186、187、188、189、190、191及192)以及编码本发明氨基酸序列与融合蛋白质(例如，SEQ ID NOS89-92、95、151-160、177、209、210及211)的核酸序列杂交的核酸序列。用于本文，术语“于低严苛度下杂交”、“于中严苛度下杂交”、“于高严苛度下杂交”或“于非常高严苛度下杂交”是描述用于核酸序列的杂交与漂洗的条件。关于进行杂交反应(可包括水性及非水性方法)的导引可参见，现今分子生物学提案(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威利父子，N.Y.(1989)，其完整地以引用方式纳入本文。
对于需要高选择性的应用，可使用相对上较高严苛度条件来形成杂交体。于用于一些基于膜的杂交作用的溶液中，添加有机溶剂(例如甲酰胺)可令反应能在较低温度下发生。高严苛度条件为(例如)相对上较低的盐类及/或较高的温度条件。高严苛度是通过约0.02M至约0.10M NaCl，于约50℃至约70℃的温度下提供。高严苛度条件允许两序列之间发生配错数量有限。为达到较低严苛度条件，可增加盐类浓度及/或可减低温度。中严苛度是于盐类浓度为约0.1至0.25M NaCl，及约37℃至约55℃的温度下达成，而低严苛度是于盐类浓度为约0.15至0.9M NaCl，及从约20℃至约55℃的温度温度范围下达成。用于杂交的组成与条件，为习于该项技艺人士已熟知，且经回顾于奥舒贝尔等人(1997，分子生物学的简短提案(Short Protocols in MolecularBiology)，约翰威利父子，纽约N.Y.，单元2.8-2.11、3.18-3.19与4-64.9)。
“个体”用于本文可为哺乳动物，例如灵长类或囓齿类(例如大鼠、小鼠)。在特别的实施方式中，个体为人类。
“有效量”当关于本发明组合物及融合蛋白质的量时，是指当其给药予个体时，为足以产生治疗功效的量(例如，足以刺激个体内免疫反应的量)的组合物及融合蛋白量或剂量。本发明的组合物及融合蛋白可以单剂或以多剂给药。
本发明的方法可通过以肠道或非经肠道方式，给药本发明的组合物及融合蛋白而完成。特别地，给药途径是经由口服摄入(例如，饮料、片剂、胶囊形式)或肌肉内注射该组合物及融合蛋白。其它给药途径亦包含于本发明，包括静脉内、真皮内、关节内、腹膜内或皮下途径，及鼻部给药。亦可使用栓剂或经皮贴布。
本发明的组合物及融合蛋白，可活体外给药予个体的自身树突细胞。于树突细胞暴露至本发明的组合物及融合蛋白之后，可将所述树突细胞给药予该个体。
本发明的组合物及融合蛋白可单独给药，或可共给药予患者。共给药意欲包括同时或依序给药个别或呈组合的本发明组合物、融合蛋白或多肽。在本发明的组合物及融合蛋白是个别地给药的情形下，给药形式可在时间上彼此足够靠近(例如，组合物的给药时间与融合蛋白的给药时间接近)，以使对于刺激个体内免疫反应的功效为最大。亦设想到多重给药途径(例如，肌肉内、口服、真皮内)可用于给药本发明的组合物及融合蛋白。
本发明的组合物及融合蛋白可单独或呈与习知赋形剂(例如适于肠道或非经肠道应用的医药上(或生理上)可接受的有机或无机载剂物质，其不会与抽出物有害地反应)的掺合物。适宜的医药上可接受载剂包括水、盐类溶液(诸如林格氏溶液)、醇类、油类、明胶与碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯类、羟甲基纤维素与聚乙烯基吡咯烷酮。此类制剂可经灭菌，且(若希望)与诸如润滑剂、防腐剂、安定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐类、缓冲液、着色剂及/或芳香性物质等不会与本发明的组合物、融合蛋白或多肽有害地反应的辅助剂混合。若希望，亦可将制剂与其它用以减少代谢降解的活性物质组合。本发明的组合物及融合蛋白，可通过口服给药(例如呈一种饮料)，肌肉内或腹膜内注射，或经鼻内递送方式进行给药。组合物及融合蛋白单独，或当与掺合物组合时，可以单剂或多于一剂给药一段时间，以赋予所希望的功效(例如，减轻预防病毒感染，减轻病毒感染例如流行性感冒或黄病毒感染的症状)。
当需要或希望非经肠道施用时，特别适用于组合物及融合蛋白的掺合物为可注射、无菌溶液(较佳地为油性或水性溶液)，以及悬浮液、乳液或植入物(包括栓剂)。尤其，用于非经肠道给药的载剂包括，右旋糖水溶液、食盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯嵌段聚合物等。安瓿为方便的单位剂量。亦可将组合物、融合蛋白或多肽并入脂质体中，或经由经皮帮浦或贴布给药。适用于本发明的医药掺合物为习于该项技艺人士所熟知，且经描述于(例如)制药科学(Pharmaceutical Sciences)(第17版，马克出版公司(Mack Pub.Co.)，伊斯顿，PA)及WO 96/05309，其教示是以引用方式纳入本文。
本发明的组合物及融合蛋白可于用以将本发明组合物、融合蛋白与多肽展现予个体的免疫系统，而于个体内产生免疫反应的撑体上给药予个体。本发明组合物、融合蛋白与多肽的展现，将较佳地包括暴露出病毒蛋白的抗原性部分，以产生抗体。本发明组合物、融合蛋白与多肽的组成(例如，PAMP与病毒蛋白)，在撑体上的物理位置是彼此靠近。可将本发明的组合物及融合蛋白，通过共价或非共价性连接，而接附至该撑体上。较佳地，该撑体为生物可兼容性。“生物可兼容性”用于本文意指该撑体于个体中不产生免疫反应(例如，制造抗体)。撑体可为生物可分解性基质载剂，例如聚合物珠粒或脂质体。撑体可进一步包括明矾或适宜的佐剂。撑体可为病毒(例如腺病毒、痘病毒、阿伐病毒)、细菌(例如沙门氏杆菌)或核酸(例如质粒DNA)。
给药予个体的剂量与频率(单剂或多剂)，可视各种不同因素，包括先前暴露至某一抗原、病毒蛋白，病毒感染的持续期，先前的病毒感染治疗，组合物、融合蛋白或多肽的给药途径；个体的尺寸、年龄、性别、健康、体重、身体质量指数与饮食；病毒暴露、病毒感染及引起感染的特定病毒(例如，黄病毒、流感病毒)的特性及病征程度，或另一抗原(例如流感抗原)的治疗或感染，同时进行治疗的种类，因病毒暴露引起的并发症，病毒性感染或显露，或其它健康-相关的问题而有所变化。其它治疗摄生法或剂可用于与本发明的方法及组合物、融合蛋白或多肽结合。例如组合物及融合蛋白的给药可伴随其它病毒治疗剂或剂的使用，以治疗与暴露至该抗原，例如黄病毒感染相关或因其造成的病症(例如，高烧、麻痹、DHF、脑膜脑炎)或流行性感冒感染。已确定剂量(例如频率与时间长短)的调整及操作，是属习于该项技艺人士的能力所及。
流感病毒为属于正黏液病毒科的单股RNA病毒。流感病毒分成三类型(A、B、C)，取决于其在病毒的核糖核蛋白(RNP)及基质(M)抗原的抗原性差异。流感A病毒于自然界会感染人类与数种其它哺乳动物(包括猪与马)，及许多各种禽类物种，并于人类族群中造成传染病与流行病。流感B病毒于自然界似乎仅感染人类，而可造成人类的传染病。流感C病毒已经从人类与猪分离得，但是一般不会发生传染病，且在人类通常导致温和的疾病。
成熟的流感病毒颗粒有包膜包覆，具有多型结构，粒径范围从80至120nm。单股RNA基因组与螺旋核蛋白紧密缔合，且以七个(流感C)或八个(流感A与B)分开的核糖核蛋白(RNP)节段存在，各必须存在以成功进行病毒复制。分节的基因组包封在外脂蛋白包膜内。基质蛋白1(MP1或于本文亦称作“M1”)排列于外脂蛋白包膜的内侧，并与RNP结合。
血细胞凝集素(HA)是一种位于病毒(例如，流感病毒)上的表面糖蛋白，其负责结合至宿主细胞上的N-乙酰基神精氨酸(NeuNAc；于本文亦称作“唾液酸”)与后续的病毒与宿主膜的融合。HA以其能够造成红血球结块或凝集的效能而获得其名。流感HA为由三个单体(HA0)亚单位组成的三聚体。HA于感染过程中执行两种重要的功能与细胞膜唾液酸寡糖受体结合，及病毒与宿主膜的融合。在HA三聚体与宿主细胞膜结合后，宿主细胞膜将病毒卷入内体中，并企图通过将内体的内部酸化而消化其中的内容物，并将其转运至宿主细胞中的溶酶体。然而，溶酶体的酸性环境使HA不安定，导致HA0部分伸展露出蛋白酶-敏感位点(成熟剪切位点)，其会被宿主蛋白酶剪切而形成通过单一二硫键连结的HA1与HA2亚单位(威利，D.C.等人，Annu.Rev.Biochem.56365-394(1987))。剪切发生于特定氨基酸残基，并产生疏水性氨基末端(对于HA2亚单位)。此HA2的疏水性末端介导病毒包膜与宿主细胞的内体膜间的融合，并将病毒颗粒的内容物释放至细胞质中，此过程称作脱去外壳。因此，HA的剪切为感染性所必需。
已测定出数种病毒血细胞凝集素的晶体结构(参见，例如威尔森，I.A.等人，自然(Nature)289366-373(1981)；陈，J.等人，细胞95409-417(1998)；哈，Y.等人，The EMBO Journal 21865-875(2002)；鲁塞尔，R.J.病毒学325287-296(2004)；及柯克斯，N.J.等人，于托普立与威尔森的微生物学及微生物感染(Toply and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections)，B.W.J马帝等人编着，卷1(第9版)纽约，NY，牛津大学出版，第32章，p.634(1998))。X-射线晶体学结构显示，HA是折叠成两个结构组成或功能域-球状头部与纤维状柄(参见，例如图1)。球状头部包括HA1，其包括HA1与唾液酸结合的部分(亦称作“受体结合位点或功能域”或“唾液酸结合位点或功能域”)及反平行β-折板。纤维状柄较接近病毒膜，且由整个HA2与HA1的部分组成，包括HA1与HA2间的剪切位点。
已知有十五种流感A HA的亚型(H1-H15)，彼等共有约40至约60％序列同一性(世界卫生组织BULL.世界卫生组织(World Health OrganizationBULL.World Health Organ.)，58585-591(1980))。已经从禽类(H5、H7与H9)、马(H3与H7)、海豹(H3、H4与H7)、鲸(H1与H13)及猪(H1、H3与H9)分离出含有全部15HA亚型的流感病毒。流感A病毒的亚型一般是根据HA的特定抗原性抗原决定基(H，15主要型)及神经氨酸酶(N，约9主要型)命名。例如，亚型包括流感A(H2N1)、A(H3N2)、A(H5N1)、A(H7N2)、A(H9N2)、A(H1/H0)、A(H3/H0)与A(H5/H0)。于最近百年内，有三种亚型造成流行H1于1918与1977；H2于1957及H3于1968。于1997年，H5禽类病毒及于1999年，H9病毒导致香港地区爆发呼吸道疾病。源自B型流感病毒的HA已经从人类及海豹分离出，而未将其区分成亚型。
经流感病毒感染的宿主可能发动一种对抗HA球状头部的抗体反应，其通过阻断HA与宿主细胞间的相互作用，亦即中和该病毒的感染性，而保护该宿主后续不再被同一品系病毒感染。由于流感病毒RNA复制的正确性低且速率高，病毒恒定地进行HA基因的次要突变，其仍保留球状头部结构及宿主细胞作用，但可能使后代病毒逃脱免疫系统监视。此等定点突变称的为“抗原漂移(antigenic drift)”。此外，若单一宿主同时被两不同品系的流感A病毒感染，则可能因为重配或不同品系的流感A病毒间交换RNA节段(或基因)，而导致萌生新的病毒亚型。因重配而萌生的病毒将新抗原性经验呈现给人类免疫系统，其通常会造成高罹病率与死亡率。此类型激烈的抗原性改变称作“抗原性移转(antigenic shift)”。因为B型流感病毒几乎排他地仅于人类流通，故此等病毒无法进行与动物品系的重配，而因此只通过抗原漂移发生改变。
对HA的免疫性可降低感染的可能性，及若已确实发生感染时的疾病严重性。HA为重要的抗原性标靶，且疫苗的有效性取决于疫苗株与流通株的抗原性配对。因为血细胞凝集素蛋白容易进行抗原性移转及漂移以躲避宿主的免疫防御，故传统疫苗必须以正在流通的流感病毒株为基础并每年更新。每年更新流感病毒疫苗不仅代价昂贵，彼等亦需要大量制造时间与制造基础建设。基于病毒非变异区的疫苗组合物，可提供广范围交叉反应性保护作用。
与HA球状头部相反，在HA成熟剪切位点附近的氨基酸残基的改变，会因功能束缚而受限制。HA成熟剪切位点附近的氨基酸残基影响识别，及因此该位点由宿主蛋白酶剪切的可剪切性。因为病毒不编码该蛋白酶，故改变成熟剪切位点附近的氨基酸残基是受到限制。结果，一段跨越成熟剪切位点的大约20个氨基酸的肽，在相同HA亚型的流感病毒间在基因上仍保持稳定(WO2004/080403；班奇等人，J Virol 797380-7388(2005))或呈分歧的肽类(荷瓦斯等人，Immunol Letters 60127-136(1998)，那吉等人，Scand J Immunol40281-291(1994))。
A型流感病毒的第二高度固有抗原为基质2蛋白的胞外功能域(M2e)。M2为以低水平表达于成熟病毒颗粒中的97-氨基酸蛋白质，并且在被感染的细胞中水平高出甚多。M2蛋白形成同元四聚体，其功能为一种对于病毒复制为必要的离子通道，因此，M2e中的突变并不如HA中的突变耐受性一样高。24-氨基酸胞外功能域(M2e)在多数A型流感病毒株具有高度保守性。于哺乳动物中，天然形式的M2e为低度致免疫性的。于A型流感病毒感染的动物模型中，针对M2e的抗体可给予被动保护(崔诺，J.J.等人，J Virol 641375(1990)；刘，W.P.等人，Immunol Lett 93131(2004))，并非通过中和病毒及防止感染性，而是通过杀死受感染细胞及摧毁病毒的生命周期(齐贝迪，S.L.等人，J.Virol.622762(1998)；杰格勒，A.N.等人，J Immunol 1725598(2004))，其可通过抗体-依赖性NK细胞活性达成(杰格勒，A.N.等人，J Immunol 1725598(2004))。包括M2e蛋白的组合物可限制流感A疾病的严重性，同时使宿主免疫反应能发展出对于优势中和性流感抗原(HA)的适应免疫性。
用以管控因流感病毒感染造成的感染与疾病的策略，在过去四十年中并无显著改变。由于流感病症的季节特性、威胁人类族群的流感病毒的不同类型(A与B)、及各型病毒的基因不稳定性，故每年必需基于流行病学预测将于即将到来的流感季节中在人类族群可能流通的品系，重新调制多价疫苗。疫苗是从所选择原型病毒株储备物，生长于含胚胎鸡蛋中而制得。因此，目前的策略具有数种限制，包括(a)仰赖对于将流通品系的不确定预测；(b)依赖可使适当病毒株生长于鸡蛋中的能力；(c)基于鸡蛋的生产系统具有产品发生污染的危险；(d)于鸡蛋中生产的产物不能用于对鸡蛋过敏的个体；及(e)典型多价疫苗不会给予能对抗人类族群对其并无预先存在的免疫性的病毒传染品系的保护的明显危险。
目前可利用的流感疫苗的主要保护性组成为病毒血细胞凝集素(HA)。较有效的疫苗可能不仅包括品系特异性HA，亦包括交叉保护性抗原，例如M2e及成熟剪切位点。较目前以鸡为基础的方法更可信赖、具经济效益且可扩大规模的疫苗制造方法亦为较佳。本发明的组合物、融合蛋白与多肽提供包括HA、M2e与流行性感冒蛋白的成熟剪切位点的组合物，其可刺激免疫反应，特别地，个体内针对多个流行性感冒抗原的保护性免疫反应。
本文所引述的所有专利案、公开申请案及参考文献的教示，皆完整地以引用方式纳入本文。
实施例 实施例1设计A型流感病毒天然血细胞凝集素的部分 材料与方法 设计对于A/波多黎各/8/34(H1N1)的HA1-1、1-2及1-3球状头部构建体。流感病毒株A/波多黎各/8/34(PR8)为A型流感病毒已经十分特征化的小鼠-适应株。使用成熟PR8HA(SEQ ID NO1)(甘柏林等人，2005科学3031838-1842；PDB登录号1RU7)的确定晶体结构，结合分子模型制作数据库，决定出三个PR8球状头部构建体的边界。A型流感病毒血细胞凝集素分子的已解出晶体结构的完整列表，可参见蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)或国际生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)构造网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/构造)。
PR8 HA的三维晶体结构是使用Cn3D程序于NCBI网站中察看。三聚体HA分子具有蘑菇形状。球状头部是指位于血细胞凝集素分子顶端，组装成蘑菇头部的部分，而卷曲螺旋型柄部是指，该分子组装成蘑菇柄的底部(图1)。球状头部含有与细胞表面的唾液酸结合的底物结合位点，而因此对于病毒进入是重要的。此外，大多数中和性抗体抗原表位是位于靠近且包围此底物结合位点，使球状头部成为保护性疫苗的良好标靶物。球状头部含有与大部分HA1肽，其包括(例如)于PR8中的标号从E51至K327的残基。
PR8链A的单体结构(其涵括球状头部)，是用于导引设计PR8HA1-1、1-2及1-3构建体(图1)。所述HA构建体是经设计为在球状头部内具有功能域边界，以使当该分子在宿主细胞中表达时，所编码的蛋白质能于试管内自发性折叠或伸展，以模拟天然的构型。蛋白质内的结构功能域(于本文亦称作“功能域”)为，整体结构中具自我安定性，且往往独立于该蛋白质链其它部分进行折叠的组件。大多数功能域可归类成折叠。许多功能域并非由单一基因或单一基因家族制造的蛋白质所特有，而是出现在各种蛋白质中。功能域往往因为彼等于其所属蛋白质的生物功能中扮演重要角色，而被命名或独立出来；例如，血细胞凝集素的底物结合功能域可参与与底物的结合。因为功能域可自我安定，故功能域能在某一蛋白质与另一蛋白质间进行交换，或通过遗传工程与其它载体蛋白缔合，而制造出嵌合型蛋白质。功能域可由无、一段或许多结构基序组成。在流感病毒血细胞凝集素构建体设计的个案中，是保留许多结构基序。边界选择是通过已知晶体结构来指导。于PR8的个案，从E51至K327的残基(SEQ ID NO1)折叠成，一种可与HA分子其它部分辨别的紧密结构，而因此为用于设计HA构建体的焦点区域。
设计对于A/越南/1230/2004(H5N1)的HA1-1、1-2及1-3球状头部构建体。用于设计越南/1230/2004(H5N1)球状头部构建体中作为参考的HA结构，是经描述于史提芬斯等人，2006，科学312404-410(MMDB编号38730；PDB登录号2FK0)。如前文关于PR8球状头部构建体所述，使用成熟A/VietNam/1203/2004HA(SEQ ID NO2)的已公开晶体结构，结合分子模型制作数据库，决定出三个越南球状头部构建体的边界。将用于保留该结构功能域的二级与三级结构相同的构造标准，应用于设计所述越南构建体。虽然不同血细胞凝集素分子，其包含血细胞凝集素的残基性质或数目可能不相同；整体构造却十分相似。因此，设计越南球状头部构建体的功能域边界，需要将边界放置于与HA分子的结构上相当，但数字上不同的位置。
设计对于A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)的HA1-1、1-2及1-3球状头部构建体。印度尼西亚HA的晶体结构尚未被解出。一般，当所给定HA分子的晶体结构尚未被解出时，可使用具有最高同一性的可取得结构来导引构建体设计。于设计印度尼西亚球状头部构建体的个案中，最接近的可取得结构为A/越南/1203/2004(史提芬斯等人，2006.科学312404-410；MMDB编号38730；PDB登录号2FK0)，其与A/印度尼西亚/5/2005为同一亚型。
为设计此HA的球状头部构建体，首先将印度尼西亚HA(SEQ ID NO3)的一级序列与A/越南/1203/2004HA(H5VN；SEQ ID NO2)分子进行校准(一级序列同一性96.13％)。A/越南/1203/2004HA(H5VN；SEQ ID NO2)与A/印度尼西亚/5/2005(H5IN；SEQ ID NO3)的一级序列校准，是使用CLUSTALW进行且列示于下，其中(*)星号＝同一性，()冒号＝保守性取代；(.)句点＝弱保守性取代；及(空格)＝趋异性取代。50 H5IN MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE H5VN MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE *******:****************************************** 100 H5IN KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN H5VN KKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN *.************************************************* 150 H5IN PTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSA H5VN PVVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSA *.*******.******************************.**** ***** 200 H5IN CPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA H5VN CPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA **** *..********************:********************** 250 H5IN AEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK H5VN AEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK ****:**********:***********:********************** 300 H5IN PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA H5VN PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA ****************************:********************* 350 H5IN INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFG H5VN INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFG **************************************** ********* 400 H5IN AIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNS H5VN AIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNS ************************************************** 450 H5IN IIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN H5VN IIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN ************************************************** 500 H5IN ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRN H5VN ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRN ***********************************************:** 550 H5IN GTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMA H5VN GTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVA ***:********************************************:* 568 H5IN GLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO3) H5VN GLSLWMCSNGSLQCR---(SEQ ID NO2) *************** 设计对于A/新喀里多尼亚/20/1999(H1N1)的HA1-1、1-2及1-3球状头部构建体。新喀里多尼亚HA的晶体结构尚未被解出。为设计此HA的球状头部构建体，首先将新喀里多尼亚HA(H1NC；SEQ ID NO4)的一级序列，与相同亚型的两种其结构已被解出的密切相关HA分子(一级序列同源性>85％)，特别是H1N1 1918病毒(与A/南卡罗来那/1/18相同)(SEQ ID NO5)及A/波多黎各/8/34病毒(H1PR8；SEQ ID NO1)(甘柏林等人，科学303，1838-42(2004))进行校准。A/南卡罗来那/1/18MMDB编号26943，PDB登录号1RUZ；及PR8，MMDB编号26941与PDB登录号1RU7。一级序列校准是使用CLUSTALW进行且列示于下，其中(*)星号＝同一性，(:)冒号＝保守性取代；(.)句点＝弱保守性取代；及(空格)＝趋异性取代。 50 H1N CMKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL H1PR8 MKANLLVLLSALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLL ***:*****.:::*: **********************************100 H1NC EDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP H1PR8 EDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETP ********* **********:*.:***:******:*:. .*********150 H1NC NPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSA H1PR8 NSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTA 　 *.*** **** * ******************************...**:* 200 H1NC SCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPPN H1PR8 ACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPN :***:************* *:* **:*.:****:* ********:***** 250 H1NC IGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLL H1PR8 SKEQQNIYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLL :*: :*:.********:*:*.********:******* **:******* 300 H1NC EPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQG H1PR8 KPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG :**************** ******************.*.**::***** * 350 H1NC AINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIA H1PR8 AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNTPSIQSRGLFGAIA *******:**:************************* ************* 400 H1NC GFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIE H1PR8 GFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNTVIE **********:***********************************:*** 450 H1NC KMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERT H1PR8 KMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERT *** *************:******************************** 500 H1NC LDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGC-------------------- H1PR8 LDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTY ****************************** 550 H1NC -------------------------------------------------- H1PR8 DYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAIS 565 H1NC ---------------(SEQ ID NO4) H1PR8 FWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO1) 设计对于A/威斯康辛/67/2005(H3N2)的HA1-1、1-2及1-3球状头部构建体。威斯康辛HA的晶体结构尚未被解出。为设计此HA的球状头部构建体，首先将威斯康辛HA(H3Wis；SEQ ID NO6)的一级序列，与相同亚型的一种其结构已被解出的密切相关HA分子(一级序列同一性81.16％)，特别是A/X31亚型H3N2(H3X31；SEQ ID NO7)(PDB登录号1VIU)进行校准。威斯康辛HA序列是使用CLUSTAL W与A/X31 HA校准且列示于下，其中(*)星号＝同一性，(:)冒号＝保守性取代；(.)句点＝弱保守性取代；及(空格)＝趋异性取代。X31中的各氨基酸经发现，于A/威斯康辛/67/2005序列中具有相对应的配对。接着使用X31结构的功能域边界鉴认在A/Wisconsin/67/2005的功能域边界。 50 H3Wis QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGG H3X31 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGK *.**********************:*****:******************100 H3Wis ICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPY H3X31 ICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPY **:.**:**** :***********:** ***:.**********:******150 H3Wis DVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNNSFFSR H3X31 DVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVIQNGGSNACKRGPGSGFFSR ******************** *.*.**** *** *.**** ....**** 200 H3Wis LNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFLHAQASG H3X31 LNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGIHHPSTNQEQTSLYVQASG *****: .**.********::********:***.*:::* *:.**** 250 H3Wis RITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGN H3X31 RVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGN *:****:*****:******** :*:.**************:*:***.** 　　　　　　　　　　　　　　 300 H3Wis LIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI H3X31 LIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKI *********:*:************..* ********************:* 329 H3Wis TYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR(SEQ ID NO6) H3X31 TYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQT-(SEQ ID NO7) ******:********************* 结果 PR8 HA构建体的功能域边界的描述。所选择的边界功能域是于下列序列(SEQ ID NO1)中强调如下HA1-1边界是加单下划线(SEQ ID NO1的S53-R324)；

边界是加双下划线(SEQ ID NO1的K62-S284)；HA1-3边界是加粗下划线(SEQ ID NO1的N101-G276)。各亚单位设计与边界功能域的详细描述，请参见下文。
60 MKANLLVLLSALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCR 120 L

QLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE 180 QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNS 240 YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQA 300 GRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFG

NASMHECNTKCQTPLG 360 AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGM 420 IDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRM 480 ENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGC 540 FEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLESMGIYQILAIYSTVASSL 565 VLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO1) PR/8HA1-1构建体(SEQ ID NO8)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO1的位置59的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO1的位置319的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留四(4)个固有二硫键。所保留的二硫键列示如下SEQ ID NO1的C59-C291；C72-C84；C107-C152及C295-C319。使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO1的位置53的丝氨酸，其紧邻由SEQ IDNO1(LED)的残基50-52所形成的卷曲转角。该截短完全消去由SEQ ID NO1的残基44-49[THSVNL(SEQ ID NO214)]所形成紧接于前的β-股。该股跨越SEQ ID NO1的残基53-58[SHNGKL(SEQ ID NO215)]，且保留与SEQ IDNO1的残基59-62[CRLK(SEQ ID NO216)]缔合的完整β-股。虽然于构造中SEQ ID NO1的残基53-58[SHNGKL(SEQ ID NO215)]被界定为无规则卷曲，但此等残基模拟β-股而因此供进一步稳定由SEQ ID NO1的残基307-310[PYQN，SEQ ID NO217]，及SEQ ID NO1的残基320-323[PKYV，SEQ ID NO218]所界定的β-折板。羧基末端截短是于跨越SEQ ID NO1的残基324-327[RSAK，SEQ ID NO219]的无规则卷曲中，于SEQ ID NO1的位置324的精氨酸处造成，以使与HA2作用的羧基末端完全消除。
PR/8HA1-2构建体(SEQ ID NO9)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO1的位置72的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO1的位置152的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留二(2)个固有二硫键(SEQ ID NO1的C72-C84与C107-C152)。使用前述所引用的晶体结构及MMD数据库鉴定三级与二级结构，氨基末端与羧基末端截短是位于连接两组不同β-折叠的环[KGI，SEQ ID NO1的残基62-64与NASMHE(SEQ ID NO220)，SEQ ID NO1的残基285-290]中。于此等环中的分子截短保留周围的二级结构，其后续可保持球状头部的三级结构。
氨基末端截短是于SEQ ID NO1的位置62的赖氨酸处造成，以使包含位于远离膜的β-股组的SEQ ID NO1的残基65-70，的APLQLG(SEQ ID NO221)的β-股保持完整，而较接近膜的紧接于前的β-股[CRLK，SEQ ID NO216，residues 59-62 of SEQ ID NO1]大部分被消除。羧基末端截短是于SEQ ID NO1的位置284的丝氨酸处造成，以使远程β-股组的β-股[GIITS，SEQ ID NO222，SEQ ID NO1的残基280-284]仍保持完全或大部分完整，而近端β-股组的后续β-股[CNTK，SEQ ID NO223，SEQ ID NO1的残基291-294]被完全或大部分消除。保留远程β-股组，为选择HA1-2构建体的功能域边界的主要决定因素。远程β-折叠(其包含APLQLG(SEQ ID NO221)[SEQ ID NO1的残基65-70]、SYIVET(SEQ ID NO224)[SEQ ID NO1的残基94-99]与GIITS(SEQ ID NO222)[SEQ ID NO1的残基280-284]的β-股)作用为，稳定可确保紧密功能域结构的安定性二级结构组件。
PR/8HA1-3构建体(SEQ ID NO10)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO1的位置107的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO1的位置152的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留一(1)个固有二硫键(SEQ ID NO1的C107-C152)。使用前述所引用的晶体结构及MMDB数据库鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是于SEQ ID NO1的位置101的天冬酰胺造成，致使紧接于前的α-螺旋[NIAGWLLG，SEQ ID NO225，SEQ ID NO1的残基73-80]与β-股[SYIVET，SEQ ID NO224，SEQ ID NO1的残基94-99]完全被清除，同时保留后续的β-股[PGDFI，SEQ ID NO226，SEQ ID NO1的残基109-113]，及股NSENGICY，SEQ ID NO227[SEQ ID NO1的残基101-108]，其包括位于SEQ ID NO1的位置107的固有半胱氨酸。
羧基末端截短是于近β-股[AFALSRGF，SEQ ID NO228，SEQ ID NO1的残基270-277]的终点处造成。此股的最后一个氨基酸(SEQ ID NO1的位置277)为苯丙氨酸，其被消除而不致于暴露出此疏水性残基。羧基末端截短是于SEQ ID NO1的位置276的甘氨酸处造成，其介于两二级结构之间。于此位置截短保持紧接于前的β-股[AFALSRG，SEQ ID NO229，SEQ ID NO1的残基270-276]大部分完整，且完全消除后续的β-股[GIITS，SEQ ID NO222，SEQ ID NO1的残基280-284]。
VN04HA构建体的功能域边界的描述。所选择的边界功能域是于下列序列(SEQ ID NO2)中强调如下HA1-1边界是加单下划线(SEQ ID NO2的E50-K323)；

边界是加双下划线(SEQ ID NO2的G62-E284)；HA1-3边界是加粗下划线(SEQ ID NO2的N103-G276)。各亚单位设计与边界功能域的详细描述，请参见下文。
60 MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDL 120 D

LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHL 180 LSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSY 240 NNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSG 300 RMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDS

LEYGNCNTKCQTPMGA 360 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGW 420 QGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLE 480 RRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELG 540 NGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVA 565 SSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCR(SEQ ID NO2) VN04 HA1-1构建体(SEQ ID NO11)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO2的位置58的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO2的位置318的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留四(4)个固有二硫键。所保留的二硫键列示如下SEQ ID NO2的C58-C290；C71-C83；C106-C151及C294-C318。使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO2的位置50的谷氨酸，如此使紧接于前的β-股[THAQDI，SEQ ID NO230，SEQ ID NO2的残基43-48]被完全消除，而后续的股[EKKHNG，SEQ ID NO231，SEQ ID NO2的残基50-55]，及由SEQ ID NO2的残基56-61所形成的β-股仍保留完整。于结构上，包含SEQ ID NO2的残基50-55[EKKHNG，SEQ ID NO231]的无规则肽，仿真完成膜-远程β-折叠的β-股，以使该功能域结构保持完整。羧基末端截短是于靠近SEQ ID NO2的残基323-326[KSNR，SEQ ID NO233]的环区域(其接在SEQID NO2的位置318的半胱氨酸后)中造成。此环内的截短保留，其中由SEQID NO2的残基319-322[PKYV，SEQ ID NO234]所形成的紧接于前的β-股仍然完整，而后续β-股[LVLATG，SEQ ID NO235，SEQ ID NO2的残基327-332]完全被消除的二级结构。
VN04HA1-2构建体(SEQ ID NO12)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO2的位置71的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO2的位置151的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留二(2)个固有二硫键(SEQ ID NO1的C71-C83与C106-C151)。使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO2的位置62的甘氨酸，如此使后续包含SEQ ID NO2的残基64-68[KPLIL，SEQ ID NO236]的β-股仍然完整，而紧接于前的β-股[KLCDLD，SEQ ID NO232，SEQ IDNO2的残基56-61]完全被消除。
为保留二级结构，羧基末端截短是于SEQ ID NO2的位置284的谷氨酸的环区域中造成，以使紧接于前的β-股[TIMKS，SEQ ID NO237，SEQ ID NO2的残基279-283]仍然完整，而后续β-股[YGNCN，SEQ ID NO238，SEQ ID NO2的残基287-291]完全被消除。
VN04HA1-3构建体(SEQ ID NO13)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO2的位置106的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO2的位置151的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留一(1)个固有二硫键(SEQ ID NO2的C106-C151)。
使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO2的位置103的天冬酰胺，如此使紧接于前的β-股[SYIVEK，SEQ ID NO239，SEQ ID NO2的残基93-98]完全被消除，而后续β-股[PGDFN，SEQ ID NO240，SEQ ID NO2的残基108-112]保持全部或大部分完整。为保留二级结构，羧基末端截短是于SEQ ID NO2的位置276的甘氨酸的无规则卷曲区域中造成，以使由SEQ ID NO2的残基102-105[KGDS，SEQ ID NO241]所形成的紧接于前的β-股仍保持全部或大部分完整，紧接于前的β-股[EYAYKIVK，SEQ ID NO242，SEQ ID NO2的残基267-274]完全被保留，而后续β-股[TIMKS，SEQ ID NO237，SEQ ID NO2的残基279-283]完全被消除的二级结构。
IND05HA构建体的功能域边界的描述。A/印度尼西亚/5/2005构建体描述是以参照A/越南/1203/2004结构的序列校准为基础。所选择的边界功能域是于下列序列(SEQ ID NO3)中强调如下HA1-1边界是加单下划线(SEQ ID NO3的E50-K323)；

边界是加双下划线(SEQ ID NO3的G62-E284)；HA1-3边界是加粗下划线(SEQ ID NO3的N103-G276)。各亚单位设计与边界功能域的详细描述，请参见下文。60 MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDL120 D

LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPTNDLCYPGSFNDYEELKHL180 LSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSY240 NNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSG300 RMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDS

LEYGNCNTKCQTPMGA360 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGW 420 QGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLE 480 RRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELG 540 NGCFEFYHKCDNECMESIRNGTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVA 560 SSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO3) IND05 HA1-1构建体(SEQ ID NO14)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO3的位置58的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO3的位置318的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留四(4)个固有二硫键。所保留的二硫键列示如下SEQ ID NO3的C58-C291；C71-C83；C106-C151及C294-C318。使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO3的位置50的谷氨酸，如此使紧接于前的β-股[THAQDI，SEQ ID NO243，SEQ ID NO3的残基43-48]被完全消除，而后续的股[EKTHNG，SEQ ID NO244，SEQ ID NO3的残基50-55]，及由SEQ ID NO3的残基56-61所形成的β-股[KLCDLD，SEQ ID NO245]仍保留完整。于结构上，包含SEQ ID NO3的残基50-55[EKTHNG，SEQ ID NO244]的无规则肽，仿真其完成膜-远程β-折叠的β-股，以使该功能域结构保持完整。羧基末端截短是于靠近SEQ ID NO3的残基323-326[KSNR，SEQ ID NO246]的环区域(其接在SEQ ID NO3的位置318的半胱氨酸后)中造成。此环内的截短，保留其中由SEQ ID NO3的残基319-322[PKYV，SEQ ID NO247]所形成的紧接于前的β-股仍然完整，而后续β-股[LVLATG，SEQ ID NO248，SEQ ID NO3的残基327-332]完全被消除的二级结构。
IND05 HA1-2构建体(SEQ ID NO15)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO3的位置71的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO3的位置151的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留二(2)个固有二硫键(SEQ ID NO3的C71-C83与C106-C151)。使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO3的位置62的甘氨酸，如此使后续包含SEQ ID NO3的残基64-68[KPLIL，SEQ ID NO249]的β-股仍然完整，而紧接于前的β-股[KLCDLD，SEQ ID NO245，SEQ IDNO3的残基56-61]完全被消除。为保留二级结构，羧基末端截短是于SEQ IDNO3的位置284的谷氨酸(位于[ELE，SEQ ID NO3的残基284-286]中)的环区域中造成，以使紧接于前的β-股[AIMKS，SEQ ID NO250，SEQ ID NO3的残基279-283]仍保持全部或部分完整，而后续的β-股[YGNCN，SEQ ID NO251，SEQ ID NO3的残基287-291]完全被消除。
IND05 HA1-3构建体(SEQ ID NO16)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO3的位置106的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO3的位置151的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留一(1)个固有二硫键(SEQ ID NO3的C106-C151)。使用前述所引用的晶体结构及分子模型制作数据库(MMDB)鉴定三级与二级结构，氨基末端截短是位于SEQ ID NO3的位置103的天冬酰胺，如此使紧接于前的β-股[SYIVEK，SEQ ID NO252，SEQ ID NO3的残基93-98]完全被消除，而后续的β-股序列[PGSFN，SEQ ID NO253，SEQ ID NO3的残基108-112]保持全部或大部分完整。为保留二级结构，羧基末端截短是于SEQ ID NO3的位置276的甘氨酸的无规则卷曲区域中造成，以使紧接于前的β-股[EYAYKIVK，SEQ ID NO254，SEQ ID NO3的残基267-274]完全被保留，而后续的β-股[AIMKS，SEQ ID NO250，SEQ ID NO3的残基279-283]完全被消除。
新喀里多尼亚HA构建体的功能域边界的描述。A/新喀里多尼亚/20/199构建体描述是以参照A/波多黎各/8/34结构的序列校准为基础。所选择的边界功能域是于下列序列(SEQ ID NO4)中强调如下HA1-1边界是加单下划线(SEQ ID NO4的S53-R324)；

边界是加双下划线(SEQ ID NO4的K62-S284)；HA1-3边界是加粗下划线(SEQ ID NO4的N101-G276)。各亚单位设计与边界功能域的详细描述，请参见下文。
60 MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCL 120 L

QLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELRE 180 QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKS 240 YVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQE 300 GRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFG

NAPMDECDAKCQTPQG 360 AINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGM 420 VDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRM 480 ENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGC 540 FEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSL 565 VLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO4) 新喀里多尼亚HA1-1构建体设计(SEQ ID NO17)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO4的位置59的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO4的位置319的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留四(4)个固有二硫键。所保留的二硫键列示如下SEQ ID NO4的C59-C291；C72-C84；C107-C152及C295-C319。使用参考晶体结构与MMDB检查二级结构，氨基末端截短是于SEQ ID NO4的位置53的丝氨酸造成，如此使紧接于前的β-股[THSVNLLED，SEQ ID NO255，SEQ ID NO4的残基44-52]被完全消除，而后续的β-股SHNGKL，SEQ ID NO256[SEQ ID NO4的残基53-58]，及APLQLG，SEQ IDNO257[SEQ ID NO4的残基65-70]仍保留全部完整。该于无规则卷曲序列[SHNGKL，SEQ ID NO256，SEQ ID NO4的残基53-58]中的氨基末端截短，可使二级结构大部分保持完整，因为其模拟使β-折叠完整的β-股。羧基末端截短是于无规则卷曲序列[RSAK，SEQ ID NO258，SEQ ID NO4的残基324-327]中的SEQ ID NO4的位置324的精氨酸(其接在SEQ ID NO4的位置319的半胱氨酸后)处造成。于此无规则卷曲内的截短，是通过使紧接于前的β-股[PKYV，SEQ ID NO259，SEQ ID NO4的残基320-323]保持全部完整，而后续的β-股[LRMVTG，SEQ ID NO260，SEQ ID NO4的残基328-333]完全被消除，而保留该二级结构。
新喀里多尼亚HA1-2构建体设计(SEQ ID NO18)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO4的位置72的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO4的位置152的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留二(2)个固有二硫键(SEQ IDNO4的C72-C84与C107-C152)。使用参考晶体结构与MMDB检查二级结构，氨基末端截短是于SEQ ID NO4的位置62的赖氨酸造成，如此使包含[SHNGKLCLLKGI，SEQ ID NO261，SEQ ID NO4的残基53-64]的无规则卷曲序列部分或大部分被移除，紧接于前的β-股[THSVNLLED，SEQ ID NO255，SEQ ID NO4的残基44-52]被完全消除，而后续的β-股[APLQLG，SEQ ID NO257，SEQ ID NO4的残基65-70]仍保留全部完整。羧基末端截短是于SEQ IDNO4的位置284的丝氨酸处造成，以使紧接于前的β-股[SGIITS，SEQ ID NO262，SEQ ID NO4的残基279-284]仍保留全部完整，而后续的无规则卷曲[NAPMDECDA，SEQ ID NO263，SEQ ID NO4的残基285-293]完全或大部分被消除。
新喀里多尼亚HA1-3构建体设计(SEQ ID NO19)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO4的位置107的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ ID NO4的位置152的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留一(1)个固有二硫键(SEQ IDNO2的C107-C152)。使用参考晶体结构与MMDB检查二级结构，氨基末端截短是于SEQ ID NO4的位置101的天冬酰胺造成，以使紧接于前的β-股[SYIVET，SEQ ID NO264，SEQ ID NO4的残基94-99]被完全消除，而后续的β-股[PGYFA，SEQ ID NO265，SEQ ID NO4的残基109-113]仍保留全部完整。为保留二级结构，羧基末端截短是于SEQ ID NO4的位置276的甘氨酸造成，以使β-股序列[YAFALSRGF，SEQ ID NO266，SEQ ID NO4的残基269-277]完全被保留，而后续的β-股序列[SGIITS，SEQ ID NO262，SEQ IDNO4的残基279-284]被消除。
A/威斯康辛/67/2005HA构建体的功能域边界的描述。A/威斯康辛/67/2005构建体描述是以参照A/X31结构的序列校准为基础。所选择的边界功能域是于下列序列(SEQ ID NO6)中强调如下HA1-1边界是加单下划线(SEQ ID NO6的Q44-K310)；

边界是加双下划线(SEQ ID NO6的S54-D271)；HA1-3边界是加粗下划线(SEQ ID NO6的S95-G263)。各亚单位设计与边界功能域的详细描述，请参见下文。60 QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGIC

LD120 GENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF180 NDESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIW 240 GVHHPGTDNDQIFLHAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPG 300 DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKS

APIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI 329 TYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR(SEQ ID NO6) A/威斯康辛/67/2005HA1-1构建体设计(SEQ ID NO20)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO6的位置52的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ IDNO6的位置305的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留四(4)个固有二硫键。所保留的二硫键列示如下SEQ ID NO6的C52-C277；C64-C76；C97-C139及C281-C305。使用参考晶体结构与MMDB检查二级结构，氨基末端截短是于SEQ ID NO6的位置44的谷氨酸(其紧接于由SEQ ID NO6的残基42与43[LV]所形成的紧密转角之后)造成，以使紧接于前的β-股[TNATE，SEQ IDNO267，SEQ ID NO6的残基37-41]被完全消除，而由残基QSS[SEQ ID NO6的44-46]形成的整个短β-股被保留。羧基末端截短是于无规则卷曲序列[PRYVK，SEQ ID NO268，SEQ ID NO6的残基306-310](其接在SEQ ID NO6的位置305的半胱氨酸后)中造成，以使该与HA2作用的羧基端尾部被完全去除。虽然羧基末端序列[PRYVK，SEQ ID NO268，SEQ ID NO6的残基306-310]被界定为无规则卷曲，但于构造上其是供作为进一步稳定，由SEQ IDNO6的残基44-46[QSS]及SEQ ID NO6的残基293-297[PFQNV，SEQ ID NO269]所界定的β-折叠的额外β-股。此组β-折板包含位于一安定二级结构组件中的氨基末端与羧基末端，以确保紧密功能域结构。
A/威斯康辛/67/2005HA1-2构建体设计(SEQ ID NO21)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO6的位置64的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ IDNO6的位置139的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留二(2)个固有二硫键(SEQ ID NO6的C64-C76与C97-C139)。使用参考晶体结构与MMDB检查二级结构，氨基末端截短是于连接两组不同β-折叠的环中造成。氨基末端截短是于SEQ ID NO6的位置54的丝氨酸处造成，以使膜-远程β-股组的包含SEQ IDNO6的残基57-62[QILDGE，SEQ ID NO270]的β-股仍保持完全完整，而膜-近端β-股[GGICD，SEQ ID NO271，SEQ ID NO6的残基49-53]被完全消除。羧基末端截短是于SEQ ID NO6的位置271的天冬氨酸造成。于此位置的截短，保留以使膜-远程β-股[SSIMRS，SEQ ID NO272，SEQ ID NO6的残基265-270]仍然全部完整，而膜-近端β-股[APIGK，SEQ ID NO273，SEQ ID NO6的残基272-276]被消除的二级结构。包含β-股QILDGE(SEQ ID NO270)[SEQ ID NO6的残基57-62]、LFVER(SEQ ID NO274)[SEQ ID NO6的残基86-90]与SSIMRS(SEQ ID.NO272)[SEQ ID NO6的残基265-270]的膜-远程β-折叠，是供作为确保紧密功能域结构的安定性二级结构。
A/威斯康辛/67/2005HA1-3构建体设计(SEQ ID NO22)。对于此构建体，是通过在SEQ ID NO6的位置97的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于SEQ IDNO6的位置139的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留一(1)个固有二硫键(SEQ ID NO2的C97-C139)。使用参考晶体结构与MMDB检查二级结构，氨基末端截短是于SEQ ID NO6的位置95的丝氨酸处造成，以使紧接于前的α-螺旋[TLIDALLG，SEQ ID NO275，SEQ ID NO6的残基65-72]被完全消除，而SEQ ID NO6的位置95的丝氨酸，及SEQ ID NO6的位置96的天冬酰胺，与SEQ ID NO6的位置97的半胱氨酸一起被保留。羧基末端截短是于无规则卷曲序列中，在大约SEQ ID NO6的位置263的甘氨酸处造成，以使该含有SEQ ID NO6的残基261-263[RSG]的无规则卷曲序列仍保持全部或部分完整，同时紧接于前的β-股[RGYFKI，SEQ ID NO276，SEQ ID NO6的残基255-260]被全部保留，而后续的β-股[SSIMRS，SEQ ID NO272，SEQ ID NO6的残基265-270]完全被清除。
讨论 流感病毒血细胞凝集素(HA)蛋白的部分球状头部功能域，可产生中和性抗体(布蓝德(Brand)与史奇尔(Skehel)，1972；艾克特(Eckert)，1973；杰克森(Jackson)等人，1979；鲁斯(Russ)等人，1981)，且此功能域的分开、球状结构被认为是构成可经表达于细菌与再折叠，或从真核宿主表达及分泌出的蛋白质片段，由此免除在制造全长HA蛋白时，已经面临的表达与纯化上的问题。
融合至STF2、HA1-1(SEQ ID NO8、11、14、17、20)的最大HA构建体(于本文亦称作“HA片段”)，涵括天然(野生型)HA1头部功能域的大部分或几乎整个球状区域。天然HA1片段与从病毒粒子于有限蛋白分解时，所释出的HA1-1构建体非常相似(比兹邦(Bizeband)等人，1995)。因此，结构分析与实验数据暗示，HA1-1构建体应该有效进行折叠(不论其是于细菌或真核细胞中制造)，并维持安定的类天然结构。同样，预期整个HA0，由HA1与HA2组成但排除信号肽(17aa)之外，位于病毒膜外面的HA分子外部分(SEQID NO23)，位于病毒膜内的内部肽(12aa)及跨膜功能域(24aa)，当表达于真核宿主时应保有其天然构型，或当表达于细菌时，于试管内可经再折叠成天然状态。两较小的HA片段(HA1-2(SEQ ID NO9，12，15，18，21)与HA1-3(SEQID NO10，13，16，19，22))，以可使所成的蛋白质片段去安定(HA1-3)，或将一些大的疏水性残基的侧链露出(HA1-2)的方式，截短头部功能域距离受体结合位点远程的区域。为此，遂将实验性突变作用导入HA1-2与HA1-3构建体，命名为HA1-2mut(SEQ ID NO24，26，28，30，32)及HA1-3mut(SEQ ID NO25，27，29，31，33)。于HA1-3mut(SEQ ID NO25，27，29，31，33)构建体中进行的取代，是将位于相对股上仍然由HA1-3截短暴露出的具相反电荷残基导入。“HA mut”用于本文意指，存在天然HA中的氨基酸已经被，并未发生于该天然HA的氨基酸取代。经取代的残基可形成盐桥，并稳定其可能或不然折叠差(或全然不折叠)的结构。例如，于PR8中，G105是以谷氨酸置换，而Y115是经赖氨酸取代(SEQ ID NO25)。带负电性电荷的谷氨酸与带正电性电荷的赖氨酸作用，使能通过与位于分子中心SEQ ID NO25的短螺旋15-22[NSENEICY，SEQ ID NO277]，的N-末端的赖氨酸15的电荷-电荷相互作用，来稳定SEQ ID NO25的N-端肽1-8。对于HA1-2构建体，截短可导致暴露出疏水性侧链，其不预期会减少蛋白质表达。然而，露出的残基可能造成所表达蛋白质的聚集，或使所表达蛋白质不安定。为避免聚集并增加所表达分子的安定性，遂将该些变为暴露出的大的疏水性残基，以较中性的氨基酸取代，而产生HA1-2mut(SEQ ID NO24，26，28，30，32)。此等取代基可使蛋白质更顺应强韧的操作程序，及/或具有长期安定性。
实施例2设计B型流感病毒天然血细胞凝集素的部分 材料与方法 设计对于B/Lee/40的HA1-1、1-2及1-3球状头部构建体。于设计流感B HA疫苗的结构考虑，是与所述关于A型流感病毒者相似，亦即，必须鉴定出HA球状头部的功能域边界，以使鞭毛蛋白-HA融合蛋白质能正确地折叠，或正确地再折叠而露出适当的抗原性抗原表位。不似流感A，流感B HA上无法取得已十分确定的X-射线结晶构造，因此较难明确地界定球状头部的功能域边界。于是，必须基于生物信息学与结构模型，来预测流感B HA模式(童等人，2004.J.Gen.Virl.85，3249-3259)。此等研究是使用“知识为基础的”方略，其仰赖得自蛋白质数据库的已知结构，与标靶未知结构间的高度序列同源性。一般，此方略以已知与标靶蛋白质间具有至少35％序列同一性最有利。
于流感B的个案中，最接近的模式来自A/猪/香港/9/98(SEQ ID NO34)(24％同一性，PDB登录密码1JSD)与A/Aichi/2/68(SEQ ID NO35)(21％同一性，PDB登录密码1HGF)。虽然标靶模式B/Lee/40HA(SEQ ID NO36)与已知模板模式间的序列同一性，实际上低于所希望的最小值35％，但尽管彼等的序列分歧(H1、H3、H5与H9共有仅18％序列同一性)，流感A HA蛋白质的功能与三级折叠的密切相似性，暗示有可能使用流感A HA模式成功预测流感B HA结构。而且，流感C HEF(血细胞凝集素-酯酶-融合)蛋白的折叠与流感A HA结构相似，尽管其序列同一性甚至低于任何A/B比对。
因为流感C HEF的晶体结构为已知(PDB登录号1FLC，MMDB登录号12663)，故童等人包括C HEF与已知流感A HA蛋白间结构同一性的知识，来预测流感B HA结构。童等人首先将得自C/约翰内斯堡/1/66的HEF序列(SEQ ID NO37)，与得自A型流感病毒的各别15HA亚型的一种序列(http://flu.lanl.gov)使用CLUSTALW(汤普生等人，1994.Nucleic Acids Res 22，4673-4680)进行校准，并以结构-通告校准为基础编纂图谱。
捕获并指定保守性二级结构特征，以及各型及各亚型间，因年份与宿主种类造成的变异。然后彼等进一步校准扩增的A/C图谱，至流感B HA序列(包括B/李/40)的校准。使用童(1999)的同源性模型制作技术构建B/李/40模式。
简言的，彼等首先将标靶物的主链接构，与模板的主链接构于所校准区域中进行配对。将标靶物中相对于模板的插入片段，视为具有已知末端结构的环来处理。将预期结构展开，顺应模板中相对于标靶物的插入片段。通过使用有效蒙地卡罗环-取样法制作环的主链接构模型(童，1997；刘等人，1998)。一旦将主链接构模型制作模型后，便将侧链原子接上。因为HA分子的头部紧密，故可供放置侧链原子的空间有限。因此，于该分析中，将侧链扭转角初始化至等于或近似于模板结构中者。此考虑特别可用于避免模制结构中各侧链间的冲突。最后，将全-原子模型通过使用AMBER(威能(Weiner)等人，1986)，进行短程能量最小化回合(1000循环)，以释出较不利的立体作用并使立体化学最适化。通过PROCHECK(威尔森等人.1998.J.MolBiol.276，417-436)检查标靶物模型的质量，而功能性是通过底物停靠(substrate docking)测试该模型底物结合位点是否能顺应天然底物类似物唾液酸乳糖(如吾等可于A/爱知/2/68的HA晶体结构中所观察到者(威斯等人.1988.自然333，426-431))来进行检验。所仿真的B/李/40模型在Ramachandran图(威尔森等人.1998.J.MolBiol.276，417-436)中显示似乎合理，且当使唾液酸-2-3-乳糖分子停靠入B/李/40模型的底物结合位点时，显示无立体空间上的冲突，表示其具有正确立体化学。于是，使用该B/李/40模型导引流感B HA亚单位疫苗的设计。
结果与讨论 B/李/40HA构建体的功能域边界的描述。所选择的边界功能域是于下列序列中强调如下HA1-1边界是加单下划线(SEQ ID NO36的T48-K340)；

边界是加双下划线(SEQ ID NO36的K60-G299)。各亚单位设计与边界功能域的详细描述，请参见下文。 60 MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANL
120

GKLCPNCFNCTDLDVALGRPKCMGNTPSAKVSILHEVKPATSGCFPIMHDRTKIR 180 QLPNLLRGYENIRLSTSNVINTETAPGGPYKVGTSGSCPNVANGNGFFNTMAWVIPKDNN 240 KTAINPVTVEVPYICSEGEDQITVWGFHSDDKTQMERLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVS300 QIGGFPNQTEDEGLKQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGR

S 360 LPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKE 420 RGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNYLSELE 480 VKNLQRLSGAMNELHDEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALE 540 RKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGDFSLPTFDSLNITAASLND 584 DGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIVYMVSRDNVSCSICL(SEQ.ID NO36) 所仿真的B/Lee/40模型的同等物，可于蛋白质数据库中以存取密码1TX1取得。pdb档是通过使用VAST(载体校准搜寻工具)搜寻(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html)，转换成MMDB(分子模型制作数据库)格式。然后通过Cn3D察看1TX1结构的模型，并将结构以MMDB格式储存。基于设计流感A HA1-1与HA1-2构建体所使用的相同原理，通过检验该模型结构，精确定出B/李/40HA1-1与HA1-2的功能域边界。B/李/40HA1-1(SEQ ID NO38)包括抗原表位集中的球状顶端、膜远程β-折板及位于该膜远程β-折板下方的额外β-夹层。HA1-1的氨基末端起始于SEQ ID NO36的残基48，而终止于残基340(TTTPTK(SEQ ID NO279)...-...CPIWVK(SEQ ID NO280))。B/Lee/40HA1-2(SEQ ID NO39)是通过自HA1-1移出β-夹层而设计。HA1-2起始于SEQ ID NO36的残基60，而终止于残基299(KGTQTR(SEQ ID NO281)...-...SKVIKG(SEQ ID NO282))。为确定边界选择，亦使用其它独立方法。所使用的第一种方法为一级序列校准。将A/爱知/2/68(SEQ ID NO35)的序列与B/李/40(SEQ ID NO36)序列进行校准。校准出A/爱知/2/68HA1-1(SEQ ID NO40)的边界(残基60-326QSSSTG(SEQ ID NO283)...-...CPKYVK(SEQ ID NO284))及HA1-2(SEQID NO41)的边界(残基72-287；HRILDG(SEQ ID NO285)...-...SIMRSD(SEQID NO286))与B/李/40的密切相合，支持该使用所仿真模型的边界选择。进行残基调整以避免暴露初疏水性残基与构建体的两端。因此，3-维结构预测与一级序列校准非常符合。
所使用的第二种方法为二级结构预测。功能域边界一般是位于环或转角区域中，而不会侵入诸如α-螺旋及β-折板等二级结构组件中甚多，尤其是α-螺旋束或β-折板的中心。将此条件用于重复检查，由所仿真的3-D结构造成的边界选择，是否符合独立二级结构预测。使用程序PHD(http://ca.expasy.org/tools→蛋白体学与序列分析工具→二级与三级结构工具→预测蛋白质)进行二级结构预测。除了HA1-2羧基-末端残基中两个与短α-螺旋(5氨基酸)重叠者之外，所有其它边界残基皆落于环区域中，表示为合理的边界选择。PHD结果列示如下，其中AA为氨基酸序列；OBS_sec为观察到的二级结构H＝螺旋，E＝延展折板，空白＝其它(环)；PROF_secPROF所预测的二级结构H＝螺旋，延展(折板)，空白＝其它(环)，PROF＝PROF图谱网络预测海德堡；Rel_secPROFsec预测的可信度指数(0＝低至9＝高)。
对于简略表示，强预测由′*′标示；SUB_secPROFsec预测的次组，对于所有残基具有预期的平均准确度>82％。注意对于此次组是使用下列符号L为环(其使用上标′′)；.意指此残基未作预测，由于可信度为Rel<5；O_3_acc所观察到的相对溶剂可及性(acc)于3状态下b＝0-9％，i＝9-36％，e＝36-100％；P_3_accPROF所预期的相对溶剂可及性(acc)于3状态下b＝0-9％，i＝9-36％，e＝36-100％；Rel_accPROFacc预测的可信度指数(0＝低至9＝高)。
对于简略表示，强预测由′*′标示；SUB_secPROFsec预测的次组，对于所有残基具有预期的平均相关>0.69％(主项表格)。
注意对于此次组是使用下列符号 I为中间体(其使用上标＂) .意指此残基未作预测，由于可信度为Rel<4。....，....1....，....2....，....3....，....4....，....5 AA MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTT OBS sec PROF sec EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE Rel sec 90456542111257762677454037753444441276147765653203 SUB sec L..EEE......LLLL.EEE.E...LLL........LL..EEEEEE.... O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc ee bbbbbbbbbeeb bbbbbbb eeee b bb eeebe b bbbe Rel acc33169997521111032778921201222233322135234021321012 SUB acc...bbbbbb........bbbb................e..b......... ....，....6....，....7....，....8....，....9....，....10 AAPTKSHFANLKGTQTRGKLCPNCFNCTDLDVALGRPKCMGNTPSAKVSILH OBS sec PROF sec EEEE EEEEEEEEEE Rel sec 67752200245344675222033211232342043234337875203787 SUB sec LLLL......L...LLL.......................LLLL...EEE O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc eee bbe eeeeeee eb bbbbbbbbb b b ee eeeeb bbb Rel acc 23201011020002300210201031223343310100210221541265 SUB acc ..............................b.............eb..bb ....，....11.1.，....12.1.，....13.1.，....14.1.，....15.1 AAEVKPATSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTSNVINTETAPGGPY OBS sec PROF sec EE HHHHHHHHHHHEEEEE EE Rel sec50566441224778858887664221002304663021003444556531 SUB sec E.LLL......LLLLHHHHHHH..........EE..........LLLL.. O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc b eeee bbbbb e b ebbebbee eebeeeeee Rel acc 12210110221001337264350314531332301200011120132011 SUB acc ................e.bi.b...be....................... ....，....16.1.，....17.1.，....18.1.，....19.1.，....20.1 AAKVGTSGSCPNVANGNGFFNTMAWVIPKDNNKTAINPVTVEVPYICSEGED OBS sec PROF sec HHHHHHHHHHH EEEEEE Rel sec 24431001255662036787888752378864236641012244157874 SUB sec .........LLLL...HHHHHHHHH..LLLL...LL.........LLLL. O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc bbbbbbee ee bbbbbbb bbeeeee ee ebeb b beee Rel acc 11111012110301026314921522122321112112322203203212 SUB acc ................b..bb..b..............................，....21.1.，....22.1.，....23.1.，....24.1.，....25.1 AA QITVWGFHSDDKTQMERLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTE OBS sec PROF sec EEEEEEEEHHHHHH EEEEE EEEEEEEE Rel sec 47897532588742544320368853775200122343201275331035 SUB sec .EEEEE..LLLL..H......LLLL.EEE.............LL.....L O 3acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3acc bbbbbbbbb eeeeb eeeeeeb b b e e eebee b e Rel acc 19696993033223122210203213224011122211311001202001 SUB acc .bbbbbb.....................b.........................，....26.1.，....27.1.，....28.1.，....29.1.，....30.1 AA DEGLKQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGS OBS sec PROF sec EEEEEEEEEEEEEEE EEE EEEEEEEEE Rel sec 56754320377888983577247886434023022235520330245401 SUB sec LLLL.....EEEEEEE.LLL..EEEE...........EE.......E... O 3accbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3acceee bbbbbbb bbbb ee b b bbbbbb bb b eeb bbe e Rel acc 17211105270744553301222473010244520230221020211103 SUB acc .e.....b.b.bibbb.......ib.....bbb................. ....，....31.1.，....32.1.，....33.1.，....34.1.，....35.1 AALPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTK OBS sec PROF sec HHHHHHHH HHHHH Rel sec32233333000113432246764334340342334133220003551573 SUB sec...................LLL......................HH.LL. O 3acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3acc ee e bb ee b bbbebbe be bb bbbbb Rel acc10010011112110110111101210102102111021712452461321 SUB acc......................................b..bb.bb.... ....，....36.1.，....37.1.，....38.1.，....39.1.，....40.1 AA YRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLK OBS sec PROF secEEEEHHHH EEEEE H Rel sec 56853211324203110113404531100120021023564325530623 SUB sec LLLL...................L..............LL...EE..L.. O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc b eee be bbbbbbbbbbbbbb bbbbbbbbbbbbbb bbbbbbb e Rel acc 00011411202355999999623520456353043010011315264032 SUB acc .....e......bbbbbbbbb..b..bbb.b..b.........b.bb.......，....41.1.，....42.1.，....43.1.，....44.1.，....45.1 AA STQEAINKITKNLNYLSELEVKNLQRLSGAMNELHDEILELDEKVDDLRA OBS sec PROF sec HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHH Rel sec 47888989873212477733101234446677898888878756210111 SUB sec .HHHHHHHHH.....HHH..........HHHHHHHHHHHHHHHH...... O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc bbbebbeebbe b bbee beebeeb ebbeebbe beeb eebee Rel acc 28049825725342322312063124534063444467553254223101 SUB acc .b.ebb.eb.e.b........e...eb.e.b.ebbeibee..ee...... ....，....46.1.，....47.1.，....48.1.，....49.1.，....50.1 AADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFE OBS sec PROF sec HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH EEE Rel sec03645477777753464114550578879888887664424540663252 SUB sec..H.H.HHHHHHH..L....LL.HHHHHHHHHHHHHH....H..LL..E. O 3 accbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 accbbbb bb bbbbb eebb e e b eb e b e b e bee eebbbb Rel acc 04450592968651122001021323439443944173428232012340 SUB acc.bbb.bb.bbbbb.............i.bie.bie.b.e.b.......b. ....，....51.1.，....52.1.，....53.1.，....54.1.，....55.1 TKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGDFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILL(SEQIDNO AA 36) OBS sec PROF sec EEEE HHHHHHHHHHHH EEEEEEEEE EEEEE Rel sec22003402344311355466523223103101002476217776303665 SUB sec...............LL.LLL...............EE..LLLL...EEE O 3 accbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 accb beb e bbbbb bbbb ee eebbe beb bbeb eeeeeeb bbb Rel acc42120312620271012211330320211224131235303222133868 SUB acc b.......b...b..................e.....b.........bbb ....，....56.1.，....57.1.，....58.1.(SEQ ID NO36) AAYYSTAASSLAVTLMIAIFIVYMVSRDNVSCSICL OBS sec PROF sec EEEHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEEEEEEE Rel sec 4310021478888888776321006740346860 SUB sec ........HHHHHHHHHHH.....LL....EEE. O 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb P 3 acc bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbee eb b bbb Rel acc 6362366679999996998517101010152400 SUB acc b.b..bbbbbbbbbbbbbbb.b.......b.b.. 所使用的第三种工具为疏水性分析。一般，蛋白质的结构核心倾向于，为一种以亲水性残基的延伸为侧翼的疏水性丛聚。于是，所预测的边界不应位于疏水性核心中央，而是应该位于两翼亲水性区域中。使用ProtScale(http://ca.expasy.org/tools→一级结构分析→ProtScale)绘制B/李/40HA序列(SEQ ID NO36)的疏水性。B/李/40序列(SEQ ID NO36)的疏水性分析确定，所选择的边界是位于该蛋白质的亲水性区域(图2)。用于该图的疏水性强度，列示于下表 序列长度584
为鉴定其它流感B分子，例如B/马来西亚/2506/2004(SEQ ID NO42)、B/俄亥俄/1/2005(SEQ ID NO43)、B/维多利亚/2/87种是(SEQ ID NO787)及B/上海/361/2002(SEQ ID NO44)与B/山形/16/88种是(SEQ ID NO213)，的HA 1-1与HA1-2功能域边界，遂将各HA序列与B/李/40HA序列(SEQ ID NO36)进行校准。结果指出，流感B HA蛋白相较于流感A HA蛋白更加保守，特别是于功能域边界序列中。因此，使用于B/李/40鉴定得的边界，进行其它B型流感病毒株的直接边界选择。对于各品系的所得功能域边界概述于下。
B/马来西亚/2506/2004HA1-1 44-337(SEQ ID NO45)(TTTPTK(SEQ IDNO287)-CPIWVK(SEQ ID NO288))HA1-2 56-296(SEQ ID NO46)(KGTETR(SEQ ID NO289)-SKVIKG(SEQ ID NO290)) B/俄亥俄/1/2005HA1-1 33-326(SEQ ID NO47)(TTTPTK(SEQ ID NO291)-CPIWVK(SEQ ID NO292))HA1-2 45-285(SEQ ID NO48)(KGTKTR(SEQ ID NO293)-SKVIKG(SEQ ID NO294)) B/上海/361/2002HA1-1 33-325(SEQ ID NO49)(TTTPIK(SEQ ID NO295)-CPIWVK(SEQ ID NO296))HA1-2 45-284(SEQ ID NO50)(KGTRTR(SEQ ID NO297)-SKVIKG(SEQ ID NO298)) 50 BMa1 ----IVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTT BOhi ---------------DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTT BLee MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTT BSha ---------------DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTT*********************************** 100 BMal PTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSARVSILH BOhi PTKSHFANLKGTKTRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSAEVSILH BLee PTKSHFANLKGTQTRGKLCPNCFNCTDLDVALGRPKCMGNTPSAKVSILH BSha PIKSHFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILH * **********.*******.*:************ * *.***..****150 BMal EVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGSY BOhi EVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAEKAPGGPY BLee EVKPATSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTSNVINTETAPGGPY BSha EVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKALGGPY **:*.*************************:********::*.* **.* 200 BMal KIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTEGE BOhi KIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTEGE BLee KVGTSGSCPNVANGNGFFNTMAWVIPK-DNNKTAINPVTVEVPYICSEGE BSha RLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPK-DNNKNATNPLTVEVPYICTEGE ::********.:..*** ****.:** ****.* *.:*******:*** 250 BMal DQITVWGFHSDNEAQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQT BOhi DQITIWGFHSDSETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQT BLee DQITVWGFHSDDKTQMERLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQT BSha DQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQT ****:******.::** .*****:***********************:** 300 BMal EDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG BOhi EDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG BLee EDEGLKQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG BSha EDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKG ** ** *************.******.****:****************** 350 BMal SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGT BOhi SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGT BLee SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGT BSha SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGHCPIWVKTPLKLANGT **********************************:*************** 400 BMal KYRPPAKLLKER-------------------------------------- (SEQ ID NO42) BOhi KYRPPAKLLKERGF------------------------------------ (SEQ ID NO43) BLee KYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADL (SEQ ID NO36) BSha KYRP---------------------------------------------- (SEQ ID NO44)**** B/Lee/40HA1-1构建体(SEQ ID NO38)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO36的位置69的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于位置335的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留五(5)个固有二硫键。所述似真的双硫配对如下SEQID NO36的C69与C72、C75与C87、C109与C158、C195与C289、C309与C335。使用仿真结构与MMBD检查二级结构，氨基末端截短是于SEQ IDNO36的位置48的苏氨酸(其紧接于由SEQ ID NO36的脯氨酸46导入的β-股扭结随后接亮氨酸47之后)造成，以使紧接于前的β-股[TGVI，SEQ ID NO299，SEQ ID NO36的残基42-45]被完全消除，而由残基TTTP(SEQ ID NO300)[SEQ ID NO36的48-51]形成的整个短β-股被保留。羧基末端截短是于接着位置335的半胱氨酸后的β-股PIWV(SEQ ID NO301)[SEQ ID NO36的残基336-340]的末端造成，以使该与HA2作用的羧基端尾部被完全去除。包括C-末端β-股的六个β-股，形成由β-股PIWV(SEQ ID NO301)[SEQ ID NO36的残基336-340]、PYYTG(SEQ ID NO302)[SEQ ID NO36的残基322至326]与TTTP(SEQ ID NO300)[SEQ ID NO36的残基48-51](下方β-折叠)及β-股DCLHE(SEQ ID NO303)[SEQ ID NO38的残基308-312]、YGGLN(SEQ IDNO304)[SEQ ID NO36的残基314-318]与KAIGN(SEQ ID NO305)[SEQID NO36的残基330-334](顶端β-折叠)所界定的稳定β-夹层。此组β-折叠包括，位于一安定二级结构组件中的氨基末端与羧基末端。此等截短据相信产生一种紧密的功能域结构。
B/李/40HA1-2构建体(SEQ ID NO39)。对于此构建体，是通过在SEQ IDNO36的位置69的半胱氨酸前制造氨基端截短，及于位置289的半胱氨酸后制造羧基端截短，而保留四(4)个固有二硫键。使用仿真结构与MMBD检查二级结构，氨基末端截短是于氨基末端截短是于连接两组不同β-折叠的环中造成。氨基末端截短是于位置60的赖氨酸处造成，以使膜-远程β-股组的包含SEQ ID NO36的残基62-66[TQTRG，SEQ ID NO306]的β-股仍保持完全完整，而形成HA1-1部分的膜-近端β-股[TTTP，SEQ ID NO300，SEQ ID NO36的残基48-51]被完全消除。羧基末端截短是于SEQ ID NO36的位置300的丝氨酸造成。于此位置的截短，保留以使膜-远程β-股[KVIKG，SEQ ID NO307，SEQ ID NO36的残基295-299]仍然全部完整，而膜-近端β-股[DCLHE，SEQ IDNO308，SEQ ID NO36的残基308-312]被消除的二级结构。包含β-股TQTRG(SEQ ID NO306)[SEQ ID NO36的残基62-66]、SILHEV(SEQ ID NO309)[SEQ ID NO36的残基97-102]与KVIKG(SEQ ID NO307)[SEQ ID NO36的残基295-299]的膜-远程β-折叠，是供作为其据相信可结论成紧密功能域结构的安定化二级结构。
B/马来西亚/2506/2004、B/俄亥俄/1/2005及B/上海/361/2002依照如前述的相同参考结构。
实施例3重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质于大肠杆菌中的克隆与表现 材料与方法 流感AHA亚单位的克隆。单独克隆及表达得自数种A型流感病毒品系的HA球状头部亚单位，或呈与鞭毛蛋白的融合体。吾等亦将两种已广泛用于共轭疫苗中作为载体蛋白的蛋白质，与HA球状头部功能域融合表达。CRM-197为得自白喉杆菌的经突变白喉毒素(DTx)，及LTB为大肠杆菌热不稳定性肠内毒素的B亚单位。
此等构建体是以下列四种方法其中一种产生 方法#1于此提案中，是将包含鞭毛蛋白(STF2)(SEQ ID NO212)与HA亚单位的融合基因，进行密码子最适化用于大肠杆菌表达，并通过化学合成从商业供货商(DNA2.0Inc.，蒙罗公园，CA)购得。将基因以NdeI与BlpI酶切出，将插入片段经凝胶纯化并接合至，已经以NdeI与BlpI消化且以细菌碱性磷酸酶(BAP)处理的pET24a(诺瓦金(Novagen)，圣地亚哥，CA)。
方法#2为容易克隆与鞭毛蛋白融合的基因，遂产生含有位于鞭毛蛋白(STF2)基因(SEQ ID NO212)的3′端的独特BlpI切位的卡匣质粒。此是通过于STF2的核苷酸5’-GTGCTGAGCCTGTTACGT-3’(SEQ ID NO310)[SEQ IDNO212的nt1501至1518]导入缄默突变，于质粒卡匣pET24/STF2.blp(SEQ IDNO51)中产生独特BlpI切位而完成。将对于各标靶抗原的合成基因进行密码子最适化用于大肠杆菌表达，并从商业供货商(DNA2.0Inc.，蒙罗公园，CA)购得。将合成基因以BlpI酶切出，并经由可兼容端接合至，已经以BlpI及BAP处理的pET24/STF2.blp。
方法#3使用对于各构建体所指定的正向与反向引物(Keck FoundationBRLK，耶鲁大学，纽哈芬，CT；内地认证试剂公司(Midland Certified ReagentCo.)，内地，TX)，使用于各表中所列示的DNA模板进行PCR扩增。将PCR产物进行BlpI消化，经凝胶纯化并接合至，已预先通过BlpI消化及BAP处理制备得的pET24/STF2.blp(SEQ ID NO51)载体。
方法#4通过于STF2基因的3′端导入柔性七员肽连接子，Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser(S-G-S-G-S-G-S(SEQ ID NO311))，而产生质粒卡匣pET24/STF2.SG(SEQ ID NO52)。于肽连接子中产生一个独特BlpI切位，以助于克隆与鞭毛蛋白融合的HA亚单位片段。经密码子最适化用于大肠杆菌表达的合成基因，是从商业供货商(DNA2.0Inc.，蒙罗公园，CA)购得，将其以BamHI与BlpI限制内切核酸酶从母本质粒切出，并经由可兼容端接合至，已经以BlpI及BAP处理的pET24/STF2卡匣。
于各别个案中，所构建得的质粒是用于转化胜任大肠杆菌TOP10细胞，并通过PCR筛检与限制图谱制作分析鉴定所推测的重组体。通过DNA定序证明构建体的完整性，并将其用于转化表达宿主，BLR3(DE3)(诺瓦金，圣地亚哥，CA；Cat#69053)。转化株是于含有卡那霉素(50μg/mL)、四环素(5μg/mL)与葡萄糖(0.5％)的平板进行筛选。挑取菌落并接种入2ml补充以25μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素与0.5％葡萄糖的LB培养基中，并生长过夜。将等分的此等培养物用于接种以相同培养基调配的新鲜培养基，将其进行培养直到OD600＝0.6，此时通过添加1mM IPTG，及于37℃下培养3小时而诱导蛋白质表达。收取细胞并分析蛋白质表达。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过凝胶电泳术与免疫印迹分析，测定蛋白质表达及同一性。将细胞经由离心收取，并于Laemmli缓冲液中溶解。将10μl等分的各溶胞产物稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(SDS-PAGE)。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；莫里斯，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行细胞溶解产物进行电泳，并经电转移至PVDF膜上，再以5％(w/v)奶粉封阻。
然后将膜以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)，或流感APR/8/38恢复期免疫小鼠血清进行探测。PR/8/34免疫血清是于，接受经实验测定得的次致死激发剂量为8 x 101鸡蛋感染性剂量的PR/8/34流感病毒的BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)中产生。然后令动物在感染后恢复>21天，此时将免疫血清分离及澄清化。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯，洛克兰，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加(Promega)，马地森，WI)呈现蛋白质条带。筛选出产生具有正确分子量，并与适当抗体反应的蛋白质条带的细菌纯株，用于制造供用于生物分析的蛋白质。
通过如方法#1与方法#4中所述的合成基因途径，制得衍生自A/波多黎各/8/34株(PR8)(SEQ ID NO1)的HA及列示于表1的构建体。同样，衍生自A/越南/1203/2004株(SEQ ID NO2)的构建体列示于表2，衍生自A/印度尼西亚/2005株(IND)(SEQ ID NO3)的HA的构建体列示于表3，而得自A/新喀里多尼亚/12/99株(NC)(SEQ ID NO4)的构建体列示于表4。“IND”用于本文意指“印度尼西亚”。若适当，用于PCR扩增反应的DNA引物与DNA模板列示于同一表中。
表1用于大肠杆菌中表达的PR8HA构建体 表2用于大肠杆菌中表达的VN HA构建体 表3用于大肠杆菌中表达的IND HA构建体 表4用于大肠杆菌中表达的NC HA构建体 结果 蛋白质载体已广泛应用于人类疫苗。白喉毒素的交叉反应性物质(CRM197)被认为，有利的用于数种共轭疫苗调合物中作为载体分子。例举性载体包括大肠杆菌热不稳定性肠内毒素(LT)与其B亚单位(LTB)、破伤风类毒素(TT)及霍乱弧菌类毒素(CT)。使用CRM197与LTB作为此全载体蛋白的代表，吾等已产生其中A/波多黎各/8/34株(PR8)(SEQ ID NO1)的HA球状头部，是以方法#1融合至CRM197基因或LTB基因的3’端的构建体，而产生构建体CRM.HA1-2(SEQ ID NO62)与LTB.HA1-2(SEQ ID NO63)。所述构建体经由DNA定序证明，并用于转化表达宿主BLR3(DE3)(诺瓦金，圣地亚哥，CA；Cat#69053)。
将转化株于含有卡那霉素(50μg/mL)、四环素(5μg/mL)与葡萄糖(0.5％)的平板进行筛选。挑取数个菌落隔夜培养，将培养物用于接种补充以25μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素与0.5％葡萄糖的新鲜LB培养基。于OD600＝0.6时，以1mM IPTG于37℃下培养3小时诱导蛋白质表达。收取细胞，并将等分的溶胞产物于10％ SDS-PAGE上，通过考马西蓝染色，及通过使用PR/8/34恢复期血清的免疫印迹法进行分析。于CRM.HA1-2构建体的个案中，是挑取数个菌落并通过SDS-PAGE分析表达。
当通过考马西蓝染色SDS-PAGE凝胶进行分析时，所又纯株皆呈现具有明显MW 84Kda，且与所预期MW一致的条带。于对照组培养物(不加IPTG者)中未出现此条带，表示其是由IPTG特异性诱导的。此观察在将两纯株#5与#6的细胞萃取物，于有或无还原剂(5mM DTT)存在下进行级分时，获得进一步确认。其二硫键已通过DTT处理破坏的重组蛋白质，不会被相关的抗体识别，但天然重组蛋白质却会。同样地，表达构建体LTB.HA1-2的纯株，呈现与所预测分子量39.8KDa一致的条带，当以IPTG诱导表达的蛋白质。LTB-HA1-2融合蛋白的同一性，是通过使用小鼠恢复期血清的蛋白质印迹分析来确认。此条带当有还原剂(β-巯基乙醇)存在时，其强度减落。此后述的观察暗示，该实验使用的还原剂量似乎并不足够。综合本文所示的数据支持，HA球状头部能够成功地融合至载体蛋白，而产生构型上灵敏的蛋白质的构想。
重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质于大肠杆菌中的克隆 HA流感B亚单位的克隆。自数种B型流感病毒品系克隆得HA球状头部，并表现呈与鞭毛蛋白的融合体。此等构建体是通过两步骤PCR产生。
HA亚单位经密码子最适化用于大肠杆菌表达，并以化学合成从商业供货商(DNA2.0Inc.，蒙罗公园，CA)购得。将HAI-1或HA1-2使用合成得的DNA作为模板进行PCR扩增。鞭毛蛋白(STF2)序列(SEQ ID NO212)是衍生自质粒pET24a-STF2.HA1-2。将STF2DNA片段进行PCR扩增，而PCR产物的C-端与融合HA亚单位的N-端序列，有一段28-30bp的重叠。
将STF2与HA亚单位通过2nd PCR融合在一起。使用列示于下表的各别正向与反向引物(整合DNA科技，Inc，卡洛谷，IA52241)，从亦列示于下表的DNA模板扩增得融合蛋白质DNA。接着将PCR产物进行XbaI分解，凝胶纯化及接合至预先以XbaI与SnaBI消化的pET24a-STF2.HA1-2。
所述构建体系列示于下表，若适当，亦列示用于PCR扩增反应的DNA引物与DNA模板。
用于大肠杆菌中表达的FluB STF2.HA构建体 于各别个案中，所构建得的质粒是用于转化胜任大肠杆菌DH5α细胞，并通过限制图谱制作分析鉴定所推测的重组体。通过DNA定序证明构建体的完整性，并将其用于转化表达宿主，BLR3(DE3)(诺瓦金，圣地亚哥，CA；Cat#69053)。转化株是于含有卡那霉素(35μg/mL)的LB(Veggie蛋白胨，EMD生物科学，La Jolla，CA；Cat#71280；veggie酵母抽出物，EMD生物科学，Cat#71279；)平板进行筛选。挑取菌落并接种入2ml补充以35μg/ml卡那霉素的LB(Veggie)培养基中，并生长过夜。将等分的此等培养物用于接种以相同培养基调配的新鲜培养基，将其进行培养直到OD600＝0.6。通过添加1mM IPT G诱导蛋白质表达。于37℃下培养2小时后，收取细胞并分析其蛋白质表达。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过凝胶电泳术与免疫印迹分析，测定蛋白质表达及同一性。将细胞经由离心收取，并于Tris/NaCl(50mM Tris，200mMNaCl，pH8.0)缓冲液中溶解。将两等分的各溶胞产物稀释于SDS-PAGE样本缓冲液中，并煮沸5分钟。将其中一等分样本以还原DTT(终浓度200mM，EMD生物科学，La Jolla，CA 92039；Cat#233155)。将样本(1.5μl/行细胞溶解产物)加样至4-12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(SDS-PAGE)。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；莫里斯，CA)染色，以呈现蛋白质条带。
对于蛋白质印迹，是将重复凝胶进行电泳，并经点转移至PVDF膜上，再以5％(w/v)奶粉封阻。然后将膜以抗-鞭毛蛋白抗体(6H11，Inotek，贝福里，MA；Lot#1030B5)，或针对B/马来西亚(2506/2004，CDC#2005741987)产生的雪貂抗血清进行探测。待以山辣根过氧化酶(HRP)-共轭的次级抗体(1:10，000)(山羊抗-小鼠是购自杰克森免疫研究实验室；西葛洛弗，PA.山羊抗-雪貂是购自贝西尔实验室；蒙哥马利，TX.)探测后，于以添加HRP呈色底物(皮尔斯；洛克兰，IL；Cat#34018)呈现蛋白质条带。STF2.HA1-1(MAL)的大约分子量为84kDa；而STF2.HA1-2(MAL与SH)的大约分子量为～78kDa。加样两STF2.4×M2e融合蛋白的微生物，作为抗-鞭毛蛋白抗体的阳性对照组，及抗-HA血清的阴性对照组。于该实验包括病毒溶解产物(B/马来西亚2506/2004，CDC#2005756250)，作为抗-HA血清的阳性对照组，及抗-鞭毛蛋白抗体的阴性对照组。凝胶的考马西蓝染色显示，低诱导STF2.HA1-1(MAL)蛋白质；但STF2.HA1-2(MAL)及STF2.HA1-2(SH)蛋白的条带强很多。使用抗-鞭毛蛋白单克隆抗体(1:4000)的蛋白质印迹分析，在加样STF2.HA1-1(MAL)的行呈现大约84kDa的强阳性条带，而于加样STF2.HA1-2(MAL)或STF2.HA1-2(SH)的行呈现大约75kDa条带。各融合蛋白于蛋白质印迹的诱导型式，与经考马西蓝染色凝胶的结果非常类似。未经还原及经还原蛋白质，被抗-鞭毛蛋白抗体识别的程度相当。抗-鞭毛蛋白(STF2.4×M2e)的阳性对照组显示单一强的条带，而阴性对照组则无呈现任何条带。
使用抗-HA多克隆抗血清(1:1000)的蛋白质印迹分析，呈现与以抗-鞭毛蛋白的印迹类似的型式，惟经还原的蛋白相较于未经还原样本其信号减弱，表示存在该抗血清中的大部分抗-HA多克隆抗体，是识别由正确二硫键形成所形成的构型抗原表位，而抗血清中的小部分抗体，识别不依赖二硫键形成的线形抗原表位。使用捕获ELISA分析观察到相似结果。有价值地注意到，针对B/马来西亚/2506/2004(维多利亚种是)的抗血清亦识别，属于山形种是的B/上海/361/2002。此结果指出，此二种是不仅共有许多一级序列相似性，亦共有三级结构。
蛋白质印迹与ELISA结果确定，具功能性的流感B HA1-1与HA1-2蛋白质表达于大肠杆菌。
实施例4重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的纯化与生物化学特征化 材料与方法 细菌生长及细胞溶解。将HA构建体表达于宿主菌株BLR(DE3)中。将带有编码STF2.HA1-1.his(PR8)(SEQ ID NO54)的质粒的大肠杆菌细胞，如前所述进行培养及收获。将各别菌从甘油储备物恢复，并生长于摇瓶中至最终体积为12L。将细胞生长于含有25μg/ml卡那霉素/12.5μg/ml四环素/0.5％葡萄糖的LB培养基中到OD600＝0.6，并以1mM IPTG于37℃下培养3小时进行诱导。将细胞通过离心(7000rpm x 7分钟于Sorvall RC5C离心机)收取，并再悬浮于1X PBS、1％甘油、1μg/ml DNAseI、1mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物及1mg/ml溶菌酶中。然后将细胞于15,000psi下两次通过微液化器使的溶解。将溶胞产物于贝克曼(Beckman)Optima L超速离心机(贝克曼犁刀(Beckman Coulter)；弗勒顿，CA)中，于45,000g下离心一小时，以使可溶性与不可溶性部分分开。
从大肠杆菌纯化STF2.HA1-1.his(PR8)(SEQ ID NO89)蛋白质及再折叠。经溶解与离心后，将不可溶性(沉淀)部分再悬浮于100ml1X TBS，pH8.0+1mMβ-巯基乙醇中，并将固态尿素加入至终浓度为6.2M。待以Dounce玻璃球均质器再悬浮后，将混合物如前述进行离心。将所得的上清液加样至充以NiSO4，并于缓冲液A[20mM Tris，pH 8.0/8M尿素/0.5M NaCl]平衡的螯合琼脂糖管柱(GE/艾默逊(GE/Amersham Biotechnology)生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上。
待以1L缓冲液B[缓冲液A+1％(w/v)TX-100]冲洗后，将管柱于5-管柱体积从100％缓冲液A至100％缓冲液C[缓冲液A+0.5M咪唑]的线性梯度中进行洗脱。汇集高峰流份，于Amicon 15离心浓缩器(密里泊(Millipore)；贝利卡，MA)浓缩3.5倍，并对3 x 2升8M尿素/20mM Tris，pH 8.0/2mM EDTA透析。于透析后，将STF2.HA1-1.his(PR8)-(SEQ ID NO89)通过快速稀释至终浓度为0.1mg/ml蛋白质于再折叠缓冲液
中，并于室温下培育过夜而进行再折叠。
然后将经再折叠的蛋白质捕获于5ml充以NiSO4，并于缓冲液D[20mMTris，pH 8.0/0.5M NaCl/1mM还原型谷胱甘肽/0.2mM氧化型谷胱甘肽]平衡的螯合琼脂糖HiTrap管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上，并100％缓冲液E[缓冲液D+0.5M咪唑]于中进行洗脱。汇集高峰流份，使用Amicon15离心浓缩器(密里泊；贝利卡，MA)浓缩，并于经1X TBS，pH 8.0+0.5％(w/v)脱氧胆酸Na平衡的Superdex 200尺寸排除管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)进行级分。汇集高峰流份，对3 x 2L of 1X TBS，pH 8.0(不含脱氧胆酸盐)透析，装瓶并储放于-80℃。
STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)与STF2.HA1-2mut(PR8)(SEQ ID NO91)的纯化将带有编码STF2.HA1-2.his(PR8)(SEQ ID NO55)的质粒的大肠杆菌细胞，如前所述进行培养及收获。经溶解与离心后，将含有STF2.HA1-2(PR8)的不可溶性(沉淀)部分再悬浮，并使用Dounce均质器于50mM Tris，pH 8.0+0.5％(w/v)Triton X-100中均质化。然后将均质液离心(19,000rpm x 10min)。接着将所得的沉淀部分于50mM Tris，pH 8.0+0.5％(w/v)Triton X-100+1.0M NaCl中再均质化，并离心。然后将包涵体部分(沉淀)溶解于缓冲液A[50mM醋酸Na，pH4.0+8.0M尿素]中，并离心(19,000rpm x 10min.)以去除不可溶性碎片。
将所得的上清液于经缓冲液A中平衡的蔗糖S管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)进行级分，并于5管柱-体积以缓冲液B(50mM醋酸Na，pH4.0，1.0M NaCl)的线性梯度中洗脱。然后将蛋白质通过快速稀释至缓冲液C(100mM Tris-HCl，pH 8.0)中进行再折叠。接着将经折叠的蛋白质于经缓冲液C中平衡的Q琼脂糖HP管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上进行级分，并于以缓冲液D(缓冲液C+1MNaCl)的0％至60％线性梯度中洗脱。然后将Q HP洗脱物于经1X Tris-缓冲食盐水，pH 8.0平衡的Superdex 200尺寸排除色层分析(SEC)管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)进行级分，以将单体与聚集的蛋白质分离。然后汇集单体流份，等分并储放于-80℃。
STF2.HA1-3(PR8)(SEQ ID NO92)的纯化将带有编码STF2.HA1-3(PR8)(SEQ ID NO57)的质粒的大肠杆菌细胞，如前所述进行培养及收获。经溶解与离心后，将含有STF2.HA1-3(PR8)的可溶性(上清液)部分调整至6.2M尿素，100mM DTT并于室温下培育过夜亦将蛋白质完全还原及变性。然后将蛋白质五倍稀释于缓冲液A(50mM柠檬酸，pH 3.5，8M尿素，1mM β-巯基乙醇，1mM EDTA)中，并加样至以缓冲液A平衡的SP琼脂糖FF管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上。为去除内毒素，遂将管柱以缓冲液B(缓冲液A+1％(w/v)Triton X-100)，随后再以10管柱体积缓冲液C(50mM柠檬酸，pH 3.5，1mMβ-巯基乙醇，1mM EDTA，70％(v/v)异丙醇)冲洗。
接着将结合蛋白质于五管柱体积缓冲液A缓冲液D(缓冲液A+1M NaCl)的线性梯度中洗脱。然后将洗脱出的蛋白质对缓冲液E(20mM Tris，pH 8.5，8M尿素，1mMβ-巯基乙醇，1mM EDTA)透析，并通过蔗糖Q管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)。在流通流份中收集STF2.HA1-3(PR8)(SEQ ID NO92)蛋白质。将蛋白质使用Amicon 15离心浓缩器(密里泊；贝利卡，MA)浓缩，并对缓冲液F(20mM Tris，pH 8.0，8M尿素，1mM EDTA)透析以去除还原剂。然后将经变性的多肽通过快速稀释至终浓度为0.1mg/ml，于再折叠缓冲液
中进行再折叠，并于室温下培育过夜。然后将经再折叠的蛋白质于经1X Tris-缓冲食盐水(TBS)，pH 8.0，加0.25％(w/v)胆酸钠平衡的Superdex200尺寸排除管柱上进行级分，以将单体STF2.HA1-3(PR8)与聚集的蛋白质分离。汇集单体流份，对透析以去除胆酸盐，等分并储放于-80℃。
HA1-2His(PR8)(SEQ ID NO93)的纯化将带有编码STF2.HA1-2.his(PR8)(SEQ ID NO61)的质粒的大肠杆菌细胞，如前所述进行培养及收获。经溶解与离心后，将不可溶性部分均质化，并以缓冲液A(50mM Tris，pH 8.0)清洗一次，随后依序以缓冲液+0.5％(w/v)Triton X-100及缓冲液A+0.5％(w/v)TritonX-100+1M NaCl清洗。接着将不可溶性物质再以单独缓冲液A清洗两次。然后将经清洗的包涵体溶解于缓冲液B(1X PBS，pH 7.4，8M尿素)中，并加样至充以NiSO4的Ni-NTA(西格马-亚得力奇(Sigma-Aldrich)；圣路易市，MO)管柱，并于缓冲液C(50mM Tris，pH 8.0，8M尿素，0.3M NaCl，0.5M咪唑)的线性梯度中洗脱。为去除内毒素，遂经洗脱的蛋白质对透析过夜，并加样至Ni-NTA管柱。
接着将管柱以缓冲液D(10mM Tris，pH8.8，8M尿素，60％(v/v)异丙醇)冲洗，并如前述进行洗脱。然后将经Ni-NTA纯化的蛋白质通过1:0(v/v)稀释至再折叠缓冲液(50mM Tris，pH 8.8)中进行再折叠。然后将经再折叠的HA1-2His(PR8)(SEQ ID NO93)蛋白质，使用Amicon超过滤单元(密里泊；贝利卡，MA)浓缩，并加样至经1X TBS，pH 8.0平衡的Superdex 200尺寸排除管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)进行级分。汇集单体流份，等分并储放于-80℃。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过SDS-PAGE测定所有HA构建体的同一性，及评估纯度。将5μg等分的样本稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(LifeGels；法蓝斯森林，新南韦尔斯，AUS)上，并进行电泳术。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；赫尔克里士，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行总体蛋白质如前所述进行电泳，然后经电-转移至PVDF膜上，并以5％(w/v)奶粉封阻，之后以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)，或流感A PR/8/38恢复期免疫小鼠血清(如下于蛋白质抗原性ELISA所述)进行探测。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯，洛克兰，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加，马地森，WI)呈现蛋白质条带。
蛋白质分析使用Micro BCA(二金鸡纳酸)分析(皮尔斯，洛克兰IL)以微量板格式，使用牛血清白蛋白作为标准物，根据制造商的说明，测定所有蛋白质的总体蛋白质浓度。
内毒素分析对于所有蛋白质的内毒素浓度，是使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒，依照制造商用于微量板方法的说明测定得。
TLR5生物活性分析HEK293细胞固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将下列测试蛋白质加入且培育过夜STF2.HA1-1His(PR8)(SEQ ID NO89)；STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)；STF2.HA1-2(PR8)mut(SEQ ID NO91)；STF2.HA1-3(PR8)SEQ ID NO92)；HA1-2His(PR8)(SEQ IDNO93)；STF2.HA1-2(Mal)(SEQ ID NO211)上清液；STF2.HA1-2(Mal)(SEQID NO211)经再折叠；STF2.HA1-2(SH)(SEQ ID NO211)上清液；STF2.HA1-2(SH)(SEQ ID NO211)经再折叠；STF2.HA1-1(Mal)(SEQ ID NO209)上清液；及STF2.HA1-1(Mal)(SEQ ID NO209)。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，洛克兰，IL；#M801E and#M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中的IL-8存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)测量光学密度。
蛋白质抗原性ELISA为测定重组融合蛋白是否正确展示经折叠的HA抗原表位，遂通过ELISA评估各别HA-融合蛋白的抗原性。将96-孔ELISA板以系列稀释于PBS(100μl/孔)的各标靶蛋白质(始于5μg/ml)，于4℃下涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)，于室温下封阻一小时，然后于PBS-T中清洗三次。接着将固定剂量的一级抗体加至各孔。
为分析HA反应性，遂将100μl/孔1:0,000稀释于ADB的非免疫或PR/8/34恢复期免疫血清加入。PR/8/34免疫血清是在接受经实验测定得的次致死激发剂量为8x101鸡蛋感染性剂量的PR/8/34流感病毒的BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)中产生。然后令动物在感染后恢复>21天，此时将免疫血清分离及澄清化。对于鞭毛蛋白或6x组氨酸标签的ELISA，是将抗6x His(因维托金(invitrogen)；卡斯贝得，CA)，或鞭毛蛋白(Inotek；贝弗里，MA)单克隆抗体以1μg/ml溶于ADB(100μl/孔)加入，并将板于室温下培育1小时，或于4℃下过夜。然后将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学(Jackson Immunochemical)；西葛洛弗，PA)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，微量板分光光度计(FARCyte，GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)测量A450。
结果与讨论 蛋白质产量及纯度于大肠杆菌制得的重组HA与STF2.HA融合蛋白的纯化结果，列示于表6中。所有四种蛋白质皆以高产量制得，具有估计纯度超过90％，且内毒素相当低于标准物可接受浓度0.1EU/μg。三种STF2融合蛋白亦具有非常高的试管内TLR5生物活性，而HA1-2His6(SEQ ID NO93)蛋白质(如所预期)不具有TLR5活性。
表6 于大肠杆菌制得的流感AHA蛋白的抗原性将四种重组蛋白通过以对抗STF2(鞭毛蛋白)的抗体(Inotek；贝福里，MA)，及收集自PR/8/34恢复期小鼠的免疫抗血清进行的蛋白质印迹法进行分析。三种STF2融合蛋白似乎与抗-鞭毛蛋白抗体的反应相当。STF2.HA1-1His(PR8)(SEQ ID NO89)、STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)及HA1-2His(PR8)(SEQ ID NO93)亦与抗-PR/8/34恢复期血清反应。此反应性亦仅见于未经还原的蛋白质样本；将DTT加至样本缓冲液大大地减低该信号。此发现暗示，恢复期血清中大部分抗-HA抗体为构型上依赖性，且于HA中的适当二硫键结，对于由蛋白质印迹的反应性为必需。相对于此等结果，STF2.HA1-3(PR8)(SEQ ID NO92)并未有效地与恢复期血清反应，且所产生的弱信号并不受还原剂影响。此发现暗示，STF2.HA1-3蛋白质可能不能适当折叠，且/或不能展现天然HA抗原表位。
用于流感B球状头部蛋白的捕获ELISA 使用捕获ELISA评估各别HA-融合蛋白的抗原性。抗-鞭毛蛋白单克隆抗体是用于固相捕获此等蛋白。使用于天然B/马来西亚/2506/2004感染时产生的雪貂抗-血清，来检测所捕获的HA-融合蛋白质。此项分析的结果将决定，重组融合蛋白是否展示经正确折叠的HA抗原表位。由于不同流感B球状头部分子间具有合理的序列同源性，预期84.6％此等抗血清会与马来西亚及上海球状头部构建体反应。
样本的制备 将表达STF2.HA1-2(马来西亚(SEQ ID NO210))、STF2.HA1-2(上海(SEQID NO211))及STF2.HA1-1(马来西亚(SEQ ID NO209))重组蛋白的大肠杆菌通过离心沉淀，并再悬浮于Tris缓冲液(50mM Tris，200mM NaCl，pH 8)中。将细胞以超音波震碎溶解。将细胞溶解产物离心，以使可溶性蛋白质与不可溶性蛋白质分离。将不可溶性蛋白质沉淀再悬浮于含有6M尿素的Tris缓冲液中，并将蛋白质通过将该溶液快速稀释1:0倍于Tris缓冲液，而进行快速再折叠。以UV280(分光光度计DU 800)评计可溶性蛋白质，与含有再折叠蛋白质的沉淀样本的蛋白质浓度。通过ELISA评估含有STF2.HA1-1(Mal)(SEQ ID NO209)；STF2.HA1-2(Mal)(SEQ ID NO210)、STF2.HA1-2(SH，上海)(SEQ ID NO211)蛋白质的上清液，及含有经再折叠STF2.HA1-1(Mal)、STF2.HA1-2(Mal)、STF2.HA1-2(SH)的溶解沉淀，与于天然时所产生针对B/马来西亚/2506/2004感染的雪貂抗血清的反应性。使用大肠杆菌上清液样本，及含有STF2.4xM2e(SEQ ID NO94)蛋白质的经溶解、再折叠样本作为阴性对照组。
ELISA方法 将ELISA板(Maxisorp，诺克，丹麦)涂覆以浓度为0.5ug/mL的鞭毛蛋白特异性单克隆抗体6H11(Inotek，贝福里，MA)，并于2-5℃下培育过夜。将含有抗体的溶液抽干，并以300uL/孔Super Block+Tween-20，于25℃下进行封阻2小时。将平板以1xPBS清洗一次并拍干。于稀释板中进行不同蛋白质溶液的三倍系列稀释，起始浓度为5ug/mL。将100uL从稀释板转移至ELISA板。
将板于25℃下培育1小时。通过将板以PBS+0.05％Tween-20清洗3次，而将未结合的蛋白质去除。将针对B/马来西亚/2506/2004(CDC，AL，乔治亚)产生的雪貂抗血清稀释至1:00，并将100uL加至各孔。然后将板于25℃下培育1小时。于此培育步骤后，将平板以含有0.05％Tween-20的PBS清洗6次。将经共轭至山辣根过氧化酶(HRP，贝西尔实验室Inc.(Bethyl Labs Inc.)，IL)的山羊抗-雪貂IgG稀释1:0,000，并将100uL加至各孔。然后将板培育30分钟。于此培育步骤后，将平板以PBS+0.05％Tween-20清洗6次。将100uL含有HRP底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的TMB Ultra(皮尔斯，洛克弗，IL)加至各孔。待添加此底物后，监测颜色呈色，并以添加100uL/孔1M H2SO4终止反应。于微量板计读机(SpectraMax 190，分子装置(Molecular devices)，太阳谷，CA)上测量A450。
于大肠杆菌制得的流感B HA蛋白的抗原性 ELISA数据(图3)指出，抗血清可识别对还原剂敏感的抗原表位。将蛋白质以还原剂处理，其通过破坏二硫键改变蛋白质构型，并减低抗血清与所述蛋白质的反应性。STF2.HA1-2(Mal)总体溶胞产物未经还原、STF2.HA1-2(SH)总体溶胞产物未经还原及STF2.HA1-1(Mal)总体溶胞产物未经还原，当保持于适当折叠组态时，其反应性非常良好，表示各别HA-融合蛋白的构型，与天然HA蛋白的球状头部构型相当。虽然抗血清含有对构型敏感的抗体，且反应性依赖正确的二硫键，其亦含有对二硫键不敏感的抗体，此是由在还原与非还原条件下，皆观察到残余活性而获得证明。
STF2.HA(流感B)蛋白的TLR5生物活性 重组融合蛋白呈现与得自捕获ELISA结果相符的功效，表示经折叠的样本较天然形式的溶胞产物更具活性(图4及5)。呈天然未经处理形式的样本，显示其较未经折叠样本少2-倍的活性。此等蛋白质于天然形式中为错误折叠，而因此需要再折叠步骤以恢复TLR5生物活性。此活性与于捕获ELISA中的HA活性一致。
实施例5代表病毒株A/波多黎各/8/34于大肠杆菌的重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的免疫原性 材料与方法 动物研究使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)。将小鼠分组每组10只，并于第0及14天接受鼠蹊部附近皮下(s.c)致免如下 1)PBS(磷酸盐缓冲食盐水) 2)3μg的STF2.4xM2e(SEQ ID NO94)于食盐水缓冲液(10mM组氨酸，10mM Tris，75mM NaCl，5％(vol/vol)蔗糖，0.02％(w/v)聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％(v/v)乙醇，pH7.2) 3)30μg的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)于PBS 4)3.0μg的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)于PBS 5)0.3μg的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)于PBS 6)0.03μg的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)于PBS 额外一组五只小鼠接受经实验测定得的次致死激发以8x101鸡蛋感染性剂量(EID)PR/8/34，并令其恢复>21天。然后将此等动物于激发研究(参见下述)期间，使用作为免疫恢复期阳性对照组。将小鼠于第10天(初级)及21天(促升)采血，并将血清通过凝结与离心澄清化，并储放于-20℃下。
血清抗体测定通过ELISA测定HA-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板(Costar(Cat#9018)Corning，NY)于4℃下，以100μl/孔HA0sHis蛋白质(于果蝇制造)(SEQ ID NO176)溶于PBS(5μg/ml)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根，(Cat#555213)(胜地牙哥，CA)于室温下封阻一小时。将板于PBS+0.05％(v/v)Tween 20(PBS-T)中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学；西葛洛弗，PA(Cat#115-035-146))加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte(杜尔哈，NC)微量板分光光度计上测量A450。
MDCK全细胞ELISA将MDCK细胞(ATCC(Cat#CCL-34)马纳萨斯，VA)于96-孔培养板(BD(Cat 353075)，康宁，NY)，于含有10％ FCS的DMEM完全培养基中，于37℃下生长一至二天或直到细胞接近铺满。然后将各孔与1 x 106EID的PR/8/34病毒(50μl)存在不含FCS的DMEM培养基，或单独培养基(用于未经感染对照组)进行培育。
于37℃下培育60分钟后，将200μl完全培养基加至各孔，并将板于37℃下培育过夜。次日将板以PBS清洗，并以10％福尔马林于室温下固定10分钟。将各孔以PBS/0.1％ BSA清洗三次，并以200μl/孔ADB(BD法明根(BDPharmingen)，Cat#555213)，胜地牙哥，CA)于室温下一小时，或于4℃下过夜进行封阻。将测试血清的系列稀释加至各孔，并于室温下培育一至二小时。将各孔清洗并与HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学，Cat115-035-146(西葛洛弗，PA))于室温下培育30分钟，随后与TMB Ultra底物(皮尔斯(Cat#34028)，洛克弗，IL)于室温下培育两分钟。将反应以添加25uL的1N H2SO4终止，并于使用微量板分光光度计(FARCyte，艾默逊，杜尔哈，NC)读取OD450。
结果与讨论 于以STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)免疫后HA-特异性IgG反应的诱导STF2.HA1-2的免异原性是通过，于第0及14天以一剂量范围的STF2.HA1-2(30、3.0、0.3或0.03μg)经皮下免疫BALB/c小鼠(10/组)而进行检验。对照组小鼠是以PBS(阴性对照组)、3μg的STF2.4xM2e(SEQ ID NO94)(对于免疫原性为阴性对照组，对于致死激发功效研究为阳性对照组)或次致死激发以8x101EID的流感分离株PR/8/34，以产生免疫恢复期动物来进行致免。于促升(第21天)后7天，通过ELISA检验HA-特异性IgG反应。结果证明，以30、3或0.3μg的STF2.HA1-2(PR8)进行致免，可以剂量-依赖性方式诱导一致且显著的HA0sHis-特异性(SEQ ID NO176)IgG反应(图6)。
得自经STF2.HA1-2(SEQ ID NO90)致免小鼠的血清与受流感病毒感染的MDCK细胞反应前述的直接ELISA结果证明，得自经STF2.HA1-2-免疫动物的血清，会识别重组型果蝇所表达相当于PR/8/34 HA序列的HA0sHis(SEQ ID NO176)。为了证明抗-HA抗体可识别天然病毒HA，遂检验相同血清其与受PR/8/34感染的MDCK细胞反应的能力。列示于图7的结果证明，得自经30、3或0.3μg的STF2.HA1-2致免的小鼠，可特异性与受PR/8/34感染的MDCK细胞结合，表示经由以STF2.HA1-2致免作用所产生的抗-HA抗体，可识别以其天然构型存在的HA。
综合此等结果证明，经存在PBS(无习知佐剂或载剂)的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免的小鼠，展现其可试管内识别于果蝇中表达得的重组型HA，及表达于PR/8/34感染的MDCK细胞表面的天然病毒HA的强烈抗-HA反应。
实施例6代表病毒株A/波多黎各/8/34的重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的功效 材料与方法 流感病毒激发小鼠。为分析功效，遂将如实施例5所述的经免疫小鼠，于第28天通过鼻内投予LD90(使90％小鼠致死的剂量)(8x103EID)的流感A分离株PR/8/34而进行激发。于激发后每日侦查动物的存活、体重流失及临床表征达21天。％体重流失是以每组各别动物((每日体重(g)/第28天原始体重(g))x100)的平均值为基础计算得。临床分数的指定如下4点＝健康，3点＝减少梳理，2点＝身体活性减低，及1点＝垂死。(临床分数与体重流失的实验结果反映出以存活动物于所评估天数为基础的结果)。
病毒滴定与的测定。
细胞制备将MDCK细胞(ATCC(Cat# CCL-34)，马纳萨斯，VA)培养于100 x 20mm培养板(BD(Cat# 353003)康宁，NY)中达90-95％铺满，并将单层通过与胰蛋白酶-EDTA于37℃/5％ CO2培育20分钟而脱离。通过添加补充以10％FBS的DMEM细胞培养基将胰蛋白酶去活化，并将细胞单层以无菌刮刀刮下使细胞完全脱附。收取细胞悬浮液，并以DMEM+10％FBS漂洗两次。将细胞再悬浮于DMEM+10％FBS中并计数的。将细胞浓度调整至4 x 105细胞/ml，并将100μl加至96-孔组织培养板(BD(Cat# 353075)康宁，NY)的各孔中。将板于37℃/5％ CO2培育直到达90-95％铺满。
病毒滴定将流感病毒(品系A/波多黎各/8/34[PR/8])于中无酚红DMEM+0.1％BSA(流份V(洛克兰(Cat#BSA-50)吉柏斯谷，PA)稀释至1x108EID，并使用相同培养基于96-孔板中制备得系列5-倍稀释液。将如本文所述制备得于96-孔板中的MDCK细胞单层，通过抽干培养基，置换以200μl/孔的1x PBS再抽干PBS而进行清洗。将如前述制备的流感病毒系列5-倍稀释液，以100μl/孔的体积加至该经清洗的单层。将一列孔仅以培养基处理作为对照组。将细胞于37℃/5％ CO2培育2小时，以令病毒附着及进入。将各孔通过抽干、以200μl/孔PBS漂洗及抽干PBS而进行清洗。使所有孔接受100μl/孔无酚红DMEM+0.1％BSA，并将板于37℃/5％CO2培育48小时。
细胞存活度的测定于如前述与病毒进行培育后，将培养基从各孔抽干，并置换以含有40μg/ml中性红(西格马亚得力奇(Cat# N2889)圣路易市，MO)的新鲜培养基。为测定最大溶解，遂将2μl溶解溶液(9％ Triton X-100溶于水，重量/体积)加至，仅与培养基培育的三重复孔。经一小时培育后，通过添加100μl/孔1％甲醛/1％ CaCl2于室温下5分钟固定细胞；此固定步骤重复进行两次而成功。经固定溶液抽干，并将100μl/孔萃取培养基(50％乙醇/1％醋酸)加入以使中性红释出。
将板于室温下培育20分钟，其中最后2分钟伴随搅拌。通过使用微量板分光光度计测量于540mm下的吸光值，而测定得所释出的染料量。测量相较于培养基对照组，所减少的染料释出量，即为细胞死亡(及因此的，病毒感染性)。于培育结束时，如本文所述进行中性红分析。各血清稀释液的溶解百分比经计算如下 ％减低＝100 x ((样本-病毒)/(med-病毒)) 其中样本、max与med意指分别代表实验样本、仅含病毒及仅含培养基的孔中的吸光值。各样本的中和效价是定义为，造成50％病毒感染性减低的血清稀释度。
流感A/PR/8/34中和分析此项分析是配合源自WHO手册关于动物流行性感冒诊断与监督，p.86-88(WHO/CDS/CSR/NCS2002.5)的修改。中性红分析是适应盖兹堡学院细胞实验室的公开提案(http://www3.gettysburg.edu/～sorense/Celllab04/neutralred.htm)。
特别地，如前所述将MDCK(ATCC(Cat#CCL-34)，马纳萨斯，VA)细胞平布于96-孔组织培养板(BD(Cat# 353075)康宁，NY)中。将测试试剂(实验与对照组血清)通过，于加热至56℃的水浴中培育30分钟而经热-去活化。将血清于96-孔板中，以3-倍稀释于无酚红DMEM+0.1％ BSA中进行系列滴定。将等体积稀释于相同培养基至5 x 106/ml EID的PR/8/34病毒，加至各血清稀释液以达最终病毒浓度为2.5 x 106EID/ml(为吾等目前病毒储备物的预定TCID50)。包括仅含有培养基及仅含病毒的孔，分别作为阴性与阳性对照组。将板于37℃/5％ CO2培育30分钟。
将如前述(细胞制备)制备得的细胞单层，以200μl/孔1x PBS清洗一次，然后将100μl/孔如前述所制备的血清病毒混合物及对照组试剂加入，并于37℃/5％ CO2培育2小时。于培育后，将细胞单层以PBS清洗一次，并将100μl/孔无酚红DMEM+0.1％ BSA加至各孔，并于37℃/5％ CO2培育48小时。于培育结束时，如前文所述(细胞存活度的测定)进行中性红分析。如前所述计算得各血清稀释液的溶解百分比。各样本的中和效价是定义为，造成50％病毒感染性减低的血清稀释度。
结果与讨论 以STF2.HA1-2(PR8)(SEO ID NO90)免疫提供免于以流感A的致死激发的保护作用由实施例5的结果证明，小鼠以STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免，可产生识别天然HA的抗体反应。为评估功效，遂于第28天经鼻内投予LD90(8 x 103EID)的PR/8/34病毒而进行激发。于激发后每日侦查小鼠的存活、体重流失及临床表征达19天。如图8A、8B及8C所示，经PBS-致免的小鼠在早如激发后三天，即呈现感染征状(体重流失与较低的临床分数)，且所有小鼠于激发后第21天全部死亡。反之，经30、3.0或0.3μg的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免的小鼠，证明有显著增强的保护作用。此等动物证明有少或无体重流失，临床分数明显较高，且类似于免疫恢复期对照组动物，历经21天后仍有100％存活。此等结果证明，经大肠杆菌表达的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)，诱导可于活体内成功保护BALB/c小鼠免于毒性A型流感病毒的致死激发的HA-特异性免疫反应。
为评估抗体反应的试管内有效性，遂发展基于细胞的病毒中和分析，以测试免疫血清用以中和病毒感染性的能力。于此项研究中，是检验得自经STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)及STF2.HA1-1(PR8)(SEQ ID NO151)致免动物的血清的抑制活性。将非免疫与免疫血清的系列稀释，与PR/8预培育，再与DUCK细胞进行培育。将各孔清洗以去除游离态病毒，并将板培育之后以中性红染色来检测活细胞。结果指出，得自经STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免动物的免疫血清，证实具有组织培养抑制50％剂量(TCID)为>1:40(图9)。
实施例7代表病毒株A/越南/1203/2004的重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的免疫原性 材料与方法 动物研究使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)。将小鼠分组每组10只，并于第0及14天接受鼠蹊s.c致免如下 1)PBS(磷酸盐缓冲食盐水) 2)3.0μg的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)于PBS 3)3.0μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)于PBS 4)0.3μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)于PBS 将小鼠于第21天采血，并将血清通过凝结与离心澄清化，并储放于-20℃下。
血清抗体测定通过ELISA测定HA与STF2-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板(Costar(Cat#9018)康宁，NY)于4℃下，以100μl/孔自越南/1203/2004纯化得的HA蛋白(BEI资源(BEI Resources)(Cat#NR-660)，蒙萨斯，VA))，或重组鞭毛蛋白(STF2)(SEQ ID NO96)溶于PBS(5μg/ml)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根，(Cat#555213)胜地牙哥，CA)于室温下封阻一小时。将板于含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS(PBS-T)中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学(Cat#115-035-146)，西葛洛弗，PA)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯(Cat#34028)，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte(杜尔哈，NC)微量板分光光度计上测量A450。
结果与讨论 于BALB/c小鼠检测STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)的免疫原性。将动物于第0及14天以3μg STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)，或以3或0.3μgSTF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)经s.c.致免。于第21天将动物采血，并通过ELISA检测对于自A/越南/1203/2004纯化得的HA(购自BEI资源Cat#NR-660)，及重组鞭毛蛋白(STF2；(SEQ ID NO96)的血清IgG反应(图10A与10B)。结果证明，得自经致免的小鼠的血清，呈现与自A/越南/1203/2004纯化得的H5蛋白的抗原-特异性反应性。
实施例8于杆状病毒中所制得重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的克隆、表现与生物化学特征化 克隆HA与STF2.HA融合蛋白的表达，是使用Bac-至-Bac杆状病毒(Baculovirus)表达系统(因维托金，卡斯贝得，CA)，根据制造商的指示完成(图11)。将编码HA与STF2.HA融合蛋白的cDNA克隆至pFastBac供体质粒中，然后用于转化含有杆粒(bacmid)与辅助DNA的DH10Bac细胞。接着将通过于DH10Bac中进行的同源重组所产生的重组杆粒克隆株，通过于X-gal平板上进行的蓝-白筛检加以鉴定。克隆程序的详情参见以下段落。
载体卡匣的产生pFastBacTM1载体可与Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(因维托金，卡斯贝得，CA)相容。此载体具有供高程度蛋白质表达的强AcMNPV多角体(PH)启动子，及供简化克隆的大的多重克隆位点。pFastBacTM1是一种非融合载体(亦即，该载体中无融合标签)。
为确定适当表达重组蛋白，插入物必须含有供转译引发的ATG起始密码子，及供转译终结的终止密码子。为有助于克隆与数种HA基因截短融合的鞭毛蛋白，遂加工制作两种质粒卡匣pFB-STF2Blp.wt(SEQ ID NO97)与pFB-STF2Blp.ng(SEQ ID NO98)。于后者，鞭毛蛋白(STF2)基因的推测糖化位点，是通过将Gln(Q)取代以Asn(N)而被缺失。可能的糖化位点的测定，是使用供N-糖苷基序列N-X-S/TN残基，随后接任何残基之后于第三位置为S或T。
于某些特定位点，STF2基因(SEQ ID NO212)的残基40、122、215、237、414、478及497，是并入N残基作为Q取代。隐藏此等突变，及其中蛋白质似乎未被糖类修饰的构建体，命名为非糖化(ng)突变型。同样，将糖化突变导入HA0s基因的位置11、23、268、286与480(SEQ ID NO23)。该二载体构建体(pFB-STF2Blp.wt及pFB-STF2Blp.ng)皆于STF2(SEQ ID NO212)的核苷酸GTGCTGAGCCTGTTACGT-3’(SEQ ID NO310)(nt 1501至1518)中隐藏缄默突变，于质粒卡匣中产生独特的BlpI。各卡匣含有蜂毒肽(HBM)序列(SEQ ID NO99)融合于STF2的氨基末端，以提供分泌信号。二质粒皆经密码子最适化供表达于B杆状病毒(内地认证试剂公司，内地，TX；DNA2.0Inc，蒙罗公园，CA)。将合成基因以BamHI或BglII与SphI切出，并通过可相容末端接合克隆入pFastBacTM1载体中，产生pFB-STF2Blp.wt及pFB-STF2Blp.ng卡匣。
鞭毛蛋白-HA融合卡匣将流感病毒品系A/波多黎各/8/34、A/越南/1203/2004、A/印度尼西亚/2005及A/新喀里多尼亚/12/99的HA球状头部亚单位单独表达，或于基因层次上融合至鞭毛蛋白(STF2)(SEQ ID NO178)并于杆状病毒中表达。此是以下列三种方法其中一种完成 方法#1位产生用于ELISA的试剂，遂将PR8、VN、IND与NC品系(表7及表8)的HA1-1亚单位克隆入pFASTBacTM1中，产生其包含六-His标签的pFB.HA1-1。此是通过使用如下表所列示的引物，与合成型密码-经最适化HA0s基因(HA排除信号序列及胞外功能域)作为DNA模板(DNA2.0 Inc.，蒙罗公园，CA)进行PCR而完成。将PCR片段以BglII与SphI消化，并插入已预先经BglII与SphI酶，随后再以BAP处理的pFastBacTM1中。为产生鞭毛蛋白-HA亚单位融合体，遂将PCR产物以BlpI消化，并通过可相容末端接合至pFB-STF2Blp.wt。
方法#2于此提案中，是以化学合成得代表wt与非糖化形式的经密码子-最适化HA亚单位基因(DNA2.0Inc.，蒙罗公园，CA)。将基因以BglII与SphI酶切出，并将经凝胶纯化的片段接合至，预先经BglII与SphI及BAP处理的pFB-STF2Blp.wt，或非糖化版本(pFB-STF2Blp.ng)。于各别个案中，是使用接合混合物转化TOP10细胞，并将转化株以PCR及DNA定序进行筛检，以确定插入物的存在与正确位向。将构建体用于转化MAX

DH10BacTM胜任大肠杆菌(因维托金，卡斯贝得，CA)，而产生重组杆粒。通过于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、40μg/mLIPTG与Bluo-Gal(40.μg/mL)的平板上进行蓝/白筛选，从细菌纯株筛检出阳性杆粒。制备重组杆粒DNA，并用于转感染所选择的昆虫细胞系(Sf9或Sf21细胞)，而产生重组型杆状病毒。然后将杆状病毒储备物扩增及定效价，并用于感染High Five昆虫细胞以表达重组蛋白质。
表7用于杆状病毒中表达的PR8HA构建体 表8用于杆状病毒中表达的NC，VN与NC HA构建体 蛋白质表达将草地黏虫(Sf9)昆虫细胞培养于葛氏昆虫细胞培养基(因维托金，卡斯贝得，CA)中。将重组杆粒从DH10Bac纯株纯化出，并使用细胞感染素(Cellfectin)(因维托金，卡斯贝得，CA)转感染至Sf9细胞中，产生第一代(P1)杆状病毒储备物，然后将其以传统蚀斑分析根据制造商的指示定其效价。接着使用P1病毒储备物以感染复数(MOI)为0.1感染Sf9细胞，产生具有增加病毒效价的P2病毒储备物。将表达下列蛋白质的培养物扩大培养，以供蛋白质纯化ngSTF2.HA(PR8)1-2mutHis(SEQ ID NO156)；ngSTF2.HA(PR8)1-1His(SEQ ID NO152；STF2.HA(PR8)1-1His(SEQ ID NO151)；STF2.HA(PR8)1-2His(SEQ ID NO153)；STF2.HA1-2mutHis(SEQ IDNO155)；HA(PR8)1-1His(SEQ ID NO179)HA(VN)1-1His(SEQ ID NO180)；HA(IND)1-1His(SEQ ID NO181)；HA(NC)1-1His(SEQ ID NO182)。通过将2x1L烧瓶的High-5昆虫细胞以MOI为2的P2病毒感染，并于28℃下伴随缓慢振荡培养24小时进行蛋白质表达。通过离心收取条件培养基，并通过通过0.22μm滤器澄清化并储放于4℃。
蛋白质纯化将NiSO4加至各经澄清化的上清液至最终浓度为0.5mM，并将pH调整至8.0。然后将加His6-标签的蛋白质捕获于充以NiSO4，并于缓冲液A(20mM Tris，pH 8.0，0.5M NaCl)平衡的螯合琼脂糖管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上。待以缓冲液A冲洗后，将结合的蛋白质以缓冲液B(缓冲液A+0.5M咪唑)进行洗脱。汇集高峰流份，透析至缓冲液中过夜，并加样至镍NTA(西格马-亚得力奇；圣路易市，MO)管柱。将管柱以5-管柱体积从100％缓冲液A至100％缓冲液B的线性梯度进行洗脱。汇集高峰流份，透析至1X TBS，pH 8.0中。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过SDS-PAGE测定蛋白质同一性及评估纯度。将5μg等分的各别样本稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(LifeGels；法蓝斯森林，新南韦尔斯，AUS)上，并进行电泳术。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；赫尔克里士，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行总体蛋白质如前所述进行电泳，然后经电-转移至PVDF膜上，并以5％(w/v)奶粉封阻，之后以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)，抗-His6抗体(因维托金，卡斯贝得，CA)，或流感A PR/8/38恢复期免疫小鼠血清(如下于蛋白质抗原性ELISA所述)进行探测。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯，洛克弗，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加；马地森，WI)呈现蛋白质条带。
蛋白质分析使用Micro BCA(二金鸡纳酸)分析(皮尔斯洛克弗，IL)以微量板格式，使用牛血清白蛋白作为标准物，根据制造商的说明，测定总体蛋白质浓度。
内毒素分析使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(Cambrex；E.卢瑟弗，NJ)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定内毒素程度。
TLR5生物活性分析HEK293细胞固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将下列测试蛋白质加入且培育过夜ngSTF2.HA(PR8)1-2mutHis(SEQ ID NO156)；ngSTF2.HA(PR8)1-1His(SEQID NO152)；STF2.HA(PR8)1-1His(SEQ ID NO151)；STF2.HA(PR8)1-2His(SEQ ID NO153)；STF2.HA1-2(PR8)mutHis(SEQ ID NO155)。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，洛克弗，IL；#M801E与#M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明，分析条件培养基中IL-8的存在。
蛋白质抗原性ELISA为测定重组融合蛋白是否正确展示经折叠的HA抗原表位，遂通过ELISA评估下列纯化自杆状病毒培养物的构建体ngSTF2.HA(PR8)1-2mutHis(SEQ ID NO156)；ngSTF2.HA(PR8)1-1His(SEQID NO152)；STF2.HA(PR8)1-1His(SEQ ID NO151)；STF2.HA(PR8)1-2His(SEQ ID NO153)；STF2.HA1-2mutHis(SEQ ID NO155)及HA(PR8)1-1His(SEQ ID NO179)。将96-孔ELISA板以系列稀释于PBS(100μl/孔)的各标靶蛋白质(始于5μg/ml)，于4℃下涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)，于室温下封阻一小时，然后于PBS-T中清洗三次。接着将固定剂量的一级抗体加至各孔。为分析HA反应性，遂将100μl/孔1:10,000稀释于ADB的非免疫或PR/8/34恢复期免疫血清加入。PR/8/34免疫血清是于，接受经实验测定得的次致死激发剂量为8 x 101鸡蛋感染性剂量的PR/8/34流感病毒的BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)中产生。然后令动物在感染后恢复>21天，此时将免疫血清分离及澄清化。
对于鞭毛蛋白或6x组氨酸标签的ELISA，是将抗6x His(因维托金；卡斯贝得，CA)，或鞭毛蛋白(Inotek；贝弗里，MA)的单克隆抗体以1μg/ml溶于ADB(100μl/孔)加入，并将板于室温下培育1小时，或于4℃下过夜。然后将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的经HRP-标记山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学；西葛洛弗，PA)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于微量板分光光度计(FARCyte，GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上测量A450。
结果与讨论 重组HA蛋白的表达及纯度重组STF2.HA融合蛋白的杆状病毒表达结果，是综合列示于表9中。所有蛋白质皆以中至高产量表达得。经金属螯合物层析术后的纯度大体上良好，且内毒素程度远低于0.1EU/μg的可接受限值。所有STF2融合蛋白皆证明具有效的试管内TLR5活性。
表9 将用于杆状病毒表达的蛋白，加工使其具有及不具有N-连结糖化位点，以测定此转译后修饰对蛋白质表达、折叠及生物活性的影响。ngSTF2.HA1-2.mutHis(PR8)(SEQ ID NO156)(为非糖化)，似乎以较相对应糖化蛋白质高，其程度表达于杆状病毒上清液中，表示糖化可能影响此蛋白质的折叠或分泌。然而，此蛋白质的糖化与非糖化版本，当通过蛋白质印迹进行分析时，似乎同等地与得自流感PR8-感染小鼠的恢复期血清反应。而且，ngSTF2.HA1-1His(PR8)(SEQ ID NO152)的表达程度较其糖化拷贝高，表示糖化对于此等蛋白质的影响可能不容易被一般化。
除了以较大规模表达及纯化的蛋白质外，亦分析STF2.HA1-3His(PR8)(SEQ ID NO157)与STF2.HA1-3mutHis(PR8)(SEQ ID NO158)的小规模杆状病毒上清液的HA抗体反应性。如以表达于大肠杆菌的STF2.HA1-3(PR8)蛋白质(SEQ ID NO92)所观察到者(参见实施例#4)，此等蛋白质显示于条件培养基的蛋白质印迹上，与PR8恢复期血清的反应性非常差。此结果进一步证明，STF2.HA1-3蛋白质(不论表达于原核或真核宿主)能够适当地折叠，并展现天然抗原表位。
抗原性通过ELISA分析数种于杆状病毒及大肠杆菌中制得的STF2.HA蛋白质。所有STF2融合蛋白皆同样与抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)反应良好，表示相等蛋白质加样于该分析中。然后通过测量各蛋白质与已从PR/8/34流感病毒感染恢复的小鼠血清的反应，来检验STF2.HA融合蛋白中抗体抗原表位的适当折叠与展示。杆状病毒所表达的STF2.HA1-1His(PR8)(SEQID NO151)、ngSTF2.HA1-1His(PR8)(SEQ ID NO152)及ngSTF2HA1-2mutHis(PR8)(SEQ ID NO156)及大肠杆菌所表达STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)(参见实施例#4)，与PR/8/34恢复期血清的反应性相当。因此，血清抗体识别HA球状头部，可能集中于被HA1-2包含的区域。再者，于大肠杆菌所制得STF2.HA1-2(SEQ ID NO90)的试管内折叠，产生一种其具有与从真核宿主(杆状病毒)经加工及分泌出的蛋白质的免疫反应性相当(而因此折叠构型相似)的蛋白质。此外，HA球状头部的血清抗体识别，可能似乎不仰赖糖化，且(至少对PR/8/34HA而言)可能不消极地受糖化影响。源自不同流感病毒株的HA(血细胞凝集素)具有各种不同N-连结糖化形式。糖化可能消极地影响其它HAs的免疫识别。HA的血清抗体识别可不受N-糖化影响。可能是糖化可不然影响有效性，例如疫苗的半衰期。
实施例9于杆状病毒制得的重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的免疫原性 材料与方法 动物研究使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)。将小鼠分组每组10只，并于第0及14天接受鼠蹊部附近皮下(s.c)致免如下 1)PBS(磷酸盐缓冲食盐水) 2)3μg的STF2.HA1-2(PR8)大肠杆菌(SEQ ID NO90)于PBS 3)3μg的STF2.HA1-1(PR8)杆状病毒(SEQ ID NO151)于PBS 4)3μg的ngSTF2.HA1-1(PR8)杆状病毒(SEQ ID NO152)于PBS 5)0.3μg的ngSTF2.HA1-1(PR8)杆状病毒(SEQ ID NO152)于PBS 6)3μg的STF2.HA1-1(PR8)大肠杆菌(SEQ ID NO89)于PBS 7)0.3μg的STF2.HA1-1(PR8)大肠杆菌(SEQ ID NO89)于PBS 将小鼠于第10天(初级)及21天(促升)采血，并将血清通过凝结与离心澄清化，并储放于-20℃下。将经免疫小鼠于第28天通过鼻内投予LD90(8 x 103EID)的PR/8/34病毒而进行激发(参见实施例6)。于激发后每日侦查动物的存活、体重流失及临床表征达21天。
血清抗体测定通过ELISA测定HA-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板(Costar(Cat #9018)，康宁，NY)于4℃下，以100μl/孔于果蝇制造的HA0sHis蛋白质(SEQ ID NO176)溶于PBS(5μg/ml)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根，(Cat#555213)，胜地牙哥，CA)于室温下封阻一小时。将板于含有0.05％(v/v)Tween 20(PBS-T)中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学(Cat#115-035-146))加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯(Cat# 34028)，洛克弗，PA)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte(杜尔哈，NC)微量板分光光度计上测量A450。
结果与讨论 表达于大肠杆菌及杆状病毒的STF2.HA1-1(PR8)的免疫原性与功效将BALB/c小鼠于第0及14天以3.0或0.3μg所指定的重组蛋白质经s.c.致免。于第21天将动物采血，并通过对抗果蝇表达的HA0sHis蛋白质(SEQ ID NO176)的ELISA检测HA-特异性IgG效价。图12A，12B显示所述蛋白质诱导不同程度的HA-特异性IgG，其中ngSTF2.HA1-1(PR8)(SEQ ID NO152)诱导与以表达于大肠杆菌的STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)致免的动物中观察到相似的最强反应。令人感兴趣地，经于杆状病毒表达含有完整糖化序列的STF2.HA1-1(PR8)(SEQ ID NO151)引发少至无法检测的对抗HA或鞭毛蛋白的抗体，明显与以其中共同糖化序列已被去除的STF2.HA1-1(PR8)(SEQ IDNO152)同样致免的动物中所观察到的结果相反。
将经免疫小鼠于第28天通过鼻内投予LD90(8 x 103EID)的PR/8/34病毒而进行激发。于激发后每日侦查动物的存活、体重流失及临床表征达21天。如图13A、13B、13C所示，经PBS-致免的小鼠在早如激发后三天，即呈现感染征状(体重流失与较低的临床分数)，且于第21天以前即死亡，而经3.0μg重组STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)融合蛋白致免的小鼠，因少或无观察到感染的临床征状或体重流失，而证明有增强的保护作用。虽然经STF2.HA1-1融合蛋白致免的动物证明，其较经单独PBS致免的动物具有显著较高的功效，但此等动物相较于接受STF2.HA1-2(PR8)(SEQ ID NO90)的动物，在纯活、临床分数及总体重流失方面，呈现较低的功效。此等结果证明，于杆状病毒键联至STF2的HA亚单位为免疫原性且有效，并暗示表达于大肠杆菌或杆状病毒的STF2.HA1-1(SEQ ID NO89)，较表达于大肠杆菌或杆状病毒的STF2.HA1-2(SEQ ID NO89)具有较差的免疫原性且较无效。
实施例10STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的纯化 材料与方法 细胞储备将经操作用以表达STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的大肠杆菌细胞，适应培养于专属MRSF培养基中，甘油储备物储存为1mL等份，并储放于-70℃。
MRSF培养基，pH7.0 组成 g/L 葡萄糖 10 KH2PO4 7.8 (NH4)2SO4 2.33 Citric Acid 1.0 MgSO4(7H20) 1.0 CaCl2 0.04 微量金属 1ml 硫胺素HCl 0.01 卡那霉素 0.0075 微量金属溶液 1000x 组成 g/L EDTA，二钠 5 FeSO4(7H2O) 10 ZnSO4(7H2O) 2 MnSO4(H2O)2 CoCl2(6H2O)0.2 CuSO4(5H2O) 0.1 Na2MoO4(2H2O)0.2 H3BO3 0.1 H2O 1000ml 细胞规模扩大将两瓶(2ml，储备于MRSF培养基中)经操作用以表达STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的大肠杆菌细胞从-70℃恢复，并接种至500ml的MRSF培养基中。将细胞通过于-37℃培育11.5小时扩增，其时的OD600为3.2。细胞规模扩大可提供用于接种，使用在发酵的生产生物反应器的生物质量。
发酵将250mL经规模扩大的细胞，用于接种12L作用体积含有10L专用MRBR培养基的生物反应器。将培养物伴随恒定搅拌，同时维持pH值于7.0±0.1，温度于30±0.1℃，且溶氧量(DO)于不大于30％进行培育，且以批份模式进行直到葡萄糖耗尽为止。葡萄糖耗尽是以所要求的O2突然减少为指标，且通过于YSI 2700选择葡萄糖计测量葡萄糖浓度来确认。此时培养物的OD600为20.1AU。
于葡萄糖耗尽后三十分钟，将喂料培养基于受控速度下以帮浦打入生物反应器中直到加入2L喂料为止。于葡萄糖-限制条件下持续培育5.5小时。于OD600为34AU时，通过将IPTG加入至终浓度为2mM，并伴随恒定搅拌培育2小时，而诱导培养物中的蛋白质表达。于诱导期结束时，通过于Avanti JP-20XP离心机中，于10,000g下离心20分钟收取细胞。培养物的最终OD600为58AU，且通过BCA测定得的总体蛋白质浓度为6.73mg/mL。从10.8L收取物回收得1.16kg细胞沉淀，并于-20℃下冷冻。总生物反应器操作时间为17小时。由SDS PAGE确定STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)制造。
MRBR培养基，pH 7.0 组成 g/L 葡萄糖 20 KH2PO4 2.2 (NH4)2SO4 4.5 柠檬酸 1.0 MgSO4(7H20) 1.0 CaCl2 0.04 微量金属 1ml 硫胺素HCl 0.01 消泡剂 0.05 卡那霉素 0.0075 喂料培养基，pH6.0-添加至MRBR培养基(2L最终体积) 组成 g/L 葡萄糖 160 KH2PO4 5.6 DL-丙氨酸 50.0 柠檬酸 3.0 MgSO4(7H20) 1.0(以78g/L溶液添加) CaCl22.5(以80g/L溶液添加) 微量金属 24ml FeSO47H2O 0.75 细胞破坏与澄清化将细胞沉淀解冻，并再悬浮成为50mM Tris，25mMNaCl，pH8的15％悬浮液。将浆液于APV1000均质器中，于12,000psi下三次进行均质化。将溶解产物通过添加醋酸调整至pH4.0，并离心以分离可溶性与不可溶性物质。STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)与其它蛋白质一起分配至不可溶性部分。将可溶性物质丢弃，并将不可溶性物质(沉淀)溶解于两倍原始溶解产物体积的50mM醋酸，1％ TritonX-100，8M尿素，pH 4中。待混合于0psi的均质器中，将样本离心并收集上清液，过滤并储放于4℃下。通过SDSPAGE确定适当相(沉淀或上清液)中STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的存在。
阳离子交换层析术(CEX)将经澄清化的物质加样至50ml Poros 50HS管柱。此步骤是设计用以使洗脱物相较于加样物，可降低内毒素浓度，减少核酸浓度及增加STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)纯度。待加样后，将管柱以五管柱体积的50mM醋酸，1％ Triton X-100，8M尿素，pH 4，及随后以10管柱体积的50mM醋酸，8M尿素，pH 4冲洗。将蛋白质于至1M NaCl的0-100％梯度中进行洗脱。标靶蛋白质是于大约300mM NaCl下洗脱出。汇集主要高峰(洗脱物)并储放于4℃下。通过SDS PAGE确定洗脱液中STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的存在。通过比对加样物质与该洗脱液中，蛋白质条带的数目与强度而测定STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)经此步骤的纯化。
于阳离子交换层析术(CEX)中去除内毒素内毒素是以50mM醋酸，1％Triton X-100，8M尿素，pH 4清洗及适当洗脱条件，从洗脱STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)去除。此是使用STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)测试。将两回合包含与不含50mM醋酸，1％ Triton X-100，8M尿素，pH 4冲洗(ER冲洗对无ER冲洗)的阳离子交换操作(Toso SP650M树脂)进行比较，于150mMNaCl下ER冲洗洗脱液中的内毒素浓度显示，明显较从相同回合的250mmNaCl洗脱液，或于不含50mM醋酸，1％ Triton X-100，8M尿素，pH 4冲洗的洗脱液的内毒素浓度少。
洗脱液[内毒素] [内毒素] [蛋白质]通过 UV 回合 (mM aCl) (EU/mL)(EU/mg) BCA(g/L) 280/260 装载N/A 4.4 x 106 1.8 x 1062.39 - 100 7.9 x 106 4.2 x 1061.44 1.05 No ER冲洗 250 8.0 x 106 4.1 x 1061.12 2.76 150 5，112 2，888 1.77 0.982 ER冲洗 250 24，440N/A N/A 0.545 再折叠将CEX洗脱物对50mM Tris，8M尿素，pH 8缓冲液透析，并通过快速稀释至10体积进行再折叠。
阴离子交换层析术(AEX)将经再折叠的蛋白质加样至25ml GE蔗糖Q管柱。此步骤是设计用以将经适当折叠的STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)与聚集物及宿主细胞蛋白质分离，并相较于加样物减低洗脱物的内毒素浓度。于加样后，将管柱以五管柱体积的50mM Tris，25mM NaCl，pH8冲洗。将蛋白质于至1M NaCl的0-100％梯度中进行洗脱。于大约150mM NaCl下洗脱出富含经适当折叠的STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)，而含有低内毒素(1.7EU/mL)的高峰。于大约170至270mM NaCl下洗脱出的第二高峰，含有其它包括STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)聚集物的蛋白质。汇集第一高峰中的流份，并储放于4℃下。保留得自第一高峰的流份供进一步处理。通过SDSPAGE确定第一与第二洗脱液中STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的存在。通过比对加样物质与该洗脱液中，蛋白质条带的数目与强度而测定STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)经此步骤的纯化。
制备型尺寸排除层析术(SEC)将AEX洗脱物以2 x 5mL流份对TBS，于320ml SEC管柱上流通。此步骤是设计用以将经正确折叠的STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)与其它蛋白质分离。各流通结果产生单一主要高峰的洗脱物，将其收集、汇集并通过0.22μm滤器。将产物储放于-70℃下。
通过SDS PAGE确定该洗脱液中STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的存在。通过比对加样物质与该洗脱液中，蛋白质条带的数目与强度而测定STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)经此步骤的纯化。于SDS PAGE上的最终物质分布为一条强的单一条带。
结果与讨论 蛋白质的最终特征化重组STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)蛋白是于大肠杆菌中表达，并经纯化至均一性。将最终产物调配于1x TBS(27.7mM Tris，2.7mM KCl，137mM NaCl，pH 7.4；从10x储备物制得，Teknova目录#T9530)，并以1.0ml等份储放于-70℃下。最终产量为5.75ml(45ml浓度为0.35mg/ml)，其中以LAL方法测得的内毒素含量为1.1EU/mg蛋白质。当于基于细胞的细胞介素释出分析中测量时，仍保有TLR5生物活性。
SDS-PAGE通过SDS-PAGE测定蛋白质同一性及评估纯度。将一等分样本稀释于SDS-PAGE样本缓冲液及稀释剂中。将样本煮沸5分钟，并加样至4至12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(因维托金NuPage)上，并进行电泳术。将凝胶以考马西蓝R-250染色，以呈现蛋白质条带。由位于相较于相同凝胶上的BioRad精密加标准物的约75kDa处的条带，指出STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)的阳性结果。通过目测比较STF2.HA1-2(IND)(SEQ ID NO159)相对于所有其它条带的强度评估其纯度。
TLR5生物活性分析HEK293细胞固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将测试蛋白质加入且培育过夜。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，洛克弗，IL；#M801E与#M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中的IL-8存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，艾默逊)测量光学密度。
内毒素分析使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(Cambrex)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定内毒素浓度。
蛋白质分析使用Micro BCA(二金鸡纳酸)分析(皮尔斯)以微量板格式，使用牛血清白蛋白作为标准物，根据制造商的说明，测定总体蛋白质浓度。
UV280/260分析此项分析为测量样本中，相较于蛋白质浓度的核酸浓度。核酸的最大吸光值发生于大约260nm，而蛋白质的最大吸光值发生于大约280nm。于280nm的吸光值对于260nm的吸光值比值较高，表示样本富含蛋白质多于核酸。
实施例11于果蝇中所制得重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的克隆、表现与生物化学特征化 材料与方法 HA于果蝇(Drosophila)的克隆及表达使用QIAamp MinElute病毒离心试剂盒(奎尔金，Cat#57704)，依照制造商的说明，从流感A品系A/波多黎各/8/34分离出RNA。使用RT用SuperScript III第一股合成系统(因维托金；Cat#18080-051)，或具有铂-Taq高正确性的SuperScript III一步骤RT-PCR系统(因维托金；Cat# 12574-030)，依照制造商的说明将HA RNA反转录，并将cDNA使用TOPO克隆载体PCRII Zero Blunt(因维托金)进行克隆。然后将HA0s片段(不含信号序列与跨膜功能域的HA基因)，使用基于PCR的策略于卡匣的C-端与NH2端，次克隆入pMT/STF2Δ中，而分别产生构建体STF2Δ.HA0s(PR8)(SEQ ID NO160)及HA0s(PR8).STF2Δ(SEQ ID NO167)。亦将HA基因克隆入不含STF2Δ的pMT/Bip/V5-his载体中，而产生构建体HA0s.his(SEQ ID NO170)。表10列示所述构建体及用于构建彼等的引物。
表10用于果蝇中表达的PR8HA构建体 重组蛋白质从果蝇Dmel-2细胞的表达将HA0s.His(SEQ ID NO170)及STF2Δ.HA0s(SEQ ID NO164)质粒，与pCoBlast质粒共-转感染至果蝇Dmel-2细胞中，而产生Dmel-2 HA0sHis(PR8)及Dmel-2 STF2Δ.HA0s(PR8)稳定细胞。将Dmel-2稳定细胞从黏着培养物扩增至，存在选择培养基[果蝇Sfm培养基(因维托金；卡斯贝得，CA)+25μg/ml杀稻瘟素]的振荡培养物，然后扩大至12L生产规模。
通过添加CuSO4至最终浓度为0.5mM，诱导重组蛋白质表达。经培育72小时后，将细胞以离心从条件培养基移除。然后将条件培养基通过通过0.22μm滤器澄清化，并储放于4℃下。
HA0sHis(PR8)(SEQ ID NO176)的纯化将条件培养基加样至充以NiSO4，并于缓冲液A[20mM Tris，pH 8.0，0.5M NaCl]平衡的螯合琼脂糖管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)，并于以缓冲液B[缓冲液A+0.5M咪唑]的线性梯度中进行洗脱。将蛋白通过于经1X Tris-缓冲食盐水(TBS)，pH 8.0平衡的Superdex 200 SEC管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上进行级分而进一步纯化。汇集HA0s.His6(PR8)流份，等分并储放于-80℃。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过SDS-PAGE测定蛋白质同一性，及评估纯度。将5μg等分的各别样本稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(LifeGels；法蓝斯森林，新南韦尔斯，AUS)上，并进行电泳术。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；赫尔克里士，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行总体蛋白质如前所述进行电泳，然后经电-转移至PVDF膜上，并以5％(w/v)奶粉封阻，之后以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)，或流感A PR/8/38恢复期免疫小鼠血清(如下于蛋白质抗原性ELISA所述)进行探测。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯，洛克弗，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加，马地森，WI)呈现蛋白质条带。
蛋白质分析使用Micro BCA(二金鸡纳酸)分析(皮尔斯，洛克弗IL)以微量板格式，使用牛血清白蛋白作为标准物，根据制造商的说明，测定总体蛋白质浓度。
内毒素分析使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(Cambrex；E.卢瑟弗，NJ)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定内毒素程度。
TLR5生物活性分析HEK293细胞固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将含有HA0sHis(PR8)(SEQ ID NO176)或STF2Δ.HA0s(PR8)(SEQ ID NO177)的重组果蝇条件培养基加入。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，洛克弗，IL；#M801E and #M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中的IL-8存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)测量光学密度。
蛋白质抗原性ELISA通过ELISA测试经纯化的HA0s.His6(PR8)(SEQ IDNO176)，以测定重组蛋白质是否展示经正确折叠的HA抗原表位。将96-孔ELISA板以系列稀释于PBS(100μl/孔)的HA0s.His6(PR8)(SEQ ID NO176)蛋白质(始于5μg/ml)，于4℃下涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)，于室温下封阻一小时，然后于PBS-T中清洗三次。接着将固定剂量的一级抗体加至各孔。为分析HA反应性，遂将100μl/孔1∶10,000稀释于ADB的非免疫或PR/8/34恢复期免疫血清加入。PR/8/34免疫血清是于，接受经实验测定得的次致死激发剂量为8 x 101鸡蛋感染性剂量(EID)的PR/8/34流感病毒的BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)中产生。
然后令动物在感染后恢复>21天，此时将免疫血清分离及澄清化。对于6x组氨酸标签的ELISA，是将抗6x His(因维托金；卡斯贝得，CA)，或鞭毛蛋白(Inotek；贝弗里，MA)的单克隆抗体以1μg/ml溶于ADB(100μl/孔)加入，并将板于室温下培育1小时，或于4℃下过夜。然后将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学；西葛洛弗，PA)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，微量板分光光度计(FARCyte，GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)测量A450。
结果与讨论 果蝇-所表达的HA0s的特征化条件培养基以抗-His6抗体(因维托金；卡斯贝得，CA)的蛋白质印迹分析，确定HA0sHis(PR8)(SEQ ID NO176)的表达，而以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)的蛋白质印迹分析，确定STF2Δ.HA0s(PR8)(SEQ ID NO177)由经相对应表达载体转感染的果蝇Dmel-2细胞的表达。该二蛋白质皆由呈非还原形式，以小鼠PR/8/34恢复期免疫血清的蛋白质印迹识别，而蛋白质经DTT还原后即消除识别。此结果指出该二分泌型蛋白质具有正确二硫键。STF2Δ.HA0s(PR8)(SEQ ID NO177)条件培养基展现显著的试管内TLR5活性，而HA0sHis6(PR8)(SEQ ID NO176)培养基则否(如所预期)。最后通过ELISA，经纯化的HA0sHis6(PR8)(SEQ ID NO176)蛋白显示，其与PR/8/34恢复期免疫血清具有显著反应性。此等结果表示，HA0s蛋白质是以经适当折叠的形式，从果蝇Dmel-2细胞分泌出。
实施例12代表病毒株A/越南/1203/04的重组型纤毛蛋白-血细胞凝集素融合蛋白质的免疫原性及功效 材料与方法 动物研究使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)。将小鼠分组每组15只，并于第0及14天接受皮下(s.c)致免如下 ·PBS(磷酸盐缓冲食盐水) ·无致免 ·10μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)于PBS ·3.0μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)于PBS ·1μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)于PBS 将小鼠于第21天采血，并将血清通过凝结与离心澄清化，并储放于-20℃下。
血清抗体测定通过ELISA测定HA-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板(Costar(Cat#9018)康宁，NY)于4℃下，以100μl/孔得自越南/1203/04的HA蛋白质，于杆状病毒制得，(BEIR目录编号NR-660)存于PBS(1μg/ml)进行涂覆过夜。将板以300μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法玛明，(Cat#555213)(胜地牙哥，CA)于25℃下封阻二小时。将板于PBS+0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于25℃下培育1.5小时。将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学，西葛洛弗，PA(Cat#115-035-146))加入(100μl/孔)，并将板于25℃下培育30分钟。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯(Cat 34028)，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于SpectraMax 190(分子装置，太阳谷，CA)微量板分光光度计上测量A450。
流感病毒激发小鼠为分析功效，遂将小鼠于第28天通过鼻内投予10LD90(10x使90％小鼠致死的剂量)(6 x 103EID)的流感A/越南/1203/04而进行激发。于激发后每日侦查动物的存活、体重流失及临床表征达21天。
流感H5N1储备物的制备流感A/越南/1203/04(H5N1)是得自疾病管制及预防中心(亚特兰大，GA)。于10-天龄含胚胎鸡蛋中制备得病毒储备物，并分为0.5ml等分储放于-80℃直到使用。
病毒效价的测定利用接种于96-孔板中，并生长至铺满的MDCK细胞测定TCID50(50％组织培养感染剂量)。将一系列病毒log10稀释液接种于四重复板上。然后将板培育48-72小时。通过确定使四重复孔板中有1/2阳性与1/2阴性病毒生长的稀释度，而测定得TCID50。EID50是通过将储备物的log10稀释液接种至2-4鸡蛋每稀释度而进行测定。将蛋培育40-48小时，并从每一鸡蛋收取1ml尿囊液。EID50经计算为其使1/2鸡蛋呈阴性，且1/2鸡蛋呈阳性病毒感染的稀释度。
结果与讨论 于以STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)免疫后诱导HA-特异性IgG反应STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)的免异原性是通过，于第0及14天以10、3及1μg蛋白质一的剂量范围，经皮下免疫BALB/c小鼠(15/组)而进行检验。阴性对照组小鼠是以TBS致免或未经致免。于促升(第21天)后7天，通过ELISA检验HA-特异性IgG反应。结果证明，以10、3或1μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)进行致免，可以剂量-依赖性方式诱导一致且显著的HA-特异性IgG反应(图14-16)。
以STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)致免提供免于以流感A的致死激发的保护作用前述的血清学分析证明，小鼠以STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)致免，可产生识别天然HA的抗体反应。为评估功效，遂将相同小鼠于第28天经鼻内投予10LD90(6x103EID)的A/越南/1203/04病毒而进行激发。于激发后每日侦查小鼠的存活及临床表征达21天。如图17所示，经TBS-致免或未经任何免疫的小鼠在早如激发后五天，即呈现感染征状(体重流失与较低的临床分数)，且所有小鼠于激发后第9天全部死亡。对于经STF2.HA1-2(VN)致免的小鼠，在所接受剂量与功效间有明确的关系。经10μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)致免的小鼠，证明有显著增强的保护作用。经3或1μg的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)致免的小鼠，证明对于功效分别有适度至可忽略的冲击。临床参数同样与剂量相关，且接受最高剂量STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)的动物呈现最温和的疾病征状。此等结果证明，经大肠杆菌表达的STF2.HA1-2(VN)(SEQ ID NO95)，诱导可于活体内成功保护BALB/c小鼠免于毒性A型流感病毒的致死激发的HA-特异性免疫反应。
SEQ ID NO1 A/波多黎各/8/34HA MKANLLVLLSALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGI APLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERF EIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIH HPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEAN GNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKL RMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITN KVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVK LESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI SEQ IDNO2 A/越南/1203/2004HA MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKP LILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHP NDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFI APEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLA TGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDG VTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFH DSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTDYPQYSEEARLKREEISGV KLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCR SEQ ID NO3 A/印度尼西亚/5/2005HA MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKP LILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQI IPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPN DAAEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIA PEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLAT GLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGV TNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHD SNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRNGTYNYPQYSEEARLKREEISGV KLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI SEQ ID NO4 A/新喀里多尼亚/20/1999 MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIA PLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEI FPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHH PPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGN LIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLR MVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITN KVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSN VKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKL ESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI SEQ ID NO5 A/南卡罗来那/1/18HA MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIA PLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFEKFE IFPKTSSWPNHETTKGVTAACSYAGASSFYRNLLWLTKKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGV HHPPTGTDQQSLYQNADAYVSVGSSKYNRRFTPEIAARPKVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTITFE ATGNLIAPWYAFALNRGSGSGIITSDAPVHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRST KLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGI TNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDS NVRNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGVK LESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI SEQ ID NO6 A/威斯康辛/67/2005HA QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQ NGTSSACKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFLHA QASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSI MRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR SEQ ID NO7 A/X31亚型H3N2HA QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLID ALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVIQNG GSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGIHHPSTNQEQTSLYVQAS GRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSI MRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQT SEQ ID NO8 PR/8 HA1-1 SHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEEL REQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNK 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NSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVN GQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVK KG SEQ ID NO17 NC HA1-1 SHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEEL REQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNN KEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVS SHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTL LEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIG ECPKYVR SEQ ID NO18 NC HA1-2 KGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSF ERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLW GVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFE ANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITS SEQ ID NO19 NC HA1-3 NPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLW LTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIA KRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRG SEQ ID NO20 WIS HA1-1 QSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASL RSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEK FDKLYIWGVHHPGTDNDQIFLHAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDI LLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVK SEQ ID NO21 WIS HA1-2 SPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTL EFNDESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGV HHPGTDNDQIFLHAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLI APRGYFKIRSGKSSIMRSD SEQ ID NO22 WIS HA1-3 SNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNNSFFSRLNWLTHLKF KYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFLHAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNI PSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSG SEQ ID NO23 A/波多黎各/8/34HA0s DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNP ECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTA ACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAY VSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGS 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TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAAAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGTAGCGGCAGTGGTAGCGGATCCTCTCATAACGGTAAACTGTGT CGTCTGAAAGGTATTGCACCACTGCAGCTGGGCAAATGCAACATCGCGGGTTGGCTGCTG GGTAACCCTGAATGTGACCCGCTGCTGCCGGTTCGTTCCTGGAGCTACATTGTTGAAACC CCGAACTCCGAAAACGGTATCTGCTACCCGGGCGACTTTATTGACTATGAAGAACTGCGT GAGCAGCTGTCTTCCGTGAGCAGCTTTGAACGCTTCGAAATCTTCCCGAAGGAAAGCTCC TGGCCGAACCACAACACTAACGGCGTGACGGCGGCTTGCTCCCACGAAGGCAAATCTTCC TTTTATCGTAACCTGCTGTGGCTGACTGAAAAGGAAGGTTCCTACCCAAAACTGAAAAAC AGCTATGTTAACAAAAAGGGTAAAGAAGTCCTGGTGCTGTGGGGCATCCACCACCCGCCG AACTCCAAGGAACAGCAGAATCTGTATCAGAACGAAAACGCATACGTTTCTGTCGTTACT TCCAACTATAACCGTCGTTTCACTCCGGAAATCGCGGAACGTCCGAAAGTACGCGACCAG GCTGGCCGTATGAACTACTACTGGACCCTGCTGAAACCGGGTGACACTATTATCTTCGAA GCTAACGGTAACCTGATCGCACCAATGTACGCTTTCGCACTGTCTCGTGGTTTCGGTTCC GGCATTATCACCAGCAACGCGTCTATGCACGAATGCAACACGAAATGTCAGACGCCGCTG GGCGCAATTAATAGCAGCCTGCCGTACCAGAACATCCACCCGGTGACTATCGGCGAATGC CCGAAGTATGTTCGTCATCACCATCATCACCATTAATAG SEQ ID NO55 STF2.HA1-2PR8 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTAAAGGTATTGCTCCACTGCAA CTGGGTAAATGCAATATTGCGGGTTGGCTGCTGGGCAACCCGGAATGCGATCCGCTGCTG CCGGTCCGTTCCTGGAGCTATATTGTTGAAACTCCGAACTCTGAGAACGGCATCTGCTAT CCAGGTGATTTCATTGACTATGAGGAACTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGTCTTCCTTT GAACGTTTCGAGATTTTTCCTAAAGAATCTTCTTGGCCGAACCATAACACTAATGGTGTT ACCGCTGCGTGCTCTCATGAAGGTAAATCTAGCTTTTACCGCAACCTGCTGTGGCTGACC GAGAAAGAAGGTTCTTACCCGAAACTGAAAAACAGCTACGTAAACAAAAAGGGCAAGGAA GTTCTGGTCCTGTGGGGTATCCACCATCCGCCGAACAGCAAGGAACAGCAGAATCTGTAT CAGAACGAAAACGCATACGTATCTGTTGTTACTTCTAACTACAACCGCCGTTTCACCCCT GAAATCGCGGAACGTCCGAAAGTGCGTGACCAGGCAGGCCGCATGAACTATTACTGGACC CTGCTGAAGCCGGGTGATACTATCATCTTCGAAGCGAACGGTAACCTGATCGCCCCGATG TACGCGTTCGCTCTGAGCCGTGGCTTCGGCTCTGGTATCATTACGTCTTAATAA SEQ ID NO56 STF2.HA1-2mut PR8 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTAGCGAGCGGCAGTGGTAGCGGATCCAAAGGTGCGGCTCCACTGCAA CTGGGTAAATGCAATATTGCGGGTTGGCTGCTGGGCAACCCGGAATGCGATCCGCTGCTG CCGGTCCGTTCCTGGAGCGATATTGCGGAAACTCCGAACTCTGAGAACGGCATCTGCTAT CCAGGTGATTTCATTGACTATGAGGAACTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGTCTTCCTTT GAACGTTTCGAGATTTTTCCTAAAGAATCTTCTTGGCCGAACCATAACACTAATGGTGTT ACCGCTGCGTGCTCTCATGAAGGTAAATCTAGCTTTTACCGCAACCTGCTGTGGCTGACC GAGAAAGAAGGTTCTTACCCGAAACTGAAAAACAGCTACGTAAACAAAAAGGGCAAGGAA GTTCTGGTCCTGTGGGGTATCCACCATCCGCCGAACAGCAAGGAACAGCAGAATCTGTAT CAGAACGAAAACGCATACGTATCTGTTGTTACTTCTAACTACAACCGCCGTTTCACCCCT GAAATCGCGGAACGTCCGAAAGTGCGTGACCAGGCAGGCCGCATGAACTATTACTGGACC CTGCTGAAGCCGGGTGATACTATCATCTTCGAAGCGAACGGTAACCTGATCGCCCCGATG TACGCGTTCGCTCTGAGCCGTGGCTTCGGCTCTGGTATCATTACGTCTTAATAA SEQ ID NO57 STF2.HA1-3 PR8 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGTTCTGGTAGCGGTTCTGGCTCTAACTCTGAAAATGGTATCTGT TACCCGGGTGATTTCATCGATTATGAGGAACTGCGTGAACAGCTGTCTAGCGTGAGCTCC TTTGAACGCTTCGAAATCTTCCCGAAGGAATCTAGCTGGCCGAACCATAACACGAACGGT GTGACCGCTGCTTGCTCCCACGAAGGTAAGAGCTCCTTCTACCGCAATCTGCTGTGGCTG ACTGAAAAAGAAGGTAGCTACCCGAAACTGAAAAATTCTTACGTCAACAAGAAAGGCAAG GAAGTGCTGGTTCTGTGGGGCATTCACCACCCACCGAACAGCAAAGAGCAACAGAACCTG TACCAAAATGAGAACGCTTACGTTTCTGTTGTGACTTCTAACTACAATCGTCGCTTTACC CCTGAAATCGCGGAGCGTCCAAAAGTGCGTGACCAGGCTGGTCGTATGAACTACTATTGG ACCCTGCTGAAACCGGGCGACACCATTATCTTTGAAGCGAACGGTAACCTGATCGCGCCT ATGTACGCGTTCGCTCTGTCTCGTGGCTAATAA SEQ ID NO58 STF2.HA1-3mut PR8 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGTAGCGGCAGTGGTAGCGGATCCAACTCTGAAAATGAAATCTGT TACCCGGGTGATTTCATCGATAAAGAGGAACTGCGTGAACAGCTGTCTAGCGTGAGCTCC TTTGAACGCTTCGAAATCTTCCCGAAGGAATCTAGCTGGCCGAACCATAACACGAACGGT GTGACCGCTGCTTGCTCCCACGAAGGTAAGAGCTCCTTCTACCGCAATCTGCTGTGGCTG ACTGAAAAAGAAGGTAGCTACCCGAAACTGAAAAATTCTTACGTCAACAAGAAAGGCAAG GAAGTGCTGGTTCTGTGGGGCATTCACCACCCACCGAACAGCAAAGAGCAACAGAACCTG TACCAAAATGAGAACGCTTACGTTTCTGTTGTGACTTCTAACTACAATCGTCGCTTTACC CCTGAAATCGCGGAGCGTCCAAAAGTGCGTGACCAGGCTGGTCGTATGAACTACTATTGG ACCCTGCTGAAACCGGGCGACACCATTATCTTTGAAGCGAACGGTAACCTGATCGCGCCT ATGTACGCGGCGGCTCTGTCTCGTGGCTAATAA SEQ ID NO59 HA1-1 PR8 ATGTCTCATAACGGTAAACTGTGTCGTCTGAAAGGTATTGCACCACTGCAGCTGGGCAAA TGCAACATCGCGGGTTGGCTGCTGGGTAACCCTGAATGTGACCCGCTGCTGCCGGTTCGT TCCTGGAGCTACATTGTTGAAACCCCGAACTCCGAAAACGGTATCTGCTACCCGGGCGAC TTTATTGACTATGAAGAACTGCGTGAGCAGCTGTCTTCCGTGAGCAGCTTTGAACGCTTC GAAATCTTCCCGAAGGAAAGCTCCTGGCCGAACCACAACACTAACGGCGTGACGGCGGCT TGCTCCCACGAAGGCAAATCTTCCTTTTATCGTAACCTGCTGTGGCTGACTGAAAAGGAA GGTTCCTACCCAAAACTGAAAAACAGCTATGTTAACAAAAAGGGTAAAGAAGTCCTGGTG CTGTGGGGCATCCACCACCCGCCGAACTCCAAGGAACAGCAGAATCTGTATCAGAACGAA AACGCATACGTTTCTGTCGTTACTTCCAACTATAACCGTCGTTTCACTCCGGAAATCGCG GAACGTCCGAAAGTACGCGACCAGGCTGGCCGTATGAACTACTACTGGACCCTGCTGAAA CCGGGTGACACTATTATCTTCGAAGCTAACGGTAACCTGATCGCACCAATGTACGCTTTC GCACTGTCTCGTGGTTTCGGTTCCGGCATTATCACCAGCAACGCGTCTATGCACGAATGC AACACGAAATGTCAGACGCCGCTGGGCGCAATTAATAGCAGCCTGCCGTACCAGAACATC CACCCGGTGACTATCGGCGAATGCCCGAAGTATGTTCGT SEQ ID NO60 HA1-1.his PR8 ATGTCTCATAACGGTAAACTGTGTCGTCTGAAAGGTATTGCACCACTGCAGCTGGGCAAA TGCAACATCGCGGGTTGGCTGCTGGGTAACCCTGAATGTGACCCGCTGCTGCCGGTTCGT TCCTGGAGCTACATTGTTGAAACCCCGAACTCCGAAAACGGTATCTGCTACCCGGGCGAC TTTATTGACTATGAAGAACTGCGTGAGCAGCTGTCTTCCGTGAGCAGCTTTGAACGCTTC GAAATCTTCCCGAAGGAAAGCTCCTGGCCGAACCACAACACTAACGGCGTGACGGCGGCT TGCTCCCACGAAGGCAAATCTTCCTTTTATCGTAACCTGCTGTGGCTGACTGAAAAGGAA GGTTCCTACCCAAAACTGAAAAACAGCTATGTTAACAAAAAGGGTAAAGAAGTCCTGGTG CTGTGGGGCATCCACCACCCGCCGAACTCCAAGGAACAGCAGAATCTGTATCAGAACGAA AACGCATACGTTTCTGTCGTTACTTCCAACTATAACCGTCGTTTCACTCCGGAAATCGCG GAACGTCCGAAAGTACGCGACCAGGCTGGCCGTATGAACTACTACTGGACCCTGCTGAAA CCGGGTGACACTATTATCTTCGAAGCTAACGGTAACCTGATCGCACCAATGTACGCTTTC GCACTGTCTCGTGGTTTCGGTTCCGGCATTATCACCAGCAACGCGTCTATGCACGAATGC AACACGAAATGTCAGACGCCGCTGGGCGCAATTAATAGCAGCCTGCCGTACCAGAACATC CACCCGGTGACTATCGGCGAATGCCCGAAGTATGTTCGTCATCACCATCATCACCAT SEQ ID NO61 HA1-2.his PR8 ATGAAAGGTATTGCTCCACTGCAACTGGGTAAATGCAATATTGCGGGTTGGCTGCTGGGC AACCCGGAATGCGATCCGCTGCTGCCGGTCCGTTCCTGGAGCTATATTGTTGAAACTCCG AACTCTGAGAACGGCATCTGCTATCCAGGTGATTTCATTGACTATGAGGAACTGCGTGAA CAACTGTCTTCCGTGTCTTCCTTTGAACGTTTCGAGATTTTTCCTAAAGAATCTTCTTGG CCGAACCATAACACTAATGGTGTTACCGCTGCGTGCTCTCATGAAGGTAAATCTAGCTTT TACCGCAACCTGCTGTGGCTGACCGAGAAAGAAGGTTCTTACCCGAAACTGAAAAACAGC TACGTAAACAAAAAGGGCAAGGAAGTTCTGGTCCTGTGGGGTATCCACCATCCGCCGAAC AGCAAGGAACAGCAGAATCTGTATCAGAACGAAAACGCATACGTATCTGTTGTTACTTCT AACTACAACCGCCGTTTCACCCCTGAAATCGCGGAACGTCCGAAAGTGCGTGACCAGGCA GGCCGCATGAACTATTACTGGACCCTGCTGAAGCCGGGTGATACTATCATCTTCGAAGCG AACGGTAACCTGATCGCCCCGATGTACGCGTTCGCTCTGAGCCGTGGCTTCGGCTCTGGT ATCATTACGTCTCATCACCATCATCACCAT SEQ ID NO62 CRM.HA1-2 ATGGGTGCTGATGATGTCGTTGATTCCTCCAAAAGCTTCGTTATGGAAAATTTCTCTTCT TATCACGGCACCAAACCGGGTTATGTGGATTCTATCCAAAAAGGCATCCAGAAACCGAAG TCCGGTACGCAGGGTAACTATGATGACGATTGGAAAGGTTTTTACTCCACCGATAATAAA TATGACGCGGCTGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCACTGTCTGGTAAGGCTGGCGGT GTCGTAAAGGTAACGTATCCTGGCCTGACCAAGGTGCTGGCACTGAAGGTGGATAACGCT GAAACCATCAAAAAGGAGCTGGGCCTGAGCCTGACTGAACCGCTGATGGAGCAGGTCGGT ACCGAGGAATTCATCAAACGCTTCGGTGATGGCGCCTCCCGTGTTGTGCTGTCCCTGCCG TTCGCAGAAGGCTCTTCCTCTGTCGAATATATCAACAACTGGGAACAGGCTAAAGCTCTG AGCGTCGAACTGGAAATTAACTTTGAGACCCGTGGCAAGCGTGGTCAGGACGCGATGTAC GAATATATGGCTCAGGCTTGTGCCGGTAACCGTGTTCGCCGTTCCGTCGGTTCCTCTCTG TCTTGCATCAACCTGGATTGGGACGTTATCCGTGATAAGACCAAAACCAAAATTGAAAGC CTGAAGGAACACGGTCCGATCAAAAACAAAATGTCTGAATCTCCGAACAAAACCGTGTCC GAGGAAAAAGCGAAACAGTATCTGGAAGAATTCCACCAGACTGCCCTGGAACATCCTGAA CTGTCCGAACTGAAGACTGTAACCGGCACTAACCCGGTGTTCGCAGGCGCAAACTACGCC GCGTGGGCGGTAAACGTTGCGCAGGTTATTGATAGCGAAACCGCAGATAACCTGGAAAAA ACGACCGCAGCTCTGTCTATCCTGCCGGGTATCGGTTCCGTTATGGGTATTGCGGACGGC GCTGTGCACCACAACACGGAAGAAATCGTCGCACAGTCTATCGCGCTGTCTTCTCTGATG GTTGCTCAGGCAATTCCACTGGTAGGTGAACTGGTGGACATTGGCTTTGCGGCGTACAAC TTCGTCGAAAGCATTATCAACCTGTTCCAGGTTGTACACAACTCTTACAACCGTCCGGCC TACAGCCCTGGCCACAAAACCCAACCGTTTCTGCACGACGGTTATGCGGTGTCCTGGAAC ACGGTTGAAGACTCTATCATTCGTACCGGCTTTCAGGGCGAGTCCGGCCACGATATCAAA ATTACTGCAGAAAACACTCCGCTGCCGATCGCTGGCGTTCTGCTGCCGACCATCCCGGGT AAGCTGGATGTGAACAAAAGCAAAACCCACATCTCTGTTAACGGTCGTAAAATTCGCATG CGCTGTCGTGCTATCGACGGTGATGTTACCTTCTGCCGTCCGAAATCTCCAGTCTACGTG GGCAACGGTGTTCATGCCAACCTGCACGTGGCGTTCCATCGTAGCTCTAGCGAAAAAATC CACTCCAACGAAATCTCTAGCGATTCTATCGGTGTTCTGGGTTATCAGAAAACGGTGGAT CATACGAAAGTCAATTCTAAACTGAGCCTGTTCTTCGAAATCAAATCTAGCGGCTCTGGA TCCGGTTCCAAAGGCATCGCGCCGCTGCAGCTGGGTAAATGTAACATTGCGGGCTGGCTG CTGGGTAATCCGGAATGCGATCCGCTGCTGCCGGTCCGTAGCTGGTCTTACATTGTTGAA ACTCCGAACTCTGAGAATGGCATCTGCTACCCGGGCGATTTTATCGACTATGAAGAACTG CGTGAACAGCTGTCTTCCGTTTCTTCCTTTGAACGTTTCGAAATCTTCCCGAAAGAAAGC AGCTGGCCGAATCACAATACGAACGGTGTTACTGCTGCGTGTTCTCATGAAGGTAAATCC AGCTTCTACCGTAACCTGCTGTGGCTGACCGAAAAAGAGGGTTCTTATCCTAAACTGAAA AACAGCTACGTTAACAAAAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGTATCCATCACCCT CCGAACTCTAAAGAACAACAGAATCTGTATCAGAACGAAAACGCTTACGTTTCCGTGGTG ACCTCTAACTATAACCGTCGTTTTACCCCGGAGATTGCTGAACGTCCGAAAGTGCGCGAT CAGGCTGGCCGTATGAACTACTATTGGACCCTGCTGAAACCGGGCGATACCATCATTTTC GAAGCTAACGGCAACCTGATTGCTCCGATGTATGCGTTTGCTCTGTCTCGTGGCTTCGGC TCTGGTATTATTACGTCTTAATAA SEQ ID NO63 LTB.HA1-2 ATGAATAAGGTTAAGTTCTACGTACTGTTTACCGCGCTGCTGTCTTCTCTGTGCGCGCAT GGTGCTCCGCAGTCTATTACTGAACTGTGCTCTGAATACCACAACACCCAGATCTATACT ATCAACGATAAAATCCTGAGCTATACCGAATCTATGGCAGGCAAACGCGAAATGGTTATC ATTACCTTTAAAAGCGGCGCCACCTTTCAAGTGGAAGTTCCGGGCTCTCAGCATATTGAC TCTCAAAAAAAAGCGATCGAACGTATGAAAGATACTCTGCGCATTACCTACCTGACCGAA ACCAAAATCGATAAACTGTGCGTATGGAACAATAAGACTCCTAACTCTATCGCAGCTATT TCTATGGAAAACTCTGGTAGCGGATCCGGTTCTAAAGGCATCGCGCCGCTGCAGCTGGGT AAATGTAACATTGCGGGCTGGCTGCTGGGTAATCCGGAATGCGATCCGCTGCTGCCGGTC CGTAGCTGGTCTTACATTGTTGAAACTCCGAACTCTGAGAATGGCATCTGCTACCCGGGC GATTTTATCGACTATGAAGAACTGCGTGAACAGCTGTCTTCCGTTTCTTCCTTTGAACGT TTCGAAATCTTCCCGAAAGAAAGCAGCTGGCCGAATCACAATACGAACGGTGTTACTGCT GCGTGTTCTCATGAAGGTAAATCCAGCTTCTACCGTAACCTGCTGTGGCTGACCGAAAAA GAGGGTTCTTATCCTAAACTGAAAAACAGCTACGTTAACAAAAAGGGCAAAGAAGTGCTG GTGCTGTGGGGTATCCATCACCCTCCGAACTCTAAAGAACAACAGAATCTGTATCAGAAC GAAAACGCTTACGTTTCCGTGGTGACCTCTAACTATAACCGTCGTTTTACCCCGGAGATT GCTGAACGTCCGAAAGTGCGCGATCAGGCTGGCCGTATGAACTACTATTGGACCCTGCTG AAACCGGGCGATACCATCATTTTCGAAGCTAACGGCAACCTGATTGCTCCGATGTATGCG TTTGCTCTGTCTCGTGGCTTCGGCTCTGGTATTATTACGTCTTAATAA SEQ ID NO64 STF2.HA1-1 VN ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG 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CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGGAGAAGAAACACAATGGCAAACTGTGTGATCTGGATGGTGTG AAACCGCTGATTCTGCGCGATTGCTCTGTGGCAGGCTGGCTGCTGGGCAACCCTATGTGT GACGAATTCATTAACGTTCCGGAATGGTCTTACATTGTTGAAAAAGCTAACCCTGTCAAC GATCTGTGTTACCCTGGTGACTTTAACGATTACGAAGAACTGAAGCACCTGCTGTCTCGT ATCAATCACTTCGAGAAAATCCAGATCATCCCGAAATCCTCCTGGAGCTCCCACGAAGCT TCTCTGGGCGTATCCTCCGCGTGCCCGTACCAGGGCAAATCCTCTTTCTTTCGTAACGTT GTTTGGCTGATCAAGAAAAACTCCACCTACCCGACGATCAAGCGTAGCTATAATAACACC AACCAGGAAGACCTGCTGGTTCTGTGGGGCATCCACCATCCAAACGATGCTGCGGAACAG ACCAAGCTGTACCAGAACCCGACCACCTACATCAGCGTGGGCACCTCTACGCTGAACCAG CGTCTGGTACCGCGTATCGCAACCCGCAGCAAGGTAAACGGTCAAAGCGGCCGCATGGAA TTTTTCTGGACCATCCTGAAACCGAACGACGCAATCAACTTCGAATCTAACGGCAATTTC ATCGCTCCGGAGTATGCGTACAAAATCGTAAAGAAAGGTGATAGCACTATCATGAAATCC GAGCTGGAATATGGCAACTGTAACACCAAATGCCAGACCCCGATGGGTGCAATCAACTCC TCCATGCCGTTTCACAACATTCACCCGCTGACTATCGGCGAATGTCCGAAATACGTTAAA TAGTAA SEQ ID NO65 FOR引物 AGTGGCTGAGCCTGTTAGCGGAGAAGAAACACAATGGCAAACTGTG SEQ ID NO66REV引物 AGTCGCTCAGCTTACTATTTAACGTATTTCGGACATTCGCCGATAGTCAG SEQ ID NO67 HA0s VN GTGCTGAGCCTGTTACGTCAGATTTGTATCGGCTACCACGCAAACAACTCTACCGAGCAA GTTGATACCATCATGGAGAAAAACGTGACCGTTACTCACGCGCAGGACATCCTGGAGAAG AAACACAATGGCAAACTGTGTGATCTGGATGGTGTGAAACCGCTGATTCTGCGCGATTGC TCTGTGGCAGGCTGGCTGCTGGGCAACCCTATGTGTGACGAATTCATTAACGTTCCGGAA TGGTCTTACATTGTTGAAAAAGCTAACCCTGTCAACGATCTGTGTTACCCTGGTGACTTT AACGATTACGAAGAACTGAAGCACCTGCTGTCTCGTATCAATCACTTCGAGAAAATCCAG ATCATCCCGAAATCCTCCTGGAGCTCCCACGAAGCTTCTCTGGGCGTATCCTCCGCGTGC CCGTACCAGGGCAAATCCTCTTTCTTTCGTAACGTTGTTTGGCTGATCAAGAAAAACTCC ACCTACCCGACGATCAAGCGTAGCTATAATAACACCAACCAGGAAGACCTGCTGGTTCTG TGGGGCATCCACCATCCAAACGATGCTGCGGAACAGACCAAGCTGTACCAGAACCCGACC ACCTACATCAGCGTGGGCACCTCTACGCTGAACCAGCGTCTGGTACCGCGTATCGCAACC CGCAGCAAGGTAAACGGTCAAAGCGGCCGCATGGAATTTTTCTGGACCATCCTGAAACCG AACGACGCAATCAACTTCGAATCTAACGGCAATTTCATCGCTCCGGAGTATGCGTACAAA ATCGTAAAGAAAGGTGATAGCACTATCATGAAATCCGAGCTGGAATATGGCAACTGTAAC ACCAAATGCCAGACCCCGATGGGTGCAATCAACTCCTCCATGCCGTTTCACAACATTCAC 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GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGGGTGCGAAACCGCTGTCTCTGCGCGATTGCTCTGTGGCAGGC TGGCTGCTGGGCAACCCTATGTGTGACGAATTCATTAACGTTCCGGAATGGTCTGATATT GCCGAAAAAGCTAACCCTGTCAACGATCTGTGTTACCCTGGTGACTTTAACGATTACGAA GAACTGAAGCACCTGCTGTCTCGTATCAATCACTTCGAGAAAATCCAGATCATCCCGAAA 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GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTAGCGGAGAAAACGCATAACGGTAAACTGTGCGACCTGGACGGCGTG AAGCCGCTGATCCTGCGTGACTGTTCTGTTGCTGGCTGGCTGCTGGGCAACCCGATGTGC GATGAGTTCATCAACGTTCCGGAGTGGTCTTATATTGTTGAAAAAGCGAACCCGACCAAT 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ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTAGCGGGCGCAAAGCCGCTGTCTCTGCGTGACTGTTCTGTTGCTGGC TGGCTGCTGGGCAACCCGATGTGCGATGAGTTCATCAACGTTCCGGAGTGGTCTGATATT GCGGAAAAAGCGAACCCGACCAATGACCTGTGCTACCCGGGCTCTTTTAATGACTACGAG GAGCTGAAACATCTGCTGTCTCGCATCAACCATTTCGAAAAAATTCAGATCATCCCGAAA TCTTCCTGGAGCGATCACGAAGCTTCTTCCGGCGTATCTTCTGCATGCCCTTACCTGGGT TCCCCGTCTTTCTTCCGTAACGTGGTTTGGCTGATCAAGAAGAACTCTACGTACCCGACC ATCAAGAAATCCTATAACAACACTAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGTATCCAT CATCCAAACGATGCAGCCGAACAGACCCGCCTGTACCAGAATCCGACCACGTACATCTCT ATCGGCACTTCTACCCTGAATCAACGCCTGGTGCCGAAAATCGCAACTCGCAGCAAAGTC AACGGCCAATCTGGTCGCATGGAGTTTTTCTGGACCATCCTGAAACCGAACGACGCGATT AACTTCGAAAGCAACGGCAACTTCATTGCACCGGAATATGCTTACAAGATCGTTAAAAAG GGTGATTCTGCGATCATGAAAAGCGAGTAATAG SEQ ID 79 HA1-2mut IND GGCGCAAAGCCGCTGTCTCTGCGTGACTGTTCTGTTGCTGGCTGGCTGCTGGGCAACCCG ATGTGCGATGAGTTCATCAACGTTCCGGAGTGGTCTGATATTGCGGAAAAAGCGAACCCG ACCAATGACCTGTGCTACCCGGGCTCTTTTAATGACTACGAGGAGCTGAAACATCTGCTG TCTCGCATCAACCATTTCGAAAAAATTCAGATCATCCCGAAATCTTCCTGGAGCGATCAC GAAGCTTCTTCCGGCGTATCTTCTGCATGCCCTTACCTGGGTTCCCCGTCTTTCTTCCGT AACGTGGTTTGGCTGATCAAGAAGAACTCTACGTACCCGACCATCAAGAAATCCTATAAC AACACTAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGTATCCATCATCCAAACGATGCAGCC GAACAGACCCGCCTGTACCAGAATCCGACCACGTACATCTCTATCGGCACTTCTACCCTG AATCAACGCCTGGTGCCGAAAATCGCAACTCGCAGCAAAGTCAACGGCCAATCTGGTCGC ATGGAGTTTTTCTGGACCATCCTGAAACCGAACGACGCGATTAACTTCGAAAGCAACGGC AACTTCATTGCACCGGAATATGCTTACAAGATCGTTAAAAAGGGTGATTCTGCGATCATG AAAAGCGAGTAATAGGCTGAGC SEQ ID NO80 STF2.HA1-1 NC ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGTCCCACAACGGTAAACTGTGTCTGCTGAAAGGCATCGCACCG CTGCAGCTGGGTAACTGTAGCGTTGCAGGTTGGATCCTGGGTAACCCGGAGTGCGAACTG CTGATTTCCAAGGAGAGCTGGTCTTACATTGTCGAAACGCCGAATCCGGAAAACGGCACT TGTTATCCGGGTTACTTCGCCGATTACGAAGAACTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGAGC TCTTTCGAACGTTTCGAGATCTTCCCGAAAGAGAGCAGCTGGCCAAACCACACTGTTACC GGTGTGTCTGCGAGCTGTTCTCACAACGGCAAGTCTTCTTTCTACCGCAACCTGCTGTGG CTGACGGGTAAGAATGGCCTGTATCCGAACCTGTCTAAATCTTACGTAAACAACAAAGAG AAAGAGGTGCTGGTCCTGTGGGGCGTACACCATCCACCAAATATCGGCAACCAGCGCGCC CTGTACCACACCGAAAACGCTTATGTGTCCGTGGTGAGCTCCCATTACAGCCGTCGTTTT ACTCCGGAGATTGCCAAACGTCCGAAAGTTCGTGATCAGGAAGGCCGTATTAACTACTAC TGGACTCTGCTGGAGCCGGGCGATACCATCATTTTCGAGGCAAACGGCAACCTGATTGCG CCATGGTACGCGTTCGCCCTGAGCCGTGGTTTTGGCTCCGGTATTATCACCTCTAACGCG CCAATGGACGAATGCGACGCGAAATGCCAAACGCCGCAGGGCGCAATCAACAGCAGCCTG CCGTTCCAGAACGTTCACCCGGTTACCATCGGCGAATGCCCTAAATACGTGCGCTAATAG SEQ ID NO81 FOR引物 AACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGAGCCTGTTAGCGTCCCACAACGGTAAACTGTGTCTG CTGAAAGGCATCGCACCGCTGCAG SEQ ID NO82 REV引物 GAACAGCTCAGTTCCTACGAGCTCAGCCTATTAGCGCACGTATTTAGGGCATTCGCCGATG GTAACCGGGTGAACGTT SEQ ID NO83 HA0s NC GACACGATCTGTATTGGTTATCATGCAAACAACTCTACTGACACTGTAGATACTGTGCTG GAAAAGAACGTAACCGTTACCCACAGCGTTAACCTGCTGGAAGATTCCCACAACGGTAAA CTGTGTCTGCTGAAAGGCATCGCACCGCTGCAGCTGGGTAACTGTAGCGTTGCAGGTTGG ATCCTGGGTAACCCGGAGTGCGAACTGCTGATTTCCAAGGAGAGCTGGTCTTACATTGTC GAAACGCCGAATCCGGAAAACGGCACTTGTTATCCGGGTTACTTCGCCGATTACGAAGAA CTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGAGCTCTTTCGAACGTTTCGAGATCTTCCCGAAAGAG AGCAGCTGGCCAAACCACACTGTTACCGGTGTGTCTGCGAGCTGTTCTCACAACGGCAAG TCTTCTTTCTACCGCAACCTGCTGTGGCTGACGGGTAAGAATGGCCTGTATCCGAACCTG TCTAAATCTTACGTAAACAACAAAGAGAAAGAGGTGCTGGTCCTGTGGGGCGTACACCAT CCACCAAATATCGGCAACCAGCGCGCCCTGTACCACACCGAAAACGCTTATGTGTCCGTG GTGAGCTCCCATTACAGCCGTCGTTTTACTCCGGAGATTGCCAAACGTCCGAAAGTTCGT GATCAGGAAGGCCGTATTAACTACTACTGGACTCTGCTGGAGCCGGGCGATACCATCATT TTCGAGGCAAACGGCAACCTGATTGCGCCATGGTACGCGTTCGCCCTGAGCCGTGGTTTT GGCTCCGGTATTATCACCTCTAACGCGCCAATGGACGAATGCGACGCGAAATGCCAAACG CCGCAGGGCGCAATCAACAGCAGCCTGCCGTTCCAGAACGTTCACCCGGTTACCATCGGC GAATGCCCTAAATACGTGCGCTCCGCCAAACTGCGCATGGTTACTGGTCTGCGTAACATC CCGAGCATTCAGTCTCGCGGTCTGTTCGGTGCGATCGCGGGCTTCATTGAAGGCGGTTGG ACCGGTATGGTGGATGGTTGGTACGGCTACCATCACCAGAACGAACAGGGTAGCGGTTAC GCTGCCGACCAGAAATCCACCCAGAACGCTATTAACGGTATCACCAACAAAGTTAACAGC GTAATTGAGAAGATGAACACGCAGTTCACCGCCGTAGGTAAGGAATTCAACAAGCTGGAA CGTCGCATGGAAAACCTGAACAAAAAGGTGGACGACGGCTTTCTGGACATCTGGACCTAC AACGCTGAACTGCTGGTGCTGCTGGAAAACGAACGTACCCTGGATTTCCACGACTCTAAT GTTAAAAACCTGTACGAAAAGGTCAAGTCTCAACTGAAAAACAATGCGAAGGAAATCGGC AACGGCTGTTTCGAATTCTACCATAAATGCAACAACGAATGCATGGAATCCGTTAAAAAC GGTACCTATGACTACCCTAAATACTCCGAAGAAAGCAAACTGAACCGCGAGAAAATCGAT GGTGTAAAACTGGAATCTATGGGTGTTTACCAGATCCTGGCGATCTACTCCACGGTAGCC AGCAGCCTGGTTCTGCTGGTTAGCCTGGGTGCAATTAGCTTCTGGATGTGCTCTAACGGC AGCCTGCAATGCCGCATCTGTAATAGGCTGAGC SEQ ID NO84 STF2HA1-2 NC ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATATATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGAAAGGCATCGCACCGCTGCAGCTGGGTAACTGTAGCGTTGCA GGTTGGATCCTGGGTAACCCGGAGTGCGAACTGCTGATTTCCAAGGAGAGCTGGTCTTAC ATTGTCGAAACGCCGAATCCGGAAAACGGCACTTGTTATCCGGGTTACTTCGCCGATTAC GAAGAACTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGAGCTCTTTCGAACGTTTCGAGATCTTCCCG AAAGAGAGCAGCTGGCCAAACCACACTGTTACCGGTGTGTCTGCGAGCTGTTCTCACAAC GGCAAGTCTTCTTTCTACCGCAACCTGCTGTGGCTGACGGGTAAGAATGGCCTGTATCCG AACCTGTCTAAATCTTACGTAAACAACAAAGAGAAAGAGGTGCTGGTCCTGTGGGGCGTA CACCATCCACCAAATATCGGCAACCAGCGCGCCCTGTACCACACCGAAAACGCTTATGTG TCCGTGGTGAGCTCCCATTACAGCCGTCGTTTTACTCCGGAGATTGCCAAACGTCCGAAA GTTCGTGATCAGGAAGGCCGTATTAACTACTACTGGACTCTGCTGGAGCCGGGCGATACC ATCATTTTCGAGGCAAACGGCAACCTGATTGCGCCATGGTACGCGTTCGCCCTGAGCCGT GGTTTTGGCTCCGGTATTATCACCTCTTAATAA SEQ ID NO85 FOR引物 AACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGAGCCTGTTAGCGAAAGGCATCGCACCGCTGCAGCTG GGTAACTGTAGCGTTGCAGGTTGG SEQ ID NO86 REV引物 GAACAGCTCAGTTCCTACGAGCTCAGCCTATTAAGAGGTGATAATACCGGAGCCAAAACC ACGGCTCAGGGCGAACGCGTACCA SEQ ID NO87 STF2.HA1-2mut NC ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGAAAGGCGCGGCACCGCTGCAGCTGGGTAACTGTAGCGTTGCA GGTTGGATCCTGGGTAACCCGGAGTGCGAACTGCTGATTTCCAAGGAGAGCTGGTCTGAT ATTGCAGAAACGCCGAATCCGGAAAACGGCACTTGTTATCCGGGTTACTTCGCCGATTAC GAAGAACTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGAGCTCTTTCGAACGTTTCGAGATCTTCCCG AAAGAGAGCAGCTGGCCAAACCACACTGTTACCGGTGTGTCTGCGAGCTGTTCTCACAAC GGCAAGTCTTCTTTCTACCGCAACCTGCTGTGGCTGACGGGTAAGAATGGCCTGTATCCG AACCTGTCTAAATCTTACGTAAACAACAAAGAGAAAGAGGTGCTGGTCCTGTGGGGCGTA CACCATCCACCAAATATCGGCAACCAGCGCGCCCTGTACCACACCGAAAACGCTTATGTG TCCGTGGTGAGCTCCCATTACAGCCGTCGTTTTACTCCGGAGATTGCCAAACGTCCGAAA GTTCGTGATCAGGAAGGCCGTATTAACTACTACTGGACTCTGCTGGAGCCGGGCGATACC ATCATTTTCGAGGCAAACGGCAACCTGATTGCGCCATGGTACGCGTTCGCCCTGAGCCGT GGTTTTGGCTCCGGTATTATCACCTCTTAATAG SEQ ID NO88 HA1-2mut NC GCTGAGCCTGTTAGCGAAAGGCGCGGCACCGCTGCAGCTGGGTAACTGTAGCGTTGCAGG TTGGATCCTGGGTAACCCGGAGTGCGAACTGCTGATTTCCAAGGAGAGCTGGTCTGATAT TGCAGAAACGCCGAATCCGGAAAACGGCACTTGTTATCCGGGTTACTTCGCCGATTACGA AGAACTGCGTGAACAACTGTCTTCCGTGAGCTCTTTCGAACGTTTCGAGATCTTCCCGAA AGAGAGCAGCTGGCCAAACCACACTGTTACCGGTGTGTCTGCGAGCTGTTCTCACAACGG CAAGTCTTCTTTCTACCGCAACCTGCTGTGGCTGACGGGTAAGAATGGCCTGTATCCGAA CCTGTCTAAATCTTACGTAAACAACAAAGAGAAAGAGGTGCTGGTCCTGTGGGGCGTACA CCATCCACCAAATATCGGCAACCAGCGCGCCCTGTACCACACCGAAAACGCTTATGTGTC CGTGGTGAGCTCCCATTACAGCCGTCGTTTTACTCCGGAGATTGCCAAACGTCCGAAAGT TCGTGATCAGGAAGGCCGTATTAACTACTACTGGACTCTGCTGGAGCCGGGCGATACCAT CATTTTCGAGGCAAACGGCAACCTGATTGCGCCATGGTACGCGTTCGCCCTGAGCCGTGG TTTTGGCTCCGGTATTATCACCTCTTAATAGGCTGAGC SEQ ID NO89 STF2.HA1-1his(PR8) MAQVTNTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRTNSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLASHNGKLCRLKGI APLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERF EIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIH HPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEAN GNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRHHHH HH SEQ ID NO90 STF2.HA1-2(PR8) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAKGIAPLQLGKCNI AGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWP NHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQ NLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYA FALSRGFGSGIITS SEQ ID NO91 STF2.HA1-2mut(PR8) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAKGAAPLQLGKC NIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSDIAETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSW PNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQ QNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMY AFALSRGFGSGIITS SEQ ID NO92 STF2.HA1-3(PR8) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLANSENGICYPGDFI DYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKN SYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRM NYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRG SEQ ID NO93 HA1-2his(PR8) KGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSF ERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLW GIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIF EANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSHHHHHH SEQ ID NO94 STF2.4xM2e MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLRLSLLTEVETPIRN EWGSRSNDSSDPLESLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPGSSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPELS LLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPSR SEQ ID NO95 STF2.HA1-2(VN) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAGVKPLILRDCSV AGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWS SHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVMLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQT KLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYK IVKKGDSTIMKSE SEQ ID NO96 STF2 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLA SEQ ID NO97 STF2.Blp.wt ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGAATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AATGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCACAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT GGAACCGTGACGCTGGCCGCTGGTGCCACCAAGACCACCATGCCAGCCGGCGCCACAACT AAGACCGAGGTGCAGGAGTTAAAGGACACCCCCGCGGTGGTTAGCGCAGATGCCAAAAAC GCGTTGATCGCCGGCGGAGTGGATGCAACTGATGCTAATGGTGCGGAGCTGGTTAAAATG TCGTATACAGACAAGAATGGTAAGACGATCGAGGGCGGTTATGCCCTTAAGGCAGGAGAT AAGTATTACGCTGCTGATTACGATGAGGCGACGGGAGCTATTAAGGCCAAGACAACGTCA TACACGGCGGCGGACGGAACGACTAAGACGGCTGCCAATCAGTTGGGAGGGGTTGACGGG AAGACAGAGGTCGTTACGATCGATGGCAAGACATACAACGCCTCCAAGGCCGCTGGCCAC GATTTCAAAGCTCAACCCGAACTGGCCGAGGCCGCGGCGAAAACAACTGAGAACCCGTTG CAGAAGATTGATGCGGCCCTGGCGCAAGTAGATGCCCTGCGCTCAGACCTGGGCGCCGTT CAAAATCGATTCAATTCCGCGATTACAAACCTGGGCAATACAGTAAACAATCTATCCGAG GCCAGATCCCGCATTGAAGACTCCGACTACGCGACAGAAGTAAGTAACATGAGTCGTGCC CAGATTCTGCAGCAGGCCGGCACTAGTGTCCTGGCCCAGGCCAATCAAGTCCCGCAGAAT GTGCTGAGCCTACTACGAGAGTTCAGTCGTTACCCAGCCCAATGGCGGCCGCTC SEQ ID NO98 STF2.Blp.ng ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAAGTGATCAACACCAACTCCCTGTCCCTGCTCACTCAAAACAACCTCCAGAAA TCTCAGTCTGCTCTCGGTACTGCTATCGAGCGTCTCTCCTCCGGCCTGAGGATCAACTCC GCTAAAGATGACGCCGCCGGACAAGCTATCGCTAACCGCTTTACTGCCAACATTAAAGGC CTGACCCAAGCCTCTAGGAACGCCAATGATGCGCATTTCTATCGCTCAAACCACCGAAGGC GCCCTGAACGAAATCAATAATAACCTGCAACGTGTCCGCGAACTCGCCGTCCAGTCCGCC CAATCTACCAACTCTCAGTCTGACCTGGACTCTATCCAAGCTGAGATCACCCAAAGGCTC AACGAGATCGATCGTGTGTCTGGTCAAACTCAGTTTAACGGCGTCAAAGTGCTGGCTCAA GACAACACACTCACCATCCAAGTAGGAGCCAATGACGGCGAGACAATCGATATCGACCTG AAGCAGATCAATTCTCAAACTCTGGGCCTGGACTCCCTGAACGTCCAAAAGGCTTACGAC GTGAAGGACACCGCTGTGACAACCAAAGCCTATGCTAATCAAGGAACAACCCTGGACGTG TCCGGACTCGATGACGCCGCTATCAAGGCCGCTACTGGCGGCACTCAGGGAACTGCCTCT GTGACCGGAGGCGCTGTGAAGTTCGACGCCGATAACAACAAATACTTCGTCACTATTGGT GGTTTCACTGGCGCTGACGCCGCTAAGAACGGTGACTACGAGGTCAACGTCGCCACTGAC GGAACAGTGACACTGGCCGCTGGCGCTACCAAGACCACAATGCCTGCTGGTGCTACTACT AAGACAGAGGTGCAGGAACTCAAGGACACCCCTGCCGTGGTGTCCGCCGATGCTAAGAAC GCTCTCATTGCTGGTGGTGTCGACGCTACGGACGCCAACGGAGCCGAGCTTGTGAAAATG TCCTACACCGACAAGAACGGAAAGACTATCGAGGGAGGTTACGCTCTGAAGGCTGGCGAT AAGTACTACGCCGCTGATTATGACGAAGCTACAGGCGCCATTAAAGCTAAAACCACATCT TATACCGCTGCCGATGGTACTACCAAGACTGCTGCCAATCAGCTGGGTGGAGTCGATGGA AAAACCGAAGTGGTCACAATCGACGGAAAGACCTATCAAGCCTCCAAGGCTGCTGGCCAC GACTTCAAGGCCCAACCCGAACTGGCCGAGGCTGCTGCTAAAACCACTGAAAACCCCCTG CAGAAAATTGACGCTGCCCTGGCCCAAGTGGATGCCCTCCGCTCCGACCTCGGCGCTGTG CAAAACCGCTTCAACTCCGCTATTACAAACCTCGGCAATACCGTCAATCAGCTCTCTGAA GCTAGGTCTCGTATTGAGGATTCCGATTACGCTACCGAGGTCTCCCAGATGTCCCGTGCC CAAATTCTCCAACAAGCCGGCACCTCCGTCCTCGCCCAAGCCAATCAGGTGCCACAGAAT GTGCTGAGC SEQ ID NO99 蜜蜂蜂毒素(mellitin) ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCG SEQ ID NO100 STF2.HA0s ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGAATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AATGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCACAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT GGAACCGTGACGCTGGCCGCTGGTGCCACCAAGACCACCATGCCAGCCGGCGCCACAACT AAGACCGAGGTGCAGGAGTTAAAGGACACCCCCGCGGTGGTTAGCGCAGATGCCAAAAAC GCCTTGATCGCCGGCGGAGTGGATGCAACTGATGCTAATGGTGCGGAGCTGGTTAAAATG TCGTATACAGACAAGAATGGTAAGACGATCGAGGGCGGTTATGCCCTTAAGGCAGGAGAT AAGTATTACGCTGCTGATTACGATGAGGCGACGGGAGCTATTAAGGCCAAGACAACGTCA TACACGGCGGCGGACGGAACGACTAAGACGGCTGCCAATCAGTTGGGAGGGGTTGACGGG AAGACAGAGGTCGTTACGATCGATGGCAAGACATACAACGCTTCCAAGGCCGCTGGCCAC GATTTCAAAGCTCAACCCGAACTGGCCGAGGCCGCGGCGAAAACAACTGAGAACCCGTTG CAGAAGATTGATGCGGCCCTGGCGCAAGTAGATGCCCTGCGCTCAGACCTGGGCGCCGTT CAAAATCGATTCAATTCCGCGATTACAAACCTGGGCAATACAGTAAACAATCTATCCGAG GCCAGATCCCGCATTGAAGACTCCGACTACGCGACAGAAGTAAGTAACATGAGTCGTGCC CAGATTCTGCAGCAGGCCGGCACTAGTGTCCTGGCCCAGGCCAATCAAGTCCCGCAGAAT GTGCTGAGCCTACTAGCATCAGGTTCCGGCTCAGGTTCCGACACCATTTGCATTGGATAC CATGCAAACAACTCAACCGATACTGTTGATACCGTCCTTGAGAAGAACGTTACCGTCACG CACTCGGTCAACCTATTAGAGGATAGCCACAACGGAAAGCTGTGCCGTCTGAAAGGCATA GCGCCACTGCAGCTCGGCAAATGTAACATCGCAGGTTGGCTCCTTGGTAACCCGGAGTGC GACCCCCTCCTCCCTGTACGATCCTGGAGTTATATCGTGGAGACCCCCAATAGCGAGAAC GGAATTTGCTACCCAGGAGATTTCATAGACTACGAGGAGTTGCGCGAGCAGCTTTCGTCT GTGAGCAGCTTCGAAAGGTTCGAGATATTCCCGAAGGAGAGCAGCTGGCCGAATCATAAC ACTAACGGTGTGACAGCCGCCTGCAGTCATGAAGGAAAGAGTTCATTCTATCGCAACCTG CTGTGGTTGACGGAGAAAGAGGGCAGCTACCCTAAGTTGAAGAACTCCTATGTGAACAAA AAAGGCAAGGAGGTTCTGGTGCTGTGGGGCATACACCACCCCCCCAATAGCAAGGAGCAG CAGAATCTGTACCAAAACGAGAATGCCTATGTGAGCGTGGTCACTAGTAACTATAACCGT CGGTTCACTCCCGAGATCGCCGAGCGTCCGAAGGTGAGGGACCAGGCAGGCCGGATGAAC TACTACTGGACCCTATTGAAGCCAGGGGACACGATTATCTTCGAGGCAAACGGAAACCTC ATAGCGCCGATGTACGCCTTCGCCCTGAGCCGTGGCTTTGGATCGGGGATCATCACGTCT AACGCCTCGATGCACGAATGTAATACCAAATGCCAGACCCCACTGGGTGCTATCAACTCG TCCTTACCCTATCAAAATATACATCCGGTCACCATAGGCGAGTGTCCCAAATATGTCAGA TCCGCCAAGTTGCGGATGGTGACCGGCCTCCGCAATATTCCTAGTATTCAGTCACGCGGC TTGTTCGGCGCCATCGCTGGTTTCATCGAAGGCGGGTGGACAGGCATGATTGATGGCTGG TATGGCTATCACCACCAGAACGAGCAGGGCTCGGGCTACGCGGCTGACCAGAAGTCGACT CAGAATGCCATCAATGGCATCACGAATAAGGTGAACACGGTCATTGAAAAGATGAACATT CAATTTACAGCCGTAGGAAAAGAGTTTAATAAACTGGAAAAAAGAATGGAGAATCTGAAT AAGAAGGTGGACGACGGATTTTTGGACATCTGGACGTACAACGCCGAGCTGCTGGTTCTG CTGGAAAATGAGCGAACACTGGATTTTCATGATTCTAACGTAAAGAATCTGTACGAGAAG GTGAAGTCCCAACTAAAGAATAATGCCAAGGAAATCGGAAATGGATGCTTTGAGTTTTAC CACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAATCCGTGCGAAATGGTACATACGATTACCCAAAG TACTCCGAAGAATCCAAGCTAAATCGCGAAAAGGTTGATGGTGTTAAACTTGAATCCATG GGTATTTACCAACACCATCATCACCACCATTAATAG SEQ ID NO101 FOR引物 AGTCGCTGAGCCTACTAGCATCAGGTTCCGGCTCAGGTTCCGACACCATTTGCATTGGAT ACCATGC SEQ ID NO102 REV引物 AGTCGCATGCCTATTAATGGTGGTGATGATGGTGTTGGTAAATACCCATGGATTC SEQ ID NO103 HA0s PR8 GACACCATTTGCATTGGATACCATGCAAACAACTCAACCGATACTGTTGATACCGTCCTT GAGAAGAACGTTACCGTCACGCACTCGGTCAACCTATTAGAGGATAGCCACAACGGAAAG CTGTGCCGTCTGAAAGGCATAGCGCCACTGCAGCTCGGCAAATGTAACATCGCAGGTTGG CTCCTTGGTAACCCGGAGTGCGACCCCCTCCTCCCTGTACGATCCTGGAGTTATATCGTG GAGACCCCCAATAGCGAGAACGGAATTTGCTACCCAGGAGATTTCATAGACTACGAGGAG TTGCGCGAGCAGCTTTCGTCTGTGAGCAGCTTCGAAAGGTTCGAGATATTCCCGAAGGAG AGCAGCTGGCCGAATCATAACACTAACGGTGTGACAGCCGCCTGCAGTCATGAAGGAAAG AGTTCATTCTATCGCAACCTGCTGTGGTTGACGGAGAAAGAGGGCAGCTACCCTAAGTTG AAGAACTCCTATGTGAACAAAAAAGGCAAGGAGGTTCTGGTGCTGTGGGGCATACACCAC CCCCCCAATAGCAAGGAGCAGCAGAATCTGTACCAAAACGAGAATGCCTATGTGAGCGTG GTCACTAGTAACTATAACCGTCGGTTCACTCCCGAGATCGCCGAGCGTCCGAAGGTGAGG GACCAGGCAGGCCGGATGAACTACTACTGGACCCTATTGAAGCCAGGGGACACGATTATC TTCGAGGCAAACGGAAACCTCATAGCGCCGATGTACGCCTTCGCCCTGAGCCGTGGCTTT GGATCGGGGATCATCACGTCTAACGCCTCGATGCACGAATGTAATACCAAATGCCAGACC CCACTGGGTGCTATCAACTCGTCCTTACCCTATCAAAATATACATCCGGTCACCATAGGC GAGTGTCCCAAATATGTCAGATCCGCCAAGTTGCGGATGGTGACCGGCCTCCGCAATATT CCTAGTATTCAGTCACGCGGCTTGTTCGGCGCCATCGCTGGTTTCATCGAAGGCGGGTGG ACAGGCATGATTGATGGCTGGTATGGCTATCACCACCAGAACGAGCAGGGCTCGGGCTAC GCGGCTGACCAGAAGTCGACTCAGAATGCCATCAATGGCATCACGAATAAGGTGAACACG GTCATTGAAAAGATGAACATTCAATTTACAGCCGTAGGAAAAGAGTTTAATAAACTGGAA AAAAGAATGGAGAATCTGAATAAGAAGGTGGACGACGGATTTTTGGACATCTGGACGTAC AACGCCGAGCTGCTGGTTCTGCTGGAAAATGAGCGAACACTGGATTTTCATGATTCTAAC GTAAAGAATCTGTACGAGAAGGTGAAGTCCCAACTAAAGAATAATGCCAAGGAAATCGGA AATGGATGCTTTGAGTTTTACCACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAATCCGTGCGAAAT GGTACATACGATTACCCAAAGTACTCCGAAGAATCCAAGCTAAATCGCGAAAAGGTTGAT GGTGTTAAACTTGAATCCATGGGTATTTACCAACACCATCATCACCACCATTAATAG SEQ ID NO104 STF2.HA1-1 ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGAATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AATGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCACAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT GGAACCGTGACGCTGGCCGCTGGTGCCACCAAGACCACCATGCCAGCCGGCGCCACAACT AAGACCGAGGTGCAGGAGTTAAAGGACACCCCCGCGGTGGTTAGCGCAGATGCCAAAAAC GCCTTGATCGCCGGCGGAGTGGATGCAACTGATGCTAATGGTGCGGAGCTGGTTAAAATG TCGTATACAGACAAGAATGGTAAGACGATCGAGGGCGGTTATGCCCTTAAGGCAGGAGAT AAGTATTACGCTGCTGATTACGATGAGGCGACGGGAGCTATTAAGGCCAAGACAACGTCA TACACGGCGGCGGACGGAACGACTAAGACGGCTGCCAATCAGTTGGGAGGGGTTGACGGG AAGACAGAGGTCGTTACGATCGATGGCAAGACATACAACGCTTCCAAGGCCGCTGGCCAC GATTTCAAAGCTCAACCCGAACTGGCCGAGGCCGCGGCGAAAACAACTGAGAACCCGTTG CAGAAGATTGATGCGGCCCTGGCGCAAGTAGATGCCCTGCGCTCAGACCTGGGCGCCGTT CAAAATCGATTCAATTCCGCGATTACAAACCTGGGCAATACAGTAAACAATCTATCCGAG GCCAGATCCCGCATTGAAGACTCCGACTACGCGACAGAAGTAAGTAACATGAGTCGTGCC CAGATTCTGCAGCAGGCCGGCACTAGTGTCCTGGCCCAGGCCAATCAAGTCCCGCAGAAT GTGCTGAGCCTACTAGCATCAGGTTCCGGCTCAGGTTCCAGCCACAACGGAAAGCTGTGC CGTCTGAAAGGCATAGCGCCACTGCAGCTCGGCAAATGTAACATCGCAGGTTGGCTCCTT GGTAACCCGGAGTGCGACCCCCTCCTCCCTGTACGATCCTGGAGTTATATCGTGGAGACC CCCAATAGCGAGAACGGAATTTGCTACCCAGGAGATTTCATAGACTACGAGGAGTTGCGC GAGCAGCTTTCGTCTGTGAGCAGCTTCGAAAGGTTCGAGATATTCCCGAAGGAGAGCAGC TGGCCGAATCATAACACTAACGGTGTGACAGCCGCCTGCAGTCATGAAGGAAAGAGTTCA TTCTATCGCAACCTGCTGTGGTTGACGGAGAAAGAGGGCAGCTACCCTAAGTTGAAGAAC TCCTATGTGAACAAAAAAGGCAAGGAGGTTCTGGTGCTGTGGGGCATACACCACCCCCCC AATAGCAAGGAGCAGCAGAATCTGTACCAAAACGAGAATGCCTATGTGAGCGTGGTCACT AGTAACTATAACCGTCGGTTCACTCCCGAGATCGCCGAGCGTCCGAAGGTGAGGGACCAG GCAGGCCGGATGAACTACTACTGGACCCTATTGAAGCCAGGGGACACGATTATCTTCGAG GCAAACGGAAACCTCATAGCGCCGATGTACGCCTTCGCCCTGAGCCGTGGCTTTGGATCG GGGATCATCACGTCTAACGCCTCGATGCACGAATGTAATACCAAATGCCAGACCCCACTG GGTGCTATCAACTCGTCCTTACCCTATCAAAATATACATCCGGTCACCATAGGCGAGTGT CCCAAATATGTCAGACACCATCATCACCACCATTAATAG SEQ ID NO105 FOR引物 AGTCGCTGAGCCTACTAGCATCAGGTTCCGGCTCAGGTTCCAGCCACAACGGAAAGCTGT GCCGTC SEQ ID NO106 REV引物 AGTCGCATGCCTATTAATGGTGGTGATGATGGTGTCTGACATATTTGGGACACTCGCCTA TGGTGAC SEQ ID NO107 STF2.HA1-2 ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGGATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCGCAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT GGAACCGTGACGCTGGCCGCTGGTGCCACCAAGACCACCATGCCAGCCGGCGCCACAACT AAGACCGAGGTGCAGGAGTTAAAGGACACCCCCGCGGTGGTTAGCGCAGATGCCAAAAAC GCGTTGATCGCCGGCGGAGTGGATGCAACTGATGCTAATGGTGCGGAGCTGGTTAAAATG TCGTATACAGACAAGAATGGTAAGACGATCGAGGGCGGTTATGCCCTTAAGGCAGGAGAT AAGTATTACGCTGCTGATTACGATGAGGCGACGGGAGCTATTAAGGCCAAGACAACGTCA TACACGGCGGCGGACGGAACGACTAAGACGGCTGCCAATCAGTTGGGAGGGGTTGACGGG AAGACAGAGGTCGTTACGATCGATGGCAAGACATACAACGCCTCCAAGGCCGCTGGCCAC GATTTCAAAGCTCAACCCGAACTGGCCGAGGCCGCGGCGAAAACAACTGAGAACCCGTTG CAGAAGATTGATGCGGCCCTGGCGCAAGTAGATGCCCTGCGCTCAGACCTGGGCGCCGTT CAAAATCGATTCAATTCCGCGATTACAAACCTGGGCAATACAGTAAACAATCTATCCGAG GCCAGATCCCGCATTGAAGACTCCGACTACGCGACAGAAGTAAGTAACATGAGTCGTGCC CAGATTCTGCAGCAGGCCGGCACTAGTGTCCTGGCCCAGGCCAATCAAGTCCCGCAGAAT GTGCTGAGCCTACTAGCATCAGGTTCCGGCTCAGGTTCCAAAGGCATAGCGCCACTGCAG CTCGGCAAATGTAACATCGCAGGTTGGCTCCTTGGTAACCCGGAGTGCGACCCCCTCCTC CCTGTACGATCCTGGAGTTATATCGTGGAGACCCCCAATAGCGAGAACGGAATTTGCTAC CCAGGAGATTTCATAGACTACGAGGAGTTGCGCGAGCAGCTTTCGTCTGTGAGCAGCTTC GAGAGGTTCGAAATCTTCCCGAAGGAGAGCAGCTGGCCGAATCATAACACTAACGGTGTG ACAGCCGCCTGCAGTCATGAAGGAAAGAGTTCATTCTATCGCAACCTGCTGTGGTTGACG GAGAAAGAGGGCAGCTACCCTAAGTTGAAGAACTCCTATGTGAACAAAAAAGGCAAGGAG GTTCTGGTGCTGTGGGGCATACACCACCCCCCCAATAGCAAGGAGCAGCAGAATCTGTAC CAAAACGAGAATGCCTATGTGAGCGTGGTCACTAGTAACTATAACCGTCGGTTCACTCCC GAGATCGCCGAGCGTCCGAAGGTGAGGGACCAGGCAGGCCGGATGAACTACTACTGGACC CTATTGAAGCCAGGGGACACGATTATCTTCGAGGCAAACGGAAACCTCATAGCGCCGATG TACGCGTTCGCCCTGAGCCGTGGCTTTGGATCGGGGATCATCACGTCTCACCATCATCAC CACCATTAATAG SEQ ID NO108 FOR引物 AGTCGCTGAGCCTACTAGCATCAGGTTCCGGCTCAGGTTCCAAAGGCATAGCGCCACTGC AGCTCG SEQ ID NO109 REV引物 AGTCGCATGCCTATTAATGGTGGTGATGATGGTGAGACGTGATGATCCCCGATCCAAAGC CACGGCTCAG SEQ ID NO110 STF2.HA1-2mut ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGAATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AATGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCACAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT GGAACCGTGACGCTGGCCGCTGGTGCCACCAAGACCACCATGCCAGCCGGCGCCACAACT AAGACCGAGGTGCAGGAGTTAAAGGACACCCCCGCGGTGGTTAGCGCAGATGCCAAAAAC GCGTTGATCGCCGGCGGAGTGGATGCAACTGATGCTAATGGTGCGGAGCTGGTTAAAATG TCGTATACAGACAAGAATGGTAAGACGATCGAGGGCGGTTATGCCCTTAAGGCAGGAGAT AAGTATTACGCTGCTGATTACGATGAGGCGACGGGAGCTATTAAGGCCAAGACAACGTCA TACACGGCGGCGGACGGAACGACTAAGACGGCTGCCAATCAGTTGGGAGGGGTTGACGGG AAGACAGAGGTCGTTACGATCGATGGCAAGACATACAACGCCTCCAAGGCCGCTGGCCAC GATTTCAAAGCTCAACCCGAACTGGCCGAGGCCGCGGCGAAAACAACTGAGAACCCGTTG CAGAAGATTGATGCGGCCCTGGCGCAAGTAGATGCCCTGCGCTCAGACCTGGGCGCCGTT CAAAATCGATTCAATTCCGCGATTACAAACCTGGGCAATACAGTAAACAATCTATCCGAG 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CAGAATGTGACCCCCTCCTGCCCGTCCGTTCTTGGTCTGACATCGCTGAAACACCTAACT CCGAGAACGGCATCTGTTACCCGGGCGACTTCATTGACTACGAGGAGCTCCGCGAACAGC TGTCTTCTGTCTCTTCTTTCGAACGTTTCGAAATTTTCCCAAAGGAATCCTCCTGGCCAA ACCATAACACCAACGGAGTGACCGCCGCCTGTAGCCATGAGGGCAAGTCTTCTTTCTACC GTAATCTGCTGTGGCTGACTGAAAAAGAGGGTTCTTATCCCAAACTGAAGAACTCTTATG TCAACAAGAAGGGCAAAGAGGTCCTGGTGCTGTGGGGTATCCACCACCCCCCCAACTCCA AGGAGCAGCAGAATCTGTACCAAAACGAAAATGCTTACGTGTCTGTCGTGACATCTAACT ACAACCGGCGCTTCACGCCCGAAATCGCCGAGCGTCCCAAAGTGCGCGATCAGGCCGGAA GGATGAACTACTACTGGACCCTGCTCAAACCCGGAGATACCATCATATTCGAAGCCAATG GCAATCTCATCGCTCCCATGTATGCTTTCGCTCTCTCTCGCGGATTCGGTTCCGGCATAA TCACTAGCCACCACCACCACCACCACTAATAG SEQ ID NO112 STF2.HA1-3 ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGGATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCGCAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT GGAACCGTGACGCTGGCCGCTGGTGCCACCAAGACCACCATGCCAGCCGGCGCCACAACT AAGACCGAGGTGCAGGAGTTAAAGGACACCCCCGCGGTGGTTAGCGCAGATGCCAAAAAC GCGTTGATCGCCGGCGGAGTGGATGCAACTGATGCTAATGGTGCGGAGCTGGTTAAAATG TCGTATACAGACAAGAATGGTAAGACGATCGAGGGCGGTTATGCCCTTAAGGCAGGAGAT AAGTATTACGCTGCTGATTACGATGAGGCGACGGGAGCTATTAAGGCCAAGACAACGTCA TACACGGCGGCGGACGGAACGACTAAGACGGCTGCCAATCAGTTGGGAGGGGTTGACGGG AAGACAGAGGTCGTTACGATCGATGGCAAGACATACAACGCCTCCAAGGCCGCTGGCCAC 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NO114 REV引物 AGTCGCATGCCTATTAATGGTGGTGATGATGGTGGCCACGGCTCAGGGCGAAGG SEQ ID NO115 STF2.HA1-3mut ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTAT GCGGCCCAGGTTATCAATACCAACTCCCTGTCGTTGCTCACCCAAAATAACCTTAATAAA AGCCAGAGCGCACTGGGAACCGCCATAGAACGCCTCTCAAGCGGCCTCCGGATCAATTCT GCAAAAGACGACGCCGCCGGTCAGGCCATCGCAAACCGCTTTACCGCCAATATCAAGGGA CTGACGCAGGCTTCGAGGAATGCTAACGATGGAATAAGCATCGCTCAAACCACGGAGGGC GCCCTGAACGAGATCAACAACAACCTACAGCGCGTCAGGGAGCTCGCAGTGCAGTCCGCC AATTCGACCAACTCGCAGTCGGACCTGGACTCGATCCAAGCCGAAATCACCCAGCGCCTG AATGAGATTGACCGGGTGAGCGGTCAGACACAGTTTAACGGCGTGAAGGTACTTGCACAG GATAACACACTTACGATACAGGTGGGCGCCAACGATGGTGAAACCATAGACATTGATCTC AAACAGATTAACAGCCAGACGCTCGGGTTGGATAGCCTGAATGTGCAAAAGGCGTACGAC GTGAAAGACACGGCGGTCACTACCAAAGCCTACGCTAACAATGGCACTACCTTGGATGTG AGCGGATTGGATGATGCAGCAATCAAGGCTGCTACCGGCGGTACGAACGGAACCGCGTCC GTGACCGGCGGTGCCGTGAAGTTCGATGCTGACAACAATAAGTATTTCGTCACCATTGGA GGCTTTACTGGCGCCGACGCAGCAAAGAACGGCGACTATGAAGTGAACGTGGCAACCGAT 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AAGCGTCCGAAAGTGCGTGACCAGGAGGGACGTATCAACTATTATTGGACGCTGTTGGAG CCAGGCGATACAATTATCTTCGAGGCTAACGGTAACCTTATCGCTCCCTGGTACGCCTTC GCCCTGTCGCGTGGTTTCGGTAGTGGAATAATCACTAGTAATGCTCCTATGGACGAGTGT GACGCTAAGTGCCAAACACCTCAGGGCGCTATCAATAGCTCCCTTCCATTCCAGAACGTC CATCCGGTTACCATTGGAGAGTGTCCAAAGTACGTGAGACACCATCATCACCATCACTAA TAG SEQ ID NO140 FOR引物 AGGCAGATCTATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTC TTACATCTATGCGAGCCACAATGGTAAGCTGTGTCTGTTGAAG SEQ ID NO141 REV引物 AGTCGCATGCCTATTAATGGTGGTGATGATGGTGTCTCACGTACTTTGGACACTCTCCAATGG SEQ ID NO142 HA0s NC AGATCTATGAAGTTTCTCGTGAACGTTGCACTGGTGTTTATGGTAGTCTATATATCGTAC ATTTATGCTGACACGATTTGCATCGGTTACCATGCGAACAACTCCACGGATACCGTGGAC ACAGTGTTGGAAAAGAACGTGACCGTCACGCACTCCGTAAACCTTCTGGAGGACAGCCAC AATGGTAAGCTGTGTCTGTTGAAGGGAATTGCACCCCTCCAACTGGGCAACTGTTCGGTC GCTGGTTGGATCCTCGGAAACCCAGAATGCGAGCTCCTTATCAGTAAGGAATCTTGGTCT TATATTGTCGAAACCCCGAACCCCGAGAACGGAACATGCTACCCGGGTTACTTTGCTGAT TACGAAGAGCTTCGCGAGCAACTCAGCTCCGTATCCTCCTTCGAGCGCTTCGAGATTTTT CCCAAAGAGTCCAGCTGGCCAAATCATACCGTCACCGGCGTGTCGGCCTCCTGTTCCCAC AACGGAAAGTCTAGCTTCTATAGAAATCTTCTCTGGCTGACGGGTAAGAATGGTCTTTAC CCCAATTTGAGCAAGTCCTACGTCAACAACAAAGAAAAGGAAGTTCTGGTATTGTGGGGT GTGCACCACCCTCCGAACATCGGCAATCAGCGCGCCCTGTATCACACAGAGAACGCGTAT GTTTCCGTTGTCTCCTCACATTACTCGAGGCGCTTCACTCCTGAAATAGCTAAGCGTCCG AAAGTGCGTGACCAGGAGGGACGTATCAACTATTATTGGACGCTGTTGGAGCCAGGCGAT ACAATTATCTTCGAGGCTAACGGTAACCTTATCGCTCCCTGGTACGCCTTCGCCCTGTCG CGTGGTTTCGGTAGTGGAATAATCACTAGTAATGCTCCTATGGACGAGTGTGACGCTAAG TGCCAAACACCTCAGGGCGCTATCAATAGCTCCCTTCCATTCCAGAACGTCCATCCGGTT ACCATTGGAGAGTGTCCAAAGTACGTGAGATCGGCCAAACTTCGCATGGTCACGGGTCTG CGCAACATCCCGTCAATCCAATCTAGGGGCCTCTTCGGCGCTATCGCCGGTTTCATTGAG GGCGGTTGGACTGGAATGGTTGACGGATGGTACGGCTATCATCACCAGAACGAACAAGGT TCCGGTTACGCTGCTGACCAGAAATCTACTCAGAACGCGATCAATGGTATCACGAACAAG GTGAACAGCGTCATTGAAAAGATGAATACTCAGTTTACAGCCGTGGGCAAAGAGTTCAAT AAACTCGAGAGACGTATGGAAAACCTCAATAAGAAGGTGGATGACGGCTTCCTGGACATT TGGACTTACAACGCCGAGCTGCTGGTCCTGCTCGAGAACGAGAGAACCCTTGACTTCCAC 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GCCTACAAGATAGTTAAGAAGGGTGATTCAGCGATCATGAAGTCGGAACTTGAGTATGGC AACTGCAACACTAAATGCCAAACTCCAATGGGCGCTATCAACTCCAGTATGCCATTCCAT AACATCCACCCATTGACAATCGGTGAATGTCCCAAGTACGTGAAGCACCACCATCACCAT CACTAATAG SEQ ID NO148 FOR引物 AGGCAGATCTATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTC TTACATCTATGCGGAGAAAACCCATAACGGTAAGTTGTG SEQ ID NO149 REV引物 AGTCGCATGCCTATTAATGGTGGTGATGATGGTGCTTCACGTACTTGGGACATTCACCGA TTG SEQ ID NO150 HA0s IND AGATCTATGAAGTTCCTGGTCAATGTAGCCTTGGTATTTATGGTAGTCTATATCTCGTAC ATTTACGCAGACCAGATTTGTATTGGATATCACGCTAACAACAGCACAGAGCAGGTAGAT ACTATTATGGAGAAAAATGTTACCGTCACTCACGCCCAGGACATCCTGGAGAAAACCCAT AACGGTAAGTTGTGCGACCTTGACGGTGTAAAGCCCCTGATCCTCCGTGACTGCAGTGTT GCTGGTTGGCTTTTGGGCAACCCCATGTGTGACGAATTTATCAACGTGCCTGAATGGTCA TACATTGTAGAGAAGGCCAACCCCACGAACGATCTCTGTTATCCCGGCAGCTTCAATGAC TATGAGGAACTTAAGCACCTTCTGTCACGTATCAACCACTTCGAAAAGATCCAGATCATC CCGAAGAGCTCCTGGAGCGACCACGAAGCCAGTTCGGGTGTGTCTTCCGCTTGCCCCTAC CTCGGTAGCCCTTCCTTCTTCCGTAACGTAGTGTGGCTGATCAAGAAGAATAGCACTTAC CCTACAATCAAAAAGTCGTATAACAATACTAACCAAGAGGATCTGCTTGTACTCTGGGGA ATTCATCATCCCAACGACGCGGCGGAGCAGACCAGGTTGTACCAGAACCCCACCACTTAC ATCTCCATCGGTACGTCCACACTGAATCAGCGTCTGGTCCCCAAGATCGCAACCAGGTCC AAGGTTAACGGTCAGTCCGGTCGTATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCCAACGAC GCCATCAACTTCGAGTCCAACGGTAATTTCATTGCTCCGGAGTACGCCTACAAGATAGTT AAGAAGGGTGATTCAGCGATCATGAAGTCGGAACTTGAGTATGGCAACTGCAACACTAAA TGCCAAACTCCAATGGGCGCTATCAACTCCAGTATGCCATTCCATAACATCCACCCATTG ACAATCGGTGAATGTCCCAAGTACGTGAAGAGCAACAGGTTGGTATTGGCCACCGGTTTG AGAAACAGCCCCCAGAGAGAGTCGCGTCGTAAAAAGCGCGGCTTGTTCGGAGCCATCGCT GGCTTCATAGAGGGTGGTTGGCAGGGAATGGTCGATGGTTGGTATGGTTATCATCATTCC AACGAGCAGGGAAGTGGTTACGCCGCCGACAAAGAATCGACCCAGAAGGCTATTGACGGC GTCACAAACAAAGTAAACTCTATCATTGATAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTAGGT AGAGAATTCAACAACCTCGAAAGACGTATTGAGAACCTGAACAAGAAAATGGAGGATGGC TTCCTGGACGTGTGGACCTACAATGCTGAGCTGTTGGTCCTTATGGAGAACGAGCGTACC CTCGATTTCCATGACTCAAACGTGAAGAACCTGTATGACAAGGTGCGTTTGCAACTGAGG GACAACGCAAAGGAGCTTGGAAACGGTTGTTTCGAATTTTATCATAAGTGCGACAATGAG TGTATGGAGTCGATTAGAAATGGCACGTACAACTACCCTCAATACAGCGAAGAAGCTCGT CTCAAACGTGAGGAAATCAGCGGCGTCAAGCTCGAATCAATCGGTACCTATCAGCACCAC CATCACCATCACTAATAGGCATGC SEQ ID NO151 STF2.HA1-1His(PR8) MKFLVNVALVFMVVYISYIYAAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAA GQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQ AEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAY DVKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFT GADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGG VDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTK TAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDA LRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQV PQNVLSLLASGSGSGSSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNS ENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTE KEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERP KVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPL 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SHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVS VVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGHHHHH H SEQ ID NO158 STF2.HA1-3mutHis(PR8) MKFLVNVALVFMVVYISYIYAAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAA GQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQ AEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAY DVKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFT GADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGG VDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTK TAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDA LRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQV PQNVLSLLASGSGSGSNSENEICYPGDFIDKEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAA CSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYV SVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAAALSRGHHHH HH SEQ ID NO159 STF2.HA1-2(IND) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASR NANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFN GVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYDVKDTAVTTKAYANNGTTL DVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIGGFTGADAAKNGDYEVNVATDG TVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKNALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDK NGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTSYTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDG KTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAGVKPLILRDCSV AGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWS DHEASSGVSSACPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQT RLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKI VKKGDSAIMKSE Drosophila SEQ ID NO160 STF2Δ.HA0shis ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC 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AGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAA TTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGAC AATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAG TCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAG ACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGA SEQ ID NO161 FOR引物 ATTCTCCGGCGGCCGCTCGACACAATATGTATAGGCTACC SEQ ID NO162 REV引物 AGTCTTGCGGCCGCCTATTAATGGTGATGGTGATGATGCTGATAGATCCCCATTGATTCC SEQ ID NO163 HA0s PR8模板 GACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTC GAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAA CTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGG CTTTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTA GAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAG CTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAA AGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGAGGGGAAA AGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTG AAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCAC 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ATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGGACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCAT CATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTATGCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATT AACGGGATTACAAACAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCT GTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAGAAAAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGAT GATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAA AGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAA TTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGAAATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGAC AATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAATGGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAG TCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAG TAG SEQ ID NO165 FOR引物 ATTCTCCGGCGGCCGCTCGACACAATATGTATAGGCTACC SEQ ID NO166 REV引物 AGTCTTGCGGCCGCCTATTAATGGTGATGGTGATGATGCTGATAGATCCCCATTGATTCC SEQ ID NO167 HA0s.STF2Δ GACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTC GAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAA CTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGG CTTTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTA 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GCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCT ATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGAT TCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTTTGCAGCAGGCCGGT ACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTTAA TAG SEQ ID NO168 FOR引物 AGGCAAGATCTGACACAATATGTATAGGCTACC SEQ ID NO169 REV引物 AGTCAGACGCGTCTATTAACGTAACAGAGACAGCAC SEQ ID NO170 Ha0s.his GACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTC GAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAA CTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGG CTTTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTA GAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAG CTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAA AGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGAGGGGAAA AGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTG AAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCAC CCGCCTAACAGTAAGGAACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTA GTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGA GATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATAATA TTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTT GGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACA CCCCTGGGAGCTATAAACAGCAGTCTCCCTTACCAGAATATACACCCAGTCACAATAGGA GAGTGCCCAAAATACGTCAGGAGTGCCAAATTGAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATT CCGTCCATTCAATCCAGAGGTCTATTTGGAGCCATTGCCGGTTTTATTGAAGGGGGATGG ACTGGAATGATAGATGGATGGTATGGTTATCATCATCAGAATGAACAGGGATCAGGCTAT GCAGCGGATCAAAAAAGCACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAACACT GTTATCGAGAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGGTAAAGAATTCAACAAATTAGAA AAAAGGATGGAAAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATAT AATGCAGAATTGTTAGTTCTACTGGAAAATGAAAGGACTCTGGATTTCCATGACTCAAAT GTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAGAAATCGGA AATGGATGTTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAATGAATGCATGGAAAGTGTAAGAAAT GGGACTTATGATTATCCCAAATATTCAGAAGAGTCAAAGTTGAACAGGGAAAAGGTAGAT GGAGTGAAATTGGAATCAATGGGGATCTATCAGACGCGTTACCGGTCATCATCACCATCAC CATTGA SEQ ID NO171 FOR引物 ATTCTCCGGCGGCCGCTCGACACAATATGTATAGGCTACC SEQ ID NO172 REV引物 AGTCTTGCGGCCGCCTATTAATGGTGATGGTGATGATGCTGATAGATCCCCATTGATTCC SEQ ID NO173 HA0s GACACAATATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTC GAGAAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTTAACCTGCTCGAAGACAGCCACAACGGAAAA CTATGTAGATTAAAAGGAATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATGTAACATCGCCGGATGG CTTTTGGGAAACCCAGAATGCGACCCACTGCTTCCAGTGAGATCATGGTCCTACATTGTA GAAACACCAAACTCTGAGAATGGAATATGTTATCCAGGAGATTTCATCGACTATGAGGAG CTGAGGGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTCGAAAGATTCGAAATATTTCCCAAAGAA AGCTCATGGCCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCAGCATGCTCCCATGAGGGGAAA AGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGCTGACGGAGAAGGAGGGCTCATACCCAAAGCTG AAAAATTCTTATGTGAACAAAAAAGGGAAAGAAGTCCTTGTACTGTGGGGTATTCATCAC CCGCCTAACAGTAAGGAACAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGCTTATGTCTCTGTA GTGACTTCAAATTATAACAGGAGATTTACCCCGGAAATAGCAGAAAGACCCAAAGTAAGA GATCAAGCTGGGAGGATGAACTATTACTGGACCTTGCTAAAACCCGGAGACACAATAATA TTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTT GGGTCCGGCATCATCACCTCAAACGCATCAATGCATGAGTGTAACACGAAGTGTCAAACA 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STF2.HA1-2(俄亥俄) ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG 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TATATCTGCACCGAAGGTGAAGATCAAATCACGATTTGGGGCTTCCACTCCGACAGCGAG ACACAAATGGCGAAACTGTACGGTGACAGCAAACCGCAAAAATTCACTAGCTCCGCTAAC GGTGTTACCACCCACTACGTTTCCCAGATCGGTGGTTTCCCAAACCAGACCGAAGATGGT GGTCTGCCGCAGTCCGGTCGCATCGTTGTAGATTATATGGTGCAGAAAAGCGGTAAAACC GGTACCATCACCTACCAGCGTGGCATCCTGCTGCCGCAGAAAGTTTGGTGCGCTTCCGGT CGTAGCAAAGTAATCAAAGGTTGATAG SEQ ID No193 FOR引物 CGGATAACAATTCCCCTCTAG SEQ ID No194 REV引物 CGAAGTGAGATTTGGTTGGAGTAGTGGTCGCTAACAGAGACAGCACGTTC SEQ ID No195 FOR引物 CCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTAGCGACCACTACCCCAACCAAATCTC SEQ ID No196 REV引物 CTATTTCACCCAAATTGGAC SEQ ID No197 REV引物 CACAGCTTGCCACGGGTTTCAGTGCCTTTCGCTAACAGAGACAGCACGTTC SEQ ID No198 FOR引物 CCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTAGCGAAAGGCACTGAAACCCGTGGC SEQ ID No199 REV引物 GACTAGACGCTCAGCTATCAACCTTTGATTACTTTGCTACGACC SEQ ID No200 REV引物 CACAGCTTACCGCGGGTACGAGTGCCTTTCGCTAACAGAGACAGCACGTTC SEQ ID No201 FOR引物 CGGGATCCAAAGGCACTCGTACCCGCGGTAAG SEQ ID No202 REV引物 GACTAGACGCTCAGCTATCAGCCCTTAATGACCTTGGAACGGCC SEQ ID No203 REV引物 GCATAGTTTTCCTCTGGTCTGTGTTCCTTTCGCTAACAGAGACAGCACGTTC SEQ ID No204 FOR引物 AAAGGAACACAGACCAGAGG SEQ ID No205 REV引物 CTACTACCCTTTTATTACCTTGCTCC SEQ ID No206 REV引物 CACAGCTTGCCACGGGTTTTAGTGCCTTTCGCTAACAGAGACAGCACGTTC SEQ ID No207 FOR引物 AAAGGCACTAAAACCCGTGGC SEQ ID No208 REV引物 GACTAGACGCTCAGCTATCAACCTTTGATTACTTTGCTACGACC SEQ ID NO209 STF2.HA1-1(MAL) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLATTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVA LGRPKCTGNIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVIN AENAPGGSYKIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTEGED QITVWGFHSDNEAQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRI VVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKS KPYYTGEHAKAIGNCPIWVK SEQ ID NO210 STF2.HA1-2(MAL) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPS ARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGSYKIG TSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNE AQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKT GTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG SEQ ID NO211 STF2.HA1-2(SH) MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPS AKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKALGGPYRLG TSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKT QMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTG TIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKG SEQ ID NO212 STF2 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGT SEQ ID NO213 B/山形/16/18HA MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLK GTKTRGKLCPNCLNCTDLDVALGRPMCMGTIPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIR QLPNLLRGYENIRLSTHNVINAERAPGGPYRLGTSGSCPNVTSRNGFFATMAWAVPRDNK TATNPLTVEVPYICTKGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQ IGDFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSL PLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKER GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEV KNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALER KLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDD GLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIVYMVSRDNVSCSICL SEQ ID NO787 B/维多利亚/2/87HA MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLK GTKTRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGTIPSAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIR QLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAETAPGGPYKVGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDN NKTATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNEAQMVKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYV SQIGGFPNQAEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKG SLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLK EKGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSEL EVKNLQRLSGAMDELHNKILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLAL ERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLN DDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIVYMVSRDNVSCSICL 实施例13具有供化学共轭的人为改造半胱氨酸残基的鞭毛蛋白 细菌鞭毛蛋白鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白第2型(STF2，SEQ ID NO312)的晶体结构已经被报导(米仓等人，自然424，643-650(2003))。已报导通过电子冷冻显微镜术的细菌鞭毛丝状体的完整原子模型，以及基于此结构进行TLR5活化的最详细结构-功能研究(史密斯，K.D.等人，自然免疫学41247-1253(2003))。钟样受体5(TLR5)识别位于鞭毛蛋白上，供原丝形成及细菌运动所需的固有位点(自然免疫学4(12)1247-1253)。突变分析证明，鞭毛蛋白的TLR5活性存在于N-与C-末端功能域中的两个区域，分别是含39与31氨基酸的伸长(史密斯等人)。此等区域为图18中以灰色强调的区域。此等区域的丙氨酸-扫描致变，鉴定得许多可减低TLR5活化的突变，但是没单一突变可完全消除活性，暗示在TLR5结合位点中有某种程度的可挠性或冗余。此促成演化可能的概念，或不然细菌可能容易演化以逃避被TLR5检测。缺失高变铰链区及保留固有的N-与C-末端功能域，产生一种仍保有完整TLR5活性的蛋白质(STF2Δ)，证明N-与C-末端功能域(共同)，对于TLR5活化作用为必要且充分的。
赖氨酸残基为用于将各种化学结构化学共轭至，诸如鞭毛蛋白等蛋白质载体的方便底物。STF2(SEQ ID NO312)的30个赖氨酸残基中，只有一个位于经实验界定的TLR5活化位点内，且此特别的赖氨酸于所有细菌鞭毛蛋白中并非固有(史密斯，K.D.等人，自然免疫学41247-1253(2003))。其余29个赖氨酸中，有24个位于鞭毛蛋白的高变区中，因此于STF2Δ(SEQ ID NO313)中剩下5个赖氨酸残基。图19与20中的结构显示，大多数赖氨酸在空间上是远离TLR5活化功能域，因此赖氨酸似乎可随机与肽或碳水化合物抗原共轭，而合理地可能不会干扰所成的共轭STF2Δ(SEQ ID NO313)蛋白的TLR5活性。五个赖氨酸位置似乎相当靠近TLR5活化位点；若抗原与赖氨酸的共轭会影响TLR5活性时，此等残基将首先被考虑进行突变。
可将供共轭的可能额外位点(例如半胱氨酸或额外的赖氨酸)，通过将此类残基置入高变区或距离TLR5结合位点远程的固有N-与C-末端功能域的尾部中，而以人为改造至全长(STF2(SEQ ID NO312))或STF2Δ(SEQ ID NO313)。亦存在用于共轭至其它氨基酸的化学方法。此等包括羧基氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)与羧基末端氨基酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸及丝氨酸。任一此等策略可用于将抗原结构共轭至鞭毛蛋白，而不干扰TLR5活化位点。
有些类型抗原包括多糖类，不能执行重组融合DNA技术，亦不能施予合成肽化学，而因此无法以基因或合成方法键联至钟样受体(TLR)的配体。此外，肽类与TLR配体的基因或合成型融合，可能会抑制TLR配体的适当折叠。可利用抗原与TLR配体(经折叠及纯化)的化学共轭。肽类的化学共轭亦允许使抗原放置于TLR配体的特别位点，因此限制对TLR配体的受体结合的干扰，或使对抗原受体的暴露最大化。许多肽类抗原与TLR配体的共轭，亦可通过增加与抗原所展现至免疫系统的构型异质性，而使免异原性极大化。为提供用于此类抗原与鞭毛蛋白进行化学共轭的位点，遂将半胱氨酸残基改造于编码STF2Δ(其中高变铰链区已经缺失的鞭毛蛋白；SEQ ID NO313与SEQ ID NO314)的基因中的不同位点。
材料与方法 聚合酶链反应(PCR)

PCR SuperMix高正确性试剂盒(目录编号12532-016，因维托金公司，卡斯贝得(Carlsbad)，CA)是用于所有使用下列已制造商的说明为准的提案进行的PCR扩增。
1.将下列组成依任意顺序加至各反应试管中 a.45μl

PCR SuperMix高正确性(PCR反应缓冲液) b.引物溶液(10pMol终浓度的各引物) c.模板DNA溶液(10ng质粒DNA) 2.反应体积以水调整至50μl 3.将试管加盖并装载于热循环器中 4.将试管培育于94℃下30至120秒，以使模板完全变性并且活化酶 5.进行下列PCR扩增达25-35次循环 a.于94℃下进行变性15-30秒 b.于50-55℃下进行黏合15-30秒 c.于68-72℃下进行延长1分钟每kb的PCR产物大小 d.若需要，冷却至4℃并维持直到下一制程所需 STF2Δ基因(SEQ ID NO314)的构建鼠伤寒沙门氏杆菌的全长鞭毛蛋白fljb(STF2，SEQ ID NO312)是由1.5kb基因(SEQ ID NO315)所编码。为产生STF2Δ(SEQ ID NO314)，遂将对应于高变铰链区的序列(SEQ ID NO312的氨基酸170至415)缺失，并置换以经设计有助于供TLR5传讯所必要的，STF2(SEQ ID NO315)的NH2与COOH末端序列的作用(史密斯，K.D.等人，2004)，的短的柔性连接(GAPVDPASPW(SEQ ID NO336))。钟样受体5(TLR5)识别位于鞭毛蛋白上，供原丝形成及细菌运动所需的固有位点(自然免疫学4(12)1247-1253)。
为产生STF2Δ质粒，遂使用两步骤PCR(图21)。于第一反应中，是将编码STF2.OVA(全长STF2与全长卵白蛋白的融合，SEQ ID NO316)的质粒，与引物STF28BGF-1(SEQ ID NO317)及STF28MCR-1(SEQ ID NO318)混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增。于平行反应中，是将STF2.OVA模板质粒与引物STF28.MCF-2(SEQ ID NO319)及STF28ECR-2(SEQ ID NO320)混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增。
所述PCR扩增反应分别产生～500bp与270bp片段。将此等PCR产物与引物STF28BGF-1(SEQ ID NO317)及STF28ECR-2(SEQ ID NO320)混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增。将从此反应扩增得的DNA产物(770bp)，以BglII与EcoRI限制酶于37℃下分解2小时，并接合至预先经BglII与EcoRI消化及，以牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理的pMTBiP/V5-His B(因维托金公司，卡斯贝得，CA)中。取一等份接合混合物用于转化大肠杆菌TOP10细胞。将所成的构建体用于产生半胱氨酸修饰STF2Δ构建体。
构建经改造用于表达单一半胱氨酸残基的STF2Δ基因为将半胱氨酸残基导入于STF2多肽中的确定位置，遂使用pMT/STF2Δ作为与如下所述引物对进行PCR中的模板。
为构建STF2Δ.3’Cys(SEQ ID NO325)质粒，遂将pMT/STF2Δ质粒与3’正向1(SEQ ID NO321)及3’反向1(SEQ ID NO322)引物混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增。
为构建5’Cys.STF2Δ(SEQ ID NO326)质粒，遂将pMT/STF2Δ质粒与5’正向2(SEQ ID NO323)及5’反向2(SEQ ID NO324)引物混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增。
对于STF2Δ.3’Cys(SEQ ID NO325)及5’Cys.STF2Δ(SEQ ID NO326)构建体，是将所产生的PCR产物以Nde1与Blp1限制酶分解，并通过琼脂凝胶电泳术纯化。将经纯化片段经由可相容端接合至，预先经Nde1与Blp1限制酶分解及CIP处理的pET24a(诺瓦金，马地森，WI)质粒DNA。所成的构建体分别命名为pET/STF2Δ.3’Cys与pET/5’Cys.STF2Δ。
为构建STF2Δ.铰链Cys(SEQ ID NO331)质粒，遂利用类似于图18所述的两步骤PCR。通过将pMT/STF2Δ与成对的铰链正向1(SEQ ID NO327)及铰链反向3(SEQ ID NO328)引物混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增，而产生一片段。另一片段是通过将pMT/STF2Δ与成对的铰链正向2(SEQ ID NO329)及铰链反向4(SEQ ID NO330)引物混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增而产生。将得自各此等PCR反应的等份组合，并与铰链正向1(SEQ ID NO327)及铰链反向4(SEQ ID NO330)引物混合于PCR反应缓冲液中，并将混合物于前述的PCR反应中进行扩增。将最终PCR产物经由琼脂凝胶电泳术纯化，并以Nde1与Blp1限制酶分解，且将经纯化片段接合至如前所述的pET24a载体中。所成的构建体是命名为pET/STF2Δ.铰链Cys。
蛋白质表达将质粒pET/STF2Δ.3’Cys、pET/5’Cys.STF2Δ及pET/STF2Δ.铰链Cys如下述转化至胜任大肠杆菌BLR(DE3)细胞中。将20μl等份的BLR(DE3)细胞与1μl质粒DNA(1μg/μl)加至，于冰上预冷的1.5-ml弹盖聚丙烯试管中，并将混合物培育30分钟。将试管于42℃水浴中不加搅拌加热确实30秒，然后置于冰上再另2分钟。将250μl的室温SOC加至各管经热激的细胞。
将细胞于37℃下(于250rpm下振荡)恢复60分钟，之后涂布于含有卡那霉素的选择培养基上。涂布各种不同等份的转化混合物，并将板于37℃下培育18小时。挑取菌落并接种至补充以25μg/ml卡那霉素与12.5μg/ml四环素的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，并培养过夜。通过将等份的过夜培养物1:100稀释而接种新鲜LB培养物，并于37℃下伴随振荡进行培养。当培养物的OD600到达0.6至1.0时，通过添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM诱导蛋白质表达。经诱导数小时后，收取细胞以供通过SDS-PAGE分析蛋白质表达。从生长于补充以0.5％葡萄糖、25μg/ml卡那霉素与12.5μg/ml四环素的LB中的培养物，于添加甘油(7％终浓度)后冷冻于-80℃，而制备得甘油储备物。
蛋白质纯化蛋白质STF2Δ.3’Cys(SEQ ID NO332)与STF2Δ.铰链Cys(SEQ ID NO333)的表达及纯化如下。将带有所希望质粒的大肠杆菌BLR(DE3)细胞的甘油储备物，接种入10L含有LB的振荡-烧瓶中，并伴随恒定振荡培育于37℃下。当培养物到达A600＝0.8的光学密度时，通过添加1mM IPTG诱导蛋白质表达，并将培养物于37℃下伴随恒定振荡培育4小时，之后进行收获。通过于5,000rpm(SLA3000转体)下低速离心10分钟，而从10L培养物收集细胞，并悬浮于50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA，1mM DTT(100ml/10L)中。
通过将细胞悬浮液于18,000psi下，两次通过微液化器而破坏细胞。通过于10,000rpm(SS34转体)下离心15分钟，而使不可溶性物质与可溶性蛋白质分开。于所述的培养条件下，所有STF2Δ蛋白质与不可溶性物质同级份，且形成于离心后呈固体沉淀物被收集的稳定包涵体。将包涵体以50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1M NaCl与0.5％ Triton X-100清洗两次，随后以不含清洁剂的相同缓冲液洗两次。每次清洗皆使用dounce均质器进行，并通过于10,000rpm(SS34转体)下离心15分钟，收集经清洁的包涵体(IBs)。将经纯化的IBs以50mMTris-HCl，pH 8.0清洗最后一次，并以细胞沉淀形式储放于-80℃直到需要。
将IB物质解冻并溶解于pH4.0的8M尿素中。此步骤选择性地安定标靶蛋白质，而使显著量的碎片与杂质蛋白质仍呈可由离心去除的固体沉淀。因为此等蛋白质中存在单一半胱氨酸，故所有后续纯化程序是使用含有1mM DTT作为还原剂的缓冲液完成。将溶解蛋白质使用SP快速流通琼脂糖(30ml，XK16)捕获，并选择性地以8M尿素溶于25mM醋酸Na(C2H3O2Na)，pH 4.0，1mMDTT，1mM EDTA与0.2M NaCl洗脱。为清除经此步骤后的蛋白质沉淀，遂于蛋白质再折叠前，将SP洗脱物的pH值通过对50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mMDTT，1mM EDTA透析，而从4.0调整至8.0。将经透析的物质通过直接稀释(10-倍)至50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM DTT与1mM EDTA，以使最终蛋白质浓度小于0.1mg/ml，而进行再折叠。将经再折叠的SP汇集直接加样至Q高效能琼脂糖(30ml，XK16)上，并将结合的蛋白以20管柱体积从0至0.5M NaCl存于50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM DTT，1mM EDTA中的线性梯度洗脱。此层析术步骤产生单一个于导电率为大约15ms/cm洗脱出的高峰。将此洗脱物汇集并储放于-80℃。
蛋白质特征化使用下列分析针对蛋白质的纯度、同一性、内毒素含量及生物活性特征化。
SDS-PAGE将蛋白质(代表性地5μg)稀释于含有或不含5mMβ-巯基乙醇的SDS-PAGE样本缓冲液(1％ SDS，30mM Tris-HCl，pH 6.8，4％甘油，0.1mg/ml溴酚蓝)中。将样本煮沸5分钟，并加样至4-20％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上。于电泳术后，将凝胶以考马西蓝染色以呈现蛋白质条带。
内毒素分析使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(BioWhittaker#50-648U)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定内毒素浓度。
蛋白质分析通过以96-孔格式，使用BSA作为标准物的MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(皮尔斯生物技术(Pierce Biotechnology))，根据制造商的说明测定蛋白质浓度。
鞭毛蛋白ELISA通过以特异于鞭毛蛋白的抗体进行的ELISA，检验蛋白质完整性与浓度。将96-孔ELISA板于4℃下，以各标靶蛋白质溶于PBS的系列稀释(开始于5μg/ml)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)于室温下封阻一小时，然后于含有Tween-20的磷酸盐缓冲食盐水(PBS-T，12mM NaPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，0.05％ Tween 20)中清洗三次。将兔多株抗-鞭毛蛋白抗体于ADB的稀释液(100μl/孔，1:5000)加入全部孔中，并将板于室温下培育1小时，或于4℃下过夜，然后以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-兔IgG抗体(杰克森免疫化学)加入(100μl/孔，1:5000)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte微量板分光光度计上测量A450。
TLR5生物活性分析HEK293细胞(ATCC，Cat#CRL-1573，马纳萨斯，VA)固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将重组型测试蛋白质加入。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，洛克弗，IL；#M801E与#M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中的IL-8存在。使用微量板分光光度计测量光学密度。
结果与讨论 蛋白质产量及纯度各蛋白质的最终产量与内毒素含量程度列示如下 鞭毛蛋白整体性将单一半胱氨酸改造于STF2Δ中，并不减低其由鞭毛蛋白-特异性抗体的识别，如图22所示。
于HEK293IL-8分析的TLR5激动剂活性将单一半胱氨酸改造于STF2Δ中，并不减低该蛋白的TLR激动剂活性，如图23所示。经暴露至STF2Δ.3’Cys(SEQ ID NO332)或STF2Δ.铰链Cys(SEQ ID NO333)的细胞，分泌与所述经由暴露至全长鞭毛蛋白(STF2，SEQ ID NO312)，或无半胱氨酸残基的STF2Δ(SEQ ID NO313)所诱导的IL-8分泌程度相当。
全长鞭毛蛋白(STF2，SEQ ID NO312)，或铰链区-经缺失的鞭毛蛋白(STF2Δ，SEQ ID NO313)与蛋白质抗原，例如西尼罗病毒包膜蛋白或流感A血细胞凝集素融合，明显增加该经融合抗原的免疫原性。此提案可用于，其能被编码于使鞭毛蛋白与所兴趣抗原表达呈单一蛋白质，的基因融合构建体中的蛋白质或肽类抗原，但是其无法应用于非-蛋白质或非-肽类抗原，例如多糖类抗原。因为许多细菌与肿瘤细胞表现，其具有抗原性但是免疫原性差的特异性多糖结构，故发明出用以增加此类结构的免疫原性及保护功效的可数量方法很重要。将其化学共轭至TLR配体(例如鞭毛蛋白)是一项有潜能的策略。
有数种化学连接方法，但其中最简单者是将抗原偶联至自由态硫醇基，例如位于单一、未配对的半胱氨酸残基。因为鞭毛蛋白于自然下不含有任何半胱氨酸，故将半胱氨酸残基改造入鞭毛蛋白的三个位置其中的一鞭毛蛋白的氨基末端(5’Cys.STF2Δ，SEQ ID NO326与SEQ ID NO334)、鞭毛蛋白的羧基末端(STF2Δ.3’Cys，SEQ ID NO325与SEQ ID NO332)及于鞭毛蛋白的被缺失铰链区中(STF2Δ.铰链Cys，SEQ ID NO331与SEQ ID NO333)。所有构建体皆于用于大肠杆菌表达的表达载体pET2Aa中制得。当从大肠杆菌细胞纯化得时，STF2Δ.铰链Cys(SEQ ID NO333)及STF2Δ.3’Cys(SEQ ID NO332)蛋白质保有全部抗原性，与未经修饰STF2Δ蛋白质的TLR5生物活性特性，因此确定导入单一半胱氨酸残基，并不会负面冲击STF2Δ的表达、纯化、再折叠或生物活性。
流感病毒血细胞凝集素成熟剪切部位肽与STF2Δ.铰链CYS的共轭 将代表流感病毒血细胞凝集素的成熟剪切位点的肽，以化学方式共轭经修饰的鞭毛蛋白，STF2Δ.铰链Cys(SEQ ID NO333)。
材料与方法 制造STF2Δ.铰链Cys蛋白质如先前的实施例所述，表达及纯化得STF2Δ.铰链Cys蛋白质(SEQ ID NO333)。
合成H1C1肽序列NH2-NIPSIQSRGLFFAIAGFIE-COOH(SEQ ID NO337)代表流感病毒A/H1N1血细胞凝集素的成熟剪切位点(比安契，E.等人(2005))。普遍性流感B疫苗是基于血细胞凝集素前驱物的成熟剪切位点(比安契，E.等人，J.Virol.797380-7388(2005))。设计两种于氨基-末端具有额外半胱氨酸，或额外赖氨酸以助于化学键联至载体蛋白的肽，产生下列肽序列 CysH1C1(SEQ ID NO338)NH2-CNIPSIQSRGLFFAIAGFIE-COOH(SEQID NO338) LysH1C1(SEQ ID NO339)NH2-KNIPSIQSRGLFFAIAGFIE-COOH(SEQID NO339) 所述肽是由安纳斯帕克股份有限公司(Anaspec，Inc.，桑琼斯，CA)，使用标准Fmoc化学合成得，之后将彼等以三氟乙酸(TFA)从基材裂解出，经由逆相HPLC纯化并冷冻干燥。
CysH1C1肽与STF2Δ.铰链Cys的共轭作用将浓度为4.9mg/mL的STF2Δ.铰链Cys蛋白质(SEQ ID NO333)，于缓冲液A[1x磷酸盐-缓冲食盐水(PBS)，5mM EDTA，pH7.2]中进行透析过夜。将BM(PEO)2(皮尔斯生物科技，洛克佛，IL)，其为一种同双官能性顺丁烯二酰亚胺交联剂，溶解于DMSO(二甲基亚砜)中，并加至终浓度为2.3mM。待于室温下培育1小时后，使用5ml Superdex25HiTrap脱盐管柱，将游离态交联剂从蛋白质移除。将CysH1C1 peptide(SEQID NO338)溶于DMSO中，并加至终浓度为0.32mM的经顺丁烯二酰亚胺衍生化STF2Δ.铰链Cys蛋白质。待于室温下培育3小时后，通过将DTT(二硫赤藓糖醇)加至终浓度为40mM终止反应。通过于经于1x磷酸盐-缓冲食盐水(PBS)，pH 8.0中平衡的Superdex 200 10/300尺寸排除层析术(SEC)管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)上进行级分，而使蛋白质及蛋白质-肽共轭物与游离肽分离。
蛋白质特征化如先前实施例所述，对蛋白质的纯度、同一性、内毒素含量及生物活性特征化。
结果与讨论 STF2Δ.铰链CysCysH1C1肽共轭物的特征化通过以考马西蓝染色的SDS-PAGE，分析CysH1C1肽(SEQ ID NO338)与STF2A.铰链Cys STF2Δ.铰链Cys(SEQ ID NO333)的共轭作用。肽与蛋白质共轭产生双重条带，其中较快速移动条带相当于未-经共轭的蛋白质，而较慢移动条带相当于蛋白质-肽共轭物。
由于该肽溶解度低，于共轭混合物中观察到雾状沉淀。为确定蛋白质-肽共轭物是否沉淀，遂将混合物离心(16,000xg下15分钟)，并将所成的沉淀与上清液通过SDS-PAGE分析。大部分肽-共轭蛋白质保留于上清液中，表示其仍然为可溶性。
进行STF2Δ.铰链CysCysH1C1共轭物的尺寸排除层析术(SEC)，以使蛋白质与残留的交联剂及未经共轭的肽分离。于预测出现单体STF2Δ的管柱体积所包括的范围内洗脱出单一主要高峰，同时有非常少物质洗脱于空隙体积中(图24)，表示大多数蛋白质为单体。
STF2Δ.铰链CysCysH1C1共轭物的单体特性，是通过将S200流份进行SDS-PAGE分析确认。蛋白质-肽共轭物与加样样本中相同比例的未经共轭蛋白质共洗脱出，表示该共轭物为单体。
经发现，STF2Δ.铰链CysCysH1C1共轭混合物的生物活性与未经共轭的STF2A.铰链Cys蛋白质相等，表示接附上BM(PEO)2交联剂及肽共轭反应，不抑制TLR5刺激活性(图8)。
流感病毒血细胞凝集素抗原与含PAM3CYS-脂肽的共轭 有数类型钟样受体(TLR)是有效地受脂质或脂质-共轭物活化。此等包括TLR2/1(二酰基脂蛋白与GPI-连结蛋白质)、TLR2/6(三酰基脂蛋白与GPI-连结蛋白质)及TLR4(脂多糖类)。由经键联至此类脂质的抗原所组成的疫苗的用途是明显的脂质为先天免疫途径的强活化剂，但本身具有若免疫原性。然而，此类共轭物的制造非常复杂。重组脂蛋白于细菌中的生物合成，受限于低产量且所成蛋白质-脂肽融合物的纯化相当困难。脂肽抗原的化学合成较直接，但是限制于肽抗原。在此，吾等证明以一种绕过固有存在于二者生物合成的困难，且完成脂质化抗原的化学合成的制程，进行Pam3Cys脂肽(一种TLR2/6激动剂)与流感HA1-1His6的化学共轭。
材料与方法 制造HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)如本文所述制备得HA1-1His6(PR8)Bv。
合成Pam3CS(K)4GC(SEQ ID NO335)由安纳斯帕克股份有限公司(桑琼斯，CA)，使用标准Fmoc化学进行一般脂肽合成，之后将彼等以三氟乙酸(TFA)从基材裂解出，经由逆相HPLC纯化并冷冻干燥。
Pam3CS(K)4GC(SEQ ID NO335)与HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)的共轭作用将HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)透析至缓冲液A(1x PBS+5mM EDTA，pH 7.2)中。将异双官能性顺丁烯二酰亚胺/NHS交联剂磺基-SMCC(皮尔斯；洛克兰，IL)溶解于DMSO中，并加至终浓度为0.432mM。待于室温下培育30min.后，将蛋白质使用G-25HiTrap脱盐管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)，脱盐至缓冲液A中。将Triton X-114(TX-114)(西格马(Sigma)；圣路易市，MO)加入至终浓度为1％(w/v)。将Pam3CS(K)4GC溶解于DMSO中至20mg/ml，并加入达终浓度为0.6mg/ml。待于室温下培育3小时后，将反应试管置于37℃浴中达10分钟，以使TX-114液滴形成。然后将样本于16,000xg下离心10分钟，以分离清洁剂与水相。将水相吸出后，将清洁剂相以缓冲液A再悬浮至原始反应体积。然后通过SDS-PAGE分析总体、清洁剂与含水样本。
蛋白质特征化蛋白质-脂肽共轭物是通过SDS-PAGE特征化。将样本(代表性地5μg)稀释于SDS-PAGE样本缓冲液(0.1M Tris，pH 8.0/4％ SDS/25％甘油/0.1M DTT)中。将样本煮沸5分钟，并加样至4-20％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上。于电泳术后，将凝胶以考马西蓝染色以呈现蛋白质条带。
结果与讨论 输入HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)，于SDS-PAGE呈现双重条带。此已经在目前于杆状病毒制得的所有HA1-1His6蛋白质观察到，而其似乎是由于糖化的差异所致。已经磺基-SMCC衍生化但未与脂肽共轭的HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)，于进行TX-114分离程序时仍留在水相中，为可溶性、球状蛋白质所预期的特性。经共轭至Pam3Cys的HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)，呈现3或4条具有较衍生化输入蛋白质高分子量的条带，符合其被脂肽共价修饰。于进行TX-114相分离时，较高mw物种主要隔离至清洁剂相中，而较低物种(相当于未经修饰蛋白质)仍留在水相中。此特性与一般所观察脂蛋白隔离于清洁剂液滴中相符，且确定HA1-1His6(PR8)Bv(SEQ ID NO179)已经以Pam3CS(K)4GC(SEQ ID NO335)脂肽共价修饰。大约60、120及180kDa的较高分子量条带(其于经SMCC-衍生化蛋白质中观察到，但未在该输入中出现)，为由交联剂形成的共价HA1-1多聚体。此多聚化将通过将半胱氨酸改造入HA1-1中，及使用半胱氨酸-特异性而非赖氨酸-特异性交联剂来防止。此类对策亦可给予较佳控制脂肽接附于HA1-1上的位点，产生更均质的产物及可能增进免疫原性。
SEQ ID NO312，STF2的氨基酸序列 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR SEQ ID NO313，STF2Δ的氨基酸序列 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPV DPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSD YATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR SEQ ID NO314，STF2Δ的核苷酸序列 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCATGGAGCGCCGGTG GATCCTGCTAGCCCATGGACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAG GTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACC AACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGAC TACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCC GTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGT SEQ ID NO315，STF2的核苷酸序列 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGT SEQ ID NO316，STF2.OVA的核苷酸序列 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACCACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTACGTCTCGAGGGCTCCATCGGCGCAGCAAGCATGGAATTTTGTTTT GATGTATTCAAGGAGCTCAAAGTCCACCATGCCAATGAGAACATCTTCTACTGCCCCATT GCCATCATGTCAGCTCTAGCCATGGTATACCTGGGTGCAAAAGACAGCACCAGGACACAA ATAAATAAGGTTGTTCGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGGAGACAGTATTGAAGCTCAG TGTGGCACATCTGTAAACGTTCACTCTTCACTTAGAGACATCCTCAACCAAATCACCAAA CCAAATGATGTTTATTCGTTCAGCCTTGCCAGTAGACTTTATGCTGAAGAGAGATACCCA ATCCTGCCAGAATACTTGCAGTGTGTGAAGGAACTGTATAGAGGAGGCTTGGAACCTATC AACTTTCAAACAGCTGCAGATCAAGCCAGAGAGCTCATCAATTCCTGGGTAGAAAGTCAG ACAAATGGAATTATCAGAAATGTCCTTCAGCCAAGCTCCGTGGATTCTCAAACTGCAATG GTTCTGGTTAATGCCATTGTCTTCAAAGGACTGTGGGAGAAAGCATTTAAGGATGAAGAC ACACAAGCAATGCCTTTCAGAGTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTAC CAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTT CCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTT GAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTT ATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAAC CTCACATCTGTCTTAATGGCTATGGGCATTACTGACGTGTTTAGCTCTTCAGCCAATCTG TCTGGCATCTCCTCAGCAGAGAGCCTGAAGATATCTCAAGCTGTCCATGCAGCACATGCA 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TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCATGGAGCGCCGGTG GATCCTGCTAGCCCATGGACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAG GTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACC AACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGAC TACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCC GTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGTGAATTCTCT AGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCTGC SEQ ID NO326，5’Cys.STF2Δ的核苷酸序列 ATGTGCGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAAC AAATCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAAC AGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAA GGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAA GGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCT GCTAACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGC CTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCG CAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGAT CTGAAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCATGGAGCGCCG GTGGATCCTGCTAGCCCATGGACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCG CAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATC ACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCC GACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACT TCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGT SEQ ID NO327，铰链正向1的核苷酸序列 ACTGAGTGCATATGGCACAAGTAATCAACACTAACAG SEQ ID NO328，铰链反向3的核苷酸序列 GGTCCATGGGCAAGCAGGATCCACCGGCGCT SEQ ID NO329，铰链正向2的核苷酸序列 AGCGCCGGTGGATCCTGCTTGCCCATGGACC SEQ ID NO330，铰链反向4的核苷酸序列 GACTGACTGCTCAGCCTATTAACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGCGGGACCTGGTTAG SEQ ID NO331，STF2Δ.铰链Cys的核苷酸序列 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCATGGAGCGCCGGTG GATCCTGCTTGCCCATGGACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAG GTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTACAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACC AACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAAGCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGAC TACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTTTGCAGCAGGCCGGTACTTCC GTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTACGT SEQ ID NO332，STF2Δ.3’Cys的氨基酸序列 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPV DPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSD YATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLREFSRYPAQWRPLC SEQ ID NO333，STF2Δ.铰链Cys的氨基酸序列 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPV DPACPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSD YATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR SEQ ID NO334，5’Cys.STF2Δ的氨基酸序列 MCAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIK GLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQR LNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAP VDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDS DYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR SEQ ID NO335， CSKKKKGC SEQ ID NO336， GAPVDPASPW 实施例14 STF2.4xH1C1，一种包含鞭毛蛋白(TLR5激动剂)与流感A血细胞凝集素成熟剪切部位肽的融合蛋白质的克隆及表现 材料与方法 构建体设计为助于克隆与鞭毛蛋白融合的基因，遂使用位于鞭毛蛋白基因的3′端含有独特BlpI切位的卡匣质粒(STF2.blp，SEQ ID NO340)。此卡匣是通过将缄默突变(5’-GTGCTGAGCCTGTTACGT-3’)导入于STF2的核苷酸1501至1518，于该质粒卡匣pET24/STF2.blp(SEQ ID NO340)中产生独特BlpI切位而制得。将编码一、二、三及四拷贝的流感A亚型H1(NIPSIQSRGLFGAIAGFIE；SEQ ID NO341)的成熟剪切位点片段(H1C1)的合成基因，进行密码子最适化用于大肠杆菌表达，并从商业供货商(DNA2.0 Inc.，蒙罗公园，CA)购得。将合成基因以BlpI酶切出，并经由可兼容端接合至，已经以BlpI及细菌碱性磷酸酶(BAP)处理的pET24/STF2.blp。此等构建体是分别命名为STF2.1xH1C1、STF2.2xH1C1、STF2.3xH1C1与STF2.4xH1C1(SEQID NO342；SEQ ID NO343；SEQ ID NO344；SEQ ID NO345)。
同样，构建含有H1C1序列与一对半胱氨酸为侧翼，以助于多联体的环形成的融合基因，命名为STF2.4xH1C2(SEQ ID NO346)。使用类似的程序产生包含流感A亚型H5(RERRRKKRGLFGAIAGFIE；SEQ ID NO347)剪切片段的四个串联拷贝的构建体，命名为构建体STF2.4xH5C1(SEQ ID NO348)。因此代表亚型H3(NVPEKQTRGIFGAIAGFIE；SEQ ID NO349)、H2(NVPQIESRGLFGAIAGFIE；SEQ ID NO350)及B-品系，B/HA(PAKLLKERGFFGAIAGFLE；SEQ ID NO351)的共有剪切片段，可顺应于如前述所列的本实验提案。于各别个案中，是使用所构建的质粒转化胜任大肠杆菌TOP10细胞，并通过PCR筛检与限制图谱制作分析鉴定所推测的重组体。
通过DNA定序证明构建体的完整性，并将其用于转化表达宿主，BLR3(DE3)(诺瓦金，圣地亚哥，CA；Cat #69053)。转化株是于含有卡那霉素(50μg/mL)、四环素(5μg/mL)与葡萄糖(0.5％)的平板进行筛选。挑取菌落并接种入2ml补充以25μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素与0.5％葡萄糖的LB培养基中，并生长过夜。将等分的此等培养物用于，接种相同培养基调配的新鲜培养基，将其进行培养直到OD600＝0.6，此时通过添加1mM IPTG，及于37℃下培养3小时而诱导蛋白质表达。收取细胞并分析蛋白质表达。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过凝胶电泳术与免疫印迹分析，测定蛋白质表达及同一性。将细胞经由离心收取，并于Laemmli缓冲液中溶解。将10μl等分的各溶胞产物稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(SDS-PAGE)。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；莫里斯，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行细胞溶解产物进行电泳，并经电转移至PVDF膜上，再以5％(w/v)奶粉封阻。将膜以抗-鞭毛蛋白抗体6H11(Inotek；贝弗里，MA)进行探测。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯，洛克兰，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加，马地森，WI)呈现蛋白质条带。筛选出产生具有正确分子量，并与适当抗体反应的蛋白质条带的细菌纯株，用于制造供用于生物分析的蛋白质。
结果与讨论 剪切位点构建体的克隆与表达血细胞凝集素前驱物的成熟剪切位点，于流感病毒株A与B间具有相当保守性，而因此可为用于研发有效对抗，大多数流感病毒流行株的通用疫苗的标靶物。产生一系列编码TLR5配体与剪切片段的融合蛋白的质粒，并于大肠杆菌株BLR3(DE3)中表达。如由SDS-PAGE凝胶的考马西蓝染色所分析，及通过免疫印迹分析确定者，带有构建体STF2.1xH1C1、STF2.2xH1C1、STF2.3xH1C1及STF2.4xH1C1的大肠杆菌株，呈现分别对应于所预定的分子量55、58、60及62的条带。同样，表达构建体STF2.4xH1C2与STF2.4xH5C1的BLR(DE3)菌株，呈现具有明显分子量分别为62Kda与66Kda的融合蛋白质。此等数据指出，鞭毛蛋白与HA剪切片段的融合蛋白丰富表达于大肠杆菌。
STF2.4xH1C1，一种包含鞭毛蛋白(TLR5激动剂)与流感A血细胞凝集素成熟剪切部位肽的融合蛋白质的表现及纯化 材料与方法 细菌细胞生长与细胞溶解将STF2.4xH1C1(SEQ ID NO345)构建体表达于大肠杆菌宿主菌株BLR(DE3)中。将菌株从甘油储备物恢复，并生长于摇瓶中至最终体积为12L。将细胞生长于含有25μg/ml卡那霉素/12.5μg/ml四环素/0.5％葡萄糖的LB培养基中到OD600＝0.6，并与1mM IPTG于37℃下培养3小时进行诱导。将细胞通过离心(7000rpm x 7分钟于Sorvall RC5C离心机)收取，并再悬浮于20mM Tris-HCl，pH 8.0、1μg/ml DNAseI、1mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物及1mg/ml溶菌酶中。然后将细胞于15,000psi下两次通过微液化器(微量液体学(Microfluidics)；纽顿，MA)使的溶解。将溶胞产物于贝克曼Optima L超速离心机(贝克曼犁刀；弗勒顿，CA)中，于45,000g下离心一小时，以使可溶性与不可溶性部分分开。
STF2.4xH1C1(SEQ ID NO345)的纯化经离心后，将上清液流份收集，并通过Q琼脂糖快速流通管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)。将得自此步骤的流通流份补充以Triton X-100(西格马；圣路易市，MO)至终浓度为1％(w/v)，并通过相同Q琼脂糖管柱。再次收集流通流份，并补充以尿素至终浓度为8M，及柠檬酸至终浓度为20mM。经以浓HCl将pH值调整至3.5后，将溶液通过经20mM柠檬酸，pH 3.5平衡的蔗糖S管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)。
然后将管柱以10管柱体积补充以1％(w/v)Triton X-100的平衡缓冲液冲洗，以去除内毒素。接着于5-管柱体积0至1M NaCl于平衡缓冲液的线性梯度中洗脱。然后将STF2.4xH1C1通过快速稀释至再折叠缓冲液
中进行再折叠。将经折叠的蛋白质使用加压超过滤搅拌池(密里泊；贝利卡，MA)浓缩，并于Superdex 200尺寸-排除管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)进行级分。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过SDS-PAGE测定蛋白质同一性，及评估纯度。将5μg等分的各别样本稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(LifeGels；法蓝斯森林，新南韦尔斯，AUS)上，并进行电泳术。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；赫尔克里士，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行总体蛋白质如前所述进行电泳，然后经电-转移至PVDF膜上，并以5％(w/v)奶粉封阻，之后以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)，或得自经合成型、脂质化H1C1肽致免的小鼠的血清进行探测。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯；洛克兰，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加，马地森，WI)呈现蛋白质条带。
蛋白质分析使用Micro BCA(二金鸡纳酸)分析(皮尔斯；洛克弗，IL)以微量板格式，使用牛血清白蛋白作为标准物，根据制造商的说明，测定总体蛋白质浓度。
内毒素分析使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(Cambrex；E.卢瑟弗，NJ)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定内毒素程度。
TLR5生物活性分析HEK293细胞固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将STF2.4xH1C1测试蛋白质加入。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，洛克兰，IL；#M801E与#M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中IL-8的存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，GE/艾默逊；皮斯卡塔威，NJ)测量光学密度。
结果与讨论 经纯化及再折叠的STF2.4xH1C1蛋白质(SEQ ID NO345)经发现，实际上聚集呈级分于Superdex S200管柱的空隙体积中的大部分蛋白质(图26)。该蛋白质亦具有差的试管内LTR5活性，其EC50值大约高于标准鞭毛融合蛋白STF2.OVA两次方。经纯化蛋白质会与得自经合成型、脂质化H1C1肽致免的小鼠的血清反应。
STF2.1xH1C1，一种包含鞭毛蛋白(TLR5激动剂)与流感A血细胞凝集素成熟剪切部位肽的融合蛋白质的表现及纯化 材料与方法 细菌细胞生长与细胞溶解将STF2.1xH1C1(SEQ ID NO355)构建体表达于大肠杆菌宿主菌株BLR(DE3)中。将菌株从甘油储备物恢复，并生长于摇瓶中至最终体积为12L。将细胞生长于含有25μg/ml卡那霉素/12.5μg/ml四环素/0.5％葡萄糖的LB培养基中到OD600＝0.6，并与1mM IPTG于37℃下培养3小时进行诱导。将细胞通过离心(7000rpm x 7分钟于Sorvall RC5C离心机)收取，并再悬浮于20mM Tris-HCl，pH8.0、1μg/ml DNAseI、1mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物及1mg/ml溶菌酶中。然后将细胞于15,000psi下两次通过微液化器(微量液体学；纽顿，MA)使的溶解。将溶胞产物于贝克曼Optima L超速离心机(贝克曼犁刀；弗勒顿，CA)中，于45,000g下离心一小时，以使可溶性与不可溶性部分分开。
STF2.1xH1C1(SEQ ID NO342)的纯化经离心后，将上清液流份收集，并通过Q琼脂糖快速流通管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)。将得自此步骤的流通流份补充以Triton X-100(西格马；圣路易市，MO)至终浓度为1％(w/v)，并通过相同Q琼脂糖管柱。再次收集流通流份，并补充以尿素至终浓度为8M，及柠檬酸至终浓度为20mM。经以浓HCl将pH值调整至3.5后，将溶液通过经20mM柠檬酸，pH3.5平衡的蔗糖S管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)。
然后将管柱以10管柱体积补充以1％(w/v)Triton X-100的平衡缓冲液冲洗，以去除内毒素。接着于5-管柱体积0至1M NaCl于平衡缓冲液的线性梯度中洗脱。然后将STF2.1xH1C1通过快速稀释至再折叠缓冲液
中进行再折叠。将经折叠的蛋白质使用加压超过滤搅拌池(密里泊；贝利卡，MA)浓缩，并于Superdex 200尺寸-排除管柱(GE/艾默逊生物科学；皮斯卡塔威，NJ)进行级分。
SDS-PAGE与蛋白质印迹法通过SDS-PAGE测定蛋白质同一性，及评估纯度。将5μg等分的各别样本稀释于，含有或不含100mM DTT作为还原剂的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(LifeGels；法蓝斯森林，新南韦尔斯，AUS)上，并进行电泳术。将凝胶以考马西蓝R-250(Bio-Rad；赫尔克里士，CA)染色，以呈现蛋白质条带。对于蛋白质印迹，是将0.5μl/行总体蛋白质如前所述进行电泳，然后经电-转移至PVDF膜上，并以5％(w/v)奶粉封阻，之后以抗-鞭毛蛋白抗体(Inotek；贝弗里，MA)，或得自经Pam3Cys.H1C1 peptide(SEQ ID NO358)致免的小鼠的血清进行探测。待以碱性磷酸酶-共轭的次级抗体(皮尔斯；洛克兰，IL)探测后，以碱性磷酸酶呈色底物(普美加，马地森，WI)呈现蛋白质条带。
结果与讨论 经纯化及再折叠的STF2.1xH1C1蛋白质(SEQ ID NO342)经发现，当以Superdex 200凝胶过滤管柱的洗脱流份判别时，其为单体。大部分蛋白质经发现存在于，在大约14mls处洗脱出主要高峰的夹杂体积中。此与经纯化、单体鞭毛蛋白于此管柱上的已知洗脱图谱密切相符。在空隙体积(对于此管柱已知大约为7mls)中，几乎没有发现蛋白质洗脱出，证明实际上无聚集体存在。
PAM3CYS.H1C1，一种包含PAM3CYS(TLR2激动剂)与流感A血细胞凝集素成熟剪切部位肽的融合蛋白质的免疫原性及功效 材料与方法 肽设计与合成Pam3(三-棕榈酰基)为钟样受体2(TLR2)的天然配体，且其自然表达呈细菌脂蛋白(BLP，SEQ ID NO357)的脂质化基序。Pam3可通过化学合成制得及共轭至诸如蛋白质等巨分子，或可使用标准肽合成化学偶联至合成肽的N-末端。此策略通常涉及所兴趣肽的合成，包括将经Pam3-修饰的半胱氨酸(Pam3Cys)偶联至氨基末端，而产生所兴趣的脂肽。此提案是用于合成脂质化HA剪切片段肽，Pam3Cys.H1C1(Pam3Cys-SLWSEENIPSIQSRGLFGAIAGFIEE，SEQ ID NO358)。
小鼠与致免使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(杰克森实验室，巴尔港，ME)。将小鼠分组每组10只，并于第0及14天接受鼠蹊部附近皮下(s.c)致免如下 1)PBS(磷酸盐缓冲食盐水) 2)20μg的H1C1天然肽(SEQ ID NO358)于食盐水缓冲液(10mM组氨酸，10mM Tris，75mM NaCl，5％(vol/vol)蔗糖，0.02％(w/v)聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％(v/v)乙醇，pH 7.2) 3)20μg的Pam3Cys.H1C1肽(SEQ ID NO358)于食盐水缓冲液 额外一组五只小鼠接受经实验测定得的次致死激发以8x101鸡蛋感染性剂量(EID)PR/8/34，并令其恢复>21天。然后将此等动物于激发研究(参见下述)期间，使用作为免疫恢复期阳性对照组。将小鼠于第10天(初级)及21天(促升)采血，并将血清通过凝结与离心澄清化，并储放于-20℃下。
血清抗体测定通过ELISA测定H1C1-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板(Costar(Cat#9018)康宁，NY)于4℃下，以100μl/孔H1C1肽(SEQ ID NO358)溶于PBS(5μg/ml)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根，(Cat#555213)(胜地牙哥，CA)于室温下封阻一小时。将板于PBS+0.05％(v/v)Tween 20(PBS-T)中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学；西葛洛弗，PA(Cat#115-035-146))加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯(Cat 34028)，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte(杜尔哈，NC)微量板分光光度计上测量A450。
流感病毒激发小鼠。为分析功效，遂将如前所述的经免疫小鼠，于第28天通过鼻内投予LD90(使90％小鼠致死的剂量)(8x103EID)的流感A分离株PR/8/34而进行激发。于激发后每日侦查动物的存活、体重流失及临床表征达21天。％体重流失是以每组各别动物((每日体重(g)/第28天原始体重(g))x100)的平均值为基础计算得。临床分数的指定如下4点＝健康，3点＝减少梳理，2点＝身体活性减低，及1点＝垂死。(临床分数与体重流失的实验结果反映出以存活动物于所评估天数为基础的结果)。
结果与讨论 于以Pam3Cys.H1C1致免后H1C1-特异性抗体反应的诱导将小鼠以天然H1C1肽(SEQ ID NO358)，及通过添加氨基末端Pam3Cys残基修饰的相同肽致免，以测试将肽与TLR2配体键联会增加其免疫原性的理论。免疫原性是通过测量于经致免小鼠血清中，对抗天然H1C1(SEQ ID NO358)的抗体程度而测定得。结果清楚地显示，经Pam3Cys-修饰肽致免的小鼠产生，较经天然肽(SEQ ID NO358)致免的小鼠更高，对抗致免肽骨架序列的抗体效价(图27)。
于以Pam3Cys.H1C1免疫后的免于致死流感激发的保护作用图27的结果证明，小鼠以Pam3Cys.H1C1致免产生可识别天然H1C1肽的抗体反应。为评估功效，遂于第28天经鼻内投予LD90(8 x 103EID)的PR/8/34病毒而进行激发。于激发后每日侦查小鼠的存活、体重流失及临床表征达21天。如图28所示，经PBS-致免的小鼠在激发后6至10天之间即死亡，而恢复期小鼠于21-天观察期之后仍存活。经天然H1C1(SEQ ID NO358)致免的小鼠在感染后6之前，以与PBS对照组小鼠相似的速度死亡，虽然于21-天观察期之后10只小鼠中有2只仍存活。相反地，类似于恢复期小鼠，所有经Pam3Cys.H1C1致免的小鼠于21-天观察期之后皆仍存活。因此，虽然H1C1单独不具有效的免疫原性(图27)，亦不具保护性(图28)，与TLR2配体偶联的相同序列却兼具免疫原性与保护性。
SEQ ID NO340 STF2.blp ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTACGT SEQ ID NO341 HA成熟剪切片段(H1N1) NIPSIQSRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO342 STF2.1xH1C1 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAMEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO343 STF2.2xH1C1 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAMEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIEEWENIPSIQSR GLFGAIAGFIE SEQ ID NO344 STF2.3xH1C1 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAMEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIEEWENIPSIQSR GLFGAIAGFIEEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO345 STF2.4xH1C1 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAMEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIEEWENIPSIQSR GLFGAIAGFIEEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIEEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO346 STF2.4xH1C2 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAGCGSEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIEEWENIPSI QSRGLFGAIAGFIEEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIEEWENIPSIQSRGLFGAIAGFIESG C SEQ ID NO347 HA成熟剪切片段(H5N1) RERRRKKRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO348 STF2.4xH5C1 MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVQKAYD VKDTAVTTKAYANNGTTLDVSGLDDAAIKAATGGTNGTASVTGGAVKFDADNNKYFVTIG GFTGADAAKNGDYEVNVATDGTVTLAAGATKTTMPAGATTKTEVQELKDTPAVVSADAKN ALIAGGVDATDANGAELVKMSYTDKNGKTIEGGYALKAGDKYYAADYDEATGAIKAKTTS YTAADGTTKTAANQLGGVDGKTEVVTIDGKTYNASKAAGHDFKAQPELAEAAAKTTENPL QKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRA QILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLAEWERERRRKKRGLFGAIAGFIEEWERERRRKKRG LFGAIAGFIEEWERERRRKKRGLFGAIAGFIEEWERERRRKKRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO349 HA成熟剪切片段(H3N2) NVPEKQTRGIFGAIAGFIE SEQ ID NO350 HA成熟剪切片段(H2N1/H2N2/H2N3/H2N5/H2N8/H2N9) NVPQIESRGLFGAIAGFIE SEQ ID NO351 HA成熟剪切片段(B strain) PAKLLKERGFFGAIAGFLE SEQ ID NO352 STF2.4xH1C1 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTAGCGATGGAATGGGAGAACATCCCTAGCATCCAATCTCGCGGCCTG TTTGGCGCTATCGCGGGCTTTATCGAAGAATGGGAGAACATCCCGAGCATCCAATCTCGC GGTCTGTTTGGTGCGATCGCTGGTTTCATCGAGGAGTGGGAGAACATTCCTAGCATTCAA AGCCGTGGCCTGTTCGGCGCTATTGCAGGTTTTATTGAAGAATGGGAAAATATCCCGTCT ATCCAATCCCGCGGTCTGTTCGGCGCGATCGCAGGTTTCATTGAATAATAAGCTAAGC SEQ ID NO353 STF2.3xH1C1 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGATGGAATGGGAAAATATCCCTAGCATCCAATCTCGCGGTCTG TTCGGTGCTATTGCTGGCTTCATCGAGGAATGGGAGAACATCCCATCTATTCAGTCTCGC GGCCTGTTTGGTGCGATCGCGGGTTTTATTGAGGAATGGGAAAACATTCCAAGCATTCAG TCACGTGGTCTTTTCGGCGCCATCGCTGGTTTTATCGAATGATAAGCTTAGCCCAAGG SEQ ID NO354 STF2.2xH1C1 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGATGGAATGGGAAAATATCCCTAGCATCCAATCTCGCGGTCTG TTCGGTGCTATTGCTGGCTTCATCGAGGAATGGGAGAACATCCCATCTATTCAGTCTCGC GGCCTGTTTGGTGCGATCGCGGGTTTTATTGAGTGATAAGCTTAGCCCAAGG SEQ ID NO355 STF2.1xH1C1 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGAGCCTGTTAGCGATGGAATGGGAAAATATCCCTAGCATCCAATCTCGCGGTCTG TTCGGTGCTATTGCTGGCTTCATCGAGTGATAAGCTTAGCCCAAGG SEQ ID NO356 STF2.4xH1C1 ATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGCTGACCCAGAATAACCTGAACAAA TCCCAGTCCGCACTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGACTCACTGAACGTGCAGAAAGCGTATGAT GTGAAAGATACAGCAGTAACAACGAAAGCTTATGCCAATAATGGTACTACACTGGATGTA TCGGGTCTTGATGATGCAGCTATTAAAGCGGCTACGGGTGGTACGAATGGTACGGCTTCT GTAACCGGTGGTGCGGTTAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACTTTGTTACTATTGGT GGCTTTACTGGTGCTGATGCCGCCAAAAATGGCGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGAC GGTACAGTAACCCTTGCGGCTGGCGCAACTAAAACCACAATGCCTGCTGGTGCGACAACT AAAACAGAAGTACAGGAGTTAAAAGATACACCGGCAGTTGTTTCAGCAGATGCTAAAAAT GCCTTAATTGCTGGCGGCGTTGACGCTACCGATGCTAATGGCGCTGAGTTGGTCAAAATG TCTTATACCGATAAAAATGGTAAGACAATTGAAGGCGGTTATGCGCTTAAAGCTGGCGAT AAGTATTACGCCGCAGATTACGATGAAGCGACAGGAGCAATTAAAGCTAAAACTACAAGT TATACTGCTGCTGACGGCACTACCAAAACAGCGGCTAACCAACTGGGTGGCGTAGACGGT AAAACCGAAGTCGTTACTATCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGCCGCTGGTCAT GATTTCAAAGCACAACCAGAGCTGGCGGAAGCAGCCGCTAAAACCACCGAAAACCCGCTG CAGAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGCTCTGATCTGGGTGCGGTA CAAAACCGTTTCAACTCTGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAATCTGTCTGAA GCGCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACATGTCTCGCGCG CAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACTTCCGTTCTGGCGCAGGCTAACCAGGTCCCGCAGAAC GTGCTGTCTCTGTTAGCGGGTTGTGGTTCCGAGTGGGAAAATATTCCGTCTATCCAGAGC CGTGGTCTGTTCGGCGCAATTGCTGGCTTCATTGAAGAATGGGAAAACATCCCGTCCATC CAGAGCCGTGGCCTGTTCGGCGCCATTGCTGGTTTCATCGAGGAATGGGAAAACATTCCG TCCATCCAGTCCCGCGGTCTGTTTGGCGCTATCGCCGGTTTCATTGAGGAATGGGAAAAT ATCCCTTCCATCCAGTCTCGTGGTCTGTTCGGCGCGATTGCAGGCTTTATCGAATCTGGT TGCTAATAAGCTAAGC SEQ ID NO357大肠杆菌的细菌脂蛋白 MKATKLVLGAVILGSTLLAGCSSNAKIDQLSSDVQTLNAKVDQLSNDVNAMRSDVQAAKDDAARANQ RLDNMATKYRK SEQ ID NO358 H1C1天然肽 SLWSEENIPSIQSRGLFGAIAGFIEE 实施例15鞭毛蛋白-M2e融合蛋白质 M2e在多数流感A亚型(于本文亦称作“病毒株”)具有保守性。M2e为M2蛋白的至少一部分，尤其是M2蛋白的24-氨基末端(于本文亦称作“胞外功能域”)。M2胞外功能域相较于HA(约566氨基酸)及NA(约469氨基酸)，为相对上较小的氨基酸序列(24氨基酸)。例举性禽类流感A分离株的M2e序列与人类分离株的不同，但是在禽类分离株之间具有高度保守性(参见，例如SEQ ID NOS544-556、570及573-578)。产生M2e的四个串联拷贝，与鞭毛蛋白STF2(全长或STF2铰链区被缺失)的羧基末端融合。不含铰链区的STF2，于本文亦称作“STF2Δ”。
融合蛋白质的构建 合成型4xM2e序列(4段相连续的24氨基酸序列)与STF2的羧基末端融合，是依如下进行构建。pET24A载体是购自诺瓦金，圣地亚哥，CA。该策略是使用购自史塔金(Stratagene，La Jolla，CA www.stratagene.com)的无接缝克隆试剂盒(目录编号214400)，由DNA 2.0Inc.(蒙罗公园，CA)完成。编码融合蛋白的基因是存在pDrive 4xM2e G00448中，且用于供构建与STF2的C-端融合表达构建体的插入物制备作为PCR模板。合成型4xM2e构建体pDrive4xM2e G00448是用于如购自史塔金(拉乔拉，CA)的无接缝克隆试剂盒(目录编号214400)所列的PCR作为模板。从此扩增所预期的产物包括318bp及限制酶位点并入用于扩增此插入物的寡核苷酸。该程序如下 PCR条件 1μL-20ng的pDrive 4xM2e G00448 5μL的10x克隆Pfu聚合酶缓冲液 1μL的40mM dNTP mix 1μL-10pmol的正向引物4xM2eforbsl 1μL-10pmol的反向引物4xM2erevwsto 40μL ddH2O 于开始热循环之前，始将1μL的PfuTurbo DNA聚合酶加入。
4xM2eforbs1引物序列 5’-CGCTCTTCAMTGAGCTTGCTGACTGAGGTTGAGACCCCGATTC(SEQ ID NO566) 4xM2erevwsto引物序列 5’-CGCTCTTCACGCTTATTATCTAGACGGGTCTGAGCTATCGTTAGAGCGAG(SEQ ID NO567) 此反应是如下于Thermo Hybaid PxE热循环器(瓦萨姆(Waltham)，MA)进行循环。
初始循环 后续九次循环 于此时将下列加至各反应中。
5μL的10x克隆Pfu聚合酶缓冲液 1μL的5-甲基dNTP mix 44μL ddH2O 接着重复下列热循环五次。
将100μL产物通过添加TE缓冲液，而将体积带至300μL。将所成的产物经酚氯仿(因维托金公司，卡斯贝得，CA-目录编号15593-031)萃取一次，及氯仿萃取一次。然后将扩增产物通过添加30μL醋酸钠缓冲液pH 5.2，及750μL of 100％乙醇进行酒精沉淀。将DNA沉淀以300μL70％乙醇清洗并风干十分钟，然后再悬浮于50μL TE缓冲液中。
载体STF2于pET24的扩增 将先前构建得的pET24a/STF2.M2e构建体用于，如购自史塔金(La Jolla，CA)的无接缝克隆试剂盒(目录编号214400)所列的PCR作为模板。从此扩增所预期的产物包括整个pET24质粒加STF2序列，但不包括存在此构建体中的单一M2E拷贝。该程序如下 PCR条件 1μL-20ng的STF2.M2E pET22-2 5μL的10x克隆Pfu聚合酶缓冲液 1μL的40mM dNTP mix 1μL-10pmol的引物4xMECpET24 1μL-10pmol的引物4xM2eC-STF2 40μL ddH2O 于开始热循环之前，始将下列加入 1μL的PfuTurbo DNA聚合酶 4xMECpET24引物序列 5’-GCTCTTCAGCGGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGG(SEQID NO568) 4xM2eC-STF2引物序列 5’-CGCTCTTCACAGACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGCGG(SEQ IDNO569) 此反应是如下于Thermo Hybaid PxE热循环器(瓦萨姆，MA)进行循环。
初始循环 后续九次循环 于此时将下列加至各反应中。
5μL的10x克隆Pfu聚合酶缓冲液 1μL的5-甲基dNTP mix 44μL ddH2O 接着重复下列热循环五次。
将100μL产物通过添加TE缓冲液，而将体积带至300μL。将所成的产物经酚氯仿(因维托金公司，卡斯贝得，CA-目录编号15593-031)萃取一次，及氯仿萃取一次。然后将扩增产物通过添加30μL醋酸钠缓冲液pH 5.2，及750μL of 100％乙醇进行酒精沉淀。将DNA沉淀以300μL 70％乙醇清洗并风干十分钟，然后再悬浮于50μL TE缓冲液中。
载体与插入物扩增的分解及接合 分别装备用于载体与插入物的Eam 1104I分解物如下 30μL经酒精沉淀后的扩增产物 5μL的10x通用缓冲液(附于无接缝克隆试剂盒) 4μL Eam 1104I限制酶(附于无接缝克隆试剂盒) 11μL ddH2O 将分解物温和混合并培育于37℃下一小时，将如前述制备的载体与插入物产物，进行如下的接合反应(试剂附于无接缝克隆试剂盒) 依序加入所列示的成份 9μL ddH2O 5μL的经Eam 1104I分解的4xM2e已扩增插入物 5μL的经Eam 1104I分解的STF2.M2E pET22-2已扩增载体 2μL 10x接合缓冲液 2μL 10mM rATP 1μL T4 DNA接合酶(1:16稀释自储备物) 1μL Eam 1104I限制酶 将接合反应温和地混合，并于37℃下培育30分钟。然后将接合物储放于冰上，直到于同一天稍后转化至XL-10胜任细胞(史塔金目录编号200314)中。
接合物转化至XL-10胜任细胞中 将微量离心管(Eppendorf tubes)冷却十分钟，同时将XL-10(史塔金目录编号200314)胜任细胞置于冰上解冻。
将胜任细胞从储备试管等分50μL每管用于每一接合物。
2μL伴随XL-10细胞所附的β-巯基乙醇储备物。
将此混合物于冰上培育十分钟，伴随每2分钟温和混合。将无接缝克隆接合反应(4μl)加入，温和涡漩然后培育于冰上30分钟。将离心管于42℃下于水浴中热休克35秒。将离心管于冰上培育至少两分钟。将SOC培养基(400μL)加至细胞，并于37℃下伴随搅动培育一小时。
将两片LB琼脂卡那霉素(50μg/mL)平板，用于涂布200μL及10μL的转化细胞，并令其生长过夜。
卡那霉素抗性克隆的筛检 将用于小量制备的重组候选株生长于含有卡那霉素(25μg/mL)的Luria液体培养基中，并使用QIAprep Spin Miniprep Kit(奎尔金(Qiagen)凡西亚，CA目录编号27106)进行萃取。将候选纯株通过限制酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolab)，贝弗里，MA)筛检，并将阳性克隆株生长于含有卡那霉素(25μg/mL)的Luria液体培养基中，并使用奎尔金HiSpeed Plasmid Midi Kit(目录编号12643)进行萃取。此等纯株送至GENEWIZ(北布斯威克，NJ)进行定序。
STF2.4xM2e融合蛋白的制造及纯化 将STF2.4xM2e存在大肠杆菌BLR(DE3)pLysS宿主(诺瓦金，圣地亚哥，CA，目录#69053)中从甘油储备物恢复，并放大至5L。将细胞生长于含有15μg/ml卡那霉素与12.5μg/ml四环素的LB培养基中到OD600＝0.4，并与1mMIPTG于37℃下培养3小时进行诱导。将细胞通过离心(7000rpm x 7分钟于Sorvall RC5C离心机)收取，并再悬浮于2x PBS、1％甘油、1μg/ml DNAseI、1mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物及1mg/ml溶菌酶中。将悬浮液通过微液化器使细胞溶解。将溶胞产物离心(于贝克曼Optima L超速离心机中，于45,000g下一小时)，以使可溶性与包涵体分开。将蛋白质通过SDS-PAGE于可溶与不可溶部分检测。
将可溶性部分于高盐存在下加样至琼脂糖Q树脂，经由批份方法减少DNA、内毒素及其它杂质。将含有所兴趣蛋白质的流通物加样至30ml Q琼脂糖管柱(艾默逊生物科学)上。将结合蛋白质使用从缓冲液A至缓冲液B的线性梯度洗脱出。(缓冲液A100mM Tris-Cl，pH 8.0。缓冲液B100mM Tris-Cl，1M NaCl，pH 8.0)。将洗脱出的蛋白质进一步使用45ml蔗糖Q管柱纯化，其可提供用以解析掺杂蛋白质的较大分辨率。将结合蛋白质以从缓冲液A至缓冲液B(缓冲液A100mM Tris-Cl，pH 8.0。缓冲液B100mM Tris-Cl，1M NaCl，pH 8.0)的线性梯度洗脱出。
使用Superdex-200凝胶过滤层析术，完成蛋白质的最后纯化。该管柱是以100mM Tris，150mM NaCl与1％甘油加1％Na-脱氧胆酸展开，以去除LPS。使用对含有50mM Tris，100mM NaCl与1％甘油的缓冲液完成过夜透析，进行缓冲液交换以去除Na-脱氧胆酸。使用MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(皮尔斯生物技术)测定蛋白浓度。STF2.4xM2e的经纯化制剂以考马西染色呈现单一条带，其于12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上显示具有分子量为约64kDa。
实施例16编码流感A M2胞外功能域序列的鞭毛蛋白(STF2与STF2Δ)融合蛋白质构建体的表现及纯化 得自数种人类流感A病毒株，及禽类来源的共有M2e序列经列示于SEQID NOS544-556、570与573-578。为助于克隆M2e序列，遂产生两种各含有多重克隆位点(MCS)的载体卡匣，pMT/STF2与pMT/STF2Δ(参见图17A及17B)。为产生pMT/STF2，将编码全长鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白fljb第2型(或STF2)的1.5kb基因，融合至供表达于果蝇的pMTBIP/V5-His载体(因维托金公司，卡斯贝得，CA)的Ig结合蛋白(BIP)分泌信号。BiP序列是包括于该构建体的5′端，作为供表达于果蝇的分泌信号。将代表H1、H2与H3共有序列的经化学合成得4xM2e基因，克隆入pMT/STF2的MCS中而产生pMT/STF2.4xM2e(H1)。
预言性地使用相似策略，克隆两种H5-关连M2e序列，SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP(SEQ ID NO553)(A/越南/1203/2004)与SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDP(SEQ ID NO552)(A/香港/156/97)。将含有预言性地指定的H5-关连M2e序列的四个串联重复拷贝，的经密码子-最适化、以化学合成得的基因克隆入pMT/STF2中，而分别产生STF2.4xM2e(H5VN)与STF2.4xM2e(H5HK)。为产生含有多重M2e形式的构建体，遂将异源4xM2e序列预言性地插入所述初级构建体其中的一。
“异源序列”用于本文意指得自不同物种的序列。例如，H1序列为人类序列，而H5序列为禽类序列。因此，H1与H5序列为异源序列(例如，SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPLESLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPESSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDPGSSLLTEVETPTRNEWESRSSDSSDP(SEQID NO597))，由tctctgctgactgaagtagaaactccaacgcgtaatgaatgggaatcccgttctagcgactcctctgatcctctcgagtccctgctgacggaggttgaaaccccgacccgcaacgagtgggaaagccgttcctccgattcctctgatccggagagcagcctgctgaccgaggtagaaaccccgacccgtaatgagtgggaatctcgctcctctgattcttctgacccgggatcctctctgctgaccgaagtggagactccgactcgcaacgaatgggagagccgttcttctgactcctctgacccg(SEQ IDNO598)所编码。
初级构建体包含至少一种病原体-关连的分子型式(例如，STF2、STF2Δ)，及至少一种整合性膜蛋白的至少一部分(例如，M2e如SEQ ID NOS510与544)。若有一种以上整合性膜蛋白存在初级构建体中，则该整合性膜蛋白是源自相同物种。
异源构建体包括至少两种整合性膜蛋白，例如H1(人类)与H5(禽类)，如于SEQ ID NOS583及584中。
为产生pMT/STF2Δ，遂将跨越SEQ ID NO499的全长鞭毛蛋白基因的氨基酸170至415的高变区缺失，并置换以一段经设计有助于TLR5传讯所必需的氨基与羧基的作用的，短(10氨基酸)柔性肽连接子(GAPVDPASPW，SEQID NO594)。从此构建体所表达的蛋白质，仍保留有效TLR5活性，而不论其是单独或是与测试抗原融合表达。因此，预言性地以pMT/STF2Δ为基础产生第二系列M2e构建体。将于室温下生长于补充以10％ FBS与抗生素的许奈德氏培养基中的果蝇Dmel-2细胞(因维托金；卡斯贝得，CA)，使用Cellfectin试剂(因维托金)，根据制造商的说明预言性地以前述的构建体转感染。于转感染后二十四小时，预言性地将细胞以0.5mM CuSO4，于缺乏FBS的培养基中并再另培育48小时进行诱导。预言性地从经诱导的培养物收取条件培养基(CM)，并通过SDS-PAGE及使用抗-鞭毛蛋白与抗-M2e特异性抗体的蛋白质印迹分析筛检蛋白质表达。通过ELISA分析融合蛋白的同一性、TLR生物活性、抗原性，及预言性地进行活体内小鼠研究分析其免疫原性。
实施例17鞭毛蛋白-血细胞凝集素(HA)的构建及表现 从得自内部组织实验室品系PR8(为一种A/波多黎各/8/34的减毒衍生物)的基因组DNA，分离得编码HA的基因(SEQ ID NO565，编码SEQ ID NO564)。将该基因融合至已预先经构建于pPICZΔ中的STF2Δ卡匣，产生STF2Δ.HAPR8(SEQ ID NO560，编码SEQ ID NO559)(参见图42)。将经纯化的重组蛋白质于BALB/c小鼠中，测试其免疫原性及功效。定做合成编码A/越南/1203/04病毒株的H5N1的基因，并融合至STF2Δ卡匣产生STF2Δ.HAH5(SEQ ID NO558，编码SEQ ID NO557)。将人类与禽类HA构建体转化至巴斯德毕赤酵母菌株GS115及X-33(因维托金公司，卡斯贝得，CA)中。将所选择的纯株通过于SDS-PAGE凝胶上级分与以考马西蓝染色，及使用抗-HA与抗-鞭毛蛋白抗体的蛋白质印迹分析筛检蛋白质表达。
实施例18PAM3CYS融合蛋白的产生 将M2e(SEQ ID NO544)透过该肽的氨基末端丝氨酸残基，以化学方式偶联至三棕榈酰基半胱氨酸(Pam3Cys)部分。融合蛋白(Pam3Cys.M2e)的结构列示于图39。Pam3Cys.M2e的化学名为[棕榈酰基-Cys((RS)-2，3-二(棕榈酰基氧基)-丙基)-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Pro-OH乙酸盐]。Pam3Cys.M2e的分子量为3582.3道尔顿。
Pam3Cys.M2e是使用，以相当建立的Fmoc-策略(胡本-威尔(Houben-Weyl)，2004。肽类与肽模拟物的合成(Synthesis of peptides andpeptidomimetics)，卷22，乔治提姆出版(Georg Thieme Verlag Stuttgart)，NY)为基础的固相肽合成方法合成得。Pam3Cys.M2e的合成流程及制造方法，是以下述流程图表示。Pam3Cys.M2e为融合蛋白质(经化学键联得)，且于本文亦称作“脂质化肽”。
合成的第一步骤包括固相肽合成。通过固相肽合成将Pam3Cys.M2e的氨基酸序列组合于氯化H-Pro-2-氯三氟甲基树脂上。该树脂很适合用于以Fmoc-策略形成肽类。肽链是通过连续偶联氨基酸衍生物而增长。各偶联步骤之前为一Fmoc-去保护步骤，解该二步骤皆是通过重复清洗树脂而完成。于偶联最后一个氨基酸衍生物后，进行最后一次Fmoc-去保护步骤。最后，将肽树脂清洗并于减压下干燥。于固相肽合成期间，进行各步骤的颜色指示剂测试，以监测Fmoc-裂解及后续的氨基酸衍生物偶联是否完全。
合成的阶段2包括Pam3Cys-OH的偶联。将Pam3Cys-OH于1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，以N，N′-二氯己基-羰二酰亚胺(DCCI)预先活化。将所成的溶液过滤并加至肽树脂。于反应时间结束时，将肽树脂清洗并于减压下干燥。进行颜色指示剂测试，以管控Pam3Cys-OH的偶联。
合成的阶段3包括从树脂裂解出，其包括侧链保护基的裂解。将肽树脂以三氟乙酸(TFA)处理。将产物从反应混合物沉淀出并冷冻干燥。
合成的阶段4包括，通过制备型逆相HPLC进行纯化。将得自阶段3的粗制物质，以制备型HPLC于使用TFA系统的逆相管柱上进行纯化。收集流份，通过分析型HPLC检查并将其汇集。将从TFA执行汇集得的流份冷冻干燥。
合成的阶段5包括，于EDTA存在下进行沉淀。将得自阶段4的纯化物质，从EDTA水溶液沉淀出。将产物过滤出并减压下干燥。
合成的阶段6包括离子交换层析术。制造Pam3Cys.M2e的最后阶段，是将其通过离子交换从三氟乙酸盐交换成醋酸盐。将得自阶段5的物质加样至离子交换管柱上，并以醋酸进行洗脱。通过薄层层析术检查各流份，并将所组合得含有产物的流份过滤，并冷冻干燥而产生最终产物。

Pam3-Cys-OH＝棕榈酰-Cys((RS)-2，3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-OH 由RP-HPLC，Pam3Cys.M2e药物物质的纯度规格是≥80％。此规格是基于以三批从同一批M2e-中间物树脂的GMP组，所制得Pam3Cys.M2e的非-GMP组达到的纯度。该三批Pam3Cys.M2e的非-GMP组的纯度为80.2％、80.3％与80.8％，分别对应于D.001.Pam3Cys.M2e、D.002.Pam3Cys.M2e及D.003.Pam3Cys.M2e。
实施例19免疫原性 材料与方法 PAM3CYS.M2E的合成与纯化 Pam3Cys.M2e是由Genemed合成与Bachem，使用如前述的固相合成方法及FMOC化学制备得。使用质谱分析确定最终产物的分子量。
内毒素分析 使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(BioWhittaker#50-648U)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定STF2.4xM2e及Pam3Cys.M2e的内毒素浓度。
TLR5生物活性分析 HEK293细胞固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将HEK293细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将测试蛋白质加入且培育过夜。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯；#M801E与#M802B)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中IL-8的存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，艾默逊)测量光学密度。结果经报导为，以该项分析中IL8的标准曲线结论所测定得每ml中IL8的pg数。
TLR2生物活性分析 RAW264.7细胞(ATCC)表达TLR2，并于对TLR2传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括TNFα)。将RAW264.7细胞接种于96-孔微量板中(50,000个细胞/孔)，并将测试蛋白质加入且培育过夜。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-小鼠TNFα配合的抗体对(皮尔斯)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中TNFα的存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，艾默逊)测量光学密度。结果经报导为，以该项分析中TNF的标准曲线结论所测定得每ml中TNF的pg数。
小鼠免疫原性 使用约6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(国家癌症学会)。将小鼠分组每组5至10只，并于第0及21天以所指定浓度的STF2.4xM2e或Pam3Cys.M2e融合蛋白，于尾部基部的两侧以皮下致免。将小鼠于第10天(初级)及28天(促升)通过眼眶后穿刺采血。并通过将无肝素血液样本凝结与离心采收血清。
小鼠血清抗体测定 通过ELISA测定M2e-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板(Costar(Cat#9018)康宁，NY)于4℃下，以100μl/孔M2e肽溶于PBS的5μg/ml溶液进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)于室温下封阻一小时。将板于含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS(PBS-T)中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗三次。将稀释于ADB的山辣根过氧化酶，或HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；皮尔斯)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte(杜尔哈，NC)微量板分光光度计上测量O.D.450。
兔免疫原性 使用约13-17周龄的雄性与雌性NZW兔(柯凡斯研究产品)。将兔分组每组3只雄性与3只雌性，并于第0及21与42天，以所指定浓度的STF2.4xM2e肽或Pam3Cys.M2e融合蛋白，于交互的大腿上以i.m.致免。将动物于第-1天(前采血)、14(初级)及28与42天(促升)采血。并通过将样本凝结与离心采收血清。
兔血清抗体测定 通过ELISA测定M2e-特异性IgG浓度。将96-孔ELISA板于大约4℃下，以100μl/孔M2e肽溶于PBS(5μg/ml)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)于室温下封阻一小时。将板于PBS-T中清洗三次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗3x。使用HRP-共轭的山羊抗-兔IgG(杰克森免疫化学)检测结合的IgG。将板以PBS-T清洗三次。待添加TMB Ultra底物(皮尔斯)，并监测颜色呈色后，于分子装置Spectramax微量分光光度计上测量O.D.450。结果是报导为，通过各动物致免后的O.D.450读值减去各动物前采血的O.D.450读值，而测定得的Delta O.D.。
BALB/C小鼠功效模型 于代表性的实验中，是购得约5-6周龄的雌性BALB/c小鼠(每组10-20只)，并令其适应一周。通过s.c.注射投予经调配于PBS或其它适合调合物的融合蛋白质。将小鼠于第0及14天致免。于第21天通过眼眶后穿刺采收血清，并通过ELISA评估M2e特异性IgG。将小鼠通过鼻内投予1xLD90的已相当特征化小鼠适应流感A病毒株，A/波多黎各/8/34(H1N1)而进行激发。每日侦查动物的存活及体重流失达14天。将其体重相较于原始体重流失30％的小鼠以安乐死牺牲，并将牺牲日记录为与死亡日。功效数据是以存活时间报导。
结果 试管内生物活性 此等分析是以表达适当TLR的细胞为基础，并筛检其于对TLR引发的反应中制造IL8或TNF-α的能力。于图52中，是于刺激TLR5阳性HEK293细胞后，评估STF2.4xM2e(■)或STF2.OVA(○)可刺激TLR5依赖性IL8制造的能力。结果表示，该二融合蛋白皆以剂量依赖方式刺激IL8制造，且PAMP的活性仍保留于融合蛋白中。
同样地，于刺激TLR2阳性RAW264.7细胞后，针对Pam3Cys.M2e进行评估。于图51中，实验组为已知内毒素、LPS(作为阳性对照组(◆))、LPS加内毒素polymixin B(PMB)的抑制剂作为阴性对照组(○)、自由态Pam3Cys作为TLR2传讯的阳性对照组(■)、自由态Pam3Cys加PMB(√)，Pam3Cys.M2e(◆)及Pam3Cys.M2e加PMB(□)。结果显示Pam3Cys.M2e与自由态TLR2配体Pam3Cys具有相似的活性图谱。添加polymixin B(PMB)不会降低其活性，表示无或只有低的内毒素污染。
PAMP与抗原的物理键联增加免疫原性 使用免疫原性的小鼠模型，Pam3Cys与M2e的化学偶联可增加M2e抗原的免疫原性，当相较于单独递送M2e肽或与自由态Pam3Cys共同递送。于图52所示的实验中，将各组小鼠于第0及21天，以PBS作为阴性对照组(.*)、自由态TLR2配体、Pam3CSK-4(()、单独M2e肽(○)、自由态Pam3CSK-4混合以M2e肽(√)或与Pam3Cys与M2e的融合体称作Pam3.M2e(◆)进行致免。将所递送M2e肽的适当莫耳比例保持恒定。于第28天采收血清，并通过ELISA分析M2e-特异性抗体效价。结果显示Pam3Cys与M2e的化学偶联(Pam3Cys.M2e)，产生可检测的针对M2e抗原的血清抗体反应。
TLR5配体STF2与抗原间的物理键联，是使用模式抗原卵白蛋白(OVA)证明。小鼠接受以STF2、OVA、STF2.OVA融合蛋白、STF2+OVA混合物或单独PBS的单一s.c.致免。计算剂量以每组递送相当量的12μg的STF2与OVA。于七天后，采收血清并通过ELISA检验OVA-特异性抗体。于图53中的数据描述，于1:100血清稀释度下的IgG1效价。此等结果证明，TLR5配体与抗原间的物理键联导致最适活体内免疫原性。
经PAMP键联的抗原较习知佐剂更具免疫原性 将每组5只BALB/c小鼠于第0及14天，以30μg的Pam3Cys.M2e(◆)、22.5μg的M2e(其与30μg Pam3Cys.M2e中M2e的莫耳数相等)(□)、22.5mg吸附于习知佐剂明矾的M2e(√)或25mg重组蛋白质STF2.4xM2e(■)致免。包括一组接受PBS作为阴性对照组(○)。于第二次剂量后7天收取血清，并通过ELISA评估M2e特异性IgG。列示于图54的结果指出，M2e单独的免疫原性差，因其无法引起高于背景值的抗体效价。习知佐剂明矾提供适度增加对M2e的免疫反应。然而，经PAMP键联的M2e构建体提供免疫原性的最大增强。此等结果指出PAMPs与流感病毒蛋白的整合性膜蛋白的部分键联，可引起较由习知佐剂明矾所引起者更有效的免疫反应。
剂量与免疫原性 进行剂量范围研究以进一步分析Pam3Cys.M2e与STF2.4xM2e的功效。对于STF2.4xM2e，是将BALB/c小鼠于第0及14天，以范围从0.25至25μgSTF2.4xM2e每次致免的STF2.4xM2e稀释液进行致免。前缀D002是指用于本实验的STF2.4xM2e的特定批份，而R-028意指用于本实验的STF2.4xM2e的医院参考批份。于最后一次致免(第21天)后七天将小鼠采血，并通过ELISA评估M2e-特异性IgG反应。列示于图55的结果证明，以低如0.25μg每次致免的STF2.4xM2e的剂量进行致免，诱发可检测量的M2e-特异性IgG，于小鼠的最适剂量落于约2.5至约25μg的范围内。
对于Pam3Cys.M2e，是将BALB/c小鼠于第0及14天，以每次致免0.05至30μg的Pam3Cys.M2e进行致免。于最后一次致免(第21天)后七天将小鼠采血，并通过ELISA评估M2e-特异性IgG反应。列示于图56的结果证明，以低如0.05μgPam3Cys.M2e的浓度进行致免，诱发可检测量的M2e-特异性IgG，于此研究对于小鼠的最适剂量为约30μg。
于多数小鼠品系中的免疫原性 于包括BALB/c(●)、C57BL/6(■)、CB6/F1(◆)、DBA/2(▲)、Cr:NIH(瑞士)(X)及C3H/HeN(*)的多数小鼠品系中评估Pam3Cys.M2e的免疫原性。将各品系每组5只BALB/c小鼠于第0及14天，以每次致免30μg的Pam3Cys.M2e进行致免。于第21天采收血清，并通过ELISA评估M2e-特异性IgG。所有品系皆呈现显著量的M2e-特异性IgG，表示Pam3Cys.M2e的免疫原性不依赖特定MHC(图57)。
于兔中的免疫原性 进行研究目的在于，评估Pam3Cys.M2e与STF2.4xM2e在第二物种(兔)的免疫原性。于第一项研究中，是于第0、21及42天，将兔(3雄性与3雌性/组)以500、150、50、15或5μg(i.m.)的Pam3Cys.M2e进行致免。作为对照组，一额外组接受调合缓冲液F111(10mM Tris，10mM组氨酸，75mM NaCl，5％蔗糖，0.02％聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％乙醇，20mg/mL羟基丙-β-环糊精，pH7.2)。于促升2后第7天取得周边血液，并通过ELISA评估抗-M2e抗体效价。列示于图58的结果说明，于1:125血清稀释度下的个别兔抗体效价。数据暗示用于初级/促升疫苗接种的Pam3Cys.M2e量，与所达到的抗体效价程度之间有剂量-反应关系。
于第二项研究中，是将兔(3雄性与3雌性/组)以500、150、50、15或5μg(i.m.)的STF2.4xM2e进行致免。作为对照组，一额外组仅接受食盐水。于致免后第14天取得周边血液，并通过ELISA评估抗-M2e抗体效价。特别地，于所有经致免动物中，在引发后第14天之前可检测到明显的M2e-特异性IgG反应(图59)。所述结果指出，STF2.4xM2e于兔中引发快速且一致的免疫反应。
于小鼠激发模型的功效 于小鼠中使用已相当特征化小鼠适应流感A病毒株，A/波多黎各/8/34(H1N1)作为激发病毒，评估Pam3Cys.M2e与STF2.4xM2e的功效。将每组十只小鼠于第0及14天，经s.c.以30μg的Pam3Cys.M2e存在调合缓冲液F111(■)、30μg的Pam3Cys.M2e存在专属缓冲液F120(10mM Tris，10mM组氨酸，10％蔗糖，0.02％聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％乙醇，0.075％琥珀辛酯钠，pH7.2)(▲)，30μg Pam3Cys.M2e存在缓冲液F119(10mM Tris，10mM组氨酸，75mM NaCl，5％蔗糖，0.02％聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％乙醇，0.1％琥珀辛酯钠，pH 7.2)、30μg of STF2.4xM2e存在缓冲液F105(10mMTris，10mM组氨酸，75mM NaCl，5％蔗糖，0.02％聚山梨糖酸酯-80，0.1mMEDTA，0.5％乙醇，pH 7.2)，3μg STF2.4xM2e存在缓冲液F105(10mM Tris，10mM组氨酸，75mM NaCl，5％蔗糖，0.02％聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％乙醇，pH 7.2)(●)或0.3μg STF2.4xM2e存在缓冲液F105(√)进行致免。包括一组接受单独PBS作为阴性对照组(○)，及一组经次致死剂量激发以病毒后具有对PR/8的恢复期组作为阳性对照组(□)。于第28天，以LD90的PR/8/34激发储备物进行激发。于激发后侦查体重流失及存活达14天。
恢复期组的动物已成功清除早期非致死的PR8感染，证明对后续的病毒激发具有100％保护作用。接受单独PBS缓冲一只动物，于第7及8天开始呈现病态，于第10天以前发生80％致死率，而经30μg的Pam3Cys.M2e存在F111致免的动物，证明其存活率增加(有50％存活于该项激发)。接受存在缓冲液F119的Pam3Cys.M2e的动物，于第8及9天开始呈现病态，有80％小鼠存活。接受存在缓冲液120(10mM Tris，10mM组氨酸，10％蔗糖，0.02％聚山梨糖酸酯-80，0.1mM EDTA，0.5％乙醇，pH7.2)的Pam3Cys.M2e或STF2.4xM2e蛋白质的动物，呈现最温和的疾病过程，此等组中有90至100％小鼠存活于该项激发。此等结果证明，Pam3Cys.M2e与STF2.4xM2e可授与活体内对抗以流感A激发的保护性免疫。
讨论 鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白(FljB)为TLR5的配体。于大肠杆菌中表达由全长flijB(STF2)经融合至M2e的四串联重复所组成的重组蛋白质，且经纯化至>95％纯度具有低内毒素含量。于报导细胞系中，此蛋白质(STF2.4xM2e)以TLR5-依赖方式引发IL8制造。经范围从0.25至25μg(调配于缓冲液F105，不含习知佐剂或载剂)的STF2.4xM2e稀释液进行致免的小鼠，产生剧烈的抗体反应。于其中动物接受少如5μg于单一剂量后经血清转换的蛋白质的兔免疫原性研究中，进一步证明重组蛋白质的功效。于使用流感A/波多黎各/8/34作为激发病毒的小鼠激发模型中，证明PAMP融合蛋白的功效。经少如约0.3μg蛋白质每剂量致免的小鼠呈现温和的病态，有100％小鼠存活于该项激发。
合成型三棕榈酰基化肽模拟脂质化细菌蛋白的酰化氨基末端，且为有效的TLR2活化剂。于此等研究中，是使用标准固相肽化学合成得，包含键联至流感A M2胞外功能域(M2e)的半胱氨酸残基与氨基末端的三脂肪酸链的三棕榈酰基化肽。此肽(Pam3Cys.M2e)以TLR2-依赖方式，于报导细胞系中引发TNFα制造。当无佐剂存在下用于致免小鼠时，Pam3Cys.M2e产生较M2e当与自由态Pam3CSK-4混合时更有效的抗体反应。Pam3Cys.M2e亦经发现于兔中具有免疫原性，其中观察到用于致免的Pam3Cys.M2e量，与所达到的抗体效价之间有剂量反应关系。于使用流感A/波多黎各/8/34作为激发病毒的小鼠激发模型中，评估存在许多不同调合物中的Pam3Cys.M2e肽的功效。调配于F119及F120中的Pam3Cys.M2e呈现最温和的病态，有约80至约100％小鼠存活于该项激发。
实施例20 材料与方法 PCR扩增及DNA引物 所有PCR扩增作用是使用，购自史塔金(La Jolla，CA)的Pfu Ultra HotstartPCR Master Mix(目录编号600630)，根据制造商的建议完成。DNA引物是购自西格马Genosys，且经叙述于下。
STF28BGF-1 CTCGGGAGATCTGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCT(SEQ ID NO644) STF28MCR-1CCATGGGCTAGCAGGATCCACCGGCGCTCCCTGCACGTTCA(SEQ ID NO645) STF28MCF-2GGAGCGCCGGTGGATCCTGCTAGCCCATGGACCGAAAACCCG(SEQ IDNO646) STF28ECR-2 TCTGCAGAATTCACGTAACAGAGACAGCACGTTCTGCGGGACGTCCCGCAGAACGTGCTGTCTCTGTTA CGTGAATTCTGCAGA(SEQ ID NO647) pET24AR5 TCCGGCGTAGAGGATCGAGA(SEQ ID NO648) STF2-E3R3 CAATTGACCTTCAAGCTTCGAATTGCCCTTACGTAACAGAGACAGCACGTTCTG(SEQID NO649) AX-E3F3 AAGCTTGAAGGTCAATTGGAATTCCCTAGGACTAGTATGGAAAAATTGCAGTTGAAG(SEQ ID NO650) pET24AFGCTTAATGCGCCGCTACAGG(SEQ ID NO651) 5’WNE28GCGGCCGCTCATGGAAAAATTGCAGTTGAAGGGAACAACC(SEQ IDNO652) 3’WNE28CCGCGGTTTGCCAATGCTGCTTCCAGACTTGT(SEQ ID NO653) NdeI-STF2 CCGGCATGCCATATGGCACAAGTAATCAACACTAACAGTCTGTCGCTGC(SEQ ID NO654) BlpI-EdIIIGCATGCTCAGCTTATTAAGGGTTTGCCAATGCTGCTTCCCAGACTTGTG(SEQ ID NO656) JE EIII引物TACGTGAATTCAGCAGATATCCAGCAC(SEQ ID NO53) pET/STF2Δ.EIII的克隆 鼠伤寒沙门氏杆菌的全长鞭毛蛋白fljb(鞭毛蛋白相2)(于本文亦称作＂STF2＂)是由1.5kb基因所编码。通过将跨越SEQ ID NO604的氨基酸170至415的高变区缺失，而产生STF2的截短版本(STF2Δ，SEQ ID NO606，由SEQID NO607编码)。将缺失区域置换以一段经设计有助于TLR5传讯所必需的NH2与COOH末端序列的作用的，短柔性肽连接子(GAPVDPASPW，SEQ IDNO659)。为产生此构建体，遂使用两步骤PCR。于第一反应中，是使用STF2.OVA(SEQ ID NO755编码氨基酸序列SEQ ID NO756)作为DNA模板，及STF28BGF-1与STF28MCR-1作为引物对。于分开的反应中，是将相同DNA模板与引物STF28MCF-2与STF28ECR-2组合。
所述PCR扩增反应分别产生约500bp与约270bp片段。将此等PCR产物组合于使用STF28BGF-1与STF28ECR-2作为引物的最终PCR反应。将从此反应扩增得的DNA产物(约0.77kb)，以BglII与EcoRI限制酶分解，并接合至预先经BglII与EcoRI消化及以碱性磷酸酶处理的pMTBiP/V5-HisB(因维托金公司，卡斯贝得，CA)中。取一等份接合混合物用于转化TOP10细胞(因维托金公司，卡斯贝得，CA)。使用载体特异性引物，pMTFOR(甲硫氨酸启动子)(CATCTCAGTGCAACTAAA，SEQ ID NO759)与BGHREV(牛生长激素聚A)(TAGAAGGCACAGTCGAGG，SEQ ID NO760)进行PCR筛检，而鉴定得数个阳性克隆株。将全部阳性克隆株通过限制图谱分析进一步分析，并通过DNA定序确认。将所成的构建体pMT/STF2Δ用于产生pMT/STF2Δ.EIII+。
pET/STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)的西尼罗病毒包膜蛋白的功能域III，是衍生自果蝇表达质粒pMT/STF2.E。此质粒含有全长STF2(氨基酸1-506，SEQ ID NO604)融合至西尼罗病毒包膜蛋白(氨基酸1-406，SEQ ID NO642)。将pMT/STF2.E(SEQ ID NO761)克隆株AX-1使用作为DNA模板，及5’WNE28(SEQ ID NO652)与3’WNE28(SEQ ID NO653)作为引物对进行PCR扩增。为助于限制分析及后续的克隆步骤，该5′引物编码一个新的NotI切位(New England Biolab，贝弗里，MA)，且3′引物含有独特的SacII切位。将经扩增的EIII+DNA片段(345bp；SEQ ID NO781其编码SEQ ID NO642的氨基酸292-406)，次克隆入pCR-Blunt II-TOPO克隆载体(因维托金公司，卡斯贝得，CA)中，而产生质粒TOPOEIII。接着通过使用T4DNA聚合酶钝化SacII与SpeI限制位点，而将终止密码子导入EIII+序列的下游。
为产生pMT/STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)，使用NotI与BamHI限制位点，将EIII+片段从TOPOEIII+分离出，并接合入pMT/STF2Δ中的NotI与SacII限制位点。在进行接合前，将EIII+DNA片段的BamHI切位与pMTSTF2Δ的SacII切位，以T4DNA聚合酶钝化。通过使用引物NdeI-STF2与BlpI-EdIII进行PCR扩增，将STF2Δ.EIII+序列(SEQ ID NOS673，674)从pMT/STF2Δ.EIII+分离出。为产生pET/STF2Δ.EIII+(SEQ ID NO674)，将PCR产物以NdeI与BlpI分解，并接合至已预先经NdeI与BlpI消化的pET24a质粒中。将接合混合物转化至Mach-1细胞(因维托金公司，卡斯贝得，CA)中，并将细胞生长于补充以50μg/ml卡那霉素的LB上。通过限制图谱分析鉴定得数个克隆株，并通过DNA定序确认。
pET/STF2.EIII+的克隆 pET/STF2.EIII+(SEQ ID NOS657，658)的EIII+序列是衍生自pETSTF2.E(SEQ ID NOS761，762)。此大肠杆菌表达质粒含有全长STF2(氨基酸1-506，SEQ ID NO604)，经融合至西尼罗病毒包膜蛋白(SEQ ID NO642的氨基酸292-406，其为SEQ ID NO610)。于两项独立PCR反应中，是使用pET/STF2.E作为DNA模板。一项反应使用引物pET24AR5(SEQ ID NO648)与STF2-E3R3(SEQ ID NO649)，而另一项使用AX-E3F3(SEQ ID NO650)及pET24AF(SEQ ID NO651)。此等PCR反应产生一由全长STF2组成的1.5kb片段，及其包含EIII功能域加延伸入包膜蛋白功能域I中的额外氨基酸的340bp片段。将此等PCR反应的各等份组合，并将该二产物作为模板，用于与外部引物pET24AR(SEQ ID NO648)与pET24AF(SEQ ID NO651)进行PCR反应。此导致产生约1.8kb DNA片段，其使EIII+序列(SEQ ID NO781，为编码SEQ ID NO642的氨基酸292-406的核酸序列，其为SEQ ID NO610)融合至STF2。将PCR产物以NdeI与BlpI分解，并接合至已预先经可相容酶消化及去-磷酸化的pET24a载体中。将接合混合物如前关于pET/STF2Δ.EIII+所述，转化至Mach-1细胞(因维托金公司，卡斯贝得，CA)中。通过限制图谱分析鉴定得数个克隆株，并通过DNA定序确认。
pET/STF2Δ.JEIII+的克隆 日本脑炎病毒(JEV)(品系SA-14-14-2(Jai，L.等人，Chin Med J(Eng)116941-943(2003))的包膜蛋白的一部分；目前用于的JEV疫苗中，由功能域III编码，是由DNA2.0 Inc.(蒙罗公园，CA)定做合成。将该部分功能域III使用位于插入物两侧翼的NotI与Blp I切位，从pJ2G01510切出。将DNA插入物以凝胶分离，并经由可相容末端克隆至，已预先经适当酶消化而释出西尼罗病毒EIII+插入物的pET24A/STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)中。接着将缺失的载体以凝胶纯化并且接合至一JE EIII+的分装。将接合混合物用于转化TOP10细胞(因维托金公司，卡斯贝得，CA)，并将细胞生长于补充以50μg/ml卡那霉素的LB上。通过限制图谱分析鉴定得数个克隆株，并通过DNA定序确认。
所成的构建体，pET24A/STF2Δ.JEIII(SEQ ID NOS608，609)为BLR(DE3)品系(诺瓦金)，并使用考马西蓝染色监测数个克隆株中的表达，其通过使用抗-鞭毛蛋白抗体的蛋白质印迹法确认。使用pET24A/STF2Δ.JEIII+作为DNA模板，及JE EIII+寡核苷酸作为引物(SEQ ID NO656)，使用QuikChange定点致变试剂盒(史塔金，拉乔拉，CA)根据制造商的说明，将介于与间的肽连接子区域中的半胱氨酸残基变更为丝氨酸残基。通过定序确认克隆株，并如前关于pET/STF2Δ.EIII+所述分析其表达。
当肽连接子区域中的半胱氨酸残基变更为丝氨酸残基时，于该融合蛋白质中纳入＂s＂，命名该融合蛋白质。例如，“STF2Δ.EIII+”包括位于肽连接子区域中的半胱氨酸残基(SEQ ID NO674)，而“STF2Δ.EIIIs+”包括经取代位于肽连接子区域中的半胱氨酸残基的丝氨酸残基(SEQ ID NO675)。
克隆各登革热病毒的EIII功能域经融合至鞭毛蛋白(STF2Δ)的C-末端 首先，从西尼罗病毒完整包膜蛋白的融合物获得具生物活性物质是困难的，可能是由于在包膜蛋白中存在多数半胱氨酸残基(12个半胱氨酸)(参见，SEQ ID NO642)。然而，当将编码该蛋白质功能域III(EIII)的区域进行次克隆时，该融合蛋白质于大肠杆菌中丰富表达，且于小鼠中高度有效。虽然在4株不同DEN病毒(Den1、Den2、Den3、Den4，SEQ ID NOS763-770)间有整体序列不相似性，黄病毒间的包膜蛋白功能域III内的三维结构却相似。DEN与其它黄病毒中的此功能域，编码大部分的类型-特异性相邻的重要/优势中和性抗原表位。登革热病毒(Den1、Den2、Den3及Den4)的功能域III，已经表达于细菌中且显示具有免疫原性，能够在实验动物中诱导中和性抗体(西蒙，M.等人，Am.J.Trop.Med Hyg 65159(2001))。对应于四株不同DEN病毒的残基约295至约399(正确号数是视特定DEN病毒而定，例如SEQ ID NOS763、765、767、769的)的功能域III，已经密码子最适化用于大肠杆菌表达。将合成基因使用PCR扩增，并次克隆入载体pET/STF2Δ的NotI切位中，产生pET/STF2Δ.DEN1EIII、pET/STF2Δ.DEN2EIII、pET/STF2Δ.DEN3EIII及pET/STF2Δ.DEN4EIII(SEQ ID NOS683、685、687与689)。
STF2.EIII+、STF2Δ.EIII+、STF2Δ.EIIIs+及STF2Δ.JEIII+的大肠杆菌制造 将带有pETSTF2.EIII+(SEQ ID NOS657，658)、pETSTF2Δ.EIII+(SEQ IDNOS673，674)、pETSTF2Δ.EIIIs+(SEQ ID NOS675，676)或pETSTF2Δ.JEIII+SEQ ID NOS608，609)的BLR(DE3)pLysS的细胞培养物(6L)，生长于含有15μg/ml卡那霉素、12.5μg/ml四环素与24μg/ml氯霉素的LB培养基中。于OD600为约0.6下，以1mM IPTG于37℃下约3h诱导蛋白质表达。经诱导后，将细胞通过离心(7000rpm x 7分钟于Sorvall RC5C离心机)收取，并再悬浮于2X PBS、1％甘油、1μg/ml DNAseI、1mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物及1mg/ml溶菌酶中。将悬浮液通过微液化器使细胞溶解，并将溶胞产物离心(于贝克曼Optima L超速离心机中，于45,000g下一小时)，以使可溶性部分与包涵体分开。于此等生长及培育条件下，STF2.EIII+表达呈可溶性蛋白质，而STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)、STF2Δ.EIIIs+(SEQ ID NOS675，676)及STF2Δ.JEIII+(SEQ ID NOS608，609)是形成包涵体。
STF2.EIII+的纯化 将含有可溶性STF2.EIII+(SEQ ID NOS657，658)的细胞溶解产物，于0.5M NaCl存在下加样至琼脂糖Q树脂(艾默逊生物科学，皮斯卡塔威，NJ)上，以减少DNA、内毒素及其它杂质。将流通物收集并通过以缓冲液A(缓冲液A100mM Tris-Cl，pH 8.0)10-倍稀释调整导电性。将经稀释的物质再加样至Q琼脂糖管柱上，并将结合蛋白质以20％至60％缓冲液B(缓冲液B100mMTris-Cl，1M NaCl，pH 8.0)的线性梯度洗脱出。将含有STF2.EIII+的流份汇集，并进一步以Superdex-200凝胶(SD200)过滤层析术，于Na-脱氧胆酸盐存在下处理，以去除残留的内毒素(执行缓冲液1％ Na-脱氧胆酸盐，100mM NaCl，100mM Tris-HCl，1％甘油，pH 8.0)。于通过SD200滤层析术后，将洗脱出脂蛋白质直接加样至Q琼脂糖上，并以缓冲液A充分冲洗去除清洁剂。将结合蛋白质再次以20％至60％缓冲液B的线性梯度洗脱出。在一项制备(批份057)中，是将此步骤取代以，使用萃取-D清洁剂去除凝胶(皮尔斯生物技术，洛克佛，IL)的清洁剂移除程序。将经纯化蛋白质对含有50mM Tris、100mM NaCl与1％甘油的缓冲液透析，并储放于-80℃。
STF2Δ.EIII+的纯化 将包涵体通过低速离心(7000rpm x 7分钟于Sorvall RC5C离心机)收取，并以含有8M尿素、100mM Tris-HCl、5mM EDTA，pH8.0的缓冲液溶解。将溶解蛋白质的尿素浓度调整至1M，并将样本加样至Q琼脂糖上。将结合蛋白质以从0％至100％缓冲液B的线性梯度洗脱出。(缓冲液A100mM Tris-HCl，5mM EDTA，1M尿素，pH8.0。缓冲液B100mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.0)。由于在洗脱后形成蛋白聚集物，遂将Q琼脂糖物质的尿素浓度调整至8M。将蛋白质通过使用SD200的凝胶过滤层析术进一步纯化。将管柱以100mMTris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，1％甘油，8M尿素加1％ Na-胆酸盐预先平衡。将洗脱出的蛋白质使用蔗糖Q进行第二IEX层析步骤，以去除Na-胆酸盐。将结合蛋白质以从20％至60％缓冲液B的线性梯度洗脱出。(缓冲液A100mMTris-Cl，pH8.0，8M尿素，5mM EDTA。缓冲液B100mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.0)。通过使用SD200的凝胶过滤层析术(执行缓冲液100mM Tris-HCl，pH8.0，8M尿素，100mM NaCl与1％甘油)，完成蛋白质的最后润饰。将还原剂加至SD200流份(2.5mM DTT)，并将蛋白质通过对渐减浓度的尿素进行逐步透析而再折叠。尿素浓度是对含有100mM Tris-HCl，pH8.0、100mM NaCl、1％甘油与6M、4M、2M或无尿素的缓冲液，而依序减低。
STF2Δ.EIII+三聚体的再折叠与纯化 将得自经尿素安定化包涵体的STF2Δ.EIII+(SEQ ID NOS673，674)通过如前述的简单透析，有效再折叠而形成三聚体，以SDS-PAGE中的分子量为基础推定为三聚体(STFΔ.EIII融合蛋白的3倍)。于透析后，将内毒素通过以Triton X-114多次萃取去除。通过S200尺寸排除层析术，将三聚体从单体及聚集物纯化及分离出。最终产物于SDS-PAGE上移动呈现单一条带，其显示具有分子量为约130kDa。
STF2Δ.EIII+单体的再折叠与纯化 通过使用快速稀释进行的再折叠，一致且有效地制造STF2Δ.EIII+(SEQID NOS673，674)的单体形式，其防止个别STF2Δ.EIII+融合蛋白质不会彼此互相作用而形成多聚体，例如三聚体(如前述)。将从包涵体安定化的STF2Δ.EIII+存在4M尿素增至不含还原剂的8M尿素中。然后将蛋白质于室温下快速稀释于Tris/NaCl/甘油缓冲液，pH8.0，至约0.1mg/ml及最中尿素浓度为0.1M。通过S200尺寸排除层析术，将单体从聚集物纯化及分离出。最终产物于SDS-PAGE上移动呈现单一条带，其显示具有分子量为约43kDa。
STF2Δ.EIIIs+(介于STF2Δ与EIII+间的肽连接子的丝氨酸取代，SEQ IDNO675)的取代 使用类似用于再折叠STF2Δ.EIII+单体的快速稀释方法，将得自经安定化包涵体的STF2Δ.EIIIs+(SEQ ID NOS675，676)再折叠。将经再折叠的蛋白质捕获于丁基琼脂糖管柱上并洗脱，同时去除大部分内毒素污染。将从丁基琼脂糖纯化的洗脱物浓缩，并通过4次Triton X-114萃取循环，以使内毒素浓度在通过SD200凝胶过滤的最终纯化步骤前，降至约<0.1EU/μg。最终汇集产物于SDS-PAGE上移动呈现单一条带，其显示具有分子量为约43kDa，且含有微量的Triton X-114(约0.000015％)。
STF2Δ.JEIII+(SEO ID NOS608，609)的纯化 蛋白质是于变性条件下从包涵体分离得。将包涵体以清洁剂清洗并于8M尿素中安定，导致标靶蛋白质的特别纯化。关于内毒素去除，是将蛋白质加样于低pH值(约3.5)的蔗糖S阳离子交换管柱上，并以盐类梯度(0至约1M NaCl)洗脱。将蛋白质使用如对于STF2Δ.EIII+单体所述的快速稀释进行再折叠。然后将蛋白质浓缩，并使用S200尺寸排除层析术，将单体从聚集物分离出。经纯化物质于SDS-PAGE上移动呈现单一条带，其显示具有分子量为约43kDa，且含有可接受程度的内毒素(约0.03EU/ug)。
融合蛋白的流加式(Fed Batch)制造 于好氧生物反应器中，使用流加式制程制得STF2Δ.EIIIs+。放置三个控制环，通过添加酸(2N HCl)或碱(3N NH4OH)调控pH值，通过加热(加热包覆毯)或冷却(时间循环冷却环)调控温度，及通过压缩空气流(人为操控)、搅动(混合速度)与O2流(定时控制)串连调控溶氧量。将带有STF2Δ.EIIIs+的[BLR(DE3)pLysS细胞适应及储存于MRSF培养基(参见前述)，并冷冻于25％甘油中。将细胞通过将1mL储存细胞加至1L的MRSF培养基中，并于约37℃下搅动约15.5至16.5小时，而于生物反应器放大培养。将得自放大程序的细胞以约1:10比例，于约37℃及约0.5vvm空气流下，加至MRSF或MRBR合成培养基。
以批次模式于37℃下执行该制程，直到细胞氧气消耗致使压缩空气流为约1.5vvm，且搅动达极大值为止(约6小时)，当温度降至约25℃与约33℃之间。可于进行培养物诱导前，或于之后约1至约1/2小时开始喂料。可使进料速度保持恒定，或基于制程变数(溶氧量、葡萄糖浓度)调整之。于批份葡萄糖耗尽时，将培养物以IPTG诱导。将培养物维持最少约2小时，及最长约20小时。
MRBR培养基 微量金属溶液1000x 组成 g/L 组成 g/L 葡萄糖 20EDTA，二钠 5 KH2PO4 2.2 FeSO4(7H2O) 10 (NH4)2SO4 4.5 ZnSO4(7H2O) 2 Citric Acid1.0 MnSO4(H2O) 2 MgSO4(7H20)1.0 CoCl2(6H2O) 0.2 CaCl2 0.04 CuSO4(5H2O) 0.1 微量金属 1ml Na2MoO4(2H2O)0.2 硫胺素HCl 0.01 H3BO30.1 消泡剂 0.05 MRSF培养基 喂料培养基 组成 g/L 组成 g/L 葡萄糖10(20于生物反应器)NaCl 0.5 KH2PO47.8 FeSO4(7H2O) 2 (NH4)2SO4 2.33 CaCl2 3.5 柠檬酸1.0 MgSO4(7H2O) 12 MgSO4(7H2O) 1.0 硫胺素HCl 1 CaCl2 0.04 微量金属 1ml 微量金属 1ml 葡萄糖100 硫胺素HCl 0.01 卡那霉素 0.0075(仅用于摇瓶) STF2Δ.EIIIs+是呈包涵体制得。于收取时通过离心(贝克曼Avanti J-20 XP，JLA 8.1000转体，10kxg于约4℃下约20分钟)将细胞与条件培养基分离，并悬浮于等体积的50mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0中。于相同条件下重复离心，将细胞再悬浮于最小体积的相同缓冲液中。将悬浮液于>10,000下通过均质器(APV-1000)至少两次。
可将固体分离，并将通过下列三种方法其中的一溶解；离心，过滤或流化床层析术。
方法1 将固体通过离心(贝克曼Avanti J-20 XP，JA 20转体，20kxg于约4℃下约20分钟)分离，并再悬浮于50mM tris，1m NaCl，1mM EDTA，1％甘油，0.5％Triton X-100，pH 8.0中。于渐增速度与时间(至极大值为约40kxg达约20分钟)下，重复此程序至多6次(总计)。将最后的沉淀回收后，将沉淀再悬浮于50mM Tris，0.1M NaCl，1mM EDTA，pH 8.0中，并通过离心(贝克曼AvantiJ-20 XP，JA 20转体，40kxg于约4℃下约20分钟)澄清化。将沉淀再悬浮及溶解于50mM Tris，0.1M NaCl，1mM EDTA，4M尿素，pH 8.0中。将不可溶物通过离心(贝克曼Avanti J-20XP，JA 20转体，40kxg于约4℃下约50分钟)去除，保留上清液用于进一步处理。
于多次如前述的清洗后，亦可将STF2Δ.EIIIs溶解于50mM acetate，10mMNaCl，8M尿素，pH约4.1至约5.3中，并通过离心(贝克曼Avanti J-20 XP，JA 20转体，40kxg于约4℃下约20分钟)澄清化。
方法2 于均质化后，将溶胞产物捕获于本体喂料(body feed)中，并将STF2Δ.EIIIs+以含有尿素的缓冲液萃取。本体喂料为经设计用以将粒子捕获于，位于底层滤器上的滤饼中的滤器助剂。该本体喂料(Advanced Minerals公司(AdvancedMinerals Corporation)CelPure 65)为具有高表面积与低穿透性(保留<0.2μm颗粒)的硅藻土(硅石粉末)。将滤器助剂与溶胞产物预先混合，并以帮浦通过底层滤器(Ertel 703)，建立含有本体喂料与溶胞产物颗粒的滤饼。当颗粒沈积于滤垫上时，悬浮液产生底层滤器。进行50mM Tris，100mM NaCl pH 8.0冲洗，以去除可溶性蛋白质与核酸。接着以50mM Tris，100mM NaCl，4M urea，pH8冲洗，安定及将STF2Δ.EIIIs从本体喂料移出供进一步处理。
方法3 将细胞首先再悬浮于缓冲液中后，将彼等再悬浮于含有氯化钠与尿素的缓冲液，pH约6至约8，并均质化。将溶胞产物加样于Streamline CST流化床管柱(GE健康照护(GE Healthcare))，其中STF2Δ.EIIIs+结合至该树脂而微粒流通出。STF2Δ.EIIIs+可于低盐条件下，于高于加样pH的pH值，于有或无清洁剂例如Triton X-100或聚山梨糖酸酯-80存在下洗脱出。
SDS-PAGE 将蛋白质(代表性地约5μg)稀释于有或不含β-巯基乙醇的SDS-PAGE样本缓冲液中。将样本煮沸5分钟，并加样至4-20％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上。经电泳术后，将凝胶以考马西蓝染色以呈现蛋白质条带。
内毒素分析 使用QCL-1000定量显色LAL测试试剂盒(BioWhittaker #50-648U，沃克斯谷，MD)，依照制造商用于微量板方法的说明，测定内毒素浓度。
蛋白质分析 通过以96-孔格式，使用BSA作为标准物的MicroBCA蛋白质分析试剂试剂盒(皮尔斯生物技术，洛克弗，IL)测定蛋白质浓度。
TLR5生物活性分析 HEK293细胞(ATCC，目录No.CRL-1573马纳萨斯，维吉尼亚)固有地表达TLR5，并于对TLR5传讯的反应中，分泌数种可溶性因子(包括IL-8)。将细胞接种于96-孔微量板中(约50,000个细胞/孔)，将融合蛋白质加入并培育过夜。次日，收取条件培养基，转移至干净96-孔微量板，并于-20℃下冷冻。待解冻后，于使用抗-人类-IL-8配合的抗体对(皮尔斯，#M801E与#M802B，洛克弗，Il)的夹层ELISA，依照制造商的说明分析条件培养基中的IL-8存在。使用微量板分光光度计(FARCyte，艾默逊生物科学，皮斯卡塔威，NJ)测量光学密度。
蚀斑减少中和测试(PRNT) 根据王等人，J.Immunol.1675273-5277(2001)进行PRNT。简言的，将血清样本通过培育于56℃水浴中约30min热去活化，并系列稀释于含5％明胶的PBS中，从1/10至1/2560。将西尼罗病毒稀释于含5％明胶的PBS中，以使终浓度为约100PFU/孔。将病毒与约75μl血清混合于96-孔板中，于约37℃下约1h。将等份的血清-病毒混合物培育于，生长于六-孔组织培养板的铺满Vero细胞单层上。将细胞于约37℃下培育1h，并将板美15分钟振荡。将琼脂覆盖层加入。该覆盖层是通过将等体积由100ml 2x MEM(生命科技(LifeTechnologies))组成的溶液，与无菌2％琼脂混合而制备得。将二溶液置于40℃水浴中1小时，之后加入覆盖层。将细胞培育于37℃下，于经潮湿的5％ CO2-空气混合物中培育4天。于第5天将具有额外4％中性红的第二覆盖层加入。约12小时后计数病毒蚀斑。
STF2Δ-融合蛋白的抗原性 将ELISA板(96-孔)于4℃下，以经纯化STF2Δ-融合蛋白质(SEQ ID NOS761，762，657，658，673，674)于PBS(约2μg/ml)的系列稀释液(100μl/孔)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根)于室温下封阻一小时。将板于PBS-Tween中清洗3次，然后与对构建体的鞭毛蛋白或E功能域具反应性的抗体进行培育。使用mAb 6H11(Intotek)检测鞭毛蛋白的表达，而使用一组购自Bioreliance(洛克谷，MD)的mAb(5C5、7H2、5H10、3A3与3D9)，监测WNV-E的抗原性(比斯利，D.W.等人，J.Virol.7613097-13100(2002))。将稀释于ADB的抗体(约100μl/孔)于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗3次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学，西葛洛弗，PA)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗3次。待添加TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)Ultra底物(皮尔斯生物技术，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte微量板分光光度计上测量A450。
小鼠的致免 将C3H/HeN小鼠(每组10只)于第0、14及28天，经腹膜内或皮下以所指定浓度的融合蛋白或合成肽致免。于第21天及35天，将经致免动物通过眼眶后穿刺采血。通过将无肝素血液样本凝结与离心采收血清。于第35天，将小鼠以致死剂量的WNV病毒株2741(王，T.等人，J.Immunol 1675273-5277(2001))激发。于激发后监测其存活达21天。
血清抗体测定 通过ELISA测定西尼罗包膜蛋白特异性IgG浓度。将ELISA板(96-孔)于4℃下，以100μl/孔溶于PBS浓度为2μg/ml的西尼罗E蛋白mAb 5C5、7H2、5H10、3A3与3D9(比斯利，D.W.等人，J.Virol.7613097-13100(2002))(Bioreliance，洛克谷，MD)进行涂覆过夜。将板以200μl/孔的分析稀释缓冲液(ADB；BD法明根，圣地亚哥CA)于室温下封阻一小时。将板于PBS-T中清洗3次。将血清于ADB的稀释液加入(100μl/孔)，并将板于4℃下培育过夜。将板以PBS-T清洗3次。将稀释于ADB的HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG抗体(杰克森免疫化学，西葛洛弗，PA)加入(100μl/孔)，并将板于室温下培育1小时。将板以PBS-T清洗3次。待添加TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺皮尔斯)Ultra底物(皮尔斯生物技术，洛克弗，IL)，并监测颜色呈色后，于Tecan Farcyte微量板分光光度计上测量A450。
Pam3Cys.WNV001肽合成的制造 Pam3Cys.WNV001是由Bachem生物科学股份有限公司(BachemBioscience，Inc.)(King of Prussia，PA)合成得。WNV001为西尼罗包膜蛋白的20氨基酸肽(SEQ ID NO771)，经由该肽的氨基末端丝氨酸残基，以化学方法偶联至三棕榈酰基半胱氨酸(Pam3Cys)部分。Pam3Cys.WNV001的化学名为[棕榈酰基-Cys((RS)-2，3-二(棕榈酰基氧基)-丙基)-LTSGHLKCRVKMEKLQLKGT(SEQ ID NO771)醋酸盐]。Pam3Cys.WNV001的分子质量为3163.3道尔顿。该肽是由Bachem使用固相合成方法与FMOC化学合成得。通过固相肽合成，将Pam3Cys.WNV001的氨基酸序列组合于氯化H-Pro-2-氯三氟甲基树脂上。将肽链通过连续偶联氨基酸衍生物而增长。各偶联步骤之前为一Fmoc-去保护步骤，且通过重复清洗树脂而完成。于偶联最后一个氨基酸衍生物后，进行最后一次Fmoc-去保护步骤。最后，将肽树脂清洗并于减压下干燥。于固相肽合成期间，进行各步骤的颜色指示剂测试，以监测Fmoc-裂解及后续的氨基酸衍生物偶联是否完全。为将Pam3Cys-OH与增长的肽偶联，遂将肽部分于1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，以N，N′-二氯己基-羰二酰亚胺(DCCI)预先活化。将所成的溶液过滤并加至该肽树脂。于反应时间结束时，将肽树脂清洗并于减压下干燥。进行颜色指示剂测试，以管控Pam3Cys-OH的偶联。将完成的肽通过与三氟乙酸(TFA)培育而从树脂裂解出。将释出的产物(粗制肽物质)从反应混合物沉淀出并冷冻干燥。将粗制产物用于初始免疫原性研究。
WNV-E肽列阵的合成 肽列阵(SEQ ID NOS703-754)是由西格马Genosys(伍德蓝斯，TX)合成得。
结果 西尼罗融合蛋白质 西尼罗病毒(WNV)近几年于欧洲与北美洲的温带地区出现，表示有可能发生流行及动物死亡之虞。WNV感染的最严重现象为人类与马的致死性脑炎(脑部发炎)，以及某些家禽与野生鸟类死亡。在美国，WNV亦已经为人类疾病的明显成因。西尼罗的包膜糖蛋白(WNV-E)与其它黄病毒可能产生中和性及保护性抗体。通过将此抗原键联至钟样受体配体，本文所述的组合物、融合蛋白及多肽可靶定适当抗原展现细胞，而不需要佐剂或其它免疫调制剂调合物。
如本文所述，数种策略已预期可协助于大肠杆菌中制造西尼罗病毒包膜(WNV-E)融合蛋白。其一提案是通过将WNV-E蛋白的功能域III(EIII)，及(视需要地)功能域II的氨基酸，融合至全长STF2，而改造一种较小的WNV-E抗原(例如，STF2.E，STF2.EIII+)。功能域III负责病毒-宿主相互作用，且保有许多西尼罗病毒中和抗体抗原表位。其亦仅含有存在全长包膜蛋白中12个半胱氨酸其中的2个，使其更易于大肠杆菌中表达。第二提案已用于缺失鞭毛蛋白的高变铰链区(例如STF2Δ)，由此产生较小的融合蛋白质(STF2Δ.EIII+)。鞭毛蛋白的高变区并非TLR5传讯所需要的，且其去除易可能减低鞭毛蛋白的致免疫潜能。STF2.EIII+与STF2Δ.EIII+二者，皆已于大肠杆菌中表达及纯化得。经纯化的蛋白质已于生物分析中，针对其TLR5传讯活性特征化，且使用一组WNV-E多株与中和性单克隆抗体的ELISA分析中，针对其E抗原表位展示特征化。此等研究的结果指出，STF2Δ.EIII+具有较高PAMP活性，及较更具构型-灵敏度的中和性WNV-E抗原表位。
STF2.EIII+与STF2Δ.EIII+的纯度 已于大肠杆菌中制造及纯化得数批STF2.EIII+与STF2Δ.EIII+。STF2.EIII+表达呈可溶性蛋白质，且于非-变性条件下使用4-步骤制程进行纯化，其包括阴离子交换层析术与凝胶过滤。从6L培养物所得的最终产量范围介于0.9mg至约3.8mg，且所有制剂以标准LAL程序测得的内毒素含量低(约<0.1EU/mg蛋白质，如前述)。反之，STF2Δ.EIII+于大肠杆菌中形成包涵体，且是于变性条件下进行纯化。所有用于纯化STF2Δ.EIII+的层析术步骤皆需要使用8M尿素。于纯化后，变性蛋白质是通过使能逐渐去除尿素的逐步透析进行再折叠。再折叠是代表性地于蛋白质浓度为约0.3mg/ml下进行，不会由于蛋白质沉淀而有流失。从6L培养物的两种STF2Δ.EIII+制剂，产生约1.2及约6.7mg的蛋白质，二者皆具有可接受的内毒素程度。如所预期者，经纯化STF2.EIII+与STF2Δ.EIII+于还原条件下，于SDS PAGE上分别移动呈现约65kDa及约43kDa蛋白质。显然，于还原条件下STF2Δ.EIII+的移动稍微较快。此改变的移动性可能是由于，涉及包膜蛋白功能域III中的两个半胱氨酸残基的二硫键形成。又，通过蛋白质印迹分析检测到较大的STF2Δ.EIII+，其分子量与该蛋白的三聚体形式(“(STF2Δ.EIII+)x3或3单位的STF2Δ.EIII+”)一致。
表11STF2.EIII+(SEQ ID NO658)与STF2Δ.EIII+(SEQ ID NO674)融合蛋白的内毒素程度及TLR-5活性 于HEK293IL-8分析中的TLR5活性 为比较该二融合蛋白的PAMP活性，遂进行TLR5生物分析。将HEK293IL-8细胞以两独立的蛋白质批次的系列稀释液处理(图62A与62B)。将培养物培育24小时，收取条件培养基并以ELISA分析IL-8制造。如图62A所示，STF2Δ.EIII+展现有效的TLR-5活性。滴定曲线的回归分析测定得，批份2004-044及2004-045的EC50分别为1.13ng/ml与4.34ng/ml(表11，如前述)。于该二个案中，TLR5-特异活性较对照组蛋白STF2.OVA高出至少10-倍。相反地，STF2.EIII+的2制剂呈现较STF2.OVA显著较弱的TLR5活性。STF2.EIII+批份054及057的EC50为约1195.00ng/ml与约197.92ng/ml。
STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的抗原性 通过使用特异于STF2的N-端区域的鞭毛蛋白单克隆抗体(6H11，Inotek医药品，贝弗里，MA)，及一组先前已显示于试管内中和西尼罗病毒的WNV-E-特异性抗体(5C5、7H2、5H10、3A3与3D9，Bioreliance，洛克谷，MD)进行的直接ELISA，检验STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的抗原性。如图63所示，比较全长西尼罗病毒包膜蛋白与STF2Δ.EIII+的反应性，显示西尼罗病毒单克隆抗体5C5、5H10、3A3与7H2(但非3D9)识别该融合蛋白质。此反应性形式与EIII内5C5，5H10，3A3及7H2抗原表位的所推测位点一致。3D9的抗原表位是落在西尼罗病毒包膜蛋白功能域III的外面。如所预期者，所有西尼罗病毒单克隆抗体皆与全长西尼罗病毒包膜蛋白反应，而鞭毛蛋白单克隆抗体仅与STF2Δ.EIII+反应。该二蛋白质皆与多株西尼罗病毒包膜抗血清反应，但是STF2Δ.EIII+反应性有稍许减低，也许是由于存在较小功能域中的可能抗原表位数量减少所致。
使用5C5与7H10 WNV单克隆抗体，完成直接比较STF2.EIII+与STF2Δ.EIII+的抗原性(图64A、64B、64C及64D)。于此等研究中，是将平板涂覆以所指定蛋白质，然后以多株兔抗-E或如所述的小鼠单克隆抗体检测。如图64A、64B、64C及64D所示，STF2.EIII+与STF2Δ.EIII+皆容易地由鞭毛蛋白单克隆抗体检测到，其反应性并无显著差异。然而，观察到与抗-包膜单克隆抗体的反应性不同。STF2Δ.EIII+与5C5或7H2的反应性，显著较以STF2.EIII+观察到者大。集体而言，此等结果表示STF2Δ.EIII+的鞭毛蛋白6H11抗原表位未受妥协，且与STF2.EIII+的鞭毛蛋白序列相当。彼等亦强调此等蛋白的功能域III于抗原性方面有显著差异，且表示STF2Δ.EIII+较STF2.EIII+含有更多重要的构型依赖性中和性抗原表位。
功效及免疫原性 已完成数项经设计用以于C3H/HeN小鼠中，在以西尼罗病毒激发后检验候选者的保护性功效的功效研究。研究代表性地是由5组于第0、14及28天，经腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.)致免的小鼠(每组10只小鼠)所组成。于第21及35天，采收血清并测试西尼罗病毒包膜蛋白-IgG抗体(ELISA)，及于试管内中和西尼罗病毒的能力(PRNT分析)。于第35天，将小鼠以致死剂量的WNV病毒株2741激发。于激发后监测其存活达21天。
将小鼠以PBS、含有STF2.E的果蝇条件培养基(CM，阳性对照组)、25μg的STF2Δ.EIII+i.p.、25μg STF2Δ.EIII+s.c.、25μg STF2.EIII+i.p.及25μgSTF2.EIII+s.c致免。西尼罗病毒包膜蛋白抗体反应，及存活数据经列示于图65与66。于第35天以前，所有接受STF2Δ.EIII+的组皆具有显著程度的西尼罗病毒包膜蛋白IgG。反之，接受STF2.EIII+的小鼠不具有可检测的西尼罗病毒包膜蛋白抗体反应。投予STF2Δ.EIII+i.p.或s.c，可使于西尼罗病毒激发后达100％存活。与STF2.EIII+的差的免疫原性相符，当相较于PBS对照组时，由此候选者可提供少至无的保护性。于此项研究中，STF2.EIII+的免疫原性及功效差，是由于TLR5活性减低及/或此蛋白质的弱EIII抗原表位反应性所致。
蚀斑减少中和效价 为进一步评估由STF2Δ.EIII+所引起的西尼罗病毒包膜蛋白抗体反应，及与中和效价可能相关的保护功效，遂进行蚀斑减少中和测试(PRNT)。对取自前述功效研究的第35天血清样本，测试其于培养的Vero细胞中阻断西尼罗病毒感染的能力。简言的，将汇集得的小鼠血清样本经热去活化，并两倍系列稀释于含5％明胶的PBS中。将从1:10开始的稀释液与约100pfu的西尼罗病毒株2741进行培育。将病毒/血清混合于约37℃下培育1h，然后培育在生长于二重复六-孔组织培养板中的铺满Vero细胞(ATCC，目录编号CCL-81，马纳萨斯，维吉尼亚)单层上。于添加1％琼脂覆盖层之前，先令病毒吸附至该细胞单层。将经感染的细胞培养物于37℃下培育4天，随后覆盖含有4％中性红的第二覆盖层。于12小时后计数病毒蚀斑。记录可导致80％病毒蚀斑数减少的血清效价(PRNT80)。
于下表12中列示，得自关于STF2.EIII+及STF2Δ.EIII+的功效研究的PRNT80数据。于两项涉及STF2.EIII+的独立研究中，所报导的存活率为约50％或更少，汇集得的血清无法抑制蚀斑形成。由于此构建体所引起的抗体反应微弱，故此发现并不令人意外。于三项涉及STF2Δ.EIII+的功效研究中，存活率为约70％或更高，汇集得的血清具有中和效价为1:40或更佳。中和效价为1:40或更佳，代表性地与活体内保护作用相关。
表12STF2.EIII+(SEQ ID NO658)、STF2Δ.EIII+(SEQ ID NO674)与STF2.E(SEQ ID NO762)CM(对照组培养基)融合蛋白的存活及PRNT80结果 STF2Δ.EIIIs+为STF2Δ.EIII+的经修饰版本 将用于前述小鼠功效研究中进行测试的STF2Δ.EIII+蛋白质制剂，通过于变性条件下进行的阴离子交换及尺寸-排除层析术步骤纯化，随后使用逐步透析再折叠。以此制程，产生两种相当于STF2Δ.EIII+的单体与三聚体形式的主要物种，且呈混合物存在终产物中。为使终产物的不均匀性减至最低，遂已研发出偏好制造单体或三聚体的新颖再折叠及纯化方法。因为不清楚STF2Δ.EIII+的何种形式为活性组成，或是否二者皆同样有效，故已产生毫克量的二物种，并于小鼠测试其功效。
起初并不清楚为何STF2Δ.EIII+再折叠会导致三聚体形成。然而，当再次检视STF2Δ.EIII+表达构建体的序列时，吾等于分隔STF2Δ与EIII+的肽连接子序列中鉴定出一个半胱氨酸残基。此半胱氨酸的存在似乎会干扰，于再折叠期间的适当二硫键形成，且可能促成STF2Δ.EIII+的三聚体形式。使用定点致变将此不必要的半胱氨酸改变成丝氨酸，而制造及纯化得经修饰的蛋白质(STF2Δ.EIIIs+)。应注意，将该经丝氨酸取代的构建体再折叠，仅产生单体蛋白质。
在以西尼罗病毒激发后于C3H/HeN小鼠中评估STF2Δ.EIII+(单体)与STF2Δ.EIIIs+(三聚体)的保护性功效。将五组小鼠(每组10只小鼠)于第0、14及28天，经s.c.以约25ug蛋白质致免。于第21及35天，采收血清并测试WNV-E IgG抗体(ELISA)。于第38天，将小鼠以致死剂量的WNV病毒株2741激发，并监测其存活达21天。由促升2(第35天，图67)的ELISA结果及存活数据(图68)指出，所有构建体皆于病毒激发前引起显著程度的WNV-E反应性IgG，并提供约90％至约100％对抗致死感染的保护作用。此等发现指示，STF2Δ.EIII+的单体或多聚体(例如三聚体)形式为有效，且将额外半胱氨酸从该构建体移除，并不会有感知地冲击其功效。去除肽连接子序列中的半胱氨酸，可通过减低于蛋白质再折叠后的不均匀性，而简化蛋白质的纯化。
结论 已经产生两种含有鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白(STF2)经融合至西尼罗病毒包膜蛋白的EIII+功能域的重组融合蛋白质。其一包括全长STF2序列(STF2.EIII+)，而另一者包括其缺乏STF2内部高变区的STF2经修饰版本(STF2Δ.EIII+)。该二蛋白质已于大肠杆菌中表达，且通过使用阴离子交换层析术及凝胶过滤的习知方法纯化得。STF2.EIII+是呈可溶性蛋白质制造得，且于非-变性条件下进行纯化。反之，STF2Δ.EIII+表达呈可溶性蛋白质，且于变性条件下进行纯化，并通过逐步透析进行再折叠以去除尿素。于HEK293IL8分析，STF2Δ.EIII+的制剂显示较STF2.EIII+大的TLR-5活性。
于使用ELISA分析及西尼罗病毒包膜蛋白抗体的包膜蛋白抗原表位展示分析中，STF2Δ.EIII+展示较多更多重要的构型依赖性中和性抗原表位。符合由STF2Δ.EIII+观察到的有效TLR-5活性及包膜蛋白抗原表位抗原性，STF2Δ.EIII+于经致死剂量的西尼罗病毒激发的小鼠中，具有高度免疫原性及有效性。因为STF2Δ.EIII+的单体与三聚体物种，是于此蛋白质的纯化程序中产生，故将表达构建体的肽连接子序列中的半胱氨酸改变成丝氨酸。移除此半胱氨酸可消除于折叠期间产生该蛋白的三聚体形式，并导致产生于活体内展现有效功效的单体产物。
日本脑炎融合蛋白 JE病毒分布于亚洲与北澳洲(每年约50,000个案发生，其中约10,000死亡)。最近已核准的灭活病毒疫苗，是与急性散播脑脊髓炎的个案相关，激励日本健康、劳工及社会福利部建议全国性推广该疫苗。由于在受感染小鼠脑部，或甚至在细胞培养中制造灭活病毒的程序复杂，且可能发生与灭活病毒相关的有害事件，故引起基于重组体的JE疫苗的机会。
构建得STF2Δ.JEIII+融合构建体。以合成方式产生JE EIII+DNA片段，并经密码子最适化用于大肠杆菌表达。将该序列接合至pET24STF2Δ中，而产生pETSTF2Δ.JEIII+。表达构建体已通过限制分析进行筛检，并供通过IPTG诱导于大肠杆菌BLR(DE3)的表达。已确认各构建体的DNA序列，并已扩大该蛋白质的制造规模。已产生一批物质。纯化得总共约24mg物质。此物质具有有效的TLR活性，可接受程度的内毒素(约0.03EU/μg)及A280/A260比例为约1.3。
黄病毒肽 WNV-E特异性抗体抗原表位的鉴定 为鉴定于西尼罗病毒包膜蛋白内，可由得自STFΔ.EIIIs+致免小鼠的抗血清识别的直线形抗原表位，遂产生数种肽列阵。其中一列阵是由跨越整个西尼罗病毒功能域III，及部分功能域II的长度为20个氨基酸的重叠肽所组成(SEQID NOS728-754)。以此列阵进行的ELISA鉴定得一种具有高反应性的20氨基酸序列，其经图铺确定为功能域III的N-端区域且包括部分功能域I功能域CRVKMEKLQLKGTTYGVCSK(SEQ ID NO728)。为将此抗原表位精密制图，遂产生集中于功能域I与II接合处的额外列阵(SEQ ID NOS703-754)。此等列阵包括丙氨酸取代扫描，以鉴定出对于抗体结合为重要的氨基酸(SEQ IDNOS728-754)。如图69及70所示，得自经STF2Δ.EIII(单体与三聚体)及STF2Δ.EIIIs+致免小鼠的抗血清，可与跨越EI/EIII接合(肽E-30至E-42)，且包括E2-21肽CRVKMEKLQLKGTTYGVCSK(SEQ ID NO728)的肽反应。当特定氨基酸(E6，K7，L10与K11)被改换成丙氨酸时，此反应性严重减低(图71)。虽然不知道识别此抗原表位的抗体是否为中和性，仍致力于设计及测试基于WNV-E的此区域的肽疫苗。
Pam3Cys.WNV001肽疫苗的免疫性 使用20氨基酸序列LTSGHLKCRVKMEKLQLKGT(SEQ ID NO772)(普纳克，R.等人，疫苗234442-4452(2005))合成得，于N-末端融合至Pam3Cys的脂化西尼罗病毒包膜蛋白。于C3H/HeN小鼠测试此肽的免疫原性，并与不含Pam3Cys的肽比较(图72)。通过如范例所述的直接ELISA，测试得自经致免动物的抗血清的反应性，且结果指出Pam3Cys.WNV001肽显著较未经TLR2修饰的肽更具免疫原性。得自此等研究的抗血清，将于病毒中和分析(PRNT)中进行测试，以测定所引发的抗体是否会于试管内中和西尼罗病毒。经脂化肽亦将于西尼罗病毒激发模型中进行测试，以分析其对抗致死病毒激发的保护功效。
分析发展 竞争ELISA分析发展 为分析衍生自经致免小鼠的抗血清的中和潜能，遂使用其可于培养物中和西尼罗病毒，且与西尼罗病毒包膜蛋白抗原的功能域III内的构型-敏感性抗原表位反应，的已经十分特征化单克隆抗体(7H2)研发出竞争ELISA分析。此项分析经设计为，一种测量得自经致免动物的血清防止7H2与西尼罗病毒包膜蛋白结合的能力的捕获ELISA。将取自功效研究4(图65与图66，表13)的第35天小鼠抗血清的范围从1:10至1:5000的系列稀释液，与生物素化西尼罗病毒包膜蛋白进行培育，然后加至预先涂覆以7H2单克隆抗体(Bioreliance，洛克谷，MD)的ELISA板。经数次清洗去除未结合的物质后，使用亲合素-HRP检测结合的西尼罗病毒包膜蛋白。由代表性实验所得的结果列示于图69。于1:25稀释度下，当测试衍生自经STF2Δ.EIIIs致免动物的抗血清时，观察到西尼罗病毒包膜蛋白与7H2-涂覆板的结合，有可测量的流失。以衍生自接受PBS取代抗原的仿效致免小鼠的抗血清，则无检测到竞争。此等初步结果证明，由STF2Δ.EIII+引发的抗体与7H2竞争与西尼罗病毒包膜蛋白的结合。此等发现与得自于经STF2Δ.EIII+致免动物中所观察到，可免于WNV感染的保护作用相符，且有助于建立试管内抗体抗原表位反应性与活体内功效间的关连性。
虽然本发明已参考其实例实施方式特别地列示及描述，习于该项技艺人士应了解，在无偏离本发明附属的权利要求所涵盖的范围下，于其中可于形式及细节进行各种改变。
权利要求
1.一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含下列步骤
a)将蛋白质的一部分自天然病毒血细胞凝集素分离出以由此形成蛋白质部分，其中该蛋白质部分包括
i)球状头部的至少一部分，及
ii)至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，
且其中该蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；
b)将编码该蛋白质部分的核酸序列转化至原核宿主细胞中；及
c)培养该原核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步缺乏信号序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二级结构包括至少一个β-折叠的至少一部分。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二级结构包括至少一个α螺旋。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二级结构蛋白质部分进一步包括至少一种选自由盐桥、亮氨酸拉链与锌指结构所组成的组群的成员。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步包括至少一个二硫键。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步包括至少二个二硫键。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步包括至少四个二硫键。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步包括至少五个二硫键。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步包括至少六个二硫键。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以编码至少一个选自由亲水性氨基酸残基、极性氨基酸残基及中性氨基酸残基所组成的组群的氨基酸残基的核酸序列，取代编码该蛋白质部分中至少一个疏水性氨基酸残基的核酸序列的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述疏水性氨基酸残基包括至少一种选自由苯丙氨酸残基、色氨酸残基与酪氨酸残基所组成的组群的成员。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述极性氨基酸残基包括至少一种选自由天冬氨酸残基与谷氨酸残基所组成的组群的成员。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒血细胞凝集素包括流感病毒血细胞凝集素蛋白质。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述流感病毒血细胞凝集素蛋白质包括流感A病毒血细胞凝集素蛋白质。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述流感A病毒是至少一种选自由H1、H2、H3、H5、H7及H9所组成的组群的成员。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述流感病毒血细胞凝集素蛋白质包括流感B病毒血细胞凝集素蛋白质。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述流感病毒血细胞凝集素蛋白质包括流感C病毒血细胞凝集素蛋白质。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌原核宿主细胞。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述原核宿主细胞包括假单胞菌属原核宿主细胞。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述原核宿主细胞包括芽孢杆菌属原核宿主细胞。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述原核宿主细胞包括沙门氏杆菌属原核宿主细胞。
23.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以分子伴侣核酸序列转化原核宿主细胞的步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述分子伴侣核酸序列为至少一种选自由groES-groEL分子伴侣、dnaK-dnaJ-grpE分子伴侣、groES-groEL-tig分子伴侣及tig分子伴侣所组成的组群的成员。
25.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将钟样受体激动剂的至少一部分融合至该蛋白质的步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述钟样受体激动剂包括至少一种选自由钟样受体2激动剂、钟样受体4激动剂及钟样受体5激动剂所组成的组群的成员。
27.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将编码钟样受体激动剂的至少一部分的核酸序列操作性连结至编码病毒血细胞凝集素的蛋白质部分的核酸序列的步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其进一步包括将连接子插入于该钟样受体激动剂与该蛋白质部分之间的步骤。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述钟样受体激动剂包括钟样受体5激动剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述钟样受体5激动剂包括鞭毛蛋白的至少一部分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述鞭毛蛋白缺乏铰链区的至少一部分。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述鞭毛蛋白包括至少一种选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白、大肠杆菌鞭毛蛋白、慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白、耶尔森菌鞭毛蛋白、弯曲杆菌鞭毛蛋白、绿脓杆菌鞭毛蛋白及单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白所组成的组群的成员。
33.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将编码载体蛋白的核酸序列操作性连结至编码该蛋白质部分的核酸序列的步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述载体蛋白为至少一种选自由破伤风类毒素、霍乱弧菌类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的交叉反应性突变型、大肠杆菌热不稳定性肠内毒素的B亚单位、烟草花叶病毒外壳蛋白、狂犬病毒包膜蛋白、狂犬病毒包膜糖蛋白、甲状腺球蛋白、热休克蛋白60、钥孔虫戚血蓝蛋白及早期分泌抗原结核病-6所组成的组群的成员
35.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将载体蛋白的至少一部分融合至该蛋白质部分的步骤。
36.一种制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质的方法，其包含下列步骤
a)将蛋白质的一部分自天然病毒血细胞凝集素分离出由此形成蛋白质部分，其中，所述蛋白质部分包括
i)球状头部的至少一部分，及
ii)至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，
且其中，所述蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；
b)将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中，所述真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母真核宿主细胞；及
c)培养该真核宿主细胞而由此制造刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述蛋白质部分进一步缺乏信号序列。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述蛋白质部分包括唾液酸结合位点。
39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述二级结构包括至少一个β-折叠的至少一部分。
40.根据权利要求36所述的方法，其中，所述二级结构包括至少一种选自由盐桥及α螺旋所组成的组群的成员。
41.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括以编码至少一个选自由亲水性氨基酸残基、极性氨基酸残基及中性氨基酸残基所组成的组群的氨基酸残基的核酸序列，取代编码该蛋白质部分中至少一个疏水性氨基酸残基的核酸序列。
42.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括将位于编码该蛋白质部分的核酸序列中的至少一个糖化位点缺失的步骤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述糖化位点包括N-糖化位点。
44.根据权利要求36所述的方法，其中，所述真核宿主细胞包括酵母属真核宿主细胞。
45.根据权利要求36所述的方法，其中，所述真核宿主细胞包括真菌真核宿主细胞。
46.根据权利要求36所述的方法，其中，所述真核宿主细胞包括寄生虫真核宿主细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述真核宿主细胞包括利什曼原虫真核宿主细胞。
48.根据权利要求36的方法，其中，所述真核宿主细胞包括乳酸克鲁维酵母宿主细胞。
49.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括将钟样受体激动剂的至少一部分融合至该蛋白质部分的步骤。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述钟样受体激动剂包括至少一种选自由钟样受体2激动剂、钟样受体4激动剂及钟样受体5激动剂所组成的组群的成员。
51.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括将编码钟样受体激动剂的至少一部分的核酸序列操作性连结至编码该蛋白质部分的核酸序列的步骤。
52.根据权利要求51所述的方法，其进一步包括将连接子插入于该钟样受体激动剂与该蛋白质部分之间的步骤。
53.根据权利要求51所述的方法，其中，所述钟样受体激动剂包括钟样受体5激动剂。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述钟样受体5激动剂包括鞭毛蛋白的至少一部分。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述鞭毛蛋白缺乏铰链区的至少一部分。
56.根据权利要求54所述的方法，其进一步包括将位于编码鞭毛蛋白的核酸序列中的至少一个糖化位点缺失的步骤。
57.根据权利要求54所述的方法，其中，所述鞭毛蛋白包括至少一种选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白、大肠杆菌鞭毛蛋白、慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白、耶尔森菌鞭毛蛋白、弯曲杆菌鞭毛蛋白、绿脓杆菌鞭毛蛋白及单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白所组成的组群的成员。
58.一种刺激个体内保护性免疫的方法，其包含将一种包括得自天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述蛋白质部分包括球状头部的至少一部分，及一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中，所述蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。
59.一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含下列步骤
a)将蛋白质的一部分自天然病毒血细胞凝集素分离出由此形成蛋白质部分，其中，所述蛋白质部分包括
i)球状头部的至少一部分，及
ii)至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，
且其中，所述蛋白质部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域；
b)将编码该蛋白质部分的核酸序列转感染至真核宿主细胞中，其中，所述真核宿主细胞不为巴斯德毕赤酵母真核宿主细胞或稳定转染的昆虫宿主细胞；及
c)培养该真核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
60.一种制造刺激个体内保护性免疫反应的病毒血细胞凝集素蛋白的方法，其包含下列步骤
a)将原核宿主细胞以编码至少一种缺乏跨膜功能域与胞质功能域的病毒血细胞凝集素的核酸序列进行转化；及
b)培养该原核宿主细胞而由此制造该刺激个体内保护性免疫反应的蛋白质。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述病毒血细胞凝集素包括流感病毒血细胞凝集素蛋白质。
62.根据权利要求60所述的方法，其进一步包括将原核宿主细胞以分子伴侣核酸序列转化的步骤。
63.根据权利要求60所述的方法，其进一步包括将编码钟样受体激动剂的至少一部分的核酸序列操作性连结至编码该蛋白质部分的核酸序列的步骤。
64.一种刺激个体内保护免疫性的方法，其包含将一种包括具有一种缺乏跨膜功能域及胞质功能域的病毒血细胞凝集素的蛋白质的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述蛋白质表达于原核细胞中。
65.根据权利要求64所述的方法，其于给药予该个体的组合物中进一步包括载体蛋白。
66.一种组合物，其包含至少一种病原体-关连的分子型式的至少一部分，及天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分，其中，所述天然病毒血细胞凝集素的蛋白质部分包括球状头部的至少一部分及至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且其中，所述天然病毒血细胞凝集素的部分缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。
67.根据权利要求66所述的组合物，其进一步包括载体蛋白。
68.根据权利要求66的组合物，其中，所述病原体-关连的分子型式与天然病毒血细胞凝集素的部分为融合蛋白质的组成。
69.根据权利要求66所述的组合物，其中，所述病原体-关连的分子型式包括钟样受体激动剂。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中，所述钟样受体激动剂包括至少一种选自由钟样受体2激动剂、钟样受体4激动剂及钟样受体5激动剂所组成的组群的成员。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中，所述钟样受体激动剂包括钟样受体5激动剂。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中，所述钟样受体5激动剂包括鞭毛蛋白。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白包括至少一种选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白、大肠杆菌鞭毛蛋白、慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白、耶尔森菌鞭毛蛋白、弯曲杆菌鞭毛蛋白、绿脓杆菌鞭毛蛋白及单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白所组成的组群的成员。
74.一种包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物，其中，所述鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使该鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
75.根据权利要求74所述的组合物，其进一步包括至少一种选自由钟样受体1激动剂、钟样受体2激动剂、钟样受体3激动剂、钟样受体4激动剂、钟样受体6激动剂、钟样受体7激动剂、钟样受体8激动剂及钟样受体9激动剂所组成的组群的成员的至少一部分。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中，所述钟样受体2激动剂为Pam3Cys。
77.根据权利要求76所述的组合物，其中，所述Pam3Cys进一步包括至少一个额外的半胱氨酸。
78.根据权利要求74所述的组合物，其中，至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
79.根据权利要求78所述的组合物，其中，所述半胱氨酸残基是远离该鞭毛蛋白成分的钟样受体5识别位点的至少一个氨基酸。
80.根据权利要求74所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白成分包括天然鞭毛蛋白氨基酸序列的至少一部分与该半胱氨酸残基组合。
81.根据权利要求80的组合物，其中，所述半胱氨酸残基为至少一种选自由该鞭毛蛋白成分的氨基-末端氨基酸及该鞭毛蛋白成分的羧基-末端氨基酸所组成的组群的成员。
82.根据权利要求80所述的组合物，其中，所述半胱氨酸残基是远离该鞭毛蛋白成分的钟样受体5识别位点的至少一个氨基酸。
83.根据权利要求74所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白成分缺乏高变区的至少一部分。
84.根据权利要求74所述的组合物，其进一步包括一种抗原的至少一部分。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述抗原以化学方法共轭至鞭毛蛋白成分。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中，所述抗原本质上为疏水性。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中，所述化学共轭导致该作为组合物的组成的抗原的水溶性增加。
88.根据权利要求74所述的组合物，其中，所述半胱氨酸残基位于该鞭毛蛋白成分的高变区中。
89.根据权利要求74所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为至少一种选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白、大肠杆菌fliC鞭毛蛋白、慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白、绿脓杆菌鞭毛蛋白及单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白所组成的组群的成员的至少一部分。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白是选自由SEQID NO812及SEQ ID NO816所组成的组群。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中，所述氨基酸为至少一个选自由SEQ ID NO812的氨基酸1、237、238、239、240、241与495所组成的组群的氨基酸。
93.根据权利要求90所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白包括SEQ IDNO816的至少一部分。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
95.根据权利要求94所述的组合物，其中，所述氨基酸为少一个选自由SEQ ID NO816的氨基酸1、240、241、242、243、244与505所组成的组群的氨基酸。
96.根据权利要求89所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白包括SEQ IDNO504的至少一部分。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中，所述氨基酸为少一个选自由SEQ ID NO504的氨基酸1、237、238、239、240、241与504所组成的组群的氨基酸。
99.根据权利要求89所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为绿脓杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该绿脓杆菌鞭毛蛋白包括SEQ ID NO815的至少一部分。
100.根据权利要求99所述的组合物，其中至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
根据权利要求100所述的组合物，其中，所述氨基酸为少一个选自由SEQ ID NO815的氨基酸1、211、212、213与393所组成的组群的氨基酸。
根据权利要求89所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白包括单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白包括SEQ ID NO820的至少一部分。
根据权利要求102所述的组合物，其中至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
根据权利要求103所述的组合物，其中，所述氨基酸为少一个选自由SEQ ID NO820的氨基酸1、151、152、153、154与287所组成的组群的氨基酸。
根据权利要求89所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为大肠杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该大肠杆菌鞭毛蛋白包括SEQ ID NO502的至少一部分。
根据权利要求105所述的组合物，其中至少一个半胱氨酸残基取代存在该鞭毛蛋白成分的天然鞭毛蛋白氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。
根据权利要求106所述的组合物，其中，所述氨基酸为少一个选自由SEQ ID NO502的氨基酸1、238、239、240、241、242、243与497所组成的组群的氨基酸。
根据权利要求84所述的组合物，其中，所述抗原为流感病毒抗原的至少一部分。
根据权利要求108所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒整合性膜蛋白的至少一部分。
110.根据权利要求108所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒A抗原。
111.根据权利要求108所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒B抗原。
112.根据权利要求108所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒C抗原。
113.根据权利要求109所述的组合物，其中，所述整合性膜蛋白为血细胞凝集素蛋白的至少一部分。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中，所述血细胞凝集素蛋白的部分包括血细胞凝集素蛋白的成熟剪切位点的至少一部分。
115.根据权利要求114所述的组合物，其中，所述成熟剪切位点包括少一种选自由SEQ ID NO530、SEQ ID NO532、SEQ ID NO533、SEQ ID NO534、SEQ ID NO535、SEQ ID NO600、SEQ ID NO601、SEQ ID NO602、SEQ ID NO603、SEQ ID NO821、SEQ ID NO796、SEQ ID NO797、SEQ IDNO798、SEQ ID NO799及SEQ ID NO822所组成的组群的成员。
116.根据权利要求109所述的组合物，其中，所述整合性膜蛋白包括基质2蛋白的至少一部分。
117.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述抗原为至少一种选自由西尼罗病毒蛋白、蓝佳特病毒蛋白、昆津病毒蛋白、墨累谷脑炎病毒蛋白、日本脑炎病毒蛋白、蜱传脑炎病毒蛋白、登革热1病毒蛋白、登革热2病毒蛋白、登革热3病毒蛋白、登革热4病毒蛋白、C型肝炎病毒蛋白与黄热病毒蛋白所组成的组群的成员的至少一部分。
118.根据权利要求84所述的组合物，其中，所述抗原包括病原体相关的抗原。
119.根据权利要求118所述的组合物，其中，所述病原体相关的抗原为至少一种选自由呼吸道融合性病毒、恶性疟原虫与间日疟原虫所组成的组群的成员。
120.根据权利要求74所述的组合物，其进一步包括载体蛋白。
121.根据权利要求120所述的组合物，其中，所述载体蛋白为至少一种选自由破伤风类毒素、霍乱弧菌类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的交叉反应性突变型、大肠杆菌热不稳定性肠内毒素的B亚单位、烟草花叶病毒外壳蛋白、狂犬病毒包膜蛋白、狂犬病毒包膜糖蛋白、甲状腺球蛋白、热休克蛋白60、钥孔虫戚血蓝蛋白与早期分泌抗原结核病-6所组成的组群的成员。
122.根据权利要求74所述的组合物，其中至少一种选自由精氨酸残基、丝氨酸残基与组氨酸残基所组成的组群的成员取代至少一种选自由鞭毛蛋白成分的至少一部分及鞭毛蛋白的至少一部分所组成的组群的成员的至少一个赖氨酸。
123.一种组合物，其包括其为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成，其中，所述钟样受体激动剂组成包括至少一个半胱氨酸残基，位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
124.根据权利要求123所述的组合物，其中，所述钟样受体激动剂组成包括天然钟样受体激动剂的至少一部分与该半胱氨酸残基组合。
125.根据权利要求124所述的组合物，其中，所述半胱氨酸残基是远离钟样受体激动剂的钟样受体识别位点的至少一个氨基酸。
126.根据权利要求123所述的组合物，其中，所述钟样受体激动剂为至少一种选自由钟样受体1激动剂、钟样受体2激动剂、钟样受体3激动剂、钟样受体4激动剂、钟样受体5激动剂、钟样受体6激动剂、钟样受体7激动剂、钟样受体8激动剂及钟样受体9激动剂所组成的组群的成员的至少一部分。
127.根据权利要求126所述的组合物，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
128.一种组合物，其包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中，所述鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
129.根据权利要求128所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为至少一种选自由鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白、大肠杆菌fliC鞭毛蛋白、慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白、绿脓杆菌鞭毛蛋白及单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白所组成的组群的成员的至少一部分。
130.根据权利要求129所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白是选自由SEQ ID NO812及SEQ ID NO816所组成的组群。
131.根据权利要求130所述的组合物，其中，所述经精氨酸取代的赖氨酸残基为至少一个选自由SEQ ID NO812的赖氨酸19、41、58、135、160、177、179、203、215、221、228、232、241、251、279、292、308、317、326、338、348、357、362、369、378、384、391与410所组成的组群的赖氨酸。
132.根据权利要求130所述的组合物，其中，所述经精氨酸取代的赖氨酸残基为至少一个选自由SEQ ID NO816的赖氨酸20、42、59、136、161、177、182、189、209、227、234、249、271、281、288、299、319、325、328、337、341、355、357、369、381、390、396、403、414与422所组成的组群的赖氨酸。
133.根据权利要求129所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为大肠杆菌fliC鞭毛蛋白，且该大肠杆菌鞭毛蛋白包括SEQ ID NO814的至少一部分。
134.根据权利要求129所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该慕尼黑沙门氏杆菌鞭毛蛋白包括SEQID NO813的至少一部分。
135.根据权利要求129所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为绿脓杆菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该绿脓杆菌鞭毛蛋白包括SEQ ID NO815的至少一部分。
136.根据权利要求129所述的组合物，其中，所述鞭毛蛋白为单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白的至少一部分，且该单核细胞增生李斯特菌鞭毛蛋白包括SEQ ID NO500的至少一部分。
137.根据权利要求128所述的组合物，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
138.根据权利要求137所述的组合物，其中，所述抗原于赖氨酸取代以精氨酸后，共轭至鞭毛蛋白成分。
139.根据权利要求137所述的组合物，其中，所述抗原为流感抗原的至少一部分。
140.根据权利要求139所述的组合物，其中，所述流感抗原为整合性膜蛋白的至少一部分。
141.根据权利要求140所述的组合物，其中，所述整合性膜蛋白包括血细胞凝集素蛋白的至少一部分。
142.根据权利要求140所述的组合物，其中，所述整合性膜蛋白包括基质2蛋白的至少一部分。
143.根据权利要求139所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒A抗原。
144.根据权利要求139所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒B抗原。
145.根据权利要求139所述的组合物，其中，所述流感病毒抗原为流感病毒C抗原。
146.一种组合物，其包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中，所述鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
147.一种组合物，其包含其为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分，其中，所述鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
148.一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述鞭毛蛋白成分包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
149.根据权利要求148所述的方法，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
150.一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
151.根据权利要求150所述的方法，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
152.一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个丝氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
153.根据权利要求152所述的方法，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
154.一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种其包括为鞭毛蛋白的至少一部分的鞭毛蛋白成分的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个组氨酸残基取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。
155.根据权利要求154所述的方法，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
156.一种刺激个体内免疫反应的方法，其包含将一种包括为钟样受体激动剂的至少一部分的钟样受体激动剂组成的组合物给药予该个体的步骤，其中，所述钟样受体激动剂组成包括至少一个的半胱氨酸残基，位于天然钟样受体激动剂中未出现半胱氨酸残基的处，而由此使该钟样受体激动剂组成活化钟样受体。
157.根据权利要求156所述的方法，其进一步包括至少一种抗原的至少一部分。
全文摘要
本发明是关于刺激个体内保护性免疫反应的组合物及制造方法，其包括得自天然病毒血细胞凝集素的蛋白质的部分，其中该部分包括球状头部的至少一部分，包括至少一种使球状头部实质上仍保有其三级结构的二级结构的至少一部分，且缺乏膜融合功能域、跨膜功能域及胞质功能域。组合物包含鞭毛蛋白成分或钟样受体(Toll-like Receptor)激动剂组成，其为鞭毛蛋白或钟样受体激动剂的至少一部分，其中该鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成包括至少一个半胱氨酸残基，而由此使该鞭毛蛋白成分或钟样受体激动剂组成活化钟样受体5或钟样受体。组合物包含鞭毛蛋白成分，其为鞭毛蛋白的至少一部分，其中该鞭毛蛋白成分的至少一个赖氨酸已经由至少一个精氨酸、丝氨酸与组氨酸取代，由此使鞭毛蛋白成分活化钟样受体5。组合物可进一步包括一种抗原，例如流感病毒抗原、黄病毒抗原、病原体-关连的抗原、细菌荚膜抗原与载体蛋白。组合物可用于刺激个体内免疫反应及保护性免疫反应。
文档编号A61K39/02GK101394864SQ200780007955
公开日2009年3月25日 申请日期2007年3月6日 优先权日2006年3月7日
发明者朗秋·尚, 弗利立安·纳卡尔, 亚尔柏特·E.·普莱斯, 琳达·G.·塔西, 詹姆士·W.·胡利特, 汤玛斯·J.·普威尔, 罗勃特·K.·伊凡斯 申请人:法克斯因内特公司